Siembra bacteriana a partir de diluciones

seriadas de muestra y recuento bacteriano.

Estefany Margarita Paredes S.
Ingeniería en Biotecnología, Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura,
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Sangolqui Ecuador.

RESUMEN

La presente práctica posee como objetivo realizar siembras bacterianas por

extensión y profundidad a partir de diluciones seriadas de la muestra de E. coli y
posterior recuento de unidades formadoras de colonia. Se rotularon cinco tubos. Se
realizó una dilución previa de la muestra de E. coli 1:100, se batió 25 veces. Usando una
pipeta estéril se realizó una dilucion1:10 de muestra con agua peptonada estéril, se tapó
y agito. Se repitió el procedimiento para todos los tubos usando una pipeta diferente
cada vez. Se consideró factor de dilución 1 ∗ 107 . A partir de la última dilución del tubo
5 se realizó siembra por extensión y siembra a profundidad. Las cajas Petri fueron
selladas e incubadas a 37ºC por 24 horas. Se obtuvo crecimiento masivo en los dos
cultivos realizados, por lo tanto no se pudo contar las UFC. Se describe el procedimiento
a seguir en un ejemplo hipotético de 188 colonias. Se considera que se utilizó demasiada
muestra y que las pipetas estaban sucias por lo cual se recomienda repetir la práctica.

Palabras clave: Unidades formadoras de colonias, agua peptonada, siembra por

extensión, siembra a profundidad.

INTRODUCCIÓN

Justificación del problema de estudio: Es fundamental conocer técnicas de recuento

bacteriano a partir de siembra por extensión y profundidad de diluciones seriadas.

Marco teórico

Las diluciones seriadas es una técnica utilizada en medicina, microbiología con el fin de
disminuir progresivamente la concentración de determinado soluto, en el caso de
microbiología, el número de bacterias. El número de colinas en un cultivo es igual al
número de microorganismos viables en la muestra, por ello se puede usar para obtener
un aproximado del número de bacterias de la muestra original (García & Picazo, 1998).

Las unidades formadoras de colonias UFC representan a cada colonia a contar y su

número total representa el número total de bacterias viables en la muestra. Se
consideran únicamente las cajas Petri que posean un número estadísticamente
representativo entre 30 y 300 colonias, aquellas placas que tengan más de 300 colonias
se reportan como incontables o crecimiento masivo (García & Picazo, 1998).

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El agua peptonada es un medio de enriquecimiento no selectivo de color ámbar claro se
lo puede usar en inoculación directa, las peptonas de carne proporcionan los nutrientes
necesarios para el desarrollo microbiano y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico. Es recomendado para ser utilizado en lugar de una solución fisiológica para
realizar las diluciones 1:10 y 1:100 y como medio base para la fermentación de hidratos
de carbono (Laboratorios Britania, 2015).

Inoculación por extensión en superficie o siembra masiva.

Consiste en distribuir la muestra de manera uniforme por la superficie del medio de

cultivo contenido en la placa o caja Petri, para ello se utiliza una espátula de Drigalsky,
un escobillón, una pipeta Pasteur acotada y un asa bacteriológica. Según García (1994),
es un método idóneo para el recuento de colonias. Si se pretende aislar colonias, se
pueden sembrar varias placas sucesivamente con el mismo inoculo, el número de
colonias ira disminuyendo hasta quedar perfectamente aisladas.

Inoculación en agar a sobrefusión o siembra a profundidad.

Según Negroni (2009), es método de cultivo anaerobio en el que se usa una determinada
cantidad de la muestra o de una dilución de la misma, se mezcla con 25 mL de agar a
sobrefusión (40-45ºC) y se vierte en una caja Petri de 90 mm, dejándolo solidificar. Este
método es de gran rendimiento para evaluar la población bacteriana de una muestra
(García P. , 1994).

Escherichia coli es un bacilo gramnegativo de la familia de las enterobacterias, e una

bacterias anaerobia facultativa comensal es uno de los organismos patógenos más
relevantes para el hombre. Posee formas sin movilidad y móviles (con flagelos). Para su
aislamiento e identificación se debe tomar una muestra a 37ºC en un medio selectivo
en condiciones aerobias donde las enterobacterias pueden diferenciarse por sus
características morfológicas y ser diferenciadas por la prueba del indol (Nataro, 1998).

Objetivos

Objetivo general: Realizar siembras bacterianas por extensión y profundidad a partir de

diluciones seriadas de la muestra y posterior recuento de unidades formadoras de
colonia.

Objetivos específicos:

 Realizar diluciones seriadas de la muestra de Escherichia coli.

