Anda di halaman 1dari 53

1

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Sejak beberapa dekade, perawatan kedokteran gigi telah dikenal
menggunakan banyak jenis dari material logam. Salah satu jenis logam yang
sering digunakan adalah nikel. Di Amerika Serikat pada tahun 2007, sebanyak
50% mahkota atau jembatan paduan nikel dibuat sebanyak 15 juta restorasi,
dengan total penggunaan mencapai 4-5 juta per tahun (Wataha, et al., 2013).
Logam ini masih digunakan di kedokteran gigi untuk beberapa alasan, seperti
ketahanannya terhadap korosi dan harganya yang murah (Rachmawati, 2013).
Nikel diketahui merupakan logam paling reaktif dibandingkan dengan logam lain,
dimana dapat menimbulkan sensitisasi di kulit dan mukosa rongga mulut (Hosoki
dan Nishigawa, 2011). Studi sebelumnya menyebutkan bahwa nickel (II) sulfat
memiliki sensitivitas paling tinggi dan mempengaruhi kira-kira 15% dari populasi
masyarakat Amerika, diikuti cobalt chloride dan potassium dichromate, yang
mempengaruhi 5% dan 3% dari keseluruhan populasi Amerika (Saito et al.,
2016).
Alloy logam di dalam rongga mulut berinteraksi dengan lingkungan yang
basah, menghasilkan pelepasan ion logam terus-menerus. Ion logam yang
dilepaskan berkontak dengan epitel dan mukosa rongga mulut. Ion logam nikel
dapat merangsang respon sistem imun non-spesifik pada manusia melalui ikatan
TLR4 yang selama ini dikenal merupakan reseptor untuk lipopolisakarida (LPS).
Mekanisme imun non-spesifik ini melibatkan peranan sel-sel imun PBMC
(Rachmawati, 2013). Sel mononuklear perifer (PBMC) merupakan bagian dari
sel-sel darah yang beinti bulat. PBMC terdiri dari sel monosit, sel T, sel B, sel
pembunuh alami (NK), dan sel dendritik (Končarević, et al., 2014).
Nikel juga dapat menginduksi kematian sel melalui aktivitas species
oxygen reactive (ROS) yang bertindak sebagai faktor penting dalam tahap awal
terjadinya apoptosis. Kelebihan jumlah dari ROS akan menghasilkan stres
3

oksidatif yang menyebabkan terjadinya apoptosis. Rendahnya jumlah antioksidan


dalam tubuh juga merupakan penyebab utama terjadinya peningkatan ROS.
Dalam proses penanganan kematian sel dikarenakan logam nikel,
dibutuhkan bahan antioksidan yang berasal dari sediaan herbal sebagai alternatif,
karena efek sampingnya minimal serta ketersediaannya yang melimpah
(Khotimah dan Muhtadi, 2008). Salah satu bahan alami yang dapat berperan
sebagai antioksidan antara lain adalah biji kopi robusta. Kopi merupakan
tumbuhan yang banyak ditemukan di kota Jember serta merupakan sentra
produksi terbanyak (Ermawati, 2015). Lebih dari 90% dari areal pertanaman kopi
Indonesia terdiri atas kopi robusta (Prastowo et al., 2010). Bahkan untuk rata-rata
konsumsi kopi perorangan mencapai 2,91 kg/tahun, dimana rata-rata konsumsi
kopi laki-laki sebesar 3,83 kg/tahun dan perempuan yaitu sebesar 1,97 kg/tahun
(Lestari, et al., 2009). Ekstrak biji kopi robusta mengandung polifenol dan
flavonoid yang merupakan antioksidan kuat dan dapat melindungi sel imun dari
kerusakan biologis akibat radikal bebas (Ermawati, 2015). Ekstrak etanol biji kopi
robusta menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak
heksana dan ekstrak etanol biji kopi robusta yang dipanggang. Ini terkait dengan
kandungan polifenol yang lebih tinggi, terutama asam klorogenik (Kiattisin,
2016). Dengan adanya sifat tersebut pada biji kopi robusta, diharapkan bahan ini
dapat mengurangi kematian sel setelah pengaplikasiannya.
Namun, diketahui ekstrak kopi yang mengandung kafein cukup tinggi juga
dapat menyebabkan apoptosis sel epitel rongga mulut melalui mekanisme aktivasi
caspase-3. Hal ini belum dilakukan identifikasi secara mendalam untuk
memastikan jenis-jenis zat terkandung pada ekstrak kopi yang menyebabkan
apoptosis (Hutomo, et al., 2014). Sehingga sebelum dilakukannya pengaplikasian
bahan obat tersebut, perlu untuk dilakukan uji sitotoksisitas. Uji ini dilakukan
dengan tujuan untuk mengetahui apakah bahan tersebut telah memenuhi syarat
biokompatibilitas yang dapat diterima oleh tubuh atau tidak (Nirwana, 2005). Uji
sitotoksisitas yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan uji trypan blue
dan MTT.
4

Penelitian tentang potensi ekstrak kopi robusta dalam menghambat


kematian sel dikarenakan paparan logam nikel, sepengetahuan peneliti belum
dilakukan. Oleh karena itu, perlu untuk dilakukan penelitian yang lebih lanjut
tentang hal tersebut. Tetapi, hendaknya harus diketahui terlebih dahulu
konsentrasi non-toksik dari kombinasi paparan ekstrak biji kopi robusta dan
larutan logam melalui uji sitotoksisitas terhadap PBMC, sehingga dapat diketahui
konsentrasi optimal ekstrak biji kopi robusta tanpa menimbulkan kematian sel.

1.2 Rumusan Masalah


Rumusan masalah dalam penelitian ini yaitu:
1. Bagaimana sitotoksisitas ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) pada
PBMC yang dikombinasikan dengan paparan larutan logam nikel?
2. Berapa konsentrasi ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) yang
menunjukkan maksimal konsentrasi non-toksik dalam penelitian ini?

1.3 Tujuan Penelitian


1.3.1 Mengetahui sitotoksisitas ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora)
pada PBMC yang dikombinasikan dengan paparan larutan logam nikel.
1.3.2 Mengetahui konsentrasi ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) yang
menunjukkan maksimal konsentrasi non-toksik dalam penelitian ini.

1.4 Manfaat Penelitian


1. Menambah pengetahuan tentang sitotoksisitas ekstrak biji kopi
robusta terhadap PBMC yang dikombinasikan dengan paparan larutan
logam nikel.
2. Sebagai bahan kajian dan panduan untuk penelitian selanjutnya.
Sehingga diharapkan dapat digunakan sebagai dasar menentukan
konsentrasi paparan yang tepat terhadap PBMC. Penelitian lanjutan
tersebut diharapkan dapat mengkaji lebih mendalam manfaat ekstrak
biji kopi robusta sebagai antioksidan.
5

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells)


Sel mononuklear perifer (PBMCs) merupakan bagian dari sel-sel darah
yang beinti bulat. PBMC terdiri dari sel monosit (10-20%), sel T (50-70%), sel B
(5-15%), sel pembunuh alami (NK) (2-10%), dan sel dendritik. PBMC
memainkan peranan penting dalam sistem kekebalan tubuh dan terjadinya
inflamasi (Končarević, et al., 2014). Pada individu sehat, sel-sel ini beredar
dalam tubuh dan mengantisipasi kelainan yang memicu kerja sistem kekebalan
tubuh serta terjadinya respon inflamasi. Saat menghadapi berbagai kelainan
tersebut, sel-sel ini ditargetkan untuk menghilangkan patogen potensial tersebut.
Namun aktivitas inflamasi ini dapat menyebabkan efek samping dan dalam jangka
waktu yang lama dapat menjadi parah. Aktivasi inflamasi melibatkan beberapa
fungsi biologis seperti migrasi leukosit, proliferasi sel T, respons interferon,
pensinyalan NF-κB dan regulasi kematian sel (Haudek-Prinz, et al., 2012).
Masing-masing sel ini memiliki fungsi yang berbeda. Sel T teraktivasi
saat terjadi kerusakan jaringan yang terkait dengan peradangan kronis, autoimun
dan penyakit graft versus host. Monosit bertindak sebagai regulator penting
aktivitas sel T. Setelah monosit bertemu dengan patogen potensial, sel ini menjadi
aktif dan berdiferensiasi menjadi makrofag. Makrofag memfagositosis dan
menghasilkan protein pada permukaan sel yang dapat menginduksi pengaktifan
sel T yang ditargetkan. Sel T yang diaktivasi selanjutnya dapat mengaktifkan sel
endotel, fibroblas dan monosit/makrofag (Haudek-Prinz, et al., 2012).
Akhir-akhir ini PBMC banyak digunakan sebagai indikator beberapa
penyakit, karena adanya respons PBMC saat berkontak dengan sel-sel
berpenyakit. Selain itu, PBMC diperoleh relatif mudah dari sampel darah pasien.
Sel-sel ini dapat berkontak langsung pada protein plasma sel yang sesuai. Sejauh
ini, sebagian besar penelitian yang menggunakan PBMC adalah pembuatan profil
transkripsi pada peradangan (misalnya, preeklampsia, rheumatoid arthritis, dan
6

pankreatitis kronis) dan penyakit ganas kronis, seperti leukemia kronis, limfositik
dan karsinoma ginjal) (Končarević, et al., 2014).

2.2 Alloy Logam Nikel


2.2.1 Pengertian Alloy
Logam yang digunakan di kedokteran gigi sebagai bahan restorasi tidak
menggunakan logam tunggal, karena jika digunakan kurang memenuhi syarat
fisis, mekanis, biologis, kimia dan estetis. Untuk memperbaiki sifat tersebut,
biasanya logam kedokteran gigi dicampur dengan dua atau lebih logam yang
berbeda. Logam campur atau paduan tersebut disebut alloy (Rachmawati, 2013).
Craig dan Powers dalam Soesetijo (2012), menguraikan bahwa alloy
pengganti logam mulia harus memenuhi atau mendekati persyaratan American
Dental Assosiation Spesification (ADAS) nomor 5 yaitu merupakan alloy
sederhana, terdiri dari campuran tiga macam logam utama (ternary alloy), suhu
pengecoran relatif rendah dan kemampuan cor yang baik, serta harganya relatif
murah.

2.2.2 Alloy Logam Nikel


Nikel merupakan logam transisi berwarna putih keperakan yang berada
pada periode ke-4, grup 10 dalam sistem periodik unsur. Nikel memiliki nomor
atom 28, dengan berat rata-rata atom 58,69 g/mol, dan densitas 8,9 g/cm3,
membuatnya lebih ringan dibandingkan logam lain di kedokteran gigi (Wataha, et
al., 2013).
7

Gambar 2.1 Tabel Periodik Unsur. Nikel berada pada periode 4 grup 10

Nikel (II) mempuyai elektron pada kulit terluar 3d⁸ (King dalam
Christianti, 2012). Konfigurasi elektron terluar dari nikel yang banyak diketahui
adalah 4s1 3d9, membuatnya cukup reaktif (Wataha, et al., 2013). Ion Ni (II)
mampu membentuk senyawa kompleks dengan ligan karena ion ini mempunyai
orbital d yang belum terisi penuh oleh elektron. Orbital-orbital tersebut dapat
berfungsi sebagai penerima pasangan elektron dari ligan sehingga terbentuk
senyawa kompleks jika telah kosong karena terjadi pengaturan elektron (King
dalam Christianti, 2012). Selain itu, dalam reaksinya dengan unsur lain, nikel
dapat menyebabkan reaksi oksidasi, dimana keadaan yang paling umum adalah +2
(Ni(II)Cl2). Kadar ion klorida yang tinggi, menyebabkan nikel dapat mudah
terkorosi di lingkungan rongga mulut (Wataha, et al., 2013).
Nikel adalah elemen esensial yang penggunaannya sangat penting dalam
kedokteran gigi. Nikel dasar (tidak murni) digunakan pada industri kedokteran
gigi untuk semua perawatan restoratif (fillings, mahkota, jembatan, gigi tiruan
sebagian) dan perawatan ortodontik (wires, bands, braket dan lain sebagainya)
(Rachmawati, 2013). Di Amerika Serikat pada tahun 2007, sebanyak 50%
mahkota atau jembatan paduan dengan berbasis nikel dibuat sebanyak 15 juta
restorasi, dengan total 4-5 juta per tahun (Wataha, et al., 2013).
Alloy berbahan dasar nikel pada umumnya mempunyai bentuk kristal face
centered cubic (FCC) yang merupakan struktur kristal berbentuk kubik. Pola
kristal kubik tersusun dalam sumbu yang sama panjang dan bertemu pada sudut
90° (Soesetijo, 2012).
8

Saat ini nikel masih digunakan di kedokteran gigi oleh karena


ketahanannya terhadap korosi dan harganya yang murah. Namun, penggunaan
restorasi dan casting alloy terutama berbahan dasar nikel dalam jangka waktu
yang lama masih cukup kontroversial oleh karena beberapa pengaruh merugikan
terutama sifatnya yang reaktif dan banyak menimbulkan reaksi sensitivitas yang
dapat berlanjut alergi pada manusia (Rachmawati, 2013).

