Journal of Controlled Release 111 (2006) 107 - 116

www.elsevier.com/locate/jconrel

Pembuatan dan karakterisasi protein-loaded N- trimetil

nanopartikel kitosan sebagai sistem pengiriman hidung

Maryam Amidi a, b, Stefan G. Romeijn Sebuah, Gerrit Borchard Sebuah, Hans E. Junginger Sebuah,
Wim E. Hennink b, wim Jiskoot b, *
Sebuah Departemen Teknologi Farmasi, Leiden / Amsterdam Pusat Penelitian Obat (LACDR), Leiden University,

PO Box 9502, 2300 RA Leiden, Belanda

b Departemen farmasi, Utrecht Institut Ilmu Farmasi (UIPS), Utrecht University, PO Box 80.082,

3508 TB Utrecht, Belanda

Menerima Agustus 2005 22; diterima 21 November 2005

Tersedia online 27 Desember 2005

Abstrak

Dalam studi ini, potensi N- trimetil kitosan (TMC) nanopartikel sebagai sistem pembawa untuk pengiriman hidung protein diselidiki. TMC nanopartikel disusun oleh silang ionik larutan TMC (dengan atau tanpa ovalbumin) dengan tripolifosfat,

pada suhu kamar sambil diaduk. Ukuran, zeta-potensi dan morfologi nanopartikel diteliti sebagai fungsi dari kondisi persiapan. Protein pemuatan, integritas protein dan pelepasan protein dipelajari. Toksisitas nanopartikel TMC diuji oleh silia

pengukuran beat frekuensi embrio ayam trakea dan di tes sitotoksisitas vitro. Penyerapan in vivo dari FITC-albumin-loaded TMC nanopartikel dengan hidung jaringan epitel pada tikus dipelajari oleh confocal laser scanning mikroskop.

Nanopartikel memiliki ukuran rata-rata sekitar 350 nm dan zeta-potensi positif. Mereka menunjukkan efisiensi memuat hingga 95% dan kapasitas muat sampai dengan 50% (w / w). Integritas ovalbumin terperangkap dipertahankan. Studi rilis

menunjukkan bahwa lebih dari 70% dari protein yang tetap terkait dengan nanopartikel TMC untuk setidaknya 3 jam di inkubasi di PBS (pH 7,4) pada 37 -C. tes sitotoksisitas dengan Calu-3 sel tidak menunjukkan efek racun dari nanopartikel,

sedangkan sebagian reversibel efek cilio-menghambat pada frekuensi silia beat trakea ayam diamati. Dalam studi serapan vivo menunjukkan pengangkutan nanopartikel TMC FITC-albumin-terkait di mukosa hidung. Kesimpulannya, TMC

nanopartikel adalah potensi sistem pengiriman baru untuk transportasi protein melalui mukosa hidung. Studi rilis menunjukkan bahwa lebih dari 70% dari protein yang tetap terkait dengan nanopartikel TMC untuk setidaknya 3 jam di inkubasi di

PBS (pH 7,4) pada 37 -C. tes sitotoksisitas dengan Calu-3 sel tidak menunjukkan efek racun dari nanopartikel, sedangkan sebagian reversibel efek cilio-menghambat pada frekuensi silia beat trakea ayam diamati. Dalam studi serapan vivo

menunjukkan pengangkutan nanopartikel TMC FITC-albumin-terkait di mukosa hidung. Kesimpulannya, TMC nanopartikel adalah potensi sistem pengiriman baru untuk transportasi protein melalui mukosa hidung. Studi rilis menunjukkan bahwa

lebih dari 70% dari protein yang tetap terkait dengan nanopartikel TMC untuk setidaknya 3 jam di inkubasi di PBS (pH 7,4) pada 37 -C. tes sitotoksisitas dengan Calu-3 sel tidak menunjukkan efek racun dari nanopartikel, sedangkan sebagian

reversibel efek cilio-menghambat pada frekuensi silia beat trakea ayam diamati. Dalam studi serapan vivo menunjukkan pengangkutan nanopartikel TMC FITC-albumin-terkait di mukosa hidung. Kesimpulannya, TMC nanopartikel adalah potensi

sistem pengiriman baru untuk transportasi protein melalui mukosa hidung. sedangkan sebagian reversibel efek cilio-menghambat pada silia mengalahkan frekuensi trakea ayam diamati. Dalam studi serapan vivo menunjukkan pengangkutan nanopartikel TMC F

D 2005 Elsevier-undang.

Kata kunci: N- Trimethyl nanopartikel kitosan; pengiriman protein hidung; Calu-3 sel; Silia beat frekuensi

1. Perkenalan
Kemajuan terbaru di bidang bioteknologi telah mengakibatkan ketersediaan
sejumlah besar antigen berbasis protein. Sampai sekarang, sebagian besar
vaksin diberikan melalui suntikan karena stabilitas yang rendah dalam saluran
pencernaan setelah pemberian oral dan penyerapan rendah di situs mukosa.
kelemahan yang jelas dari pemberian parenteral adalah biaya produksi yang
tinggi, kepatuhan rendah vaksin karena takut untuk suntikan oleh orang tua
dan anak-anak, dan kebutuhan tenaga terlatih untuk mengelola vaksin.
Akibatnya, rute alternatif pemberian sedang dieksplorasi. Secara khusus,
mukosa hidung adalah situs yang menarik untuk pengiriman vaksin, karena
memiliki permukaan serap yang relatif besar dan aktivitas proteolitik rendah [1-6] .
Yang penting, vaksin sengau diberikan dapat merangsang respon imun lokal dan
sistemik. Namun, sebagian besar protein tidak diserap dengan baik dari rongga
hidung bila diberikan sebagai solusi sederhana. Faktor utama yang membatasi
penyerapan protein sengau diberikan adalah kemampuan mereka miskin untuk
menyeberangi membran hidung dan mekanisme pembersihan mukosiliar, yang
dengan cepat menghilangkan solusi protein dari situs penyerapan [1,2,7] . sistem
pengiriman bioadhesive telah digunakan untuk mengatasi hambatan tersebut [2,4,5,7]
. Mukoadhesif, nanopartikel hidrofilik telah menerima banyak perhatian untuk
memberikan antigen protein melalui rute hidung. sistem nanoparticulate
mukoadhesif meningkatkan penyerapan mukosa, karena mereka sangat melekat
themucosa dan peningkatan

* Penulis yang sesuai. Tel .: +31 30 253 6970; fax: +31 30 251 7839.
Alamat email: W.Jiskoot@pharm.uu.nl (W. Jiskoot).

0168-3659 / $ - melihat hal depan D 2005 Elsevier-undang. doi: 10,1016 / j.jconrel.2005.11.014

108 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
viskositas musin. Dengan demikian mereka secara signifikan mengurangi
hidung tingkat clearance mukosiliar dan dengan demikian meningkatkan waktu
tinggal formulasi dalam rongga hidung [1,2] . Selain itu, nanopartikel
menyeberangi epitel mukosa lebih baik dari mikrosfer dilakukan, karena tidak
hanya microfold (M) sel overlay mukosa terkait limfoid jaringan (MALT) tetapi
juga sel-sel epitel yang terlibat dalam transportasi nanopartikel
[8-11] .
Di antara berbagai bahan bioadhesive yang telah diusulkan untuk
pengiriman hidung protein, kitosan, kopolimer glukosamin dan N- asetilglukosamin,
telah menerima minat khusus. Chitosan telah dipelajari sebagai biomaterial dan
sebagai eksipien farmasi untuk pengiriman obat, karena sifat biologis yang
menguntungkan [12-14] . Selain kemampuannya untuk memfasilitasi transportasi
paracellular peptida dan protein di seluruh hambatan mukosa [4,5,14,15] , Itu
adalah biodegradable dan memiliki toksisitas yang sangat rendah [16-20] .
Selain itu, mikropartikel kitosan nanopartikel atau sarat dengan makromolekul
mampu meningkatkan penyerapan molekul-molekul ini di situs mukosa [21-27] .
Beberapa studi telah menunjukkan kemampuan mikropartikel kitosan untuk
meningkatkan baik respon imun sistemik dan lokal terhadap berbagai antigen
setelah pemberian oral atau nasal [23- 25] . Juga, insulin-loaded nanopartikel
kitosan dibuat dengan gelasi ionik telah menunjukkan peningkatan hidung dan
usus penyerapan insulin pada kelinci dan tikus, menghasilkan penurunan kadar
glukosa plasma [26-29] . Dan baru-baru, Vila et al. melaporkan bahwa berat
molekul rendah kitosan nanopartikel yang mengandung toksoid tetanus bisa
menginduksi tahan lama respon imun setelah pemberian nasal pada tikus [30] .
Terlepas dari keberhasilan yang dilaporkan, kelemahan utama dari kitosan
adalah bahwa tidak larut pada pH fisiologis, sedangkan larut dan aktif sebagai
penambah penyerapan hanya dalam bentuk terprotonasi dalam lingkungan
asam [31-33] . Sebaliknya,
N- trimetil kitosan klorida (TMC), turunan kitosan sebagian quaternized,
menunjukkan kelarutan air yang baik pada rentang pH yang luas. Oleh karena itu,
larut TMC memiliki sifat mukoadhesif dan penyerapan meningkatkan efek yang
sangat baik bahkan pada pH netral
[34,35] . Selain itu, TMC adalah alternatif yang menarik lebih chitosan untuk
desain partikel protein dimuat oleh ion cross-linking. Yang penting, pH di mana
partikel-partikel TPP-TMC disusun dapat disesuaikan untuk memberikan
stabilitas maksimum dari protein bunga dan / atau untuk meningkatkan
interaksi elektrostatik antara protein dan kationik TMC untuk meningkatkan
efisiensi pemuatan. Saat ini hanya beberapa studi telah melaporkan pada
solusi TMC dan mikropartikel TMC protein hidung dan pengiriman vaksin [35-37]
. Meskipun nanopartikel mukoadhesif menawarkan banyak keuntungan
dibandingkan mikropartikel atau bentuk sediaan hidung lain [1,2,8-11] , Tidak
ada penelitian telah diterbitkan tentang TMC nanopartikel sebagai sistem
pengiriman mukosa. Selain itu, meskipun ada beberapa laporan tentang
toksisitas TMC [38-41] , Data toksisitas hanya terbatas yang tersedia untuk
partikulat sistem operator TMC [40] . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
menggali potensi nanopartikel TMC baru sebagai kendaraan untuk
administrasi hidung antigen. Oleh karena itu, TMC nanopartikel disusun oleh
teknik gelasi ionik dan potensi mereka untuk merangkum antigen Model
ovalbumin dipelajari. Setelah
optimalisasi metode penyusunan dan karakterisasi ovalbumin-loaded TMC
nanopartikel yang diperoleh, keselamatan nanopartikel TMC sebagai sistem
pengiriman hidung dievaluasi dengan beberapa in vitro dan in vivo uji
toksisitas. Akhirnya, untuk pertama kalinya, kemampuan protein-loaded TMC
nanopartikel untuk menyeberang hambatan mukosa hidung di model in vivo
ditunjukkan.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. bahan
Chitosan (Mn = 40 kDa, Mw = 177 kDa ditentukan dengan kromatografi
permeasi gel (GPC) menggunakan poly ethylene glycol (PEG) standar dan
derajat deasetilasi 93%) digunakan untuk sintesis TMC (lihat di bawah) adalah
hadiah yang murah hati dari Primex ( Avaldsnes, Norway). Bodipy 665/676
dibeli fromMolecular Probe (Leiden, Belanda). Tripolifosfat (TPP), Tween 80,
bercabang polyethyleneimine (PEI) 25 kDa, ovalbumin, Dulbecco Modifikasi
Eagle Medium (DMEM), mouse monoklonal anti-ovalbumin IgG, FITC-label
ovalbumin dan FITC-label albumin diperoleh dari Sigma (Sigma, Bornem ,
Belgium). Fluorescent-berlabel (Cy-5) kambing IgG imunoglobulin anti-tikus itu
dipasok oleh Jackson Laboratories (Jackson ImmunoResearch Eropa Ltd UK).
Semua bahan lain yang digunakan adalah kelas analitis atau farmasi.
2.2. sintesis TMC dan karakterisasi dengan spektroskopi NMR
TMC dengan tingkat quaternization dari 25% disintesis oleh metilasi dari
kitosan dengan menggunakan CH 3 Aku di hadapan basa kuat (NaOH) seperti
yang dijelaskan sebelumnya [42] . polimer yang diperoleh dimurnikan dengan
dialisis terhadap air selama 4 hari di 4 -C dan kemudian beku-kering. The
dimurnikan TMC dianalisis dengan 1 H-nuklir magnetic resonance (NMR)
spektroskopi. The NMR dari TMC di D 2 O pada 80 -C direkam dengan
spektrometer NMR (AV-400, Brucker, Swiss). Tingkat quaternization (DQ) dan
dimethylation dihitung menurut metode yang dijelaskan sebelumnya [42]
menggunakan persamaan berikut:
DQ ¼ CH 3 ð Þ 3 = H½? ? 1=9 100 ð1Þ
DM ¼ CH 3 ð Þ 2 = H½? ? 1=6 100 ð2Þ
di mana DQ dan DM adalah derajat quaternization dan dimethylation,
masing-masing, dalam persentase mol amina bebas; [(CH 3) 3] dan [(CH 3) 2] adalah
integral dari pergeseran kimia dari hidrogen dari kelompok trimetil amino pada
3,3 ppm dan gugus amino dimethylated 3,1 ppm, masing-masing; [H] adalah
integral dari H-1 puncak antara 4,7 dan 5,7 ppm, terkait dengan atom hidrogen
terikat karbon 1 dari molekul chitosan, yang diambil sebagai sinyal referensi.
2.3. Penentuan pKa dari TMC dan TPP
PKa dan jumlah amina titratable (terutama dimethylated amina) dari TMC
diukur dengan titrasi
 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
50 mg dari TMC dilarutkan dalam 3 ml 189 mM asam klorida dengan larutan
natrium hidroksida (170 mM). PKa ini kelompok fosfat dari TPP dinilai dengan
titrasi dari 25 mg TPP dilarutkan dalam 3 ml 200 mM NaOH dengan HCl (210
mM). Berdasarkan hasil titrasi ini, rasio biaya molar TPP dan TMC digunakan
untuk penyusunan nanopartikel dihitung.
2.4. Persiapan nanopartikel TMC
TMC nanopartikel disiapkan di hadapan Tween 80 sebagai agen
re-menangguhkan untuk mencegah agregasi partikel selama pemurnian.
Secara singkat, larutan TMC 2 mg / ml (5 ml) mengandung 1% (b / v) Tween
80 disiapkan dalam air. Selanjutnya, 1,8 ml (1 mg / ml) larutan TPP (pH 8)
perlahan-lahan ditambahkan drop-bijaksana untuk solusi TMC (pH 6) sambil
diaduk pada suhu kamar, menghasilkan pH akhir sekitar 7. Ovalbumin-loaded
TMC nanopartikel dibuat seperti yang dijelaskan di atas dengan melarutkan
ovalbumin (0,1, 0,2, 0,3, 0,5 atau 1 mg / ml) dalam 5 ml TMC solusi (2 mg / ml)
mengandung 1% (b / v) Tween 80 sebelum menambahkan TPP. Suspensi
nanopartikel kemudian terkonsentrasi dan dimurnikan (dari bebas TMC, TPP,
Tween 80 dan protein terikat) dengan sentrifugasi gradien. Aliquots 1,5 ml
suspensi partikel disentrifugasi pada 10 SEBUAH l dari tempat tidur gliserol di
10000 g selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dalam
fosfat buffered saline (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 18 mM KH 2 PO 4, 3 mMKCl, 138
mMNaCl; pH 7,4) atau 5 mMHEPES, pH 7,4.
2.5. efisiensi pemuatan dan kapasitas pemuatan nanopartikel ovalbuminloaded
Ovalbumin-loaded TMC nanopartikel disiapkan dan dimurnikan seperti
dijelaskan di atas. Jumlah protein terperangkap dalam nanopartikel dihitung
dari selisih antara jumlah total ditambahkan ke dalam larutan bongkar jumlah
non-terperangkap protein yang tersisa dalam supernatan. konsentrasi
ovalbumin dalam supernatan diukur dengan mikro protein assay BCA (Pierce,
USA). Sejak Tween 80 dalam supernatan mengganggu dengan uji protein,
untuk studi optimasi awal nanopartikel ovalbumin-loaded disusun tanpa Tween
80. Aliquots suspensi nanopartikel yang dihasilkan disentrifugasi selama 20
menit pada 18000 g dan 10 -C dan supernatan kemudian dipisahkan dari
nanopartikel. Jumlah yang tersisa dalam supernatan protein non-terjebak
diukur dengan mikro protein assay BCA (Pierce, USA). Suspensi nanopartikel
non-loaded tanpa Tween 80 digunakan sebagai kosong untuk mengoreksi
gangguan oleh TMC.
Untuk meneliti efek dari Tween 80 pada pemuatan protein, FITC berlabel
nanopartikel ovalbumin-loaded dibuat seperti yang dijelaskan di atas di
hadapan Tween 80 dan jumlah protein ditentukan dengan mengukur
fluoresensi (eksitasi panjang gelombang: 488 nm, panjang gelombang emisi:
520 nm ) dalam supernatan menggunakan Perkin-Elmer 3000 spektrometer
fluoresensi (Gouda, Belanda). Sebuah nanopartikel kosong
109
suspensi digunakan sebagai kosong untuk mengoreksi gangguan oleh TMC
dan Tween 80. Memuat efisiensi (LE) dan kapasitas pemuatan (LC) untuk
kedua protein dan fluoresensi uji dihitung sebagai berikut.
LE ¼ Jumlah total ovalbumin ovalbumin Gratis
Jumlah total ovalbumin
100% ð3Þ
LC ¼ Jumlah total ovalbumin ovalbumin Gratis
Nanopartikel berat kering
100% w ð= w Þ ð4Þ
2.6. Dalam rilis vitro dari ovalbumin dari nanopartikel TMC
Aliquots 1 ml ovalbumin-loaded TMC suspensi nanopartikel siap dengan
Tween disentrifugasi pada 10000 g pada 10- SEBUAH tidur gliserol l selama 15
menit. supernatan didekantasi dan pelet itu kembali ditangguhkan dalam 1 ml
phosphate buffered saline (PBS, 0,1 M, pH 7,4). Tabung diinkubasi pada 37
-C, di bawah agitasi (50 rpm), selama 3 jam. Pada waktu 0 dan pada interval
waktu yang berbeda, tabung diambil dan disentrifugasi (di 18000 g selama 10
menit). ovalbumin yang dirilis pada supernatan ditentukan oleh uji protein BCA
mikro. Sebuah sampel yang terdiri dari hanya nanopartikel kembali
ditangguhkan di PBS digunakan sebagai latar belakang. Percobaan dilakukan
dalam rangkap tiga.
2.7. Karakterisasi TMC-nanopartikel
Nanopartikel yang ditandai untuk ukuran mereka dan zetapotential dengan
Zeta-Sizer 3000 (Malvern Instrumen Ltd, Malvern, UK) di 5 mmol HEPES pH
7,4 penyangga. Distribusi ukuran partikel dari nanopartikel dilaporkan sebagai
indeks polidispersitas (PDI), mulai dari 0 untuk seluruh monodisperse hingga 1
untuk sistem sepenuhnya heterodisperse. Pemeriksaan morfologi dari
nanopartikel dilakukan oleh pemindaian mikroskop elektron (SEM). Setetes
TMC nanopartikel suspensi ditempatkan pada disk emas. Setelah airdrying
semalam pada suhu kamar, nanopartikel kering dilapisi dengan emas dalam
perangkat emas menggerutu MED 010 (Balzer, Liechtenstein) dan belajar
dengan JOEL 6700F mikroskop elektron (JOEL BV, Schiphol-Rijk, Belanda).
2.8. elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dan Western blotting
elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dan Western blotting dilakukan untuk
mengevaluasi efek dari proses persiapan pada integritas protein dan
antigenisitas. Ovalbumin-loaded TMC nanopartikel stabil dengan
menambahkan 1 ml 10% (b / v) NaCl 6,8 ml suspensi nanopartikel,
menghasilkan larutan dengan konsentrasi protein 0,3 mg / ml. protein itu
dielektroforesis pada 125 V dalam kondisi mengurangi, dalam
7,5% SDS-gel poliakrilamid. Sampel protein adalah
110 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
disiapkan dalam elektroforesis bongkar-buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, dengan
selama dua hari pada 37 -C di 95% udara dan 5% CO 2. Formulasi disiapkan
25% gliserol dan 2% SDS mengandung 0,1% bromophenol solusi biru, dan h- mercaptoethanol)
dan dipanaskan selama 5 menit pada 95 -C. Setelah elektroforesis, band
protein divisualisasikan dengan pewarnaan dengan Coomassie Biru R-250.
Untuk Western blotting, band antigen dipindahkan ke membran nitroselulosa
dengan menggunakan semi-kering sistem Western blotting beroperasi pada
arus konstan 100 mA selama 1 jam di blotting penyangga terdiri dari
penyangga Tris (25 mM Tris, 1,4% glisin, 20% (v / v) metanol, pH 8,3). Setelah
blotting situs gratis diblokir dengan 1% non-lemak susu-bubuk di buffer fosfat
saline (10 mM Na 2 HPO 4, 18 mM KH 2 PO 4, 3 mM KCl, 138 mM NaCl; pH 7,4)
yang mengandung 0,05% Tween 20 (PBS-T). Berikutnya, membran diinkubasi
dengan larutan mouse anti-ovalbumin antibodi monoklonal di PBS-T yang
mengandung
0,1% non-lemak susu bubuk. Membran kemudian dicuci untuk menghilangkan
antibodi terikat dan diinkubasi dengan Cy-5labeled, kambing IgG imunoglobulin
anti-tikus. Kompleks antigen-antibodi dihapuskan divisualisasikan dengan
sistem Western blotting fluoresensi (Amersham Corporation, IL, USA).
2.9. Dalam tes toksisitas vitro
2.9.1. Silia pengukuran beat frekuensi
Efek dari nanopartikel TMC pada silia beat frekuensi (CBF) telah dipelajari
seperti yang dijelaskan sebelumnya [43-45] . Secara singkat, trakea ayam
embrio dibedah dan diiris menjadi cincin kecil ketebalan 1 mm. Irisan jaringan
ditempatkan di Locke-Ringer solusi (LR, pH 7,0) pada 33 -C untuk memulihkan
selama 30 menit. Kemudian LR digantikan oleh suspensi nanopartikel TMC
dimurnikan di LR. Setelah memulai inkubasi, CBF diukur pada 5, 10 dan 15
menit. Setelah itu, formulasi digantikan oleh LR dan reversibilitas dari CBF
dinilai setiap 5-10 menit selama 45 menit. Tingkat reversibilitas itu
diklasifikasikan menjadi tiga kategori: ciliofriendly (> 75%), cilio-menghambat
(25-75%), atau cilio-statis (<25% dari nilai awal) [41] . Nanopartikel TMC
dimurnikan (40 mg / ml) siap dengan dan tanpa Tween 80 dan solusi TMC
berair (2 mg / ml) di LR dipelajari untuk pengaruh mereka pada CBF dalam
bentuk diencerkan murni dan 5 kali lipat, yang sama dengan estimasi faktor
pengenceran fisiologis dalam rongga hidung [45] . CBF masing-masing
formulasi dan LR (kontrol negatif) diukur selama enam batch independen dan
daerah di bawah kurva (AUC) dari setiap pengukuran selama inkubasi (0-15
menit) dan selama periode pengujian reversibilitas (15-60 menit) dihitung
secara terpisah. Pengaruh formulasi pada CBF dan reversibilitas dari CBF
dibandingkan dengan yang LR. Data dianalisis secara statistik dengan
menggunakan analisis satu arah varians (ANOVA) dengan uji perbandingan
beberapa Bonferroni.
2.9.2. assay viabilitas sel
Sitotoksisitas dari nanopartikel TMC dimurnikan diuji in vitro pada manusia
dibedakan, lendir, submukosa garis sel karsinoma kelenjar Calu-3. Calu-3 sel
unggulan di kepadatan 5 10 5 sel per baik ke 96-baik piring budaya di DMEM
dilengkapi dengan 10% serum janin anak sapi
(FCS) dan 50 SEBUAH g / ml penisilin dan streptomisin. Sel-sel diinkubasi
dalam larutan garam seimbang Hank (HBSS) buffered dengan 30 mM N- [ 2-hidroksietil]
piperazine-
N V- [Asam 2-ethanesulphonic] (HEPES), disesuaikan dengan NaOH 0,1 M pH
7,2. Kemudian sel-sel yang terkena HBSSHEPES penyangga, suspensi
nanopartikel TMC (40 mg / ml), solusi TMC (2 dan 20 mg / ml) atau poli (etilena
imina) (PEI) solusi (0,02 dan 0,2 mg / ml) di HBSS-HEPES dan diinkubasi
selama 2 jam pada 37 -C. Setelah itu, perumusan dan polimer digantikan oleh
100 SEBUAH l dari DMEM dan 20 SEBUAH l proliferasi sel reagen [3-
(4,5-dimethylthiazole-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenil)
-2H-tetrazolium, garam batin; MTS ( Sebuah)],
Promega Benelux BV (Leiden, Belanda), dan sel-sel diinkubasi selama 1-2 jam
pada 37 -C. Akhirnya, absorbansi diukur pada 490 nm menggunakan 96-baik
pembaca lempeng [46,47] . Sebagai kontrol positif (sitotoksik), sel-sel diinkubasi
dengan SDS (0,01% b / v) dalam NaOH (1% (b / v) selama 10 menit. Data
dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis satu arah varians
(ANOVA) dengan tes perbandingan beberapa Bonferroni.
2.9.3. Pengukuran hambatan listrik transepitelial (Teer)
Calu-3 sel unggulan dengan kepadatan pembenihan 4 10 5
sel / cm 2 pada kolagen-dilapisi 12-Transwell piring dengan membran mikro
(Costar Eropa, Badhoevedorp, Belanda). Salah satu ml media kultur (DMEM)
ditambah dengan 10% FCS dan 50 SEBUAH g / ml penisilin dan streptomisin
ditambahkan ke kedua sisi basolateral dan apikal. Medium di sisi apikal telah
dihapus setelah satu hari dan sel-sel tumbuh pada antarmuka udara pada 37
-C, 90% kelembaban dan 5% CO 2. medium diganti setiap dua hari dan
budidaya dilanjutkan selama 14 hari sampai lapisan sel konfluen dibentuk.
media itu kemudian diganti dengan 1,5 ml HBSS-HEPES di basolateral sisi 30
menit sebelum memulai percobaan. Setelah itu, solusi TMC (2 mg / ml) dan
nanopartikel dimurnikan (40 mg / ml) di HBSS-HEPES (0,5 ml) yang diterapkan
di lokasi apikal monolayers sel. The Teer dari Calu-3 sel diukur pada interval
waktu tertentu (0,
15, 30, 45, 60, 90, 120, 135 dan 150 menit). Setelah 150 menit inkubasi,
formulasi digantikan oleh HBSS-HEPES untuk menentukan pemulihan Teer ke
nilai awalnya [48,49] .
2.10. Dalam serapan vivo nanopartikel TMC pada tikus hidung epitel
tikus Wistar jantan ( ¨ 380 g) dibius dengan pemberian intramuskular 0,5 ml /
kg Hypnorm dan 0,5 ml / kg Dormicum. Sebuah kanula silikon 5-cm
dimasukkan ke dalam trakea untuk memungkinkan hewan untuk napas.
Sayatan dibuat di kerongkongan untuk memasukkan kanula silikon dari 20 cm
ke bagian posterior dari rongga hidung dan menyembur fiksatif dan mencegah
drainase rumusan yang disebabkan oleh pembersihan mukosiliar dalam
rongga hidung. Suspensi nanopartikel TMC sarat dengan FITC-albumin
disiapkan dan dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat,
larutan TMC 2 mg / ml (5 ml) mengandung 1% (b / v) Tween 80 dan 0,5 mg /
ml FITC-
 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
albumin disiapkan dalam air. Setelah itu 1,8 ml 1 mg / ml larutan TPP
ditambahkan drop-bijaksana. FITC-albumin nanopartikel dimuat tersebar di PBS
dan 0,5 mg / ml solusi FITC-albumin yang diberikan ke nares tikus (50 SEBUAH l
per lubang hidung) oleh 100- SEBUAH l pipet ujung dengan PVC-tabung
terpasang. tabung dimasukkan setidaknya 0,5 cm ke dalam lubang hidung untuk
deposit formulasi ke dalam rongga hidung. Selama dosis dan paparan
berikutnya tikus berada dalam posisi terlentang.
Binatang dikorbankan 30 menit setelah pemberian intranasal dari formulasi
dan rongga hidung tikus memerah dengan 5 ml 4% (v / v) formaldehida dalam
PBS pH
7.4 melalui kanula esofagus. Septum dan terkait hidung jaringan limfoid (NALT)
terletak di bagian posterior dari hidung tikus yang dipotong dan direndam
dalam fiksatif yang sama untuk setidaknya 90 menit.
Sebelum pemeriksaan CLSM, septum dan hidung jaringan yang
permeabilized di 0,1% Triton X-100 solusi dalam PBS selama 20 menit.
Jaringan (epitel) diwarnai dengan BODIPY 665/676 dalam metanol selama 60
menit dan divisualisasikan oleh confocal laser scanning mikroskop (Bio-Rad,
Alphen a / d Rijn, Belanda). Gambar-gambar confocal diperoleh dengan
memindai epitel hidung di x, y Pesawat dengan z langkah 500 nm [11,50] .
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. karakterisasi NMR dari TMC dan pKa pengukuran TMC dan TPP
Kitosan termetilasi dengan CH 3 Aku untuk menghasilkan TMC. Dari analisis
NMR tingkat quaternization sekitar 25% dan tingkat rata-rata di- ditambah
mono-metilasi dari sekitar 75% dihitung. Titrasi larutan berair yang diasamkan
dari TMC dengan natrium hidroksida encer (lihat Bagian 2) menunjukkan pKa
rata-rata 6,2 untuk mono dan di-termetilasi amina, yang hampir sama dengan
pKa dilaporkan untuk amina di kitosan [32] .
TPP memiliki prinsip lima proton titratable. Titrasi TPP dengan NaOH encer,
bagaimanapun, mengungkapkan dua nilai pKa, yaitu
8,8 dan 6,2, mengkonsumsi satu ekuivalen NaOH per kelompok titratable. Hal ini
menunjukkan bahwa dua dari lima kelompok hidroksil dari TPP adalah asam sangat
lemah yang tidak dapat terdeprotonasinya dalam larutan encer NaOH, dan satu
adalah asam kuat dan tidak dapat terprotonasi oleh HCl encer.
3.2. Pembuatan dan karakterisasi nanopartikel TMC
TMC nanopartikel disusun oleh ionotropic gelasi dari kationik TMC dengan
anion TPP. Teknik ringan ini
Tabel 1
Karakteristik nanopartikel TMC
Formulasi / nanopartikel Akhir TMC Akhir TPP pekat. TMC / TPP (w
TMC pekat. mg / ml mg / ml / w)
dibongkar 1.470 0,265 5.5
Sarat dengan ovalbumin Sebuah 1.470 0,265 5.5
Sebuah LE = 79,8%, LC = 28,6%.
111
melibatkan pencampuran dua larutan air pada suhu kamar sambil diaduk tanpa
menggunakan sonikasi atau pelarut organik. Karena protein adalah molekul
yang sangat labil sensitif terhadap beberapa faktor stres [51] , Metode persiapan
ringan ini sangat cocok untuk mempersiapkan protein dimuat nanopartikel.
Berbagai formulasi dibuat dengan konsentrasi yang berbeda awal TMC (1-6
mg / ml) dan solusi TPP (0,25-3 mg / ml) untuk membangun kondisi persiapan
di mana nanopartikel terbentuk. Sejak partikel yang lebih kecil umumnya
menunjukkan serapan yang lebih tinggi oleh epitel hidung daripada yang lebih
besar [8- 11] , Ukuran, distribusi ukuran, stabilitas koloid dan reproduktifitas
produksi nanopartikel kriteria yang digunakan untuk memilih parameter
formulasi terbaik untuk mempersiapkan nanopartikel. Nanopartikel TMC
optimal terbentuk ketika rasio TMC / TPP adalah 5,5 (w / w) yang dekat
dengan rasio optimal dari 3- 5 untuk kitosan / TPP (w / w) ditemukan oleh
Calvo et al. [28,29] . Pada rasio yang sangat rendah atau tinggi TMC / TPP baik
solusi yang jelas terlihat (hampir tidak ada pembentukan partikel) atau
nanopartikel lebih besar dengan stabilitas koloid rendah diperoleh,
masing-masing. Di antara formulasi yang menyebabkan pembentukan
suspensi nanopartikel, salah satu rumusan yang mengakibatkan partikel koloid
stabil dengan distribusi ukuran yang sempit ( Tabel 1 ) Dipilih untuk studi
berturut-turut. Tabel 1 menampilkan karakteristik kosong dan ovalbumin-loaded
nanopartikel TMC dan menunjukkan bahwa partikel agak kecil dengan
zeta-potensi sedikit positif terbentuk. The zetapotential positif dari nanopartikel
TMC-TPP dapat dijelaskan dengan rasio molar muatan positif dari TMC (yang
pada pH 7 adalah hampir secara eksklusif karena amina quaternized,
menghasilkan biaya rata-rata ca. 0,25 per unit aminosugar) dan muatan negatif
dari TPP (ca.
2 per molekul). Ini
rasio molar dihitung menjadi 1,1 untuk nanopartikel yang disebutkan dalam Tabel
1 , Ketika asumsi bahwa semua molekul TPP dan TMC berpartisipasi dalam
pembentukan nanopartikel. Kedua dibongkar dan nanopartikel dimuat
menunjukkan sedikit peningkatan dalam ukuran dan PDI setelah pemurnian,
yang paling mungkin karena agregasi sedikit partikel. pemindaian mikroskop
elektron ( Gambar. 1 ) Menegaskan bahwa nanopartikel memiliki distribusi
ukuran yang sempit dan ukuran mereka dalam perjanjian dengan ukuran
seperti yang diperoleh dari pengukuran DLS. Ukuran dan morfologi
nanopartikel tidak terpengaruh oleh beban protein hingga LC dari 50% dan LE
dari ca. 90%. Konsentrasi protein yang lebih tinggi (yaitu, protein awal / rasio
TMC secara substansial melebihi LC maksimum; lihat Bagian 3.3, di bawah)
mengakibatkan lebih rendah LE dan partikel agregasi, yang mungkin karena
konsentrasi tinggi dari ovalbumin gratis di suspensi nanopartikel pada kondisi
ini.
Ukuran (nm) sebelum PDI Ukuran (nm) setelah PDI Zeta-potensial (mV)
pemurnian (berarti T SD) n pemurnian (berarti T SD) n (mean T SD) n = 3
=3 =3
254 T 9 0,157 360 T 26 0,242 20 T 2
366 T 23 0.230 479 T 32 0,327 16 T 4
112 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116

Sebuah protein dalam solusi pemuatan. Pada protein yang lebih rendah / rasio TMC,
LC linear meningkat dengan protein rasio / TMC ( Gambar. 2 ). Efisiensi bongkar
kapasitas ovalbumin-loaded TMC nanopartikel tidak terpengaruh oleh Tween
80, karena nilai-nilai yang sebanding LE dan LC untuk FITC-ovalbumin
disiapkan di hadapan Tween 80 diperoleh. Efisiensi pemuatan tinggi untuk
ovalbumin mungkin karena interaksi elektrostatik antara ovalbumin bermuatan
positif TMC dan bermuatan negatif (pI = 4.5) pada pH 7.

Dalam studi rilis vitro menunjukkan bahwa sekitar 30% dari protein dimuat
segera dilepaskan ke PBS. ledakan yang diamati mungkin berasal molekul
protein yang longgar terikat untuk TMC (mungkin pada permukaan partikel).
Sisanya 70% dari protein dimuat itu secara stabil terkait dengan nanopartikel
TMC untuk setidaknya 3 jam. Pemuatan dan pelepasan karakteristik yang mirip
dengan albumin-loaded N- ( 2hydroxy) nanopartikel propil-3-trimetil amonium
b
chitosan dilaporkan oleh Xu et al. [52] . Adalah penting bahwa protein tersebut
tidak dirilis untuk sebagian besar sebelum protein dimuat-nanopartikel
melewati penghalang epitel hidung selama tinggal mereka di rongga hidung.
Normal tingkat clearance mukosiliar hidung manusia yang sehat adalah sekitar
20 menit [7] . Soane et al. melaporkan bahwa mikrosfer kitosan mukoadhesif
dibersihkan dari rongga hidung manusia dengan setengah-waktu (waktu yang
dibutuhkan untuk 50% izin; t 50%) sekitar 80 menit [1] .

3.4. SDS-PAGE dan analisis Western blotting dari ovalbumin terperangkap

dalam partikel TMC

c SDS-PAGE mengungkapkan bahwa selain band yang sesuai dengan

ovalbumin monomer, tidak ada band tambahan yang akan menunjukkan
adanya agregat kovalen atau fragmen. analisis Western blot menegaskan
bahwa antigenisitas ovalbumin tidak diubah mengikuti jebakan dalam
nanopartikel (data tidak ditampilkan).

110

100

90

80

70
LE, LC (%)

60

50

. Gambar 1. Scanning mikroskop elektron (SEM) gambar nanopartikel TMC; (A dan b) partikel 40

non-loaded, (c) partikel ovalbumin-loaded. 30

3.3. Memuat dan pelepasan studi ovalbumin dari nanopartikel TMC 20

10

Gambar. 2 menunjukkan LE dan LC dari ovalbumin- dan FITClabeled 0.0 0,2 0,4 0,6 0,8 1.0
Ovalbumin (mg / ml)
nanopartikel ovalbumin-loaded. Kedua ovalbumin (persiapan tanpa Tween)
dan FITC-label ovalbumin (persiapan dengan Tween) menunjukkan hampir Gambar. 2. Memuat efisiensi (LE) dan kapasitas pemuatan (LC) dari TMC nanopartikel sebagai

100% LE hingga konsentrasi 0,5 mg / ml dimana kapasitas loading (LC) untuk fungsi konsentrasi ovalbumin yang digunakan untuk persiapan dalam ketiadaan Tween 80 (data
dinyatakan sebagai berarti T SD dari 5 percobaan independen) dan konsentrasi FITC-ovalbumin
ovalbumin mencapai maksimum sekitar 50% b / b ( Gambar. 2 ). LC dari TMC
digunakan untuk persiapan di hadapan Tween 80 (data dinyatakan sebagai berarti T SD dari 3
nanopartikel untuk ovalbumin dan FITCovalbumin dipengaruhi oleh konsentrasi
percobaan independen). ( h) LE% dan ( 0) LC% (ovalbumin). ( g) LE% dan (>) LC% (FITC-ovalbumin).
awal
 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116 113

Sebuah dari CBF (untuk ca. 40% dari nilai awal) terlihat untuk kedua nanopartikel TMC
120
murni (40 mg / ml), disiapkan baik di hadapan atau tidak adanya Tween 80,
100 dan larut TMC (2 mg / ml) dibandingkan dengan referensi ( p < 0,001). Untuk 5
kali lipat diencerkan suspensi TMC nanopartikel (8 mg / ml), disiapkan baik di
80
hadapan atau tidak adanya Tween 80, kurang menonjol tapi masih signifikan ( p
% Dari silia dipukuli
frekuensi

60 < 0,05) penurunan CBF (70-90% dari nilai awal) diamati ( Gambar. 3 b). Uji
reversibilitas menunjukkan bahwa baik TMC larut (0,4, 2 mg /
40

20

ml) dan nanopartikel (40 mg / ml) disiapkan di hadapan Tween 80 dapat

0
diklasifikasikan sebagai cilio-menghambat dibandingkan dengan LR sebagai
0 10 20 30 40 50 60
Waktu (min) kontrol negatif ( p < 0,01), sedangkan diencerkan suspensi murni dan 5 kali

b lipat TMC nanopartikel (40 dan 8 mg / ml) tanpa Tween 80 dan 5 kali lipat
diencerkan nanopartikel TMC (8 mg / ml) disiapkan di hadapan Tween 80
120
diklasifikasikan sebagai cilio -ramah ( Gambar. 3 b) ( p> 0,05). Dari hasil
100 tersebut, dapat disimpulkan bahwa nanopartikel TMC kurang beracun dari
larutan polimer TMC. Lima kali lipat pengenceran TMC larut tidak mengurangi
80
efek toksisitas dari polimer, yang mungkin karena interaksi yang kuat dari
% Dari silia dipukuli
frekuensi

60
molekul kationik dengan membran sel silia. Nanopartikel TMC murni disiapkan
di hadapan Tween 80 memiliki efek yang lebih kuat pada CBF dari nanopartikel
40 disiapkan tanpa Tween, yang mungkin berasal dari jumlah jejak Tween 80
dalam formulasi.
20

0
0 10 20 30 40 50 60
Waktu (min) Hasil pengukuran CBF harus ditafsirkan dengan hati-hati, karena

