Anda di halaman 1dari 24

TUGAS MATA KULIAH BIOLOGI

Jurnal

“ISOLASI DNA”

Oleh
Bekti Dwisepti Mafiana
( 41204720114084 )

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam


UNIVERSITAS NUSA BANGSA
2015
TUGAS MATA KULIAH BIOLOGI
Jurnal

“ISOLASI DNA”

Oleh
Bekti Dwisepti Mafiana
( 41204720114084 )

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam


UNIVERSITAS NUSA BANGSA
2015
KATA PENGANTAR

Pujisyukur saya panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkatrahmat dan karunia-
Nya Tugas Jurnal Biologi ini dapat diselesaikan tepat waktu.
Saya mengucapkan terimakasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam proses
pembuatan Tugas Jurnal Biologi ini sehingga sesuai dengan rencana dan target yang telah
ditentukan
Saya menyadari di dalam Tugas Jurnal Biologi ini jauh dari kata sempurna. Olehkarenaitu saya
mengharapkan kritik dan saran daripembaca. Akhir kata saya mengharapkan Tugas Jurnal
Biologi ini dapat bermanfaat bagi para pembaca.
Salam.
DAFTAR ISI

Kata Pengantar
Daftar Isi
BAB I. PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang
1.2.Tujuan
1.3.Waktu dan Tempat
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
BAB III. METODE PERCOBAAN
III.1. Alat
III.2. Bahan
III.3. Prosedur Kerja
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1. Hasil Percobaan
IV.2. Pembahasan
BAB V. PENUTUP
V.1. Kesimpulan
V.2. Saran
DAFTAR PUSTAKA
BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang


DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah molekul utama yang mengode semua informasi
yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas 3
komponen utama yaitu gula deoksiribusa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk
nukleotida. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus,
mitokondria dan kloroplas (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang terususn helix
Ganda (double helix), yang basa nitrogen dan kedua “benang” polinukleotida saling berpasangan
dalam pasangan yang tetap melali ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan yang
lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sek makhluk hidup dan
disebut sebagai “cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa
informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Agus dan
Sjafaraenan, 2014).
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu, DNA juga bisa diisolasi.
Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya strand-strand DNA dapat terpisah dalam
bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih. Tujuan isolasi DNA adalah
mendapatkan ekstrak DNA pada jaringan atau sel yang diinginkan (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Isolasi DNA ini sangat penting dalam bidang bioteknologi maupun bidang biologi
molekuler. Pengenalan isolasi DNA sangat penting mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini
sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil
diintroduksi ke dalam tanaman seperti padi kapas dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk
perkembangan keanekaragaman hayati di masa mendatang memerlukan keterampilan dan
pemikiran. Salah satunya adalah dengan mengetahui cara pengumpulan DNA dan prinsip
dasarnya sebagai pijakan untuk mempelajari biologi molekuler pada khususnya (Agus, dan
Sjafaraenan, 2014).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam
keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan
DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley,
2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam
proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti
protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus
sederhana dan cepat.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme
pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan.
Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh
suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti
Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM
Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya
memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA
dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki
kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan
waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang
bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau
jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-
thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi
maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen
yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel
(Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk
melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein
globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl
sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam
melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang
merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain
seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan
membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter
keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi
NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah
air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus
dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang
mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang
baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi
polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan
inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada
suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan
untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada sel
tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan Rhizobium
(Surzycki, 2000).

Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti


NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan
polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa
polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan
polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol
yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu
dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat
menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu
polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA
(Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat
mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).

Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai
12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA
terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas
12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk
menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan
mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer,
dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen
(Surzycki 2000).

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti


ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang
dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara
mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill
dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari
kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi
protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan
mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp,
2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan
terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada
lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi
sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase
organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau
campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA
yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari
DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).
Gambar 1. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi
pada tahapan ekstraksi (Clark, 2010). klik gambar untuk memperbesar.