2.3 Respon Sel Rongga Mulut terhadap Paparan Logam


Ni (II) dapat memediasi terjadinya perubahan seluler. Ni (II) dari senyawa
Ni seperti Ni sulfat, Ni klorida atau Ni asetat diperkirakan masuk ke sel melalui
transporter logam divalen (DMT1), yang biasanya berperan dalam mengangkut
besi atau mangan. Mekanisme kedua yaitu melalui difusi langsung, namun,
jumlah Ni yang mencapai sitoplasma melalui rute ini tergolong sangat rendah. Di
sisi lain, fagositosis senyawa Ni yang tidak larut diperkirakan menyebabkan
konsentrasi Ni (II) di daerah intraseluler menjadi lebih tinggi. Setelah
difagositosis, partikel-partikel logam ini dicerna oleh vakuola yang memiliki pH
4.5 untuk selanjutnya dikirim ke nukleus (Wataha, 2013).

Gambar 2.2. Masuknya Ni (II) ke dalam sel (Wataha, 2013)


9

Logam nikel dapat merangsang respon imun non-spesifik (Schmidt, et al.,


2010). Sistem imun non-spesifik adalah proteksi tubuh di garis pertahanan
pertama untuk melawan patogen. Mukosa rongga mulut memainkan peranan
penting dalam menyediakan pertahanan untuk menjaga tubuh tetap dalam kondisi
baik. Di dalam saliva rongga mulut terkandung mukus, enzim dan gen berbagai
anti-bakteri, yang berkontribusi besar berfungsi sebagai barrier (pertahanan).
Komponen selular dari imunitas non-spesifik antara lain sel-sel fagosit seperti
neutrofil dan monosit/makrofag, sel dendritik, sel mast, basofil, eusinofil dan sel
NK (Natural Killer). Mereka mengetahui adanya patogen dengan berbagai
reseptor berbeda yang pada akhirnya berperan dalam mengeliminasi patogen
(Rachmawati, 2013).
Ion logam Ni (II) dan ion lainnya dilepaskan selama terjadinya korosi. Ion
Ni terakumulasi di jaringan yang berkontak dengan nikel dan menyebabkan
inflamasi gingiva pada jaringan inang tersebut. Pelepasan ion juga terjadi melalui
akumulasi ion logam pada biofilm bakteri yang menutupi protesa (Wataha, et al.,
2013). Alloy logam di dalam rongga mulut berinteraksi dengan lingkungan yang
basah, menghasilkan pelepasan ion logam terus-menerus. Ion logam yang
dilepaskan kemudian berkontak dengan epitel dan mukosa rongga mulut. Ion
logam nikel dapat merangsang respon sistem imun non-spesifik melalui ikatan
antigen logam dengan reseptor TLR4 yang selama ini dikenal merupakan reseptor
untuk lipopolisakarida (LPS) (Rachmawati, 2013).
Nikel dapat menginduksi kematian sel melalui aktivitas species oxygen
reactive (ROS) yang bertindak sebagai faktor penting dalam tahap awal terjadinya
apoptosis. ROS sebenarnya merupakan salah satu jenis radikal bebas yang
dibutuhkan dalam proses fisiologis, namun dalam konsentrasi tinggi dapat
menyebabkan stress oksidatif (Birben et al., 2012). Apabila ROS dihasilkan dalam
jumlah berlebih, hal ini akan menyebabkan induksi depolarisasi MMP dan
cytcrelease yang memicu aktivasi caspase (Guo et al., 2016). ROS akan menarik
elektron dari senyawa disekitarnya dan mengubah senyawa tersebut menjadi
rantai radikal bebas yang baru. Reaksi ini dinamakan chain reaction (Sayuti dan
Yenrina, 2015). Target penyerangan dari ROS di sel tubuh manusia ada pada
10

mitokondria. Pembentukan ROS dapat menyebabkan kerusakan DNA dan


peroksidasi lipid pada ikatan lemak membrane sel, yang kemudian meningkatkan
apoptosis. Ni dapat menginduksi stres oksidatif secara in vitro dan in vivo. Ni
menginduksi apoptosis melalui peningkatan jumlah ROS, dan fakta bila ROS
menginduksi apoptosis melalui kerusakan mitokondria atau aktivasi siklus sel
dalam sel HeLa. Kelebihan jumlah dari ROS akan menghasilkan stres oksidatif
yang menyebabkan terjadinya apoptosis. Rendahnya jumlah antioksidan dalam
tubuh juga merupakan penyebab utama terjadinya peningkatan ROS. Superoxide
dismutase (SOD), katalase (CAT), glutathione reductase (GR), glutathione
peroxidase (GSH-Px) dan glutathione-S-transferase (GST) dan GSH merupakan
molekul antioksidan yang diperlukan tubuh. Beberapa penelitian telah melaporkan
bahwa NiCl2 dapat menurunkan sistem antioksidan. NiSO4 dapat menurunkan
tingkat GSH dan aktivitas SOD serta GSH-Px (Guo et al., 2016).

2.4 Kopi Robusta (Coffea canephora)


Kopi (coffea spp) adalah spesies tanaman berbentuk pohon yang termasuk
dalam family Rubiaceae dan genus Coffea (Najiyati dan Danarti, 2001). Famili
tersebut memiliki banyak genus, yaitu Gardenia, Ixora, Cinchona, dan Rubia.
Genus Coffea mencakup hampir 70 spesies, tetapi hanya ada dua spesies yang
ditanam dalam skala luas di seluruh dunia, yaitu kopi arabika (Coffea arabica)
dan kopi robusta (Coffea canephora var. robusta) (Rahardjo, 2012).
2.4.1 Taksonomi dan Deskripsi Kopi Robusta (Coffea canephora)
Berikut sistem taksonomi kopi secara lengkap (Rahardjo, 2012):
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Asteridae
Ordo : Rubiales
Famili : Rubiaceae
11

Genus : Coffea
Spesies : Coffea canephora var. robusta
Tanaman kopi tumbuhnya tegak, bercabang, dan bila dibiarkan tumbuh
dapat mencapai tinggi 12 m (Najiyati dan Danarti, 2001). Tanaman ini memiliki
dua tipe pertumbuhan cabang, yaitu cabang ortotrop tumbuh ke arah vertikal dan
cabang plagiotron ke arah horizontal. Daun kopi berwarna hijau mengilap yang
tumbuh berpasangan dengan berlawanan arah. Bentuk daun tanaman kopi lonjong
dengan tulang daun yang tegas (Rahardjo, 2012).
Tanaman kopi membutuhkan waktu 3 tahun dari saat perkecambahan
sampai menjadi tanaman berbunga dan menghasilkan buah kopi. Semua spesies
kopi berbunga berwarna putih yang beraroma wangi. Bunga tersebut muncul pada
ketiak daunnya. Buah kopi tersusun dari kulit buah (epikarp), daging buah
(mesokarp) dikenal dengan sebutan pulp, dan kulit tanduk (endokarp). Buah yang
terbentuk akan matang selama 7-12 bulan (Rahardjo, 2012).
Buah terdiri dari daging buah dan biji. Daging buah terdiri atas 3 bagian
lapisan kulit luar (eksokarp), lapisan daging (mesokarp) dan lapisan kulit tanduk
(endokarp) yang tipis tetapi keras. Buah kopi memiliki dua biji, tetapi kadang-
kadang hanya mengandung 1 butir atau bahkan tidak berbiji sama sekali. Biji ini
terdiri atas kulit biji dan endosperm. Endosperm merupakan bagian yang bisa
dimanfaatkan sebagai bahan untuk membuat minuman kopi (Najiyati dan Danarti,
2001). Biji kopi dibungkus kulit keras disebut kulit tanduk (parchment skin). Biji
mempunyai alur pada bagian datarnya (Rahardjo, 2012).

Gambar 2.3 Biji Kopi Robusta (Panggabean dalam Asti, 2015) .


12

2.4.2 Komposisi Kimia Kopi Robusta (Coffea canephora)


Komposisi kimia dari biji kopi bergantung pada spesies dan varietas dari
kopi tersebut serta faktor-faktor lain yang berpengaruh antara lain lingkungan
tempat tumbuh, tingkat kematangan dan kondisi penyimpanan (Panggabean dalam
Asti, 2015). Menurut Simanjuntak dalam Asti (2015) menyatakan bahwa biji kopi
mengandung protein, minyak aromatis, dan asam-asam organik. Pada umumnya,
biji kopi mengandung: (a) Air 48%; (b) Zat bahan kering 50 –52%; (c)
Karbohidrat 60%; (d) Karbohidrat dalam kopi dengan jenis dan kadarnya; (e)
Minyak 13% (1) Ester fistosterin, hidrokarbon, dan lilin 2%; (2) Trigliserida
81.3%; (3) Ester asam lemak 15,9%; (4) Sterol bebas 0.39% (f) Protein 13%; (g)
Asam-asam non volatil 8%; (h) Abu 4%; (i) Trigonelin 1%; (j) Kafein robusta
2,0%. Komposisi kimia dari biji dan bubuk kopi robusta dapat dilihat pada tabel
2.1.

Tabel 2.1 Komposisi kimia dari biji kopi robusta (Coffea canephora).
Komponen Konsentrasi Senyawa (%)
Mineral 4.0-4.5
Kafein 1.6-2.4
Trigonelline 0.6-0.75
Lipid 9.0-13.0
Total Asam Klorogenat 7.0-10.0
Asam Alifatik 1.5-2.0
Oligosakaridac 5.0-7.0
Total Polisakarida 37.0-47.0
Asam Amino 2.0
Protein 11.0-13.0
(Panggabean, 2011)

Senyawa-senyawa kimia pada biji kopi dapat dibedakan atas senyawa


volatil dan non volatil. Senyawa volatil adalah senyawa yang mudah menguap,
terutama jika terjadi kenaikan suhu. Senyawa volatil yang berpengaruh terhadap
13

aroma kopi antara lain golongan aldehid, keton dan alkohol. Senyawa non volatil
yang berpengaruh terhadap mutu kopi antara lain kafein, asam klorogenat,
hidrokarbonalifatik, asam, alkohol, tiol, furan, piro, piridin, quinon, fenol (asam
alifatik) dan amin aromatik (Ramanavicience dkk, 2003).
Ekstrak etanol menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi
dibandingkan ekstrak heksana karena adanya senyawa fenolik yang dapat
diekstraksi dengan pelarut yang lebih polar. Ekstrak biji kopi hijau etanol
menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi daripada ekstrak etanol biji kopi yang
dipanggang dalam spesies yang sama. Ini mungkin terkait dengan kandungan
polifenol yang lebih tinggi, terutama asam klorogenik. Asam klorogenat
merupakan komponen utama dalam biji kopi hijau yang kandungannya terkurangi
karena proses pemanggangan (Kiattisin, 2016).