 Ejecutar siembras bacterianas por extensión y a profundidad.
 Contar las unidades formadoras de colonia en cada siembra y expresar el
resultado en UFC/mL de muestra original.

Hipótesis: Al realizar siembras bacterianas por extensión y profundidad a partir de soluciones

seriada de una muestra se pueden obtener colonias.

2 Julio 2017
MATERIALES Y METODOLOGÍA

Se verifico la existencia de materiales y se rotularon cinco tubos y dos cajas Petri.

Dilución: Se realizó una dilución previa de la muestra de E. coli 1:100 tomando 1mL de
muestra y 99 mL de agua destilada, se batió 25 veces apoyando el codo sobre la mesa.
Usando una pipeta estéril se tomó 1mL de la dilución realizada y se colocó en el tubo 1
con 9mL de agua peptonada estéril, se tapó y agito. Usando otra pipeta estéril se tomó
1 mL del tubo 1 y se realizó la misma Dilucion 1:10, se repitió el procedimiento para
todos los tubos. El factor de dilución es 1 ∗ 107 (Koch, 2017).

Siembra por extensión: A partir del tubo 5 se tomó 0.1 mL y se colocó en el centro del
agar de la caja Petri y usando un codo de vidrio estéril (flameado con alcohol) se
extendió la muestra sobre toda la superficie del agar (Koch, 2017).

Siembra a profundidad: A partir del tubo 5 se tomó 0.1 mL y se mezcló con agar derretido
caliente, se homogenizo. Se vertió el agar con la muestra sobre la segunda caja de agar
y se mantuvo a temperatura ambiente por dos minutos hasta que se solidifico. Las cajas
fueron selladas e incubadas a 37ºC por 24 horas (Koch, 2017).

RESULTADOS

Se obtuvo crecimiento masivo en los dos cultivos realizados, por lo tanto no se pudo
contar las UFC.

a) b)

Fig 1. a) Crecimiento masivo siembra por extensión. b).Crecimiento masivo siembra a profundidad.
[Fotografía de David Flores Sangolqui. 2017) Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Ecuador.

En el caso de haber obtenido UFC se las hubiera contado y reemplazado dicho valor en
la formula, se muestra un ejemplo hipotético para 188 colonias:

𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑈𝐹𝐶 ∗ 𝐹𝐷

= (188)(1 ∗ 107 )
= 1,88 ∗ 109 𝑒𝑛 0.1 𝑚𝐿
= 1,88 ∗ 1010 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿

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DISCUSIÓN

En base a lo mencionado por Negroni (2009) y García (1994) las técnicas de siembra por
extensión y a profundidad son métodos de alto rendimiento para el recuento bacteriano
por medio de la obtención de colonias y el agua peptonada brindo los nutrientes
necesarios para el desarrollo de las bacterias evitando la lisis celular. Por ello se
considera que existió un error en el procedimiento como la toma de demasiada muestra,
el uso de pipetas sucias o no agitar lo suficiente las diluciones. Se recomienda repetir la
práctica utilizando una mayor cantidad de diluciones seriadas de este modo abra menor
cantidad de muestra y el factor de dilución incrementara, por otro lado también se
podría cambiar el agua peptonada por agua destilada con el fin de que las bacterias no
obtengan más nutrientes que los del medio agar y exista un menor crecimiento
bacteriano.

Realizar siembras bacterianas por extensión y profundidad a partir de diluciones

seriadas de la muestra y posterior recuento de unidades formadoras de colonia.

CONCLUSIONES

 Se conoció la importancia y el uso de diluciones seriadas de una muestra bacteriana.

 Se ejecutó siembras bacterianas por extensión y a profundidad.
 Se reconoció la técnica de recuento bacteriano a partir de colonias expresando el
resultado en Unidades Formadoras de Colonias sobre mililitro de muestra original.

REFERENCIAS:

Alarcón, L., & Olivas, E. (2001). Manual de practicas de Microbiología básica y Microbiología de
alimentos. Programa de Nutrición. Universidad Autónomas de la cuidad de Juárez.

García, J., & Picazo, J. (1998). Microbiologia Medica: Clinica, Volumen 2. España: Harcourt
Brace.

García, P. (1994). Microbiología clínica práctica. Universidad de Cadíz España: Servicio

Publicaciones UCA.

Laboratorios Britania. (noviembre de 2015). www.britanialab.com. Obtenido de Agua

peptonada: http://www.britanialab.com/productos/B02152%20REV%2001-
AGUA%20PEPTONADA.pdf

Nataro, J. (1998). Escherichia coli diarreogénica. American Society for Microbiology (ASM).

Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica. Argentina : Ed Médica Panamericana S.A.

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