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu,
protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut
organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan
pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang
mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang
terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi
protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi.
Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-
air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya
dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat
bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke
kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-
air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini
memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas
(20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan
kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari
faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000).
Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada
umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut
akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur
fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga
menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform
yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan
negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air.
Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul
isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol
adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan
menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga,
penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan
presipitasi DNA.
Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu
RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak
membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam
tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum
pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim
dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet
yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan
residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi
bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab
itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk
menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003).
Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka
etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara
evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol
dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan
yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat (Sambrook
et al., 2001).
Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE
ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar
-20ºC. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC
bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-
minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE
juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan
DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil
ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC.

Gambar 2. Proses pufrifikasi DNA dengan menggunakan metode silika dan kolom kromatografi
(a) proses pengikatan DNA ke silika dengan bantuan perubahan konsentrasi garam, (b) DNA
dielusi untuk memperoleh DNA (Brown, 2010). Klik gambar untuk memperbesar.

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh
beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga
disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. Berikut adalah
bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan menggunakan Kit Nucleon Phytopure yang disajikan
pada Gambar 3.

Gambar 3. Bagan isolasi DNA dengan menggunakan kit phytopure.


1.2 Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Untuk mengetahui cara atau metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari
buah-buahan.
2. Mengetahui keefektifan detergen dan buah yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi.

I.3 Waktu dan Tempat


Percobaan Isolasi DNA ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014 pukul 14.00-
17.00 WITA bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.

.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friedrich Miescher
dari Jerman yang mengisolasi inti dari sel darah putih pada tahun 1869. Miescher menemukan
bahwa di dalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang mengandung fosfat yang kemudian
dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad ke-19 telah berhasil dilakukan pemisahan antara
DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid) dari protein-protein yang melekatkan
molekul asam nukleat tersebut pada sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan
kawan-kawan menunjukkan bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula ribosa dan empat basa
yang mengandung nitrogen, sementara DNA tersusun atas gula yang berbeda yaitu deoksiribosa
(Yuwono, 2005).
Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick
pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan
Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisik, Watson dan Crick membuat model
struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix) (Yuwono, 2005).
Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai
mempunyai orientasi yang berlawanan (antiparalel): rantai yang satu mempunyai orientasi 5’ →
3’, sedangkan rantai yang lain berorientasi 3’ → 5’. Kedua rantai tersebut berikatan dengan
adanya ikatan hidrogen antara basa adenin (A) dengan thymine (T) dan antara guanine (G)
dengan cytosine (C). Ikatan antara A—T berupa dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G—C
berupa tiga ikatan hidrogen sehingga ikatan G—C lebih kuat. Spesfikasi pasangan basa seperti
ini disebut dengan komplementaritas (complementarity) (Yuwono, 2005).
Kerangka gula deoksiribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar
molekul, sedangkan basa purin dan pirimidin terletak di sebelah dalam untaian (helix). Basa-basa
purin dan pirimidin yang berpasangan terletak pada bidang datar yang sama dan tegak lurus
terhadap aksis untaian DNA. Untaian DNA mempunyai dua lekukan (groove) eksternal yaitu
lekukan besar (major groove) dan lekukan kecil (minor groove). Kedua lekukan tersebut
mempunyai peranan sebagai tempat melekatnya molekul protein tertentu (Yuwono, 2005).
Ukuran molekul DNA bervariasi antara jasad yang satu dengan lainnya. Pada jasad
prokariot variasinya tidak sebesar pada virus dan bakteriofag. Bahan genetik pada prokariot dan
virus pada umumnya berupa satu molekul tunggal DNA (kecuali virus tertentu yang bahan
genetiknya RNA). Sebaliknya, bahan genetik pada eukariot berupa beberapa molekul kromosom
yang masing-masing berupa molekul DNA berukuran besar. Ukuran DNA pada eukariot,
terutama eukariot tingkat tinggi belum diketahui secara pasti karena kompleksitasnya (Yuwono,
2005).
Struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot
tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear
dan memiliki protein. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akanberada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.
Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi
dengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi sektrak sel,
pemurnian DNA dari ektrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil
yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi yang
dapat menghambat pemurnian DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-
masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan
menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air renda. Semakin
tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA
yang terpresipitasi juga akan sedikit (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan
hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada dinding sel, membran sel membran
plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa
dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan
secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti,
salah satunya adalah detergen (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Selain itu, secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa
kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesilsulfat). Dalam
hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini
berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim
nuclease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat
digunakan untuk merusak membrane sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel
yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS di bersihkan dengan cara
sentrifugasi,sehinggayang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk
menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil
RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol
berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA
(Muladno, 2002).
Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat
menyebabkan ruaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik
detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-detergen
kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik
dan hidrofobik, demikian juga dengan detergen sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
Kemudian penambahan garam (NaCl) berfungsi untuk melarutkan DNA dan setelah itu
diberikan ethanol dingin 96% untuk mengumpulkan/menggumpalkan DNA (Agus dan
Sjafaraenan, 2014).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan
atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain
agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan
ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro, 1998).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar
(DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah
paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan
etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan
etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro, 1998).
Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah
DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang
gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian
terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspense DNA pada
panjang gelombang 260nm terhadap 280nm (Suharsonodan Widyastuti, 2006).
BAB III
METODE PERCOBAAN