2.4.3 Manfaat Biji Kopi Robusta (Coffea canephora)


Biji kopi secara alami mempunyai kandungan seperti kafein, senyawa
fenolik, trigonellin, dan asam klorogenik yang memiliki aktifitas sebagai anti
bakteri dan anti-inflamasi. Kemampuan ekstrak biji kopi robusta sebagai anti-
inflamasi yakni oleh karena kandungan yang terdapat pada biji kopi yakni kadar
kafein 2%, minyak atsiri 10-16%, asam klorogenik 6-10%, zat gula 4%, selulose
22-27%, polifenol 0,2% (Ermawati, 2015). Asam klorogenat memiliki efek
antifungi, antioksidan, anti-inflamasi dan efek antibakteri (Amiliyah et al., 2015).
Salah satu khasiat dari asam klorogenat yaitu sebagai antioksidan eksogen yang
berperan dalam mencegah kerusakan sel (Herawati dan Sukohar, 2013).
Kandungan lain yang terdapat pada ekstrak biji kopi robusta adalah adanya
polifenol dan flavonoid. Polifenol merupakan antioksidan kuat dan dapat
melindungi sel imun dari kerusakan biologis akibat radikal bebas. Polifenol
terbukti mampu mencegah peningkatan produksi sitokin inflamasi (IL-1, IL-6, IL-
8 dan TNF-α) oleh sel makrofag dan limfosit yang teraktivasi oleh radikal bebas.
Selain itu polifenol ekstrak biji kopi juga dilaporkan dapat menurunkan histamin,
bradikinin dan leukotrin yang menurunkan aktivitas sistem komplemen
(Ermawati, 2015).
14

Mekanisme flavonoid dalam menghambat proses inflamasi adalah dengan


menghambat permeabilitas kapiler, menghambat metabolisme asam arakidonat
dan sekresi enzim lisosom sel neutrofil dan sel endotel. Flavonoid memainkan
peran penting dalam mempertahankan dan meningkatkan permeabilitas resistansi
pembuluh darah kapiler. Oleh karena itu, flavonoid digunakan dalam kondisi
patologis seperti gangguan permeabilitas dinding pembuluh darah. Flavonoid
terutama bekerja pada endotel mikrovaskuler untuk mengurangi terjadinya
hipermeabilitas dan inflamasi. Beberapa flavonoid dapat menghambat pelepasan
asam arakidonat dan sekresi enzim dari membran lisosom untuk menghalangi
jalan siklooksigenase dan jalur lipoksigenase yang menghasilkan tingkat
prostaglandin dan leukotrien yang lebih rendah (mediator inflamasi) (Dewanti et
al. 2016).

2.4.4 Sitotoksisitas Kopi


Sitotoksisitas dapat diartikan sebagai tingkat kematian sel yang dapat
disebabkan oleh senyawa kimia (seperti makanan, kosmetik atau obat-obatan).
Senyawa kimia yang dapat menyebabkan kematian sel antara lain adalah ekstrak
kopi. Ekstrak kopi yang mengandung kafein cukup tinggi dapat menyebabkan
apoptosis sel epitel rongga mulut melalui mekanisme aktivasi caspase-3 (Hutomo,
et al., 2014). Apoptosis adalah bentuk kematian sel yang terpogram (programmed
cell death) yang dapat terjadi secara fisiologis maupun patologis. Apoptosis dapat
direspons secara fisologis, adaptif dan patologis. Apoptosis disebabkan oleh suatu
stimulus dengan dosis yang relatif kecil dibandingkan stimulus yang
menyebabkan nekrosis. Apoptosis merupakan proses yang normal pada
embriogenesis dan homeostasis untuk kelangsungan hidup organisme. Melalui
proses apoptosis, sel yang rusak akan dieliminasi, sedangkan sel yang masih
berfungsi baik akan dibiarkan tetap berproliferasi sehingga dapat melindungi
organisme atau tubuh dari kerusakan (Supriyadi, 2008).
Induksi dan eksekusi apoptosis melibatkan suatu sistem yang meliputi
enzim, gen pengatur dan reseptor. Di antara sistem tersebut terdapat caspase yang
terbagi dalam 2 grup, yaitu caspase inisiator (caspase-2, 8, 9, 10) dan caspase
15

eksekutor (caspase-3, 6, 7). Diantara 14 caspase yang ada, caspase-3 merupakan


faktor kunci dari eksekusi apoptosis (Hutomo, et al., 2014).
Ada 2 jalur terjadinya apoptosis yang melibatkan caspase, yaitu jalur
ekstrinsik yang terjadi bila sinyal apoptosis yang diterima death receptor cukup
kuat. Bila sinyal tidak cukup kuat, maka akan dipancarkan ke mitokondria, terjadi
pelepasan cythochrome-c yang kemudian akan mengaktifkan caspase-3 untuk
mengeksekusi apoptosis. Jalur yang kedua ini dinamakan jalur intrinsik. Caspase-
3 dapat masuk ke nukleus melalui pori-pori yang dibuat oleh caspase-9,
mengeluarkan substrat yang menyebabkan degradasi DNA. Lamin A dan fodrin
merupakan komponen skeleton nukleus dan skeleton sitosolik. Pemecahan lamin
oleh caspase-3 akan menyebabkan kondensasi kromatin, sementara pemecahan
fodrin memicu pembentukan apoptotic bodies. Pada penelitian sebelumnya
ditemukan didapatkan ekspresi caspase-3 pada sitoplasma sel cukup kuat yang
ditandai dengan warna coklat yang jelas pada sitoplasma sel, sehingga
kemungkinan besar proses apoptosis yang terjadi pada sel epitel rongga mulut
yang diinduksi ekstrak kopi ini melalui jalur ekstrinsik (Hutomo, et al., 2014).

2.5 Uji Sitotoksisitas


Uji sitotoksisitas merupakan salah satu sarana evaluasi biologi dan
screening test yang menggunakan jaringan in vitro untuk mengamati pertumbuhan
dan efek morfologi pada sel yang disebabkan oleh perlakuan medis (Li et al.,
2015). Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui efek toksik suatu bahan secara
langsung terhadap jaringan (Siregar dan Handijono, 2000). Uji ini banyak
digunakan karena sederhana, cepat dan memiliki sensitivitas yang tinggi (McGaw
et al., 2014).
Sitotoksisitas merupakan komponen utama dari biokompatibilitas.
Biokompatibilitas mengacu pada kemampuan bahan sebagai terapi medis, tanpa
menimbulkan efek lokal atau sistemik pada tubuh (Elshahawy dan Watanabe,
2014). Jadi idealnya bahan yang diletakkan dalam mulut disyaratkan tidak toksik,
tidak iritan, tidak karsinogenik dan tidak menimbulkan alergi (Nirwana et al.,
2005). Ada berbagai metode untuk menilai sitotoksisitas suatu bahan antara lain
16

uji MTT, agar overlay, filter molekul, pembebasan isotop kromium, dan metode
pewarnaan eksklusi dengan trypan blue (Siregar dan Handijono, 2000).

2.5.1 MTT
Uji MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazolium bromide)
merupakan salah satu uji sitotoksisitas yang difungsikan untuk melihat jumlah sel
yang hidup ditinjau dari aktivitas mitokondrianya (Meerlo et al., 2011). Uji MTT
didasarkan pada kemampuan sel hidup untuk mereduksi garam MTT yang
berwarna kuning menjadi formazan yang berwarna biru-ungu. Reduksi garam
tetrazolium terjadi secara intraseluler dan disebabkan adanya enzim succinic
dehidrogenase yang dihasilkan oleh mitokondria (Siregar dan Handijono, 2000).
Tujuan umum uji ini adalah untuk mengukur sel yang hidup di sumuran (96-well
plates) sehingga dapat diukur banyak sampel pada saat yang sama (Meerlo et al.,
2011). Keuntungan uji ini adalah dapat menghemat waktu, tenaga dan dana.
Keuntungan lain dari uji ini adalah tidak menggunakan isotop radioaktif, dan tidak
memerlukan transfer sel (Siregar dan Handijono, 2000).
Produk formazan yang dihasilkan dilarutkan dalam pelarut DMSO dan
diukur intensitas warnanya menggunakan spektofotometer. Pengukuran intensitas
warna dilakukan untuk selanjutnya dibaca menggunakan ELISA reader. Jumlah
formazan yang dilarutkan berbanding lurus dengan jumlah sel. Makin pekat
warnanya, makin tinggi nilai absorbansinya, dan ini berarti makin banyak jumlah
selnya (Siregar dan Handijono, 2000). Jumlah sel yang hidup dapat dideteksi
dengan mengukur konsentrasi formazan pada densitas optik (OD) dengan
menggunakan panjang gelombang yang tepat. Pengukuran absorbansi bergantung
jenis pelarut yang digunakan dan faktor kelekatan sel terhadap substrat (Siregar
dan Handijono, 2000).

2.5.2 Trypan Blue


Trypan blue adalah pewarna diazo yang banyak digunakan untuk
mewarnai jaringan mati atau sel secara selektif. Mekanisme pewarnaan trypan
blue didasarkan pada interaksinya dengan sel. Pewarna ini tidak dapat berinteraksi
17

dengan sel yang membrannya rusak. Sel yang tidak mengalami kerusakan bersifat
selektif terhadap senyawa yang melewati membrannya, dan hal inilah yang
menyebabkan sel tersebut tidak terwarnai oleh trypan blue. Sehingga dapat
disimpulkan, sel yang tidak menyerap warna, dianggap masih hidup dan tidak
rusak. Sebaliknya, sel-sel dengan membran yang rusak terwarnai dengan warna
biru yang dapat diamati di bawah mikroskop (Tran et al., 2011).

2.5.3 Tingkat Toksisitas


Data absorbansi yang didapat dari pembacaan oleh ELISA reader
kemudian dikonversi ke dalam persen viabilitas sel dengan membandingkan nilai
absorbansi kelompok perlakuan yang dipajan dengan bahan uji dengan kelompok
kontrol (CCRC, 2010).
Menurut Heravi (2013) tingkat toksisitas suatu bahan dikelompokkan
berdasarkan jumlah sel yang hidup yaitu:
a. Sel yang hidup lebih dari 90% diklasifikasikan sebagai non-toksik.
b. Sel yang hidup diantara 60% hingga 90% diklasifikasikan sebagai sedikit
toksik.
c. Sel yang hidup diantara 30% hingga 59% diklasifikasikan sebagai cukup
toksik.
d. Sel yang hidup kurang dari 30% diklasifikasikan sebagai sangat toksik.
(CCRC, 2010)
18

2.6 Peta Konsep

Pajanan logam nikel di


mukosa rongga mulut
Ekstrak kopi robusta

Pelepasan ion logam nikel


Polifenol Flavonoid

Peningkatan Antioksidan
ROS

Memodulasi Stres
respon oksidatif
(PBMC)

Homeostasis
mitokondria
sel PBMC
terganggu

Produksi ATP
menurun

Apoptosis Mencegah
PBMC apoptosis

Keterangan:
Diteliti : Uji viabilitas/toksisitas
Uji yang digunakan : MTT & Trypan Blue
Dihambat :

Mengetahui sitotoksisitas
dan konsentrasi non toksik
biji kopi robusta
19

2.8 Keterangan Peta Konsep


Adanya pajanan logam nikel di mukosa rongga mulut seperti saat
pemakaian braket dan mahkota menyebabkan pelepasan ion logam nikel yang
memodulasi respon sel-sel PBMC dan juga peningkatan ROS (Species Oxygen
Reactive). Peningkatan ROS menginduksi stress oksidatif yang mempengaruhi
sel-sel tubuh manusia, terutama sel PBMC itu sendiri. Homeostasis mitokondria
sel PBMC menjadi terganggu. Kerja mitokondria sel yang terganggu akan
menyebabkan produksi ATP sel menurun dan lama kelamaan sel akan mengalami
apoptosis. Pencegahan apoptosis pada sel PBMC diharapkan ditemukan pada
ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) yang mengandung polifenol dan
flavonoid. Kedua bahan tersebut berperan sebagai antioksidan yang mampu
mencegah apoptosis sel.

2.9 Hipotesis
Hipotesis dari penelitian ini adalah: ekstrak biji kopi robusta (Coffea
canephora) dengan konsentrasi tertentu tidak bersifat toksik terhadap PBMC yang
dipapar larutan logam nikel.
20

BAB 3. METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian


Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratoris in vitro. Penelitian
eksperimental bertujuan untuk mengungkapkan pengaruh atau suatu gejala yang
timbul akibat manipulasi tertentu (Budiharto, 2008). In vitro merupakan suatu
proses yang berlangsung diluar tubuh, diterapkan pada prosedur laboratoris
(Makfoeld dkk, 2002). Rancangan penelitian yang digunakan adalah the post test
only control group design, yaitu dengan melakukan pengukuran atau observasi
setelah perlakuan diberikan (Notoatmojo, 2005).

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian


3.2.1 Waktu Penelitian
Pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Juli 2018.
3.2.2 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di:
1. Pembuatan ekstrak biji kopi robusta dilakukan di Laboratorium
Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Jember.
2. Penelitian dilakukan di Bioscience Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Jember.

3.3 Identifikasi Variabel


3.3.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dari penelitian ini adalah ekstrak biji kopi robusta (Coffea
canephora) dan larutan logam NiCl₂.6H₂O.
3.3.2 Variabel Terikat
Variabel terikat dari penelitian ini adalah sitotoksisitas biji kopi robusta
terhadap PBMC yang dipapar logam nikel (Coffea canephora).
21

3.3.3 Variabel Terkendali


a. Konsentrasi larutan logam NiCl₂.6H₂O
b. Isolat PBMC dari pasien sehat.

3.4 Sampel Penelitian


3.4.1 Kriteria Sampel
Penelitian ini menggunakan isolat PBMC yang diperoleh dari darah vena
perifer manusia. Sampel darah ini diperoleh dari pasien sehat (tidak
mempunyai penyakit sistemik) yang telah mengisi inform consent dan
memenuhi syarat kelayakan etik pada penelitian ini.

3.4.2 Kelompok Sampel


Sampel penelitian dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan, sebagai berikut:
a) Kelompok I: PBMC dari orang sehat sebagai kelompok kontrol.
b) Kelompok II: PBMC dari orang sehat yang dipapar dengan larutan
logam NiCl₂.6H₂O konsentrasi 125 µM sebagai kelompok kontrol.
c) Kelompok III: PBMC dari orang sehat yang dipapar dengan larutan
logam NiCl₂.6H₂O konsentrasi 125 µM dan ekstrak biji kopi robusta
dengan konsentrasi 31,25 µg/ml, 62,5 µg/ml dan 125 µg/ml.

3.4.3 Besar Sampel


Besar sampel pada penelitian ini diambil menurut rumus (Daniel, 2009):
z2 σ2
n= 𝑑2

Keterangan :
n= Besar sampel tiap kelompok
σ= Standar deviasi sampel
d= Kesalahan yang masih dapat ditolerir
z= Nilai pada tingkat kesalahan tertentu, jika a= 0,05 maka z = 1,96
Pada penelitian ini nilai σ diasumsikan sama dengan nilai d (σ =
d)
22

Perhitungannya yaitu:
z2 σ2
𝑛=
𝑑2
(1,96)2 𝜎 2
𝑛= = 3,84
𝑑2
= 3,84 di bulatkan menjadi 4
Berdasarkan hasil perhitungan diatas diperoleh jumlah sampel yang
digunakan pada penelitian ini 4. Peneliti menggunakan 4 (empat) sampel
untuk setiap perlakuan.

3.5 Definisi Operasional


3.5.1 Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea canephora)
Ekstrak biji dari buah kopi robusta (Coffea canephora) merupakan
suspensi dari serbuk biji kopi robusta. Biji kopi robusta diperoleh dari perkebunan
PTPN XII Durjo Kabupaten Jember. Pembuatan ekstrak biji kopi robusta
menggunakan metode maserasi, yaitu sediaan cair yang dibuat dengan
mengencerkan bubuk biji kopi robusta dengan etanol 96%. Kemudian dilakukan
penimbangan dan pengenceran, sehingga diperoleh konsentrasi 31,25 µg/ml, 62,5
µg/ml dan 125 µg/ml.

3.5.2 PBMC
PBMC terdiri dari sel monosit (10-20%), sel T (50-70%), sel B (5-15%),
sel pembunuh alami (NK) (2-10%), dan sel dendritik. (Končarević, et al., 2014).
PBMC diisolasi dari 6 ml dari darah vena tepi dari satu pasien donor sehat
berbeda yang diketahui tidak memiliki alergi logam dengan metode Single
Filter/Lymphoprep.

3.5.3 Larutan Logam Nikel


Sebagai alergen metal, bahan kimia yang digunakan adalah larutan
NiCl₂.6H₂O. Penggunaan larutan logam nikel dikarenakan adanya data yang
menyebutkan bahwa Ni (II) pada NiCl₂ terlibat sebagai provokator inflamasi
23

(Wataha, 2013). Konsetrasi larutan logam yang digunakan adalah 125 µM yang
dilarutkan dalam Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM). Sesaat sebelum
digunakan, larutan logam dilarutkan dengan aquades (Rachmawati et al., 2013).
Penggunaan konsentrasi 125 µM dikarenakan pengobatan menggunakan
konsentrasi tersebut telah mampu menyebabkan terjadinya apoptosis pada sel
imun.

3.5.4 Uji Sitotoksisitas


Uji ini dilakukan agar diketahui apakah bahan tersebut telah memenuhi
syarat biokompatibilitas yang dapat diterima oleh tubuh atau tidak (Nirwana,
2005). Uji sitotoksisitas yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan uji
trypan blue dan MTT. Uji trypan blue didasarkan pada interaksi pewarna trypan
blue dengan sel. Sel yang tidak menyerap warna, dianggap masih hidup dan tidak
rusak (Tran et al., 2011). Sedangkan uji MTT didasarkan pada kemampuan sel
hidup untuk mereduksi garam MTT yang berwarna kuning dan larut menjadi
formazan yang berwarna biru-ungu dan tidak larut. (Siregar dan Handijono,
2000). Jumlah sel yang hidup dapat dideteksi dengan mengukur konsentrasi
formazan yang tercermin pada densitas optik (OD) dengan menggunakan
pembaca pelat 630 nm.

3.6 Alat dan Bahan


3.6.1 Alat
a. Autoclave
b. Centrifuge
c. Coverslip poli L-lysine
d. Gelas ukur
e. Hemositometer
f. Humaroller
g. Inkubator
h. Shaker Incubator
i. Laminar Flow Cabinet
24

j. Lampu spirtus
k. Microplate-24 well dan microplate-96 well
l. Mikroskop inverted
m. Object glass
n. Oven
o. Pipet mikro
p. Rak Tabung
q. Syringe 5ml
r. Tabung epondorf
s. Tabung Falcon
t. Tabung heparin
u. Neraca Timbang
v. Rotary Evaporator
w. Vortex
x. ELISA reader
y. Yellow tip dan blue tip
z. Blender

3.6.2 Bahan
a. Darah vena kapiler
b. Bubuk logam NiCl₂.6H₂O
c. Larutan Lymphorep
d. Ekstrak Biji Kopi Robusta
e. HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution)
f. RPMI (Rosewel Park Memorial Institute Media)
g. M199
h. Fungizone
i. Penicilin stepthomicin
j. Dimethylsulfoxide (Merck, Darmstadt, Germany)
k. Trypan Blue
l. Alkohol 70%
25

m. Aquades
n. MTT (3-(4,5 dimethyldiazol-2-yl)-2,5 diphenyl Tetrazolium Bromid)
o. PBS

3.7 Prosedur Penelitian


3.7.1 Ethical Clearance
Sebelum dilaksanakan penelitian, prosedur pengambilan darah pada pasien
telah disetujui oleh Komisi Etik Penelitian Kesehatan, Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Jember.

3.7.2 Sterilisasi Alat


Semua alat penelitian yang terbuat dari logam dicuci bersih kemudian
disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 121˚C. Sedangkan alat
yang terbuat dari plastik disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%.

3.7.3 Pembuatan Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea canephora)


Pembuatan ekstrak biji kopi dilakukan menggunakan biji kopi robusta
(Coffea canephora) dan dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi Fakultas
Farmasi Universitas Jember. Biji kopi yang telah dikumpulkan dibersihkan dari
pengotor, selanjutnya dicuci di bawah air mengalir sampai bersih, ditiriskan, lalu
dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Sampel yang telah kering diserbukkan
dengan menggunakan blender, serbuk yang dihasilkan diayak menggunakan
ayakan mesh 65 hingga diperoleh serbuk yang halus dan seragam. Hasilnya
dimasukkan ke dalam wadah gelas tertutup (Tanauma, et al., 2016).
Pembuatan ekstrak biji kopi robusta (Coffea canephora) dilakukan dengan
menggunakan teknik maserasi. Serbuk biji kopi robusta ditimbang sebanyak 250
gram menggunakan neraca timbang lalu dimaserasi dalam larutan etanol 96%
sebanyak 1000 ml selama 48 jam. Wadah ditutup dengan aluminium foil.
Hasil maserasi kemudian disaring dengan menggunakan corong yang
dilapisi kertas saring sehingga menghasilkan filtrat 1 dan ampas 1. Ampas 1
disaring menggunakan kertas saring menghasilkan filtrat 2 dan ampas 2. Filtrat 1
26

dan 2 digabungkan, lalu dievaporasi menggunakan rotary evaporator pada suhu


30-40˚C, sehingga diperoleh ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 100%. Ekstrak
disimpan dalam wadah gelas tertutup. Ketika akan digunakan, ekstrak diencerkan
menggunakan pelarut aquades steril.

3.7.4 Pengambilan sampel darah


a. Dilakukan pengambilan darah sebanyak 3 ml dari darah vena perifer orang
sehat dengan menggunakan syringe 3 ml.
b. Segera setelah diambil, dimasukkan dalam tabung heparin secara perlahan-
lahan dengan melewatkan pada dinding tabung agar tidak berbuih
kemudian tabung digoyangkan agar tidak menggumpal.

3.7.5 Isolasi PBMC


Teknik isolasi PBMC ini menggunakan metode Single Filter/Lymphoprep.
Isolasi sel PBMC dimulai dengan memasukkan 3 ml sampel darah pada
tabung heparin/Ka. EDTA lalu campur sampai merata secara perlahan-lahan
dengan melewatkan pada dinding tabung agar tidak berbuih menggunakan
mikropipet dan blue tip. Kemudian buat darah diluent dengan darah yang
diencerkan menggunakan garam fisiologi (HBSS/PBS pH 7.4) dengan
perbandingan 1:1, lalu dicampur sampai homogen. Selanjutnya memasukkan
diluent darah tersebut pada tabung yang sudah diisi 3 ml larutan Lymphoprep
menggunakan perbandingan Lymphoprep dengan diluent darah adalah 1:2.
Dimasukkan melalui dinding tabung secara perlahan, larutan Lymphoprep jangan
sampai pecah. Kemudian sentrifugasi pada kecepatan 700 g selama 30 menit pada
suhu 20⁰C hingga terbentuk 4 lapisan (Plasma, Mononuklear, Lymphoprep,
Polimorfonuklear eritrosit). Lalu pipet lapisan ke 2 Mononuklear (cincin kabut)
secara hati-hati dan masukkan pada tabung steril, kemudian mengencerkan sampel
Mononuklear menggunakan PBS/HBSS (1:1), lalu homogenkan. Selanjutnya
disentrifugasi dengan kecepatan 700 g selama 3 menit dengan suhu 20⁰C, lakukan
sebanyak 3 kali pengulangan. Kemudian tambahkan 1 ml HBSS/PBS pH 7,4 pada
Supernatan yang didapat dan homogenkan. Lalu tambahkan 5µl fungizone dan 20
27

µl Penicilin stepthomicin kemudian didapatkan 2 lapisan, yaitu lapisan supernatan


(PBS dan sisa plasma) pada bagian atas serta PBMC pada bagian bawah.
Supernatan dibuang dan disisakan lapisan PBMC.

3.7.6 Prosedur Penempelan Sel


Siapkan 24-well plate culture dan 96-well plate culture. Pada 24-well
culture, letakkan coverslip pada masing-masing well. Masukkan 100 µl suspense
sel. Inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37⁰C selama 10 menit. Amati di bawah
mikroskop inverted sembari menggoyang perlahan sehingga dapat dilihat
penempelan selnya. Cuci dengan RPMI sebanyak 3 kali dengan tujuan
menghilangkan kontaminasi pada sel. Amati kembali dibawah mikroskop
inverted. Setelah itu ganti media kultur dengan M199. Sel yang siap diberi
perlakuan ditambahkan RPMI sebanyak 500 µl.

3.7.7 Inkubasi PBMC dengan Logam Nikel


500 µl sel pada 24-well plate culture yang telah ditambahkan media
kultur, ditambahkan 500 µl larutan logam NiCl₂.6H₂O konsentrasi 125 µM. Sel
diinkubasi pada suhu 37⁰C di 5% kelembapan CO₂ selama 60 menit sebelum
dilakukan uji trypan blue. Sedangkan, pada 96-well plate culture, 100 µl dari
PBMC (5x10⁴) dipaparkan dengan 100 µl larutan logam NiCl₂.6H₂O konsentrasi
125 µM. Selanjutnya, sel diinkubasi pada suhu 37⁰C di 5% kelembapan CO₂
selama 24 jam sebelum dilakukan uji toksisitas MTT (Rachmawati et al., 2013).

3.7.8 Inkubasi PBMC dengan Logam Nikel dan Ekstrak Biji Kopi Robusta
500 µl sel pada 24-well plate culture yang telah ditambahkan media
kultur, ditambahkan 500 µl larutan logam NiCl₂.6H₂O konsentrasi 125 µM. Sel
diinkubasi pada suhu 37⁰C di 5% kelembapan CO₂ selama 30 menit. Siapkan
stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 500 µg/ml. Setelah itu
dilakukan perlakuan menggunakan larutan ekstrak biji kopi robusta dengan
penjabaran sebagai berikut:
28

1. Kelompok perlakuan 1 (P1) buang 125 µl sel pada 24-well plate


culture yang telah ditambahkan larutan logam NiCl₂.6H₂O, lalu
tambahkan 125 µl stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi
500 µg/ml untuk mendapatkan konsentrasi NiCl₂.6H₂O 125 µM dan
konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 125 µg/ml.
2. Kelompok perlakuan 2 (P2) buang 62,5 µl sel pada 24-well plate
culture yang telah ditambahkan larutan logam NiCl₂.6H₂O, lalu
tambahkan 62,5 µl stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi
500 µg/ml untuk mendapatkan konsentrasi NiCl₂.6H₂O 125 µM dan
konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 62,5 µg/ml.
3. Kelompok perlakuan 3 (P3) buang 31,25 µl sel pada 24-well plate
culture yang telah ditambahkan larutan logam NiCl₂.6H₂O, lalu
tambahkan 31,25 µl stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi
500 µg/ml untuk mendapatkan konsentrasi NiCl₂.6H₂O 125 µM dan
konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 31,25 µg/ml.
Selanjutnya, sel diinkubasi pada suhu 37⁰C di 5% kelembapan CO₂ selama 30
menit.
Pada 96-well plate culture, sekitar 100 µl dari PBMC (5x10⁴) yang telah
ditambahkan media kultur, ditambahkan 100 µl larutan logam NiCl₂.6H₂O
konsentrasi 125 µM. Sel diinkubasi pada suhu 37⁰C di 5% kelembapan CO₂
selama 30 menit. Siapkan stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 500
µg/ml. Setelah itu dilakukan perlakuan menggunakan larutan ekstrak biji kopi
robusta dengan penjabaran sebagai berikut:
1. Kelompok perlakuan 1 (P1) buang 40 µl sel pada 24-well plate
culture yang telah ditambahkan larutan logam NiCl₂.6H₂O, lalu
tambahkan 40 µl stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 500
µg/ml untuk mendapatkan konsentrasi NiCl₂.6H₂O 125 µM dan
konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 125 µg/ml.
2. Kelompok perlakuan 2 (P2) buang 20 µl sel pada 24-well plate
culture yang telah ditambahkan larutan logam NiCl₂.6H₂O, lalu
tambahkan 20 µl stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 500
29

µg/ml untuk mendapatkan konsentrasi NiCl₂.6H₂O 125 µM dan


konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 62,5 µg/ml.
3. Kelompok perlakuan 3 (P3) buang 10 µl sel pada 24-well plate
culture yang telah ditambahkan larutan logam NiCl₂.6H₂O, lalu
tambahkan 10 µl stok larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 500
µg/ml untuk mendapatkan konsentrasi NiCl₂.6H₂O 125 µM dan
konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 31,25 µg/ml.
Selanjutnya sel diinkubasi pada suhu 37⁰C di 5% kelembapan CO₂
selama 24 jam sebelum dilakukan uji toksisitas MTT.

3.7.9 Uji Sitotoksitas dengan MTT


Sel diinkubasi dengan inkubator CO₂ pada suhu 37⁰ selama 24 jam.
Inkubasi ini bertujuan agar sel dapat beradaptasi dan menempel pada dinding
maupun dasar sumuran. Setelah inkubasi, media kultur dibuang dan sel dicuci
dengan 50 ml larutan MTT 5mg/ml ke dalam tiap sumuran. Sel diinkubasi
kembali selama 4 jam dalam inkubator CO₂ 5% pada suhu 37⁰. MTT dihentikan
dengan stopper reagent (SDS 10% dalam 0,1 N HCl) lalu plate diletakkan diatas
plateshaker selama 10 menit agar kristal formazan terlarut. Bungkus plate dengan
kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap pada temperatur
kamar selama satu jam. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing
hingga selesai. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam
ELISA reader. Larutan diukur dengan pembacaan ELISA dengan optical density
(OD 630 nm. Sel tanpa dipapar logam dianggap 100% (CCRC, 2010).

3.7.10 Uji Sitotoksitas dengan Trypan Blue


Setelah perlakuan, kemudian isolat PBMC dicuci dua kali dengan HBSS.
Satu persatu sumuran kemudian diberi trypan blue 50 µl diratakan memenuhi
cover slip dan inkubasi selama 1 menit. Segera setelah itu, dilakukan pemotretan
(di bawah mikroskop inverted). PBMC yang tidak menyerap pewarnaan trypan
blue dihitung sebagai sel PBMC yang hidup.
30

3.7.11 Pengamatan Hasil


Persentase viabilitas sel yang diuji dengan uji MTT, dihitung
menggunakan persamaan berikut (CCRC, 2010)
% Viabilitas sel = Absorbansi sel setelah perlakuan-Absorbansi media x 100
Absorbansi sel-Absorbansi media
Keterangan:
%Viabilitas sel : Persentase jumlah kehidupan sel setelah diuji
Absorbansi tes : Nilai Optical Density (OD) formazan setiap sampel
setelah uji
Absorbansi media : Nilai OD formazan pada rata-rata setiap kontrol media.
Absorbansi sel : Nilai OD formazan pada rata-rata kontrol sel.

Persentase viabilitas PBMC yang diuji dengan uji trypan blue, dihitung
menggunakan rumus:
Viabilitas PBMC (%) = Jumlah PBMC yang viable x 100
Jumlah PBMC seluruhnya

3.8 Analisis Data


Data hasil penelitian dilakukan uji normalitas Kolmogorv-smirnov
dengan (p≥0,05) dan uji homogenitas dengan uji Levene-test dengan (p≥0,05).
Data yang terdistribusi normal dan homogen, analisis data dilanjutkan dengan uji
statistik parametrik dengan uji analisa varian dua arah (One way ANOVA dengan
p≤0,05) menggunakan aplikasi SPSS. Data yang diketahui memiliki perbedaan
antar kelompok diuji dengan uji Least Significant Different (LSD) untuk
mengetahui kemaknaan perbedaan antar uji sampel. Apabila data yang dihasilkan
tidak terdistribusi secara normal dan homogeny maka dilakukan uji non
parametrik Kruskal Wallis kemudian dilanjutkan dengan uji Mann Whitney.
31

3.9 Alur Penelitian


3 Persiapan sampel:

1. Pembuatan ekstrak biji kopi robusta 31,25 µg/ml, 62,5 µg/ml dan 125
µg/ml
2. Pembuatan larutan logam nikel dengan konsentrasi 125 µM
3. Isolasi PBMC

Kelompok I Kelompok II Kelompok III


sebagai sebagai kontrol PBMC + logam
kontrol negatif positif NiCl2 dengan
PBMC + media PBMC + logam konsentrasi 125
kultur NiCl2 dengan µM + ekstrak kopi
konsentrasi 125 robusta konsentrasi
µM 31,25 µg/ml, 62,5
µg/ml dan 125
µg/ml

Diinkubasi pada suhu 37⁰C di


5% kelembapan CO₂ selama
24 jam

Uji MTT dan


Trypan Blue
32

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Peneliti telah melakukan penelitian dengan menggunakan dua uji yaitu uji
viabilitas trypan blue serta uji sitotoksisitas MTT (3-[4,5 dimethylthiazol-2-yl] –
2,5 diphenyl tetrazolium bromide). Uji viabilitas trypan blue dapat mengindikasi
ada tidaknya sel yang mati dengan melihat perubahan warna sel setelah pemberian
trypan blue. Sel yang tidak menyerap warna, dianggap masih hidup dan tidak
rusak. Sebaliknya, sel-sel dengan membran yang rusak terwarnai dengan warna
biru yang dapat diamati di bawah mikroskop (Tran et al., 2011)

Gambar 4.1 Sel yang masih hidup dan tidak terwarnai trypan blue, ditunjukkan dengan
anak panah.

Pada penelitian ini, peneliti menggunakan larutan NiCl2.6H2O konsentrasi


125 µM dan larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 125 µg/ml, 62,5 µg/ml
dan 31,25 µg/ml.
33

1 2
\

3 4
Gambar 4.2 Kondisi sel dengan pewarnaan trypan blue setelah pemberian larutan NiCl2.6H2O
konsentrasi 125 µM (gambar 1) yang setelah itu dilanjutkan pemberian larutan ekstrak biji kopi
robusta konsentrasi 125 µg/ml (gambar 2), 62,5 µg/ml (gambar 3) dan 31,25 µg/ml (gambar 4)

Pada penelitian ini, prosentase jumlah PBMC yang hidup dan tidak
terwarnai oleh trypan blue setelah tanpa adanya perlakuan, setelah pemberian
perlakuan larutan logam nikel konsentrasi 125 µM dan setelah pemberian
perlakuan larutan logam nikel konsentrasi 125 µM serta larutan ekstrak biji kopi
robusta dengan berbagai konsentrasi ditunjukkan pada tabel dibawah ini.

Tabel 4.1 Hasil Prosentase Sel Hidup dengan Uji Trypan Blue
Perlakuan N Median Mean Standar Deviasi
Tidak diberi perlakuan 4 94,60% 94,62% 0.44930
Larutan nikel 125 µM 4 83,50% 83,44% 0.14841
Larutan nikel 125 µM dan larutan 4 85,99% 85,79% 0.32887
ekstrak biji kopi robusta 125 µg/ml
34

Larutan nikel 125 µM dan larutan 4 87,22% 87,19% 0.20116


ekstrak biji kopi robusta 62,5
µg/ml
Larutan nikel 125 µM dan larutan 4 90,60% 90,49% 0.52428
ekstrak biji kopi robusta 31,25
µg/ml

Prosentase Sel Hidup dengan Uji Trypan Blue

96
94
92
Viabilitas Sel (%)

90
88
86
84
82
80
78
76
Normal Nikel Nikel+Kopi Nikel+Kopi Nikel+Kopi
125 62,5 31,25
Perlakuan

Gambar 4.3 Histogram prosentase sel hidup dengan uji trypan blue

Keterangan:
Normal : sel PBMC + kultur media
Nikel : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM
Nikel+Kopi 125 : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM + larutan
ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 125 µg/ml
Nikel+Kopi 62,5 : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM + larutan
ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 62.5 µg/ml
Nikel + Kopi 31,25 : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM + larutan
ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 31.25 µg/ml
35

Berdasarkan keterangan dari tabel dan gambar dari penelitian di atas,


didapatkan bila nilai prosentase viabilitas sel tertinggi adalah pada kelompok
kontrol yaitu PBMC + kultur media. Selanjutnya prosentase viabilitas tertinggi
kedua adalah kelompok PBMC yang telah dipapar larutan logam nikel konsentrasi
125 µM dan diberi larutan kopi konsentrasi 31.25 µg/ml. Prosentase viabilitas
terendah ada pada kelompok PBMC dengan paparan larutan ekstrak biji kopi
robusta konsentrasi 125 µM.
Setelah didapatkan hasil dari penelitian, selanjutnya dilakukan analisis
data. Untuk uji normalitas menggunakan Kolmogorov-smirnov, sedangkan untuk
uji homogenitas menggunakan Levene-test. Tujuan penggunaan uji normalitas
Kolmogorov-smirnov adalah untuk mengetahui apakah data yang dihasilkan dari
penelitian terdistribusi normal atau tidak.

Tabel 4.2 Hasil Uji Normalitas Kolmogorov-smirnov


Kelompok % Viabilitas
N 20 20
Mean 2.00 88.3070
Std. Deviation 1.451 4.00890
Absolute .155 .188
Positive .155 .188
Negative -.155 -.125
Test Statistic .155 .188
Asymp. Sig. (2-tailed) .200c,d .063c

Berdasarkan tabel 4.2 dapat dilihat bahwa nilai signifikasi yang diperoleh
yaitu lebih besar dari 0,05 yaitu 0,063 sehingga dapat disimpulkan bahwa data
masing-masing kelompok sudah terdistribusi normal. Setelah data diketahui
terdistribusi secara normal maka dilanjutkan uji homogenitas menggunakan uji
Levene-test untuk mengetahui apakah setiap varian kelompok populasi penelitian
ini sama atau homogen.
36

Tabel 4.3 Hasil Uji Homogenitas Levene-test

Levene Statistic df1 df2 Sig.


.749 4 15 .574

Hasil uji homogenitas pada tabel 4.3 dapat dilihat bahwa nilai signifikasi
yang didapat menunjukkan nilai yang lebih dari 0,05 yaitu 0,574. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa hasil data tersebut adalah homogen dan telah memenuhi
syarat untuk uji statistik parametrik. Selanjutnya untuk mengetahui ada tidaknya
perbedaan sitotoksisitas ekstrak biji kopi robusta pada PBMC yang dipapar logam
nikel, maka dilakukan uji parametrik One Way Anova.

Tabel 4.4 Hasil Uji Parametrik One Way Anova


Sum of Squares Df Mean Square F Sig.
Between Groups 303.413 4 75.853 585.845 .000

Within Groups 1.942 15 .129


Total 305.355 19

Berdasarkan pada tabel 4.4, uji One Way Anova menunjukkan nilai
signifikasi lebih kecil dari 0,05 yaitu 0,000. Dari hasil tersebut dapat diketahui
masing-masing kelompok perlakuan memiliki perbedaan yang signifikan.
Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan kemaknaan pada masing-masing
kelompok (kelompok kontrol dan kelompok perlakuan) maka dilakukan uji LSD
(Least Significance Difference), yang hasilnya dijabarkan di bawah ini.

Tabel 4.5 Hasil Uji LSD (Least Significance Difference)


95% Confidence
Mean Interval
(I) Difference Std. Lower Upper
Kelompok (J) Kelompok (I-J) Error Sig. Bound Bound
*
Normal Nikel 11.17750 .25444 .000 10.6352 11.7198
Nikel+Kopi 125 8.82750* .25444 .000 8.2852 9.3698
Nikel+Kopi 62.5 7.43000* .25444 .000 6.8877 7.9723
37

Nikel+Kopi 31.25 4.13000* .25444 .000 3.5877 4.6723


Nikel Normal -11.17750* .25444 .000 -11.7198 -10.6352
Nikel+Kopi 125 -2.35000* .25444 .000 -2.8923 -1.8077
Nikel+Kopi 62.5 -3.74750* .25444 .000 -4.2898 -3.2052
*
Nikel+Kopi 31.25 -7.04750 .25444 .000 -7.5898 -6.5052
Nikel+ Normal -8.82750* .25444 .000 -9.3698 -8.2852
Kopi 125 Nikel 2.35000* .25444 .000 1.8077 2.8923
Nikel+Kopi 62.5 -1.39750* .25444 .000 -1.9398 -.8552
Nikel+Kopi 31.25 -4.69750* .25444 .000 -5.2398 -4.1552
Nikel+ Normal -7.43000* .25444 .000 -7.9723 -6.8877
Kopi 62.5 Nikel 3.74750* .25444 .000 3.2052 4.2898
Nikel+Kopi 125 1.39750* .25444 .000 .8552 1.9398
Nikel+Kopi 31.25 -3.30000* .25444 .000 -3.8423 -2.7577
Nikel+ Normal -4.13000* .25444 .000 -4.6723 -3.5877
Kopi Nikel 7.04750* .25444 .000 6.5052 7.5898
31.25 Nikel+Kopi 125 4.69750* .25444 .000 4.1552 5.2398
Nikel+Kopi 62.5 3.30000* .25444 .000 2.7577 3.8423

Dari hasil uji LSD (Least Significance Difference) seperti yang


digambarkan di atas, didapatkan beberapa kelompok yang memiliki perbedaan
bermakna maupun tidak. Adanya perbedaan bermakna bila didapatkan signifikasi
kurang dari 0,05 (α < 0,05). Sedangkan tidak adanya perbedaan bermakna bila
didapatkan signifasi lebih dari 0,05 (α < 0,05).
Selanjutnya dilakukan uji MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5
diphenyl tetrazolium bromide) untuk melihat sel yang hidup pada 96-well plates.
Prinsip uji MTT adalah untuk melihat jumlah sel yang hidup ditinjau dari aktivitas
mitokondrianya yang konstan dan meningkat atau terjadi penurunan jumlah sel
hidup yang secara linear juga berhubungan dengan aktivitas mitokondria (Meerlo
et al., 2011). Uji MTT didasarkan pada kemampuan sel hidup untuk mereduksi
garam MTT yang berwarna kuning dan larut menjadi formazan yang berwarna
biru-ungu dan tidak larut. Reduksi garam tetrazolium terjadi secara intraseluler
dan berhubungan dengan adanya enzim succinic dehidrogenase yang dihasilkan
oleh mitokondria (Siregar dan Handijono, 2000). Hal ini menyebabkan terjadinya
38

kenaikan atau penurunan jumlah sel yang hidup. Jumlah sel yang hidup dapat
dideteksi dengan mengukur konsentrasi formazan yang tercermin pada densitas
optik (OD). Densitas optik yang digunakan saat pembacaan ELISA Reader pada
penelitian ini adalah 630 nm.
Pada penelitian ini, prosentase jumlah sel yang hidup dan tidak setelah
dilakukan uji MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazolium
bromide) ditunjukkan pada tabel di bawah ini.

Tabel 4.2 Hasil Prosentase Sel Hidup dengan Uji MTT


Perlakuan N Median Mean Standar Deviasi
Tanpa perlakuan 4 100% 100% 0
Larutan nikel 125 µM 4 83,88% 84,65% 9,05

Larutan nikel 125 µM dan 4 86,43% 86,65% 8,69


larutan ekstrak biji kopi
robusta 125 µg/ml
Larutan nikel 125 µM dan 4 94,33% 94,93% 1,78
larutan ekstrak biji kopi
robusta 62,5 µg/ml
Larutan nikel 125 µM dan 4 98,43% 98,48% 0,19
larutan ekstrak biji kopi
robusta 31,25 µg/ml
39

Prosentase Sel Hidup dengan Uji MTT

100

95
Viabilitas Sel (%)

90

85

80

75
Normal Nikel Nikel+Kopi Nikel+Kopi Nikel+Kopi
125 62,5 31,25
Perlakuan

Gambar 4.4 Histogram Prosentase Sel Hidup dengan Uji MTT


Keterangan:
Normal : Tanpa perlakuan
Nikel 125 : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM
Nikel 125+Kopi 125 : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM + larutan
ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 125 µg/ml
Nikel 125+Kopi 62,5 : sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM + larutan
ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 62.5 µg/ml
Nikel 125+Kopi 31,25: sel PBMC + larutan nikel konsentrasi 125 µM + larutan
ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 31.25 µg/ml

Berdasarkan keterangan dari tabel dan gambar dari penelitian kedua di


atas, didapatkan bila nilai prosentase viabilitas sel terendah adalah pada kelompok
1 yaitu sel PBMC yang telah dipapar larutan logam nikel konsentrasi 125 µM.
Selanjutnya prosentase viabilitas tertinggi adalah kelompok 4 yaitu sel PBMC
yang telah dipapar larutan logam nikel konsentrasi 125 µM dan diberi larutan kopi
konsentrasi 31.25 µg/ml.
Setelah didapatkan hasil dari penelitian, selanjutnya dilakukan analisis
data. Untuk uji normalitas menggunakan Kolmogorov-smirnov, sedangkan untuk
uji homogenitas menggunakan Levene-test. Tujuan penggunaan uji normalitas
40

Kolmogorov-smirnov adalah untuk mengetahui apakah data yang dihasilkan dari


penelitian terdistribusi normal atau tidak.

Tabel 4.6 Hasil Uji Normalitas Kolmogorov-smirnov


Kelompok % Viabilitas
N 20 20
Normal Parametersa,b Mean 2.00 92.9405
Std. Deviation 1.451 8.12233
Most Extreme Differences Absolute .155 .230
Positive .155 .192
Negative -.155 -.230
Test Statistic .155 .230
Asymp. Sig. (2-tailed) .200c,d .007c

Berdasarkan tabel 4.6 dapat dilihat bahwa nilai signifikasi yang diperoleh
yaitu kurang dari dari 0,05 yaitu 0,007 sehingga dapat disimpulkan bahwa data
masing-masing kelompok belum terdistribusi normal. Dilanjutkan uji
homogenitas menggunakan uji Levene-test untuk mengetahui apakah setiap varian
kelompok populasi penelitian ini sama atau homogen.

Tabel 4.7 Hasil Uji Homogenitas Levene-test

Levene Statistic df1 df2 Sig.


4.654 4 15 .012

Hasil uji homogenitas pada tabel 4.7 dapat dilihat bahwa nilai signifikasi
yang didapat menunjukkan nilai yang kurang dari 0,05 yaitu 0,012. Sehingga
dapat disimpulkan bahwa hasil data tersebut adalah belum homogen dan belum
memenuhi syarat untuk uji statistik parametrik. Untuk memenuhi syarat,
dilakukan uji statistik lanjutan yaitu uji Kruskal Wallis.
41

Tabel 4.8 Hasil Uji Kruskall Wallis


% Viabilitas
Chi-Square 15.863
Df 4
Asymp. Sig. .003

Setelah dilakukan uji kruskall wallis, didapatkan nilai signifikasi kurang


dari 0,05 yaitu 0,003. Selanjutnya untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan
sitotoksisitas ekstrak biji kopi robusta pada PBMC yang dipapar logam nikel,
maka dilakukan uji parametrik One Way Anova.

Tabel 4.9 Hasil Uji Parametrik One Way Anova


Sum of
Squares Df Mean Square F Sig.
Between Groups 771.315 4 192.829 5.999 .004
Within Groups 482.157 15 32.144
Total 1253.472 19

Berdasarkan pada tabel 4.9, uji One Way Anova menunjukkan nilai
signifikasi lebih kecil dari 0,05 yaitu 0,004. Dari hasil tersebut dapat diketahui
masing-masing kelompok perlakuan memiliki perbedaan yang signifikan.
Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan kemaknaan pada masing-masing
kelompok (kelompok kontrol dan kelompok perlakuan) maka dilakukan uji LSD
(Least Significance Difference), yang hasilnya dijabarkan di bawah ini.

Tabel 4.10 Hasil Uji LSD (Least Significance Difference)


42

95% Confidence
Mean Interval
Difference Std. Lower Upper
(I) Kelompok (J) Kelompok (I-J) Error Sig. Bound Bound
Kontrol Nikel 15.35250* 4.00898 .002 6.8076 23.8974
Konsentrasi 125 % 13.35250* 4.00898 .005 4.8076 21.8974
Konsentrasi 62.5 % 5.07000 4.00898 .225 -3.4749 13.6149
Konsentrasi 31.25 % 1.52250 4.00898 .709 -7.0224 10.0674
Nikel Kontrol -15.35250* 4.00898 .002 -23.8974 -6.8076
Konsentrasi 125 % -2.00000 4.00898 .625 -10.5449 6.5449
Konsentrasi 62.5 % -10.28250* 4.00898 .022 -18.8274 -1.7376
Konsentrasi 31.25 % -13.83000* 4.00898 .004 -22.3749 -5.2851
Konsentrasi Kontrol -13.35250* 4.00898 .005 -21.8974 -4.8076
125 % Nikel 2.00000 4.00898 .625 -6.5449 10.5449
Konsentrasi 62.5 % -8.28250 4.00898 .057 -16.8274 .2624
Konsentrasi 31.25 % -11.83000* 4.00898 .010 -20.3749 -3.2851
Konsentrasi Kontrol -5.07000 4.00898 .225 -13.6149 3.4749
62.5 % Nikel 10.28250* 4.00898 .022 1.7376 18.8274
Konsentrasi 125 % 8.28250 4.00898 .057 -.2624 16.8274
Konsentrasi 31.25 % -3.54750 4.00898 .390 -12.0924 4.9974
Konsentrasi Kontrol -1.52250 4.00898 .709 -10.0674 7.0224
31.25 % Nikel 13.83000* 4.00898 .004 5.2851 22.3749
Konsentrasi 125 % 11.83000* 4.00898 .010 3.2851 20.3749
Konsentrasi 62.5 % 3.54750 4.00898 .390 -4.9974 12.0924

Dari hasil uji LSD (Least Significance Difference) seperti yang


digambarkan di atas, didapatkan beberapa kelompok yang memiliki perbedaan
bermakna maupun tidak. Adanya perbedaan bermakna bila didapatkan signifikasi
kurang dari 0,05 (α < 0,05). Sedangkan tidak adanya perbedaan bermakna bila
didapatkan signifasi lebih dari 0,05 (α < 0,05).

4.2 Pembahasan
Penelitian ini melibatkan sel-sel PBMC dimana sel PBMC merupakan
bagian dari sel-sel darah yang beinti bulat. PBMC terdiri dari sel monosit (10-
20%), sel T (50-70%), sel B (5-15%), sel pembunuh alami (NK) (2-10%), dan sel
dendritik. PBMC memainkan peranan penting dalam sistem kekebalan tubuh dan
43

terjadinya inflamasi (Končarević, et al., 2014). Penggunaan nikel (NiCl2.6H2O)


dalam penelitian adalah sebagai reaktor terjadinya kerusakan sel, karena sifat
nikel yang reaktif dan dapat memicu terjadinya kematian sel. Ekstrak biji kopi
robusta, digunakan sebagai bahan yang diharapkan dapat mencegah kematian sel,
karena sebagian literatur menyebutkan ekstrak biji kopi robusta mengandung
beberapa bahan yang berperan sebagai antioksidan sehingga bermanfaat dalam
melindungi sel dari kematian.
Peneliti menggunakan dua uji sitotoksisitas, yaitu uji trypan blue dan yang
kedua uji MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazolium bromide).
Uji sitotoksisitas digunakan untuk mendeteksi sel-sel yang mati, terlepas dari
bagaimana mekanisme kematian sel tersebut (Roche Diagnostic, 2008). Tujuan uji
ini adalah untuk mengetahui efek toksik suatu bahan secara langsung terhadap
kultur jaringan. Prinsip uji trypan blue didasarkan didasarkan pada interaksinya
dengan sel. Sel yang tidak menyerap warna biru dari trypan blue, dianggap masih
hidup dan tidak rusak. Sebaliknya, sel-sel dengan membran yang rusak terwarnai
dengan warna biru yang dapat diamati di bawah mikroskop (Tran et al., 2011).
Sedangkan prinsip uji MTT adalah untuk melihat jumlah sel yang hidup ditinjau
dari aktivitas mitokondrianya yang konstan dan meningkat atau terjadi penurunan
jumlah sel hidup yang secara linear juga berhubungan dengan aktivitas
mitokondria (Meerlo et al., 2011). Uji MTT didasarkan pada kemampuan sel
hidup untuk mereduksi garam MTT yang berwarna kuning dan larut menjadi
formazan yang berwarna biru-ungu dan tidak larut. Reduksi garam tetrazolium
terjadi secara intraseluler dan berhubungan dengan adanya enzim succinic
dehidrogenase yang dihasilkan oleh mitokondria (Siregar dan Handijono, 2000).
Peneliti melakukan penelitian menggunakan larutan nikel (NiCl2.6H2O)
konsentrasi 125 µM serta larutan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 125 µg/ml,
62,5 µg/ml dan 31,25 µg/ml. Setelah dilakukan uji trypan blue didapatkan hasil
bila penggunaan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 125 µg/ml prosentase sel
yang hidup yaitu 85,95%, konsentrasi 62,5 µg/ml prosentase sel yang hidup
93,1% dan konsentrasi 31,25 µg/ml prosentase sel yang hidup 94,96%. Tingkat
toksisitas suatu bahan berdasarkan jumlah sel yang hidup menurut Heravi (2013),
44

dikelompokkan dalam empat kelompok, dimana sel yang hidup lebih dari 90%
diklasifikasikan sebagai non-toksik dan sel yang hidup diantara 60% hingga 90%
diklasifikasikan sebagai sedikit toksik. Sedangkan sel yang hidup diantara 30%
hingga 59% diklasifikasikan sebagai cukup toksik dan sel yang hidup kurang dari
30% diklasifikasikan sebagai sangat toksik. Dari pengelompokkan tersebut,
didapatkan bila penggunaan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 62,5 µg/ml dan
31,25 µg/ml tidak menyebabkan toksisitas pada sel PBMC namun pada
konsentrasi 125 µg/ml bersifat sedikit toksik.
Hasil yang didapatkan dari uji MTT tidak berbeda jauh dengan uji trypan
blue, dimana prosentase sel PBMC yang hidup setelah pemberian ekstrak biji kopi
robusta konsentrasi 125 µg/ml adalah 86,65%, pemberian ekstrak biji kopi robusta
konsentrasi 62,5 µg/ml didapatkan prosentase sel yang hidup 94,93% dan terakhir
pemberian ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 31,25 µg/ml didapatkan
prosentase sel yang hidup 98,47%. Berdasarkan tingkat toksisitas dari penggunaan
ekstrak biji kopi robusta dengan beragam konsentrasi, didapatkan bila penggunaan
penggunaan ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 62,5 µg/ml dan 31,25 µg/ml
tidak menyebabkan toksisitas pada sel PBMC namun pada konsentrasi 125 µg/ml
bersifat sedikit toksik.
Baik dari uji trypan blue dan uji MTT didapatkan hasil viabilitas sel
terburuk adalah pada kelompok sel PBMC yang hanya dipapar larutan logam
nikel (NiCl2.6H2O) tanpa pemberian ekstrak biji kopi robusta. Nikel
mempengaruhi viabilitas sel karena sifatnya yang reaktif. Ion Ni (II) mempunyai
orbital d yang belum terisi penuh oleh elektron, yang menyebabkannya mudah
membentuk senyawa kompleks (King dalam Christianti, 2012). Selain itu, nikel
dapat menyebabk an terjadinya reaksi oksidasi dalam bentuk +2 (Ni(II)Cl2),
sehingga kadar ion klorida yang tinggi tersebut menyebabkan mudah terlepasnya
ion tersebut di lingkungan rongga mulut (Wataha, et al., 2013).
Ion logam yang telah menjadi reaktif tersebut bergabung dengan protein
dan bentuk dari hapten yang akan dikenal oleh sel T (Hosoki dan Nishigawa,
2011). Fase sensitisasi logam ini dimulai setelah adanya paparan nikel pada kulit
45

tubuh manusia. Ion logam nikel merangsang respon sistem imun non-spesifik
melalui ikatan antigen logam dengan reseptor TLR4 (Rachmawati, 2013).
Penelitian sebelumnya menyebutkan, apoptosis atau kematian sel yang
diinduksi logam nikel melibatkan sel B juga utamanya pada sel limfosit dan
neutrofil manusia. Dilaporkan adanya perubahan fragmentasi DNA pada ovarium
hamster China setelah diinduksi sel nikel dengan konsentrasi ≥ 160 μM dan
intensitasnya meningkat sebanding dengan peningkatan konsentrasi Ni (II). Nikel
menginduksi apoptosis melalui pembentukan ROS (Reactive oxygen species).
ROS menginduksi apoptosis dengan merusak mitokondria atau mengganggu
siklus sel di sel HeLa (Guo et al., 2016).
Viabilitas sel terbaik didapatkan pada penggunaan ekstrak biji kopi robusta
konsentrasi 31,25 µg/ml. Jumlah sel yang hidup setelah pemberian ekstrak biji
kopi robusta meningkat dibandingkan sel yang hanya dipapar logam nikel
(NiCl2.6H2O) saja. Ini membuktikan bila penggunaan ekstrak biji kopi robusta
efektif berperan dalam menghentikan kematian sel PBMC. Ekstrak biji kopi
robusta diyakini memiliki kandungan polifenol yang merupakan antioksidan kuat
dan dapat melindungi sel imun dari kerusakan biologis akibat radikal bebas.
Polifenol terbukti mampu mencegah peningkatan produksi sitokin inflamasi (IL-1,
IL-6, IL-8 dan TNF-α) oleh sel makrofag dan limfosit yang teraktivasi oleh
radikal bebas. Selain itu polifenol ekstrak biji kopi juga dilaporkan dapat
menurunkan histamin, bradikinin dan leukotrin yang menurunkan aktivitas sistem
komplemen (Ermawati, 2015).
Pemberian dosis ekstrak biji kopi robusta yang tepat akan memberikan
perlindungan yang tepat bagi sel imun manusia. Pemberian dosis ekstrak biji kopi
robusta yang tidak tepat akan menyebabkan sitotoksisitas pada sel. Pemberian
konsentrasi ekstrak biji kopi robusta yang aman diterima oleh tubuh terutama sel
PBMC yang telah dipapar logam nikel (NiCl2.6H2O) ada pada konsentrasi 31,25
µg/ml dan 62,5 µg/ml. Maksimal konsentrasi non-toksik yang dapat digunakan
adalah pada konsentrasi ekstrak biji kopi robusta 62,5 µg/ml dengan prosentase
kematian sel hanya 93,1% menggunakan uji trypan blue dan 94,93%
menggunakan uji MTT. Sitotoksisitas sel menunjukkan kondisi faktor-faktor yang
46

dapat membunuh sel dikarenakan senyawa kimia, termasuk didalamnya ekstrak


biji kopi robusta bila tidak diberikan dalam dosis yang sesuai (Roche Diagnostic,
2008). Seperti diketahui, ekstrak kopi yang mengandung kafein cukup tinggi
dapat menyebabkan apoptosis sel epitel rongga mulut melalui mekanisme aktivasi
caspase-3 (Hutomo, et al., 2014).
Prosentase viabilitas sel setelah dilakukan uji trypan blue serta MTT,
didapatkan hasil yang serupa, namun diketahui prosentase sel yang mati lebih
besar ditemukan pada uji trypan blue. Waktu inkubasi sel yang telah diberi bahan
trypan blue berpengaruh terhadap hasil dari uji trypan blue itu sendiri. Waktu
yang dibutuhkan tidak boleh terlalu lambat maupun cepat, sehingga hasilnya dapat
diketahui dengan pasti (Kwok et al., 2004). Selain itu, trypan blue juga kurang
efektif dikarenakan kemampuannya yang dapat masuk ke dalam pori-pori sel.
Molekul trypan blue dapat masuk ke dalam pori-pori sel dikarenakan kemampuan
permeabilitas sel yang mengatur keluar masuknya zat-zat ke dalam sel, sehingga
meskipun sel tidak lisis, apabila trypan blue dapat masuk ke dalam sel melalui
pori-pori sel, maka sel hidup juga akan tewarnai (Tran et al., 2011). Pada uji
MTT, sel hidup maupun mati diketahui melalui aktivitas metabolismenya.
Sehingga apabila sel tersebut masih dapat melakukan aktivitas metabolisme, sel
tersebut masih dianggap hidup (Hundie et al., 2016).
47

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Pemberian ekstrak biji kopi robusta konsentrasi 62,5 µg/ml dan 31,25
µg/ml tidak menimbulkan toksisitas pada sel PBMC yang telah dipapar
logam nikel (NiCl2.6H2O), sedangkan pemberian ekstrak biji kopi robusta
konsentrasi 125 µg/ml bersifat sedikit toksik pada sel PBMC yang telah
dipapar logam nikel (NiCl2.6H2O).
2. Pemberian konsentrasi ekstrak biji kopi robusta yang menunjukkan
maksimal konsentrasi non-toksik pada sel PBMC yang telah dipapar
logam nikel (NiCl2.6H2O) ada pada konsentrasi 62,5 µg/ml.

5.2 Saran
1. Perlu penelitian lebih lanjut mengenai kandungan zat aktif dari ekstrak biji
kopi robusta yang aman dan tidak bersifat toksik bagi sel PBMC.
48

DAFTAR PUSTAKA

Asti, S. 2015. Pengaruh Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea robusta) terhadap
Aktivitas Fagositosis Sel Monosit (Penelitian Eksperimental Laboratoris in-
Vitro). Skripsi. Fakultas Kedokteran Gigi: Universitas Jember

Baratawidjaja, K.G. dan Iris Rengganis. 2010. Imunologi Dasar Ed10. Jakarta:
Fakultas Kedokteran UI

Budiharto. 2008. Metodologi Penelitian dengan Contoh Bidang Ilmu Kesehatan


Gigi. Jakarta: EGC

Budirahardjo, Roedy. 2016. Peningkatan Viabilitas Monosit oleh Biji Kopi


Robusta terhadap Streptococus mutans. Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Jember

CCRC. 2010. Standard Operating Procedure. Cancer Chemoprevention Research


Cancer Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

Christina, B., Fransisca, C., Caroline, K.K. dan Sudiono, J. 2015. Peran Monosit
(Makrofag) pada Proses Angiogenesis dan Fibrosis. Seminar Nasional
Cendekiawan: Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Trisakti

Christianti, Natalia D. 2012. Sintesis dan Karakterisasi Material Magnetik


Berbasis Senyawa Kompleks Inti Ganda Nikel (II) dengan 2,2’-Bipiridin
Menggunakan Ligan Jembatan Oksalat. Skripsi. Departemen Kimia:
Universitas Airlangga

Daniel, W.W. 2009. Biostatistics: a foundation for analysis in the health sciences
9 th Edition. Georgia: Wiley
49

Dewanti, I Dewa Ayu Ratna, I Dewa Ayu Susilawati, Pujiana Endah, Roedy
Budirahardjo. 2016. Robusta Coffee Beans Decrease of Inflammation in
Dental Caries. UNEJ e-Proceeding, [S.l.], p. 173-176

Elshahawy, W dan I. Watanabe. 2014. Biocompatibility of Dental Alloys Used in


Dental Fixed Prosthodontics.Tanta Dental Journal, p. 150-159

Ermawati, Tantin. 2013. Efek Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea robusta)
terhadap Kemampuan Adhesi dan Viabilitas Neutrofil yang Dipapar
Porphyromonas Gingivalis. Penelitian Dosen Pemula Fakultas Kedokteran
Gigi Universitas Jember

Ermawati, Tantin. 2015. Potensi Gel Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea robusta)
Terhadap Ekspresi TNF-a pada Tikus Periodontitis yang Diinduksi
Porphyromonas gingivalis. Penelitian dosen pemula, Universitas Jember

Garanda, Cecilia., et al. 2007. Damping Excessive Inflammation and Tissue Damage
in Mycobacterium tuberculosis Infection by Toll IL-1 Receptor 8/Single Ig IL-1-
Related Receptor, a Negative Regulator of IL-1/TLR Signaling. The Journal of
Immunology. 179 (5): 3119-3125

Guo, Hongrui, Lian Chen, Hengmin Cui, Xi Peng, Jing Fang, Zhicai Zuo,
Junliang Deng, Xun Wang dan Bangyuan Wu. 2016. Research Advances on
Pathways of Nickel-Induced Apoptosis. Int. J. Mol. Sci. 17 (10): 1-18

Guyton, A.C., dan Hall, J.E. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 11.
Jakarta: EGC

Haudek-Prinz, Verena J., Philip Klepeisz, Astrid Slany, Johannes Griss, Anastasia
Meshcheryakova, Verena Paulitschke, Goran Mitulovic, Johannes Stöckl
50

and Christopher Gerner. 2012. Proteome Signatures of Inflammatory


Activated Primary Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Journal of
Proteomics. 76(5): 150–162.

Heravi F., Ramezani M., Poosti, M., Hosseini, M., Shajiei, A., dan Ahrari, F.
2013. In Vitro Cytotoxicity Assessment of an Orthodontic Composite
Containing Titanium –dioxide Nano-particles. Journal of Dental Research,
7(4): 192-198

Hosoki, M. dan Nishigawa, K. 2011. Dental Metal Allergy. Journal InTech

Hikmah, Nuzulul dan I Dewa Ayu Ratna Dewanti. 2010. Seputar Reaksi
Hipersensitivitas (Alergi). Stomatognatic (J.K.G Unej), 7 (2): 108-112

Hutomo, Suryani, Yanti Ivana Suryanto, Heni Susilowati, Agustinus Rudolf


Phym, dan Devi Chrestella Maheswara. 2014. Ekspresi Caspase-3 pada Sel
Epitel Rongga Mulut (Kb Cell Line) setelah Paparan Ekstrak Kopi. Majalah
Kedokteran Gigi, 21(2): 122 – 126

J. McGaw, Lyndy, Esameldin E. Elgorashi, Jacobus N.Eloff. 2014. 8 -


Cytotoxicity of African Medicinal Plants Against Normal Animal and
Human Cells. Toxicological Survey of African Medicinal Plants. 181-233

Khotimah, S.N. dan Muhtadi A. 2008. Review artikel: Beberapa Tumbuhan yang
Mengandung Senyawa Aktif Antiinflamasi.Jurnal Farmaka, 4 (4)

Kiattisin, Kanokwon, Thanaya Nantarat dan Pimporn Leelapornpisid. 2016.


Evaluation of Antioxidant and Anti-tyrosinase Activities as Well as Stability
of Green and Roasted Coffee Bean Extracts from Coffea arabica and Coffea
canephora Grown in Thailand. Journal of Pharmacognosy and
Phytotherapy, 8 (10); 182-192
51

Končarević, Saša, Christopher Lößner, Karsten Kuhn, Thorsten Prinz, Ian Pike
dan Hans-DieterZucht. 2014. In-Depth Profiling of the Peripheral Blood
Mononuclear Cells Proteome for Clinical Blood Proteomics. International
Journal of Proteomics. 1-9

Lestari, Endang Wiji, Idha Haryanto, dan Surip Mawardi. 2009. Konsumsi Kopi
Masyarakat Perkotaan dan Faktor-Faktor yang Berpengaruh: Kasus di
Kabupaten Jember (Level of Coffee Consumption in Urban Community and
Its Determinant Factors: Case Study in Jember District). Pelita Perkebunan,
25(3), 216-235

Makfoeld, Djarir et al. 2002. Kamus Istilah Pangan dan Nutrisi. Kaninus:
Yogyakarta

Meerloo, J. 2011. Cell sensitivity assay: the MTT assay. Methods Mol Biol
731(237): 45

Najiyati, S dan Danarti. 2001. Kopi, Budidaya dan Penanganan Lepas Panen.
Jakarta: Penebar Swadaya

Nirwana, Intan dan R. Helal Soekartono.2005. Sitotoksisitas resin akrilik hybrid


setelah penambahan glass fiber dengan metode berbeda (Cytotoxicity of the
hybrid acrylic resin after glass fiber reinforcement with difference method).
Maj. Ked. Gigi. (Dent. J.). 38 (2): 56–59

Notoatmodjo, S. 2005. Metodologi Penelitian Kesehatan. Jakarta : PT Rineka


Cipta

Panggabean, E. 2011. Buku Pintar Kopi. Jakarta: AgroMedia Pustaka.


52

Prastowo, Bambang, et al. 2010. Budidaya dan Pasca Panen Kopi. Bogor:Pusat
Penelitian dan Pengembangan Perkebunan

Rachmawati, D., Bontkes, H.J., Verstege, M.I., Muris, J., Blomberg, B., Scheper,
R.J. dan Hoogstraten, I. 2013. Transition Metal Sensing by Toll-like
receptor-4: Next to Nickel, Cobalt and Palladium are Potent Human
Dendritic Cell Stimulators. Contact Dermatitis 68: 331-338

Rachmawati, Dessy. 2016. Innate Immune Reactivity to Dental Alloy. Amsterdam:


Vrije Universiteit

Rahardjo, Pudji. 2012. Kopi. Jakarta: Penebar Swadaya

Ramanaviciene, Almira, Mostovojus, Voktoras, Bachmatova, Iriana, dan


Ramanavicius. 2003. Anti-bacterial Effect on Caffeine on Eschericia coli
and Pseudomonas florescens. Journal Acta Medica Lituania. 10 (4): 185-
188.

Saito, M., Arakaki R. dan Ishimaru N. 2016. Molecular Mechanisms of Nikel


Allergy. Int J Mol Sci, 17 (2), 202
SEH, El-Nabi, Dawoud GTM, El-Garawani IM, El Shafey SS.2018. HPLC
Analysis of Phenolic Acids, Antioxidant Activity and In Vitro Effectiveness
of Green and Roasted Caffea Arabica Bean Extract: A Comparative Study.
Anticancer Agents Med Chem.

Siregar, F. dan B. Hadijono. 2000. Uji Sitotoksisitas dengan MTT Esei. Jurnal
Kedokteran Gigi Universitas Indonesia 7:29-30

Soesetijo, FX Adi.2012.Evaluasi Kekerasan Restorasi Nikel-Kromium dengan


Berbagai Metode Casting. Jurnal Kedokteran Gigi Universitas Jember
Stomatognatic, 9 (3) 2 :145 – 151
53

Supriyadi. 2008. Evaluasi Apoptosis Sel Odontoblas Akibat Paparan Radiasi


Ionisasi. Indonesian Journal of Dentistry, 15(1): 71-76

Tanauma, Hizkia Alesta, Gayatri Citraningtyas dan Widya Astuty


Lolo.2016.Aktivitas Antibakteri Ekstrak Biji Kopi Robusta (Coffea
canephora) Terhadap Bakteri Eschericia coli. Jurnal Ilmiah Farmasi
Pharmacon, 5 (4), 243-251

Tran, Seav-Ly, Andrea Puhar, Maud Ngo-Camus, Nalini Ramarao.2011.Trypan


Blue Dye Enters Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII
of Bacillus cereus.Plos One Journal, 6 (9), 1-5

Wataha, John C, Jeanie L Drury dan Whasun O Chung. 2013. Nickel Alloys in the
Oral Environment. Expert Rev. Med. Devices, 10 (4), 519-539

Zamble, Deborah, Magdalena Rowinska-Zyrek dan Henryk Kozlowski. 2017.


Metallobiology Series No. 10 : The Biological Chemistry of Nickel. British :
The Royal Society of Chemistry 2017