Gambar. 3. Efek dari TMC larut (2 mg / ml) dan TMC nanopartikel (40 mg / pengukuran CBF mungkin melebih-lebihkan ciliotoxicity in vivo. Pertama,
ml) pada frekuensi silia beat (CBF) untuk (a) murni dan (b) 5 diencerkan kali lipat sampel. Simbol: paparan langsung dari jaringan bersilia dipotong dengan formulasi mungkin
larut TMC ( 0), TMC nanopartikel siap dengan Tween 80 ( ,), TMC nanopartikel disiapkan tanpa Tween tidak representatif untuk situasi di vivo, karena epitel bersilia dilindungi oleh
80 ( g) dan LR, kontrol negatif (?). CBF dinyatakan sebagai persentase dari frekuensi awal (100) dan
lapisan lendir yang dikeluarkan dalam rongga hidung dan formulasi diberikan
data yang dilaporkan adalah mean T SD dari 6 percobaan. panah menunjukkan titik waktu di mana
diencerkan. Kedua, sel-sel epitel pada mukosa hidung terus-menerus
formulasi digantikan oleh LR penyangga.
digantikan oleh sel-sel di membran basement in vivo, situasi yang tidak dapat
menirukan in vitro. Telah terbukti bahwa selama inkubasi jaringan bersilia di
3.5. Dalam tes toksisitas vitro PBS dan normal saline, penurunan besar dari CBF terlihat yang reversibel
(ramah-cilio) [45,53] . Selain itu, hidung manusia mengandung sekitar 0,4 ml
Pengaruh TMC nanopartikel pada frekuensi silia beat (CBF) dari embrio lendir dan paling sering digunakan semprotan hidung memiliki volume sekitar
ayam trakea dipelajari untuk menguji efek racun yang mungkin dari formulasi 0,1
TMC. Gambar. 3 a menunjukkan bahwa selama 15 menit inkubasi penurunan
yang signifikan

120

110

100

90

80
% Dari sel-sel yang layak

70

60

50

40

30

20

10

HBSSHEPES TMC 2 TMC 20 mg TMC NP 40 PEI 0,02 mg PEI 02 SDS 10 mg

mg / ml / ml mg / ml / ml mg / ml / ml

Gambar. 4. Pengaruh TMC larut (2 dan 20 mg / ml), TMC nanopartikel suspensi (NP) (40 mg / ml) dan larut PEI (0,02, 0,2 mg / ml), aktivitas dehidrogenase mitokondria dari Calu-3 sel. Data yang mean T SD dari
8 percobaan.
114 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
ml. Oleh karena itu 5 kali lipat konsentrasi yang lebih rendah dari formulasi TMC digunakan
dalam penelitian ini dapat memberikan pandangan yang lebih realistis efeknya pada CBF [43-45]
.
Pengaruh nanopartikel TMC dan solusi pada aktivitas dehidrogenase
mitokondria dari Calu-3 sel ditunjukkan pada Gambar. 4 . Calu-3 sel yang
dikenal sebagai model yang relevan untuk epitel pernapasan; mereka
membentuk monolayers ketat dan komponen mensekresikan lendir dan
surfaktan [48,49,54,55] . uji sitotoksisitas ini tidak menunjukkan efek yang
signifikan racun dari TMC suspensi nanopartikel (40 mg / ml), yang dibuat di
hadapan Tween 80, dan larut TMC (2 mg / ml) ( p> 0,05). Kami hanya
mengamati penurunan viabilitas sel ketika sel-sel diinkubasi dengan TMC larut
pada konsentrasi yang relatif tinggi (20 mg / ml) ( p < 0,001).
Hal ini diketahui bahwa makromolekul kationik seperti PEI dapat menunjukkan
toksisitas sel substansial [56] . Untuk menggambarkan keselamatan TMC, efeknya pada
viabilitas sel secara langsung dibandingkan dengan PEI. Sedangkan penurunan
substansial dari viabilitas sel diamati setelah inkubasi dengan PEI pada konsentrasi
serendah 0,02 mg / ml dibandingkan dengan HBSS-HEPES ( p < 0,001), larut TMC
sampai dengan 1000 kali lipat konsentrasi yang lebih tinggi (20 mg /
ml) menunjukkan efek kurang merusak ( p < 0,001). Perbedaan antara
sitotoksisitas TMC dan PEI dapat berasal perbedaan dalam kimia, densitas
muatan, struktur 3D dari tulang punggung polimer, distribusi berat molekul, dll,
yang semuanya dapat mempengaruhi interaksi polimer dengan membran sel,
dan dengan demikian toksisitas mereka.
Sitotoksisitas mungkin terkait dengan penurunan ireversibel di Teer karena
kehancuran persimpangan ketat dari sel-sel epitel. Hasil pengukuran Teer dari
konfluen Calu-3 lapisan sel setelah terpapar suspensi nanopartikel TMC (40
mg / ml) yang dibuat di hadapan Tween 80
Sebuah 1 Sebuah 2
b
Gambar. 5. gambar CLSM tikus hidung epitel (a) dan NALT (b) setelah pemberian suspensi
FITC-albumin nanopartikel TMC dimuat.
Sebuah b
Gambar. 6. CLSM gambar dari epitel tikus hidung (a) dan NALT (b) setelah pemberian larutan
FITC-albumin di PBS.
dan larut TMC (2 mg / ml) tidak menunjukkan penurunan nilai Teer awal selama
inkubasi sel untuk 150 menit (data tidak ditampilkan). Hasil ini sejalan dengan
pengamatan sebelumnya bahwa TMC dengan DQ rendah tidak dapat membuka
persimpangan ketat
[57-59] dan menunjukkan keselamatan dan dengan demikian penerapan potensi
nanopartikel TMC untuk pengiriman hidung.
3.6. CLSM visualisasi fluorescently berlabel TMC nanopartikel dalam
epitel nasal
FITC-albumin digunakan untuk mempersiapkan nanopartikel TMC neon
dan untuk menyelidiki transportasi nanopartikel ini melalui mukosa hidung.
Penyerapan nanopartikel oleh epitel hidung dan sel NALT tergantung
khususnya pada ukuran dan biaya mereka [10,60] . FITC-albumin dimuat
nanopartikel TMC memiliki ukuran rata-rata yang sama dan zeta-potensi
sebagai nanopartikel ovalbumin-TMC. CLSM gambar epitel hidung dan NALT
diinkubasi dengan FITC-albumin nanopartikel TMC dimuat menunjukkan
adanya nanopartikel neon di seluruh sitoplasma sel-sel ini ( Gambar. 5 ).
Sebaliknya, dalam epitel tikus hidung diinkubasi dengan larut FITC-albumin,
tidak ada fluoresensi terdeteksi ( Gambar. 6 ), Yang menunjukkan bahwa
penyerapan larut FITC-albumin itu diabaikan. gambar Z-scan dari epitel hidung
diinkubasi dengan nanopartikel fluorescently berlabel dalam langkah-langkah
yang berbeda (0,5 SEBUAH m) menunjukkan bahwa nanopartikel tidak hanya
diinternalisasi oleh sel-sel epitel nasal, tetapi juga diangkut ke lapisan sel di
bawahnya (data tidak ditampilkan). Pengangkutan protein dikemas tidak
mungkin terjadi melalui jalur paracellular, karena larut TMC (DQ: 25%) tidak
mampu meningkatkan efisien transportasi paracellular protein dengan
membuka persimpangan ketat dari sel-sel epitel [57-59] . Selain itu, hasil studi
Teer menunjukkan tidak adanya efek paracellular permeabilitas nanopartikel
TMC. Oleh karena itu, kehadiran FITC-albumin nanopartikel TMC dimuat di
mukosa hidung mungkin karena serapan intraseluler oleh epitel dan sel NALT.
4. Kesimpulan
Dalam studi ini N- trimetil nanopartikel kitosan disiapkan dalam kondisi ringan
menggunakan TPP sebagai crosslinker dan diteliti sebagai kendaraan untuk
pengiriman hidung protein. Kapan
 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
benar dipersiapkan, partikel TMC stabil dengan ukuran kecil dan distribusi
ukuran yang sempit diperoleh. TMC nanopartikel memiliki kapasitas yang
sangat baik pemuatan untuk protein, dan muatan permukaan positif, cocok
untuk melampirkan mukosa hidung. TMC nanopartikel tidak menunjukkan
sitotoksisitas pada Calu-3 sel, sedangkan efek cilio-menghambat pada CFB
trakea ayam terlihat in vitro. In vivo percobaan menunjukkan bahwa
nanopartikel TMC sarat dengan FITC-albumin, bila diberikan dalam rongga
hidung, mampu melintasi lapisan mukosa, diambil oleh epitel tikus hidung dan
sel NALT, dan diangkut ke lapisan sub-mukosa. Fitur-fitur yang menarik
membuat sistem novel ini kendaraan yang menjanjikan untuk pengiriman
hidung protein.
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada Dr. HK Koerten (Fakultas Kedokteran,
Universitas Leiden) untuk dukungan dengan SEM, H. De Bout (Divisi
Toxicology, Leiden / Amsterdam Pusat Penelitian Obat (LACDR), Leiden
University) untuk bantuan teknis dalam CLSM. Kami berterima kasih kepada
Dr. X. Jiang dan Dr. R. Schiffelers (Departemen farmasi, Utrecht Institut Ilmu
Farmasi (UIPS), Utrecht University) untuk pengukuran GPC kitosan dan
membantu dalam statistik, masing-masing.
Referensi
[1] RJ Soane, M. Ferier, AC Perkins, NS Jones, SS Davis, L. Illum,
Evaluasi karakteristik pembersihan sistem bioadhesive pada manusia, Int. J. Pharm. 178
(1999) 55-65.
[2] RJ Soane, M. Hinchcliffe, SS Davis, L. Illum, karakteristik Izin
formulasi berbasis kitosan dalam rongga domba hidung, Int. J. Pharm. 217 (2001) 183-191.
[3] SS Davis, Nasal Vaksin, Adv. Obat deliv. Wahyu 51 (2001) 21-42. [4] L. Illum, NF Farraj, SS
Davis, Chitosan sebagai sistem pengiriman hidung Novel
untuk obat peptida, Pharm. Res. 11 (1994) 1186-1189.
[5] L. Illum, I. Jabbal-Gill, M. Hinchcliffe, AN Fisher, SS Davis, Chitosan
sebagai sistem pengiriman hidung baru untuk vaksin, Adv. Obat deliv. Wahyu 51 (2001) 81-96.
[6] AJ Almeida, HO Alpar, pengiriman Nasal vaksin, J. Obat Target. 3
(1996) 455-467.
[7] L. Illum, hidung obat pengiriman-kemungkinan, masalah dan solusi,
J. Control. Melepaskan 87 (2003) 187-198.
[8] M. Desai, V. Labhasetwar, G. Amidon, R. Levy, gastrointestinal penyerapan
mikropartikel biodegradable: efek ukuran partikel, Pharm. Res. 13 (1996) 1838-1845.
[9] F. Delie, Evaluasi nano dan mikropartikel serapan oleh gastroin- yang
saluran testinal, Adv. Obat Del. Pdt 34 (1998) 221-233. [10] Y. Huang, MD Donovan, molekul
besar dan serapan partikulat di
rongga hidung: pengaruh ukuran pada penyerapan hidung, Adv. Obat Del. Pdt 29 (1998) 147-155.
[11] J. Brooking, SS Davis, L. Illum, Transportasi nanopartikel di seluruh tikus
mukosa hidung, J. Obat Target. 9 (2001) 267-279.
[12] L. Illum, Chitosan dan penggunaannya sebagai eksipien farmasi, Pharm. Res.
15 (1998) 1326-1331.
[13] O. Merasa, P. Buri, R. Gurny, Chitosan: polisakarida yang unik untuk obat
pengiriman, Obat Dev. Ind. Pharm. 24 (1998) 979-993.
[14] HE Junginger, JC Verhoef, makromolekul sebagai penetrasi yang aman
enhancer untuk obat-hidrofilik fiksi? Pharm. Sci. Technol. Hari ini 1 (1998) 370-376.
115
[15] G. Borchard, HL Luessen, AG de Boer, JC Verhoef, CM Lehr, HE
Junginger, Potensi polimer mukoadhesif dalam meningkatkan peptida usus penyerapan obat:
III. Pengaruh glutamat kitosan dan karbomer di persimpangan ketat epitel in vitro, J. Control.
Melepaskan 39 (1996) 131-138.
[16] KY Lee, WS Ha, WH Park, kompatibilitas darah dan biodegradabilitas
dari sebagian N- derivatif chitosan terasilasi, Biomaterial 16 (1995) 1211-1216.
[17] RAA Muzzarelli, kegiatan enzimatik Manusia terkait dengan therapeu- yang
administrasi tic dari turunan kitin, Sel. Mol. Hidup Sci. 53 (1997) 131-140.
[18] H. Onishi, Y. Machida, Biodegradasi dan distribusi yang larut dalam air
kitosan pada tikus, Biomaterial 20 (1999) 175-182. [19] T. Chandy, CP Sharma, Chitosan
sebagai biomaterial, artif. Sel artif.
Organ 18 (1990) 1-24.
[20] TJ Aspeden, JD Mason, NS Jones, J. Lowe, O. Skaugrud, L. Illum,
solusi kitosan pada in vitro dan in tarif transportasi mukosiliar vivo di turbinates dan relawan
manusia, J. Pharm. Sci. 86 (1997) 509-513. [21] C. Sankar, M. Rani, AK Srivastava, B. Mishra,
Chitosan berdasarkan
mikrosfer pentazocine untuk pengiriman sistemik intranasal: pengembangan dan evaluasi
biofarmasi, Pharmazie 56 (2001) 223-226. [22] van der IM Lubben, FA Konings, G. Borchard, JC
Verhoef, HE
Junginger, In vivo penyerapan mikropartikel kitosan dengan patch murine Peyer: studi
visualisasi menggunakan confocal laser scanning microscopy dan imunohistokimia, J. Obat
Target. 9 (2001) 39-47. [23] van der IM Lubben, G. Kersten, MM Fretz, C. Beuvery, JC Verhoef,
HE Junginger, mikropartikel Chitosan untuk vaksinasi mukosa terhadap difteri: studi lisan dan
khasiat hidung pada tikus, Vaksin 28 (2003) 1400-1408.
[24] M. Bivas-Benita, M. Laloup, S. Versteyhe, J. Dewit, J. De Braekeleer, E.
Jongert, G. Borchard, Generasi Toxoplasma gondii GRA1 protein dan DNA vaksin dimuat
partikel kitosan: persiapan, karakterisasi, dan studi pendahuluan in vivo, Int. J. Pharm. 266
(2003) 17-27. [25] SM Baudner, MM Giuliani, JC Verhoef, R. Rappuoli, HE Junginger,
Penggunaan bersamaan dari adjuvant mukosa LTK63 dan sistem pengiriman chitosanbased
meningkatkan imunogenisitas dan kemanjuran vaksin intranasal diberikan, Vaksin 8 (2003)
3837-3844. [26] R. Fernandez-Urrusuno, P. Calvo, C. Remunan-Lopez, JL Vila-Jato, JA
Alonso, Peningkatan penyerapan hidung Insulin menggunakan nanopartocles kitosan, Pharm.
Res. 16 (1999) 1576-1581. [27] Y. Pan, YJ Li, HY Zhao, JM Zheng, H. Xu, G. Wei, JS Hao, FD
Cui,
polisakarida Bioadhesive di sistem pengiriman protein: nanopartikel kitosan meningkatkan
penyerapan usus insulin in vivo, Int. J. Pharm. 249 (2002) 139-147.
[28] P. Calvo, C. Remunan-Lopez, JL Vila-Jato, MJ Alonso, Novel
hidrofilik kitosan nanopartikel polietilen oksida sebagai pembawa protein,
J. Appl. Polym. Sci. 63 (1997) 125-132.
[29] P. Calvo, C. Remunan-Lopez, JL Vila-Jato, MJ Alonso, Chitosan dan
chitosan / etilen oksida-propilen blok oksida kopolimer nanopartikel operator sebagai baru
untuk protein dan vaksin, Pharm. Res. 14 (1997) 1431-1436.
[30] A. Vila, A. Sanchez, K. Janes, I. Behrens, T. Kissel, JL Vila Jato, MJ
Alonso, Low molekul kitosan nanopartikel berat badan sebagai pembawa baru untuk
pengiriman vaksin hidung pada tikus, Eur. J. Pharm. Biopharm. 57 (2004) 123-131. [31] AF
Kotze', HL Lue h en, BJ de Leeuw, AG de Boer, JC Verhoef, HE
Junginger, Chitosan untuk meningkatkan permeabilitas usus: prospek untuk derivatif larut
dalam lingkungan netral dan dasar, Eur. J. Pharm. Sci. 7 (1999) 145-151. [32] AF Kotze', HL Lue h
en, BJ de Leeuw, AG de Boer, JC Verhoef, HE
Junginger, N- trimetil kitosan klorida sebagai penyerapan penambah potensial di permukaan
mukosa: dalam evaluasi vitro pada sel epitel usus (Caco-2), Pharm. Res. 14 (1997) 1197-1202.
[33] AF Kotze', HL Lue h en, BJ de Leeuw, AG de Boer, JC Verhoef, HE
Junginger, Peningkatan transportasi obat paracellular dengan sangat quaternised N- trimetil
chitosan klorida di lingkungan netral: dalam evaluasi vitro pada sel epitel usus (Caco-2), J.
Pharm. Sci. 88 (1999) 253-257.
116 M. Amidi et al. / Jurnal Controlled Rilis 111 (2006) 107-116
[34] M. Thanou, JC Verhoef, JHM Verheijden, HE Junginger, usus
penyerapan octeriotide: N- trimetil kitosan klorida (TMC) ameliorates permeabilitas dan
penyerapan properti dari analog somatostatin in vitro dan in vivo, J. Pharm. Sci. 89 (2000)
951-957. [35] JH Hamman, M. Stander, AF Kotze', Pengaruh tingkat
quaternization dari N- trimetil kitosan klorida pada peningkatan penyerapan: dalam evaluasi
vivo pada epitel tikus hidung, Int. J. Pharm. 232 (2002) 235-242.
[36] SM Baudner, M. Morandi, MM Giuliani, JC Verhoef, HE Junginger,
P. Costantino, R. Rappuoli, G. Del Giudice, Modulasi respon imun terhadap kelompok C vaksin
konjugasi meningococal diberikan intranasal untuk tikus bersama-sama dengan sistem
pengiriman trimetil chitosan, J. Menginfeksi. Dis. 189 (2004) 828-832.
[37] van der IM Lubben, JC Verhoef, MM Fretz, FAC van Opdorp, I.
Mesu, G. Kersten, HE Junginger, Trimethyl kitosan klorida (TMC) sebagai eksipien baru untuk
imunisasi mulut dan hidung terhadap difteri, STP Pharm. Sci. 12 (2002) 235-242.
[38] M. Thanou, JC Verhoef, SG Romeijn, JF Nagelkerke, FWHM
Merkus, HE Junginger, Efek N- trimetil kitosan klorida, penyerapan penambah baru, pada
Caco-2 epitel usus dan silia beat frekuensi embrio ayam trakea, Int. J. Pharm. 185 (1999) 73-82.
[39] N. Haffejee, J. Du Plessis, D. Muller, C. Schultz, A. Kotze, C. Goosen,
toksisitas intranasal enhancer penyerapan yang dipilih, Pharmazie 56 (2001) 882-888.
[40] T. Kean, S. Roth, M. Thanou, trimethylated kitosan sebagai gen non-viral
vektor pengiriman: sitotoksisitas dan efisiensi transfeksi, J. Control. Melepaskan 103 (2005)
643-653.
[41] S. Mao, X. Shuai, F. Unger, M. Wittmar, X. Xie, T. Kissel, Sintesis,
karakterisasi dan sitotoksisitas dari poli (etilena glikol) -graft-trimetil kopolimer blok chitosan,
Biomaterial 26 (2005) 6343-6356. [42] AB Sieval, M. Thanou, AF Kotze', JC Verhoef, J. Brussee,
HE
Junginger, Persiapan dan NMR-karakterisasi yang sangat diganti N-
trimetil chitosan klorida, Carbohydr. Polym. 36 (1998) 157-165. [43] HJM van de Donk, IP
Muller-Plantema, J. Zuidema, FWHM Merkus,
Efek dari perservatives pada silia mengalahkan frekuensi trakea embrio ayam, Rhinology 18
(1980) 119-130.
[44] SG Romeijn, JC Verhoef, E. Marttin, FWHM Merkus, Pengaruh
formulasi obat hidung pada silia mengalahkan in vitro, Int. J. Pharm. 135 (1996) 137-145.
[45] P. Merkus, SG Romeijn, JC Verhoef, FWHM Merkus, PF Schou-
wenburg, Klasifikasi efek cilio-menghambat obat nasal, Laryngoscope 111 (2001) 595-602.
[46] TJ Moosman, cepat uji kolorimetri untuk pertumbuhan sel dan kelangsungan hidup:
aplikasi untuk proliferasi dan sitotoksisitas tes, J. Immunol. Metode 65 (1983) 55-65.
[47] TL Riss, RA Moravec, Perbandingan MTT, XTT, dan tetra baru
Senyawa zolium untuk MTS untuk in vitro proliferasi dan tes chemosensitivity, Mol. Biol. Sel,
Suppl. 3 (1992) 207. [48] KA Foster, ML Avery, M. Yazdanian, KL Audus, Karakterisasi
garis sel Calu-3 sebagai alat untuk menyaring pengiriman paru, Int. J. Pharm. 208 (2000) 1-11.
[49] NR Mathias, J. Timoszyk, PI Stetsko, JR Megill, RL Smith, DA
Wall, karakteristik permeabilitas dari Calu-3 manusia sel epitel bronchial: dalam korelasi vitro-in vivo
untuk memprediksi penyerapan paru-paru pada tikus, J. Obat Target. 10 (2002) 31-40.
[50] E. Marttin, JC Verhoef, C. Cullander, SG Romeijn, JF Nagelkerke,
FWHM Merkus, confocal laser scanning visualisasi mikroskopik dari pengangkutan dekstran
setelah pemberian nasal ke tikus: efek dari enhancer penyerapan, Pharm. Res. 14 (1997)
631-637. [51] M. van der Weert, W. Hennink, W. Jiskoot, Protein ketidakstabilan poli (lactic-
acid) mikropartikel co-glikolat, Pharm. Res. 17 (2000) 1159-1167. [52] Y. Xu, Y. Du, R. Huang,
L. Gao, Persiapan dan modifikasi N- ( 2-
hidroksil) amonium kitosan nanopartikel klorida propil-3-trimetil sebagai pembawa protein,
Biomaterial 24 (2003) 5015-5022. [53] B. Wilbert, K. Nesil, K. Graamans, E. Huizing, fisiologis dan
larutan garam hipertonik mengganggu aktivitas silia in vitro, Laryngoscope 109 (1999)
396-399.
[54] J. Fiegel, C. Ehrhardt, UF Schaefer, CM Lehr, J. Hanes, Besar berpori
partikel pelampiasan pada monolayers-menuju sel epitel paru-paru meningkat karakterisasi
partikel di paru-paru, Pharm. Res. 20 (2003) 788-796.
[55] C. Witschi, R. Mrsny, evaluasi in vitro dari mikropartikel dan polimer
gel untuk digunakan sebagai platform hidung untuk pengiriman protein, Pharm. Res. 16 (1999) 382-390.
[56] BI Florea, C. Meaney, HE Junginger, G. Borchard, Media
efisiensi dan toksisitas polyethylenimine di dibedakan Calu-3 dan dibedakan COS-1 budaya
non sel, AAPS PharmSci 4 (2002) E12. [57] AF Kotze', MM Thanou, HL Luessen, BJ de Leeuw,
AG de Boer,
JC Verhoef, HE Junginger, Pengaruh quaternisation derajat N-
trimetil kitosan klorida pada permeabilitas sel epitel usus (Caco-2), Eur. J. Pharm. Biopharm.
47 (1999) 269-274. [58] JH Hamman, CM Schultz, AF Kotze', N- trimetil klorida chitosan:
tingkat optimum quaternization untuk penyerapan peningkatan obat di seluruh sel epitel, Obat
Dev. Ind. Pharm. 29 (2003) 161-172. [59] C. Jonker, JH Hamman, AF Kotze', permeasi
paracellular usus
peningkatan dengan chitosan quaternized: in situ dan di evaluasi vitro, Int.
J. Pharm. 238 (2002) 205-213.
[60] T. Gershanik, S. Benzeno, S. Benita, Interaksi dari lipid diri pengemulsi
sistem pengiriman obat dengan mukosa usus tikus membalik keluar sebagai fungsi dari ukuran
tetesan dan muatan permukaan, Pharm. Res. 15 (1998) 863-869.