III.1 Alat
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah pisau, mesin blender, timbangan, gelas
aqua, pengaduk, penyaring (tissu / kapas / kertas saring), spatula, tabung reaksi, pipet tetes, dan
mesin vortex.

III.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah buah tomat Solanum lypersium, buah pepaya Carica
papaya, detergen Surf bubuk, detergen Rinso cair, sabun Bucream, aquades, garam dapur, dan
etanol 96% dingin.

III.3 Prosedur Kerja


Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini sebagai berikut:
1. Melarutkan detergen (Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam 60 mL aquades diaduk pelan selama
15 menit.
2. Mengambil 100 grm daging buah ditambah 100 mL aquades dimasukkan ke dalam mesin
blender, kemudian diblender selama 40 detik.
3. Mencampurkan 4 mL masing-masing larutan sabun dengan masing-masing 4 mL jus buah.
4. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh
campuran yang homogen serta divortex.
5. Menyaring campuran yang dihasilkan sebelumnya sebanyak dua kali penyaringan.
6. 6 mL hasil penyaringan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
menambahkan 5 mL etanol 96 % dingin.
7. Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak
sedikitnya DNA yang terbentuk.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Percobaan
Tabel Pengamatan
No. Jenis Buah Perlakuan Hasil Pengamatan Jumlah
Warna Waktu
1 Tomat Detergen Bening, ada Lambat ++
Solanumlycopersium Bubuk endapan
Detergen Bening Sedang +
Cair
Detergen Putih Bening Lebih +++
Krim Cepat
2 Pepaya Detergen Putih Lebih ++++
Carica papaya Bubuk Kekuning- Cepat
kuningan
Detergen Putih keruh Lambat +++
Cair
Detergen Putih susu Sedang ++
Krim
IV.2 Pembahasan
Praktikum isolasi DNA ini dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh macam buah
dan jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Sehingga dalam
praktikum ini dibuat variabel kontrol pada jenis detergen dan jenis buah agar dapat mengetahui
buah dan jenis detergen mana yang menghasilkan DNA paling bagus dan baik. Jenis buah yang
digunakan adalah tomat Solanum lycopersicum sebagai contoh buah yang mengandung banyak
air dan pepaya Carica papaya sebagai buah yang memiliki kandungan air tidak terlalu banyak.
Sedangkan untuk detergen yang dipakai adalah detergen bubuk merk Surf, detergen cair merk
Rinso, dan detergen krim merk BuCream.
Pada dasarnya prinsip isolasi DNA ada tiga yaitu pelisisan sel, ekstraksi dan
pemurnian.Pada praktikum kali ini yang pertama-tama dilakukan ialah menghancurkan sampel
buah dengan cara mekanik atau pemblenderan buah untuk melisis/ merusak dinding sel.
Sementara itu dibuat pula larutan detergen dengan cara mencampurkan ketiga jenis detergen
(Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam aquades. Pengadukan dilakukan dengan hati-hati agar tidak
terjadi banyak busa yang dapat menghalangi pengamatan.
Kemudian jus buah ditambahkan dengan larutan detergen. Penambahan larutan detergen
berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini
disebabkan karena sifat dari detergen sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga
terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.
Lalu ditambahkan garam dapur dan diaduk. Pengisolasian DNA menggunakan garam
dapur dengan tujuan untuk memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang
dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat
DNA. Saat ion Na+ garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul.
Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring sebanyak dua kali penyaringan untuk
memisahkan serat-serat yang kasar dengan yang halus, sehingga didapatkan sampel berupa
cairan yang tidak terlalu kental.
Hasil penyaringan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah etanol 96 %
dingin yang berfungsi membantu proses pengendapan terhadap organel-organel yang sudah
keluar dari sel atau memisahkan bagian-bagian yang terurai tersebut berdasarkan berat molekul.
Ethanol berperan dalam pengumpulan dan penggumpalan DNA karena sifatnya yang dingin.
Kemudian setelah diamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan,
warna, serta banyak sedikitnya DNA yang terbentuk. Maka hasil yang didapatkan yaitu larutan
yang paling cepat membentuk gumpalan DNA adalah tomat+Bukrim dan tomat+Surf.
Hal ini bertolak belakang dengan teori yang menyatakan bahwa buah pepaya akan lebih
banyak menghasilkan gumpalan DNA karena memiliki kandungan air yang lebih sedikit
daripada tomat sehingga DNA yang terpresipitasi lebih banyak pada buah pepaya.
Kenyataan ini juga tidak sejalan dengan anggapan detergen yang paling baik digunakan
untuk isolasi DNA adalah detergen bubuk, kemudian detergen cair, lalu detergen krim. Dari hasil
tersebut maka yang dapat disimpulkan bahwa tomat dan BuCream paling banyak menghasilkan
DNA. Dan dari ketiga jenis deterjen yang digunakan, yang paling sedikit menghasilkan DNA
adalah deterjen Rinso. Larutan dengan deterjen bubuk Surf dan Bu krim menghasilkan DNA
dengan jumlah yang cukup banyak. Namun ketiga jenis deterjen tersebut tidak dapat
dibandingkan mana yang lebih baik dalam mengisolasi DNA karena pada setiap perlakuan
menunjukkan hasil yang relatif sama.
Kemungkinan terdapat kesalahan pada saat dilakukan pemblenderan buah pepaya yang
terlalu lama dan terlalu halus sehingga DNA yang didalamnya tercabik-cabik hancur dan
menyebabkan kegagalan pada saat pada isolasi DNA. Selain itu pada saat proses penyaringan
dan penambahan ethanol terjadi kehabisan bahan dan karenanya terdapat sebagian percobaan
yang belum tuntas dan menggunakan bahan pengganti yang terbatas kapasitasnya dibandingkan
bahan yang semestinya digunakan dalam praktikum.
BAB V
PENUTUP

V.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari praktikum ini adalah:
1. Untuk melakukan isolasi DNA metode atau teknik yang digunakan pada dasarnya ada tiga yaitu:
pelisisan sel, ekstraksi, dan pemurnian. Pelisisan dapat dilakukan dengan cara mekanik maupun
kimia, salah satunya dengan cara diblender dan dicampur larutan detergen. Ekstraksi dapat
dilakukan dengan penambahan garam dapur (NaCl) dan pemurnian salah satu metodenya adalah
dengan memberikan larutan ethanol dingin 96%.
2. Jenis detergen dan buah yang dipakai untuk melakukan isolasi DNA sangat berpengaruh pada
DNA yang dihasilkan.
V.2 Saran
Adapun saran untuk praktikum ini sebaiknya alat dan bahan laboratorium ditambah untuk
mencegah terjadinya kekurangan bahan yang dapat mengakibatkan keasalahan dan kurang
akuratnya hasil yang didapatkan pada praktikum ini.
DAFTAR PUSTAKA

Agus, Rosana dan Sjafaranain. 2014. Penuntun Praktikum Genetika. Makassar.


Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Kimball, J. John. 1992. Biologi. Erlangga. Jakarta.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE
Foundation. Bogor.
Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. IPB
Press. Bogor.
Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta.