www.nature.

co
m/scientificrepo
rts

BUKA
Diterima: 24 Januari 2018
Diterima: 18 Juli 2018

Dipublikasikan: xx xx xxxx

Produksi susu hipoalergenik dari DNA-

free beta-lactoglobulin (BLG) gen
knockout sapi menggunakan nukleasi
zinc-finger mRNA
Zhaolin Sun 1 , Ming Wang 1 , Shiwen Han 2 , Shuangyu Ma 1 , Zhiyuan Zou 1 , Fangrong Ding 1 , Xinrui
Li 2 , Ling Li 1 , Bo Tang 3 , Haiping Wang 1 , Ning Li 1 , Huilian Che 2 & Yunping Dai 1

Protein whey β- laktoglobulin (BLG) adalah alergen susu utama yang tidak ada dalam ASI. Di sini, kami untuk
pertama kalinya menghasilkan sapi KO bi-allelic BLG bebas-DNA dengan mRNA zinc-finger nuclease (ZFNs) dan
menghasilkan susu bebas BLG.Menurut evaluasi alergenisitas susu bebas BLG, kami menemukan itu dapat memicu
reaksi alergi yang lebih rendah dari Balb / c tikus termasuk penurunan suhu rektal dan produksi IgE immunoglobulin
spesifik alergen; Susu bebas BLG mudah dicerna oleh pepsin pada 2 menit, sementara BLG dalam susu kontrol
masih belum sepenuhnya dicerna setelah 60 menit, dan pengikatan IgE dari sapi susu alergi (CMA) pasien untuk BLG
free-susu secara signifikan lebih rendah dari itu ke susu kontrol. Sementara itu, sekuensing genom mengungkapkan
bahwa hewan kita bebas dari peristiwa di luar target. Yang penting, mengedit genome hewan tanpa memasukkan
DNA asing ke dalam sel dapat mengurangi kekhawatiran regulasi yang berkaitan dengan makanan yang dihasilkan
oleh gen yang diedit gen. Akhirnya, penargetan ZFN yang dimediasi pada sapi dapat ditularkan melalui germline
melalui pembibitan. Temuan ini akan membuka kemungkinan tak terbatas untuk memodifikasi komposisi susu agar
lebih cocok untuk kesehatan manusia dan juga meningkatkan sifat fungsional susu.

Susu sapi adalah bahan makanan yang dikonsumsi secara global karena kaya nutrisi seperti protein, lemak, karbohidrat, dan
kandungan mineral. Namun, susu sapi juga merupakan salah satu makanan paling umum yang biasanya menyebabkan reaksi
alergi 1 . Alergi susu sapi(CMA) adalah penyakit yang umum pada masa bayi dan kanak-kanak, dan prevalensinya mendekati
3.
0,3% ~ 3,5% seiring dengan meningkatnya tren 2, yang sangat penyerapan dll dan pemanfaatan nutrisi dalam produk susu
 Meskipun strategi pemuliaan, manajemen nutrisi, dan genetika kuantitatif telah meningkatkan hasil susu, pendekatan ini
tidak menyebabkan perubahan yang signifikan dalam komposisi susu 4 . Dengan perkembangan bioteknologi, terutama pada
ternak, akan ada peluang besar untuk menghasilkan produk-produk bernilai tambah baru untuk merancang susu bagi manfaat
kesehatan manusia 5 . Berbagai sapi transgenik telah dilaporkan untuk aplikasi yang berbeda, seperti ekspresi protein
farmasi 6 - 9 , peningkatan protein kasein susu 10 , peningkatan ketahanan terhadap penyakit 11 - 13 , dan peningkatan
kesejahteraan hewan 14 , 15 . Namun, metode yang efektif untuk mengurangi reaksi alergi yang disebabkan oleh susu belum
dikembangkan. Susu sapi mengandung berbagai protein alergen seperti kasein, β-laktoglobulin (BLG) dan α- laktalbumin,
dengan protein whey susu BLG sebagai alergen susu utama 16 . Sapi protein susu alergi sebuah ects hingga 2-3% dari bayi
17.
yang baru lahir, dan tren meningkat Metode erent Di telah digunakan untuk mengurangi aller-genicity dari BLG, termasuk
pemanasan, tekanan tinggi, hidrolisis enzimatik dan glikasi 18, 19. Meskipun metode ini dapat mengurangi alergenitas BLG
sampai batas tertentu, struktur dan fungsi protein lain dalam susu sapi telah rusak yang sangat mempengaruhi fungsi gizi susu,
dan sensitisasi BLG tidak sepenuhnya dihilangkan. Sebaliknya, membasmi gen BLG dengan teknologi pengeditan gen
adalah pendekatan yang lebih langsung untuk sepenuhnya memecahkan masalah, yang sangat penting untuk penelitian produk
susu hipoalergenik.

1 Laboratorium Kunci Negara untuk Agrobioteknologi, Sekolah Tinggi Ilmu Biologi, Universitas Pertanian Cina, Beijing, Cina. 2 Pusat
Inovasi Tingkat Lanjut Beijing untuk Nutrisi Makanan dan Kesehatan Manusia, Sekolah Tinggi Ilmu Makanan & Teknik Gizi, Universitas
Pertanian China, Beijing, Cina. 3Beijing Genprotein Biotechnology Company, Beijing, China. Zhaolin Sun, Ming Wang dan Shiwen Han
memberikan kontribusi yang sama. Korespondensi dan permintaan untuk materi harus ditujukan kepada HC
(email: chehuilian@cau.edu.cn ) atau YD (email: YDai@cau.edu.cn )

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 1

www.nature.com/scientificreports/
Gambar 1. Generasi dan identifikasi bebas DNA BLG sapi KO bi-allelic. ( A ) Diagram
alur yang menggambarkan metodologi yang digunakan untuk menghasilkan gen DNA-
bebas yang menargetkan sapi oleh mRNA dan SCNT ZFNs. e mRNA ditranskripsikan dari
plasmid BLG-ZFN secara in vitro , dan garis sel BFF berasal dari janin sapi Holstein
berusia 46 hari. Sel BFF ditransfeksikan dengan mRNA BLG-ZFN menggunakan
Neocleofector. A 24-48 jam, pengenceran terbatas digunakan untuk membentuk koloni sel
tunggal pada konsentrasi sel sekitar 500 sel / piringan (10 cm 2 ). Koloni sel tunggal
dihasilkan kultur er untuk tambahan 7 hingga 10 hari. Koloni sel tunggal positif
diidentifikasi dengan sekuensing dan sebagai donor untuk melakukan NT untuk
menghasilkan sapi KO-bi-allelic BLG yang bebas DNA . ( B ) Bagian gen BLG
yang ditargetkan oleh ZFN. Wilayah yang ditargetkan oleh ZFN berada di E1. Urutan
DNA dari situs pengikatan primer untuk setiap ZFN berwarna merah. situs dipotong
dipotong oleh dimerisasi dari domain noklease FokI berwarna biru. ( C ) Identifikasi sapi
yang ditargetkan ZFNs. Analisis sekuens mengungkapkan bahwa sapi hasil kloning adalah
mutan bi-alelik pada lokus BLG ( - 17 bp / - 16 bp). ( D ) Foto sapi mutan bi-alel #
111027 pada usia 10 bulan.

Kami sebelumnya menghasilkan sapi hasil kloning hidup dengan gen BLG bi-allelic yang
dimodifikasi melalui ZFNs, tetapi gen ini berisi penghapusan kecil dalam bingkai dan tidak
menciptakan alel BLG KO fungsional 20 . Baru-baru ini, susu bebas BLG dan kasein tinggi
berhasil dihasilkan dari sapi transgenik BLG knockdown yang dihasilkan oleh miRNA 21 . adalah
pelopor penelitian pertama kali membuktikan bahwa protein BLG dalam susu dapat dihilangkan
dengan metode transgenik. Namun, metode ini membutuhkan kaset pemilihan puromisin dan
menghasilkan banyak salinan transgenik. Dan sejauh ini, evaluasi alergenisitas susu bebas BLG
belum diselidiki. Untuk mengevaluasi potensi aller-genic protein makanan, model hewan adalah
alat yang berguna untuk penilaian langsung dari potensi kepekaan makanan 22, seperti model tikus
/ c Balb 23 - 25. Salah satu karakteristik penting yang bertanggung jawab untuk alergi protein
makanan adalah stabilitas mereka terhadap pencernaan pepsin 26 .Dalam sebuah penelitian in
27
vivo , protein tahan pepsin meningkatkan permeabilitas usus sebesar 15 kali lipat , sehingga
meningkatkan kemungkinan sensitisasi hewan terhadap protein yang terpajan. Studi serum manusia
dapat menilai reaktivitas klinis alergen makanan berdasarkan tingkat IgE spesifik 28 - 30
. Semua
metode ini dapat digunakan untuk menilai secara sintetis alergenitas susu bebas BLG.

Baru-baru ini, nucleases diprogram transkripsi aktivator seperti nucleases baru efektor
(Talens) dan RNA-dipandu endonuklease (RGENs) telah digunakan untuk mengedit genom
 ternak 31, 32. Namun, hewan ternak bermutasi yang mengandung nukleasi terprogram asing
DAN atau gen penanda selektif mungkin dianggap organisme modifikasi genetik (GMO) oleh
otoritas pengatur di negara-negara tertentu, yang dapat mengurangi penggunaan secara luas
dari nukleasi yang dapat diprogram pada bioteknologi hewan ternak. dan pertanian. Jadi,
penting untuk pengembangan teknologi pengeditan genom DNA-bebas untuk mengurangi
kekhawatiran regulasi yang terkait dengan hewan yang dimodifikasi secara genetika.

Dalam penelitian ini, kami menghasilkan sapi KO-biel allelic BLG biular -free DNA yang
normal tanpa DNA oleh ZFNs mRNA. Sementara itu, susu alami yang diekspresikan
dari sapi KO BLG bi-allelic adalah BLG-free dan hypoallergenic. Selain itu, sekuensing
genom mengungkapkan bahwa hewan kita bebas dari peristiwa o -target dan modi kation
secara stabil ditransmisikan ke progeni dengan multiple ovulation dan embryo transfer
(MOET) 33 . sedang mencari dasar yang kuat untuk "susu perancang " di masa depan.

Hasil
Generasi dari DNA mutasi bi-alelik BLG bebas DNA . Sebelumnya, kami menghasilkan
satu sapi mutasi bi-al- lelis hidup oleh mRNA ZFN, tetapi sapi ini memiliki penghapusan kecil
dalam bingkai dan tidak memiliki fungsi alel BLG KO yang diperlukan untuk produksi susu bebas
BLG 20 . Oleh karena itu, kami menyaring ulang sel tanpa selektif -penanda dan memilih mutasi
frame-shi yang menyebabkan produksi alel null oleh mRNA ZFN, yang sebagai donor untuk
melakukan transfer nuklir (NT) untuk menghasilkan DNA-bebas BLG bi-alelic mutations cow
(Gbr. 1A ). e ZFNs mengenali urutan 40 bp yang menjepit situs pembelahan 6 bp, dalam Exon 1
dari gen BLG (Gambar 1B ). Untuk gangguan gen BLG , 128 koloni sel tunggal diperoleh dan
diurutkan, klon # 112 memiliki mutasi bi-alel, termasuk - 17 bp dan - 16 bp indels yang dapat
menyebabkan mutasi frame-shi (Tabel 1 ). Menggunakan sel kloning ini sebagai donor nuklir
untuk kloning sel somatik, 2 hewan hasil kloning lahir. Satu meninggal segera setelah kelahiran

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 2

www.nature.com/scientificreports/

Membekukan
Saluran Budaya Terpencil Bi-alelik bingkai-shi sel Sel dikloning
seluler metode clonies mutasi diklaster untuk NT
Sel tunggal

0904FFB 128 1 ( - 16 bp / - 17 bp) 1 # 112

budaya

Tabel 1. Skrining sel transfeksi ZFNs.

 Merekonstruksi Blastokista Pregency Hidup
hari jam
Klon sel Oocytes embrio Blastokista tarif% Penerima 60 sapi
0904FFB # 112 321 182 64 35,2 16 5 1

Tabel 2. Ringkasan hasil transfer nuklir.

Gambar 2. Identifikasi ekspresi BLG dalam susu. ( A ) Karakterisasi susu bebas BLG oleh
SDS-PAGE. M, penanda protein; BLG, 2,5 μ g komersial BLG (Sigma) sebagai kontrol
positif; garis 3 –5, 1 µl susu mentah sapi tipe liar dari hari-hari yang berbeda; garis 6 –
8,1 µl susu segar # 111027 (BLG-free) dari hari-hari yang berbeda. ( B ) Karakterisasi
susu bebas BLG oleh Western blot. BLG, 2,5 μ g komersial BLG (Sigma) sebagai kontrol
positif; garis 2 –4, 1 µl susu mentah sapi tipe liar dari hari-hari yang berbeda; baris 5-7,
1 µl susu sapi mentah # 111027 (BLG-free) dari hari yang berbeda. ( C ) Konsentrasi
protein utama dalam susu kontrol dan susu bebas BLG. Hasil ditampilkan sebagai
sarana ± SD. * P <0,05, secara signifikan berbeda dari susu kontrol.
 karena efek yang umum diamati dari kloning sel somatik (Tabel 2 ). Sequencing mengungkapkan
bahwa sisa hewan hidup # 111027 memiliki mutasi bi-alelik ( - 17 bp / - 16 bp) (Gambar 1C ),
dan hewan sehat (Gambar 1D ).

Penilaian BLG dalam susu dari biakan BLG bi-alelik sapi. Untuk mengkonfirmasi
ekspresi BLG, kami memperoleh susu alami pada hari-hari yang berbeda dari BLG bi-alelic
cow # 111027. Analisis sampel susu dengan SDS-PAGE dan pewarnaan biru Coomassie
mengungkapkan bahwa tidak ada sampel susu dari sapi # 111027 yang mengandung kadar
BLG yang terdeteksi. Sebaliknya, BLG mudah dideteksi sebagai protein susu utama pada susu
kontrol tipe liar (WT) (18 kDa, Gambar 2A ). Analisis yang lebih sensitif dari tingkat BLG
oleh Western blotting mengkonstruksikan KO ekspresi BLG karena semua sampel susu dari
sapi pengeditan gen sama sekali tidak terdeteksi BLG (18 kDa, Gambar. 2B ). Kami juga
mendeteksi konsentrasi protein utama dalam susu menggunakan enzyme-linked immune
sorbent assay (ELISA). Meskipun BLG tidak ada dalam susu sapi # 111027, protein total tidak
diubah karena peningkatan ekspresi protein endogen lainnya, seperti albumin serum bovin
(BSA) dan laktoferin (Gambar 2C ). Semua hasil ini menunjukkan kita dihasilkan normal
hidup DNA bebas BLG bi-alel KO sapi # 111.027 oleh ZFNs mRNA, dan susu dinyatakan
alami dari # 111.027 adalah BLG-bebas.

Evaluasi alergenitas susu tanpa BLG oleh model alergi makanan tikus Balb
/ c. Untuk mengevaluasi alergenitas dan nutrisi susu bebas BLG, kami menetapkan model alergi
makanan pada tikus Balb / c seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3A . Kami membobot dan
mencatat mingguan berat badan untuk menilai nutrisi pada tikus Balb / c, dan kami menemukan
tidak ada perbedaan antara susu kontrol dan susu bebas BLG (Gambar 3B ). Untuk menilai
alergenisitas susu bebas BLG, kami pertama-tama mendeteksi suhu rektal, yang dapat
mempengaruhi tingkat alergi makanan, pada tikus yang tersensitisasi sebelum dan setelah tantangan
selama 40 menit. Ovalbumin (OVA), alergen positif sebagai kontrol positif, susu kontrol dan susu
bebas BLG semua dapat menyebabkan penurunan suhu rektal dari mencit Balb / c, namun, dalam
kelompok bebas BLG itu secara signifikan menurun dibandingkan dengan kelompok kontrol susu
(Gambar 3C ), yang dapat menunjukkan susu bebas BLG dapat memicu reaksi alergi yang lebih
rendah daripada susu kontrol. id kami mendeteksi tingkat IgE alergen-spesifik dalam serum semua
tikus yang diuji. Dibandingkan dengan kontrol negatif, OVA, susu kontrol dan susu bebas BLG
semua dapat meningkatkan tingkat IgE alergen-spesifik, namun, susu bebas BLG memiliki produksi
IgE alergen spesifik yang signifikan.

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 3

www.nature.com/scientificreports/
Gambar 3. Analisis model tikus Balb / c Makanan alergi. ( A ) Skema gambar yang
mewakili Balb / c model protokol dan dosis alergi makanan tikus digunakan dalam
pekerjaan ini. ( B ) Berarti berat badan mingguan tikus. ( C ) e variasi suhu rektal (°
C). ( D ) tingkat IgE alergen-spesifik dalam serum. Hasil ditampilkan sebagai
sarana ± SD. * P < 0,05, secara signifikan berbeda dari kontrol negatif dan # P < 0,05,
secara signifikan berbeda dari susu kontrol.
Gambar 4. Pepsin digestion assay dan serum IgE binding analysis. ( A ) uji pencernaan
Pepsin. Kontrol susu power (le) dan susu bubuk BLG bebas (kanan). Jalur 1: penanda berat
molekul; jalur 2-6: sampel dicerna pada 0 detik, 15 detik, 2 menit, 30 menit, dan 60
menit; jalur 7: kontrol pepsin. ( B ) kapasitas IgE-mengikat susu bubuk berbeda untuk
serum dari relawan non-alergi dan pasien CMA. 1-5: sukarelawan non-alergi yang
berbeda; 6 –11: pasien CMA yang berbeda; kotak putih: Kontrol kekuatan susu; kotak
hitam: bubuk susu bebas BLG. ( C ) reaktivitas IgE dari serbuk susu berbeda ditunjukkan
dengan imunoblotting. Jalur 1-2: Kontrol dan bubuk susu bebas BLG. Hasil ditampilkan
sebagai sarana ± SD. * P <0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; NS, tidak signi kan.

dibandingkan dengan konsentrasi susu kontrol yang sama (kelompok sedang dan tinggi,
Gambar. 3D ). Dari hasil model alergi makanan pada tikus Balb / c, kami mencapai
kesimpulan bahwa susu bebas BLG dapat menurunkan penurunan suhu rektal dan produksi
IgE alergen spesifik, yang menunjukkan bahwa alergenitasnya lebih rendah.

Evaluasi susu alergenisitas BLG bebas oleh pepsin pencernaan assay dan serum
manusia IgE mengikat - analisis ing. Jika protein alami harus mempertahankan
alergenisitasnya, maka fragmen asam amino dari IgE-binding

situs protein umumnya akan mentoleransi pencernaan pepsin. kita, protein ini dapat diserap oleh
mukosa intesti-nal dan menginduksi respon imun 34 . Oleh karena itu, fragmen protein biasanya
menunjukkan genetika aller yang lebih kuat, yang masih dapat dideteksi selama 60
menit pada pencernaan in vitro . Dalam hasil pencernaan pepsin, 5 sampel susu bubuk mg / mL
diambil pada 0 detik, 15 detik, 2 menit, 30 menit dan 60 menit dan diperiksa oleh SDS-
halaman. Susu bubuk bebas BLG mudah dicerna oleh pepsin pada 2 menit, sementara BLG (18
kDa) dalam susu bubuk kontrol masih belum dicerna selama 60 menit perawatan
 (Gambar 4A ). Sementara itu, analisis serum IgE juga dilakukan untuk mendeteksi kapasitas
pengikatan BLG dalam dua jenis susu dan speci-IgE pada serum pasien CMA . Kami mendeteksi

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 4

www.nature.com/scientificreports/

#
De novo indels
#
Degenerasi dalam
#
A Of-target 111027
TALEN
berpasangan Genom luas Dalam 20 bp dari indel

0_0 *
1 1
1_4 0 0
1_5 0 0
2_4 1 0
3_3 0 0
2_5 0 0
3_4 3 0
3_5 19 0
4_4 7 0
4_5 112 0
5_5 354 0
total 497 1

Tabel 3. Degenerasi situs ZFN dalam genom sapi. * Situs On-Target.

kemampuan mengikat sera spesifik dari ve relawan sehat non-alergi (serum nomor 1- 5) dan enam
pasien CMA yang alergi terhadap susu sapi (jumlah serum 6 -11) ke susu kontrol dan susu bebas
BLG menggunakan dua metode yang berbeda: ELISA dan Western blotting. Dari hasil ELISA
(Gbr. 4B ), kemampuan pengikatan susu bubuk BLG-bebas untuk serum nomor 7-11 dari pasien
CMA secara signifikan berkurang dibandingkan dengan yang dari susu bubuk kontrol
( * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P <0,001). Selain itu, hampir tidak ada ikatan antara serum
sukarelawan sehat non-alergi dan susu sapi . Khususnya, pengikatan serum nomor 6 dari pasien
CMA tidak dipengaruhi oleh susu bebas BLG, mungkin karena susu mengandung berbagai alergen
dan BLG bukanlah alergen yang relevan untuk pasien ini. Demikian pula, BLG adalah alergen
utama untuk serum nomor 9 dan
10 dengan perbedaan yang sangat signifikan ( *** P < 0,001); itu juga merupakan salah satu
alergen untuk serum nomor 7, 8 dan
11 dengan berbagai tingkat perbedaan (jumlah serum 7 dan 11, *
P < 0,05; jumlah serum
8, ** P < 0,01). id, kami selanjutnya memastikan apakah kadar serum yang menurun juga
diinduksi dengan kolam campuran pasien CMA yang alergi terhadap susu sapi (serum nomor
9 dan 10) menggunakan Western blotting. Dalam susu kontrol, ada pita yang terlihat pada 18
kDa, berat molekul BLG, dibandingkan dengan susu bebas BLG (Gambar 4C ). Dengan
kombinasi resistensi pepsin dan analisis serum IgE, kami mencapai kesimpulan bahwa susu
bebas BLG yang dihasilkan dari sapi knockout BLG memiliki alergenitas yang lebih rendah,
yang dapat digunakan untuk meringankan penderitaan pasien yang alergi terhadap sapi. susu.

Analisis off-target dari BLG mutasi bi-alelik sapi. Efek o -target adalah kelemahan
utama dari ZFNs. Untuk mengevaluasi efek o -target pada sapi knockout BLG bi-
allelic DNA-bebas bahwa apakah ada penghapusan-penyisipan (indels) yang dapat dirujuk ke
pembelahan DNA o -target oleh ZFNs. Kami mengurutkan genom dari kloning sapi mutan #
111027 ke rata-rata 19 × cakupan menggunakan platform Illumina HiSeq (PE125). Pemetaan
yang diurutkan secara berurutan membaca genom referensi sapi (UMD_3.1.1 (UCSC)), kami
mengidentifikasi induktor ZFNs-spesifik. Kami menilai semua induser potensial yang tersisa
untuk kedekatannya dengan merosot situs-situs o -taraksi ZFN, memungkinkan degenerasi
hingga 10 bp mismatch per pasangan ZFNs, 5 bp untuk setiap monomer ZFNs. Kami juga
memungkinkan panjang spacer bervariasi dari 4 bp hingga 16 bp, daripada optimal 6 bp yang
terdapat di situs on-target. degenerasi memperluas ruang target yang kami pertimbangkan dari
satu situs ( BLG ) sepanjang 40 bp, menjadi 497 situs (Tabel 3 ). Hanya pengeditan yang
kami maksudkan yang dipetakan ke dalam 20 bp dari target yang terdegradasi. Hasil ini
menunjukkan bahwa hewan-hewan kita bebas dari peristiwa o -target dan lebih lanjut
mendukung kota speci tinggi mRNA ZFN, terutama untuk lokus ini.

Mutasi BLG dapat diteruskan secara stabil ke generasi selanjutnya melalui

transmisi germline. e transmisi germline mutasi transgenik merupakan perhatian
penting. Oleh karena itu, kami juga menyelidiki apakah alel target darigen BLG dapat
ditularkan melalui germline. Pada ~ 16 bulan, metode MOET digunakan untuk menggandakan
progeni pendiri BLG - / - wanita # 111027. Empat F 1 o musim semi lahir, dan genotipe
dimonitor melalui PCR. Seperti yang diharapkan, semua keturunan mewarisi satu alel mutan
dari genetika yang diubah induknya (Gambar 5A ). Saat ini, musim semi F 1 o hidup normal
(Gambar. 5B ).

Diskusi
Dalam studi ini, kami menghasilkan DNA bebas B LG bersifat bialel KO kloning sapi dengan
SCNT menggunakan ZFNs sel mRNA bertarget. Susu dari sapi hasil kloning bebas BLG dan
hypoallergenic. BLG milik keluarga alergi lipoca-lin yang kuat, dan ASI tidak mengandung
BLG 35 . Dalam susu sapi , BLG menyajikan dalam bentuk biopolimer dengan berat molekul pada
36 kDa, terhitung sekitar 50% dari protein whey dan sekitar 10% dari total protein susu. BLG adalah
protein yang sangat terstruktur dan dapat menahan hidrolisis asam dan protease. Sebuah pencernaan
usus lambung, itu masih mempertahankan integritas protein atau fragmen sensitif, yang dapat
menyebabkan reaksi alergi. Studi telah menunjukkan bahwa sekitar 60% dari CMA dimediasi oleh
36
IgE disebabkan oleh BLG , oleh karena itu, BLG dianggap sebagai salah satu alergen yang paling
penting dalam susu. Jadi, produksi sapi KO BLG penting untuk meningkatkan kualitas susu dan
membuatnya lebih cocok untuk pasien alergi susu sapi.
RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 5

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 5. Transmisi Germline dari Modifikasi BLG- tertanggal. ( A ) Identiasi dari

F 1 BLG sapi knockout dengan urutan. ( B ) gambar e dari F 1 sapi.

21
Telah dilaporkan bahwa ternak BLG knockdown telah dihasilkan oleh miRNA . Meskipun
susu yang diinduksi dari ternak ini bebas BLG, susu laktasi alami tidak terdeteksi. Sementara itu,
metode ini membutuhkan gen resistensi antibiotik dan menghasilkan banyak salinan
transgenik; Selain itu, satu-satunya anak sapi transgenik hidup tidak memiliki ekor. Hal ini juga
diketahui bahwa keberadaan gen penanda asing mengganggu ekspresi gen endogen meringkik-
37, 38,
membosankan menghambat fenotipik dan analisis genetik sementara itu, mungkin juga
menimbulkan kekhawatiran publik mengenai keamanan hayati. kami, penting untuk menghasilkan
ternak genome-modi kation tanpa penanda. Pigmentasi gen penanda bebas gen, embrio domba dan
sapi telah dihasilkan oleh injeksi zygote CRISPR / Cas sistem 39 , 40 , tetapi metode ini sebagian
besar menghasilkan mosaik dari modifikasi dan banyak mutasi acak. Satu atau dua putaran
pemuliaan lebih lanjut harus dilakukan untuk mendapatkan homozigot dengan genotipe dan fenotipe
identik. Baru-baru ini, oligonukleotida DNA bermediasi zigot (ODNs) telah dilaporkan pada sapi
yang dapat meringankan beberapa cacat 41 . Untuk sepenuhnya mengatasi masalah ini, metode baru
telah dilaporkan bahwa sel somatik yang ditargetkan gen dapat digunakan sebagai donor untuk
transfer nuklir sel somatik (SCNT) untuk menghasilkan babi yang ditargetkan gen dengan mutasi
 31 , 32 , 42
tunggal dan identik. Namun, laporan ini juga menggunakan gen resistensi antibiotik dan
berisi ekspresi konstitutif komponen CRISPR / Cas9 dalam klon yang ditargetkan gen 32 , yang
mungkin juga menyebabkan peningkatan frekuensi mutasi o -target 43 - 46 .

Baru-baru ini, gen pengeditan alel penyidik nonmeiotik dan intramesi telah dihasilkan dengan
menggunakan TALEN mRNA 14 , 15 . Dalam penelitian ini, dengan menggunakan mRNA ZFN,
kami juga menghasilkan BLG bioloik klonal sapi yang hidup bebas DNA bebas tanpa klon sapi
tanpa komponen gen lain dan susu bebas BLG, yang pucat peran penting pada penerimaan ternak
yang diedit untuk konsumsi manusia di masa depan. Selain itu, baru-baru ini dilaporkan bahwa
media pematangan kimiawi yang dilengkapi dengan tiga sitokin (FGF2, LIF, dan IGF1) dalam
kombinasi, yang disebut "FLI menengah ", meningkatkan efisiensi empat kali lipat dalam produksi
babi yang dimodifikasi secara genetik oleh SCNT 47 . Dengan pengembangan SCNT dan teknologi
CRISPR / Cas9 48 , 49 yang lebih efisien dan mudah , ini dapat mempercepat produksi gen
penyunting gen tanpa penanda di masa depan.

Meskipun telah dihasilkan susu yang diinduksi BLG-bebas dengan metode transgenik 21 ,
sejauh ini alergenisitas susu bebas BLG belum diselidiki. kami, dalam penelitian ini kami
mengevaluasi alergenisitas susu yang diekspresikan dengan natrium bebas BLG menggunakan
model alergi makanan Balb / c tikus, pepsin digestion assay dan analisis IgE serum manusia
mengikat. Kami menemukan bahwa susu bebas BLG dapat memicu reaksi alergi yang lebih
rendah dan memiliki nilai gizi yang sama dibandingkan dengan susu kontrol. e suhu rektal
menurun, dan tingkat IgE spesifik susu mencit Balb / c yang diuji dalam kelompok susu bebas
BLG menurun secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol susu.Sementara itu,
tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat badan antara kedua kelompok. id, analisis
pencernaan pepsin dan analisis IgE serum manusia membuktikan kembali
hipoalergenitasnya. Susu bebas BLG lebih mudah dicerna oleh pepsin. Kami juga mendeteksi
kapasitas pengikatannya ke serum pasien CMA. Dalam beberapa serum pasien CMA ,
binding menurun secara signifikan (jumlah serum 7-11 dari pasien CMA), sementara tidak ada
perubahan dalam serum nomor 6 dari pasien CMA karena BLG bukan merupakan alergen
utama pasien ini. Sapi BLG-free kami menghasilkan susu BSA dan laktoferin tinggi. Yang
penting, laktoferin sapi adalah multifungsi gly-coprotein terlibat dalam penyerapan usus besi
dan aktivitas antimikroba 50, 51, yang juga telah ditambahkan ke dalam susu dalam yogurt
51.
manufaktur kami, temuan ini menunjukkan bahwa susu bebas BLG kami mungkin
memiliki aktivitas antimikroba yang lebih kuat daripada susu biasa. Kesimpulannya, kami
memproduksi susu hypoallergenic menggunakan teknologi pengeditan gen. Studi kami
memberikan dasar penting untuk menghilangkan lebih banyak protein alergenik dalam susu
untuk menghasilkan "susu yang dimanusiakan" non-alergen di masa depan.

Aplikasi nukleasi direkayasa dalam penelitian, bioteknologi, dan obat-obatan terhambat

oleh efek o -target mereka. Baik ZFNs, TALEN dan Cas9 dapat menginduksi mutasi di situs-
situs o -target yang sangat homol-ogous ke situs-situs yang ditargetkan. Dalam penelitian
kami, kami menggunakan sekuensing genom untuk mendeteksi o potensi -target di BLG bi-
alel KO sapi dan menemukan bahwa hewan kita bebas dari peristiwa o -target. mungkin
disarankan tinggi speci kota mRNA ZFNs khususnya untuk lokus ini, tetapi tidak semua lokus
lainnya. Dengan pengembangan teknologi mengurangi o-tarung, itu dapat meningkatkan
aplikasi hewan ternak penyuntingan gen 52 , 53 .

Transmisi germline mutasi transgenik merupakan perhatian penting. Dalam penelitian

ini, kami membuktikan transmisi germline mutasi BLG dan mempercepat produksi jumlah o
spring dari genome-editing F 0 sapi menggunakan MOET33 . Metode kami dapat
 mempercepat penerapan bovin pengeditan genome yang sangat berharga di masa depan. Yang
penting, sapi penyuntingan gen tanpa DNA kami mengandung delesi kecil (indels) di lokasi
target kromosom yang tidak dapat dibedakan dari variasi genetik yang terjadi secara alami,
apalagi susu bebas BLG adalah alergenitas yang lebih rendah daripada susu biasa. Jadi, itu
mungkin dikecualikan dari peraturan GMO saat ini di masa depan.

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 6

9 , 56 ,57

20 , 55
www.nature.com/scientificreports/

Namun, hanya satu sapi KO KO bi-allelic diperoleh dalam penelitian ini, yang mungkin membatasi penerapan produksi skala besar susu yang dirancang. mungkin disebabkan terutama oleh rendahnya efisiensi teknologi SCNT 54
, Selain itu, temuan ini dikaitkan

dengan peningkatan tingkat aborsi dan masalah kesehatan karena pemrograman ulang epigenetik yang tidak lengkap dari inti donor somatik. Dalam penelitian ini, hanya tiga puluh rekonstruksi

embrio yang disusun dipindahkan ke enam belas hewan penerima. Oleh karena itu, untuk mendapatkan BLG bi-allelic knockout cows, mentransplantasikan banyak

embrio yang direkonstruksi ke banyak hewan penerima diperlukan. Memang, dalam penelitian sebelumnya, lebih banyak hewan kloning transgenik diproduksi
menggunakan lebih banyak embrio dan hewan penerima.

Selain itu, pengembangan teknologi SCNT 58 , 59 dan peningkatan efisiensi SCNT 60

dapat
mempercepat aplikasi produksi skala besar dari susu yang dirancang.
Singkatnya, kami menghasilkan sapi knockout BLG bi-allelic DNA-bebas oleh mRNA
ZFN, yang menghasilkan susu hypoallergenic. ZFN dan metode pengeditan genom lainnya
dapat membangun alternatif untuk metode berbasis genetika transgenik (genetika) untuk
perbaikan genetik ternak dan produksi susu “ perancang ” untuk manfaat kesehatan manusia.

Material dan metode

Pernyataan etika. Semua percobaan hewan termasuk percobaan sapi transgenik dan
makanan tikus Balb / c model alergi dilakukan sesuai dengan Panduan untuk Kesejahteraan
dan Etika Penelitian Hewan dan disetujui oleh Komite Kesejahteraan dan Inspeksi
Kesejahteraan Hewan di Universitas Pertanian China (Nomor Izin: SKLAB-2013- 06-01
untuk eksperimen sapi transgenik dan FSNE-2017-02-05). Semua upaya diarahkan selama
percobaan hewan untuk meminimalkan tuntutan. Studi ini disetujui oleh Dewan Tinjauan
Institusional Universitas Pertanian China, dan semua metode dilakukan sesuai dengan
pedoman dan peraturan yang relevan. Orang tua atau wali hukum dari semua donor diberikan
persetujuan untuk penelitian, yang disetujui oleh komite etika Universitas Pertanian China
(No. 2017-04-11).
Generasi mRNA ZFNs. Metode ini berasal dari penelitian kami sebelumnya 20
. Brie y,
Xba I (New England Biolabs, USA) linierisasi yang ZFNs plasmid DNA, yang termasuk
promotor T7, hilir ZFNs coding daerah sebagai template (1μ g) untuk in vitro transkripsi
(IVT). Sebuah mMACHINE ®
T7 mRNA tran-scription kit (Ambion) digunakan untuk
melakukan IVT, dan mRNA PolyA Tailing Reaction menggunakan Poly (A) Tailing Kit
(Ambion), diikuti oleh puri kation dari mRNA tailed dengan kit MEGAClearTM ( Ambion). e
mRNA diencerkan hingga sekitar 500 ng / μ L untuk transfeksi dan disimpan pada - 80 ° C.

Transfeksi fibroblast primer. e betina primer janin sapi bohin (BFFs)

ditransfeksikan dengan BLG-ZFNs mRNA menggunakan program T-016 pada
Nucleofector TM (AMAXA) dari metode kami sebelumnya 20 .

SEBUAH Rasio co-transfeksi dari 1: 1 digunakan dan masukan mRNA total adalah 4 μ g /
10 6 sel. Membatasi pengenceran digunakan untuk mengisolasi koloni sel membentuk transfeksi
24-48 ha, dan konsentrasi sel sekitar 500 sel / piringan (10 cm 2 ).Klon sel individu diisolasi 7-10
hari pelarutan budaya, yang mana budaya diperluas dan urutan mereka dianalisis. Sel dik
cryopreservasi total 12-14 hari dalam budaya.

Identifikasi BLG -targeted clone positif. DNA genom diekstrak dari koloni sel
tunggal menggunakan DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Hilden, Jerman). e primer termasuk
primer Forward BLG: 5 ′ AGGCCTCCTATTGTCCTCGT3 ′ danprimary Reverse BLG:
5 ′ GCAAAGGACACAGGGAGAAG3 ′ . Kondisi amplifikasi adalah sebagai berikut: 94 ° C
selama 10 menit, kemudian 35 siklus 94 ° C selama 1 menit, 54 ° C untuk 30 detik dan 72 ° C selama
30 detik, diikuti dengan ekstensi pada 72 ° C selama 10 menit. Produk PCR adalah kloning TA dan
diurutkan.

Transfer inti sel somatik. Semua kloning sapi dihasilkan oleh transfer nuklir
somatik. Prosedur e untuk pematangan in vitro (IVM) oosit sapi dijelaskan sebelumnya 20 . Brie
y, kumulus-oocyte complexes (COCs) disedot dari folikel dan matang selama 18-20 jam dalam
medium maturasi (TCM199, 10% serum janin bovine (FBS), 0,01 U / ml bovine follicle-stimulating
hormone (bFSH), 0,01 U / ml bovine luteinizing hormone (bLH), 1 mg / ml estradiol-17) (Teknologi
Life). Oosit matang di enukleasi dan menyatu dengan sel donor yang diperkaya di G 0 dari siklus
sel dengan dua pulsa DC 2,5 kV / cm untuk 10 md setiap pada 1 s terpisah, disampaikan
menggunakan BTX2001 Electro Cell Manipulator (BTX, San Diego, CA) , AS). Embrio yang
direkonstruksi diaktivasi di media yang dilengkapi dengan 10 mg / ml sikloheksimida dan 2,5 mg /
ml cytochalasin D dan dikultur untuk membentuk blastokista pada hari ke 7. e blastokista berkualitas
tinggi ditransfer ke sapi penerima yang disinkronisasi 7 hari setelah estrus ( dua blastokista /
penerima). Sapi yang hamil dimonitor dengan palpasi rektal secara berkala.

Identifikasi sapi BLG yang belum diolah. DNA genom diekstrak dari telinga anak sapi
yang baru lahir oleh DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Hilden, Jerman). Selanjutnya,
DNA genom diperiksa melalui PCR. e primer termasuk primer Forward BLG:
5 ′ AGGCCTCCTATTGTCCTCGT3 ′ dan primary Reverse BLG:
5 ′ GCAAAGGACACAGGGAGAAG3 ′ . Kondisi amplifikasi adalah sebagai berikut: 94 ° C
selama 10 menit, kemudian 35 siklus 94 ° C selama 1 menit, 54 ° C untuk 30 detik dan 72 ° C
selama 30 detik, diikuti dengan ekstensi pada 72 ° C selama 10 menit. Diperkirakan panjang
ampli kation adalah 546 bp. Produk PCR adalah kloning TA dan diurutkan.

Koleksi susu transgenik. Sampel susu laktasi alami dikumpulkan pada hari 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,
15, 17, dan 19 dari sapi BLG yang ditargetkan # 111027 dan sapi tipe liar. Dua puluh lima liter susu
diperoleh pada hari rata-rata, dan bagian dari susu yang dikumpulkan disentrifugasi pada 12.000 g
selama 5 menit untuk defat, dan konsentrasi total protein diperkirakan untuk analisis lebih
lanjut. Seratus liter sampel susu bebas BLG dan susu kontrol dikering-bekukan untuk menyiapkan
bubuk susu yang bagiannya digunakan untuk melakukan uji alergenisitas.
RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 7

www.nature.com/scientificreports/

SDS-PAGE, Western blotting dan ELISA analysis. Sampel susu dari sapi target BLG
dan sapi liar dikumpulkan. Sampel protein susu 1,0 mL disentrifugasi pada 12.000 g selama 5 menit
untuk defat, dan kemudian sampel susu yang dihilangkan lemaknya mengandung 30 µ g protein
susu seperti yang diperkirakan dengan metode BCA (Beyotime, Shanghai, Cina) dianalisis dengan
SDS-PAGE dan analisis Western blot. Untuk SDS-PAGE, protein susu sam-ples dipisahkan pada
15% gel poliakrilamida tris-glisin di bawah denaturasi dan mengurangi kondisi, dan kandungan
protein yang quanti ed dengan mati gel dengan biru brilian Coomassie. Untuk analisis Western
blotting, sampel susu yang dilarutkan dipisahkan pada 15% gel poliakrilamida dalam kondisi
denaturasi dan reduksi dan kemudian dipindahkan ke membran polivinil di uorida (Invitrogen
Corporation, Carlsbad, CA, USA), yang diinkubasi dengan antibodi anti-bovine anti-bovine
(pengenceran, 1: 10000; Amerika Serikat Biologis, Inc., Swampscott, MA, USA) dan horseradish
peroxidase (HRP) -conjugated antibodi IgG anti-kelinci sekunder sekunder (pengenceran, 1:
10000;Sino-American Co., Beijing, China). Kami menggunakan BCA untuk mendeteksi
konsentrasi total protein dan perangkat ELISA komersial (eBioscience, Inc., San Diego, CA) untuk
protein utama (BLG, kasein, α protein -whey, BSA, laktoferin dan imunoglobulin) dalam susu.

Penetapan model alergi makanan pada mencit Balb / c. Balb / c tikus dalam
penelitian kami diperoleh dari Vital River Laboratories, Inc. (Beijing, Cina). Penelitian ini
dilakukan di laboratorium khusus hewan patogen bebas (SPF) dari College of Food Science dan
Nutritional Engineering, China Agricultural University (Beijing, China). Kamar-kamar hewan
dipelihara dengan suhu 22 ± 1 ° C, kelembaban 55 ± 5%, siklus cahaya / gelap 12 jam dan
pertukaran udara pada 15 kali / jam. Pakan dan air diberikan ad libitum. Feed pemeliharaan hewan
pengerat SPF komersial yang diproduksi oleh umpan Ke Ao Xie Li Co. Ltd. (Beijing, Cina)
memenuhi Standar Cina GB14924.3-2010. Percobaan hewan dalam penelitian kami dilakukan
sesuai dengan Panduan untuk Kesejahteraan dan Etika Eksperimen Hewan dalam Ilmu Pangan dan
Sekolah Tinggi Gizi Universitas Pertanian China dan telah disetujui oleh Komite Kesejahteraan dan
Inspeksi Kesejahteraan Hewan di Universitas Pertanian China. Semua upaya diarahkan selama
percobaan hewan untuk meminimalkan serangan. Sembilan puluh enam tikus betina Balb / c (usia
5-6 minggu) secara acak dibagi menjadi 8 kelompok yang memiliki perbedaan berat badan
awal ± 20%: Kontrol negatif, Kontrol positif, Kontrol bubuk susu (1 mg, 2 mg atau 4 mg protein
total dalam sampel susu bubuk kontrol) dan susu bebas BLG (1 mg, 2 mg atau 4 mg protein total
dalam BLG- sampel susu bubuk gratis). Sensitisasi dicapai di semua kelompok dengan pemberian
oral dari protein dosis yang berbeda (OVA dalam kontrol positif, susu kontrol dan susu bebas BLG)
di 200 μ L PBS pada hari 0, 7, 14, 21 dan 28. Tikus dalam Kontrol kelompok hanya digali dengan
PBS pada saat sensitisasi. Semua tikus kemudian ditantang dengan sampel protein susu bubuk 10
kali lipat (kelompok kontrol negatif dan positif semua ditantang dengan OVA) pada hari ke 42
(Gambar 3A ).

Bobot tubuh dan penurunan suhu rektal. Berat badan diukur dan
dicatat suhu mingguan dan dubur diukur sebelum dan 40 menit tantangan menggunakan probe
WI88375 (Sains dan Teknologi Beijing, Beijing, Cina).

Tingkat IgE spesifik alergen dalam serum. Sampel darah dikumpulkan dari
pleksus vena sudut pada hewan di setiap kelompok pada 30 menit tantangan pada hari ke 42.
e serum disimpan pada - 20 ° C untuk mengukur alergen spesifik IgE menggunakan metode
ELISA, sesuai dengan yang ditetapkan prosedur 28 , 29 . e spesifik c penentuan antibodi adalah
sebagai berikut: piring 96-baik dilapisi dengan alergen (OVA, susu kontrol atau susu BLG-
 bebas, 2 μ g / baik) dilarutkan dalam bikarbonat karbonat bu er (pH 9,6) dan diinkubasi selama
malam di 4 ° C. id, a mencuci 3 kali dengan PBST (0,05% Tween 20 / PBS), 200 μ Larutan
BSA ditambahkan ke dalam sumur (1% BSA / PBS) dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 °
C. serum tikus (pengenceran 1:10) ditambahkan ke dalam sumur (100 μ L / well) satu kali
pencucian 3 kali. e piring sekali lagi diinkubasi selama 1 jam pada 37 ° C dan dicuci 3 kali.
Selanjutnya, 100 μ L / well dari IgE anti-Tikus HRP terkonjugasi terkonjugasi (Abcam)
(2000 × diencerkan) ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 ° C. Sebuah er
mencuci 6 kali, 100 μ L dari TMB ditambahkan dan diinkubasi dalam gelap selama 15 menit
pada 37 ° C. id, 50 μ L dari H 2 SO 4 (2 M) ditambahkan ke sumur dan OD pada 450 nm dibaca
menggunakan pembaca mikroplate otomatis Multiskan MK3 (ermo Scienti c).

Uji pencernaan pepsin. Pepsin pencernaan uji sampel protein dilakukan menurut No
869 buletin dari Departemen Pertanian deteksi keamanan pangan dari organisme ed genetik
modi dan berasal prod-ucts: Metode protein target stabilitas pencernaan di lambung simulatif
dan usus uid 61 . Kontrol dan bubuk susu transgenik menjadi sasaran pencernaan
gastrointestinal in vitro pada konsentrasi nal 5 mg / mL. Singkatnya, protein dilarutkan dalam
cairan lambung terstimulasi (SGF, 2 g / L NaCl) pada pH 1,2, dipanaskan selama 5 menit pada
37 ° C dan dikenakan secara in vitro. gastric digestion dengan porcine pepsin (3200-4500 U /
mg protein, Sigma -Aldrich) pada rasio enzim / substrat 19: 1. Pada setiap titik waktu (0 s, 15
s, 2 menit, 30 menit dan 60 menit), 200 μ L dari campuran reaksi dipindahkan ke tabung
sampel yang berisi 70 μ L dari 5 × Laemmli bu er (40% gliserol, 5% 2-mercaptoethanol, 10%
SDS, 0,33 M Tris, 0,05% bromophenol blue, pH 6,8) dan 70 µ L 800 mM NaHCO 3 . Semua
sampel yang dinetralkan kemudian direbus pada 100 ° C selama 5 menit dan dikenakan SDS-
PAGE.

Analisis IgE serum serum manusia dengan ELISA dan Western

blotting. Kami mengumpulkan masing-masing 5 mL serum dari enam anak CMA yang
diverifikasi dan lima sukarelawan non-alergi yang direkrut dari Rumah Sakit Ketiga Universitas
Peking (Beijing, Cina). Penelitian ini disetujui oleh Dewan Pengkajian Kelembagaan dari
Universitas Pertanian China, dan semua donor memberikan informed consent. Untuk ELISA,
metode ini dijelaskan dalam tingkat IgE Allergen-spesifik dalam serum. e plate diinkubasi dengan
100 μ L biotin-konjugasi poly-clonal anti-manusia IgE dilarutkan 1: 1000 dalam media
pengenceran antibodi selama 1 jam pada 37 ° C diikuti oleh 100 μm. L HRP-kelinci konjugasi anti-
biotin diencerkan pada 1: 2000 dalam pengenceran antibodi selama 1 jam pada 37 ° C. Untuk
Western blotting, kontrol dan bubuk susu bebas BLG dipisahkan oleh SDS-PAGE, electroblotted
ke nitrocellulose mem-brane dan diinkubasi selama 1 jam di RT dengan 5% BSA di
TBST. membran e diinkubasi semalam pada 4 ° C dengan

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 8

www.nature.com/scientificreports/

pengenceran serum dari pasien alergi. Antibodi IgE yang terikat dideteksi menggunakan HRP-
tikus terkonjugasi anti-manusia IgE diencerkan 1: 1000 di TBST. e strip ringan-tahan dan
diinkubasi dengan substrat TMB di RT selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan air
suling. Setelah penghentian reaksi, membran terpapar ke lm.

Off-Target. DNA dari BLG bi-allelic knockout cow bebas DNA # 111027 telah diserahkan
kepada perusahaan BGI-Shenzhen dan disiapkan untuk pembangunan susunan sekuens
Illumina. Data urutan 19X dihasilkan di platform HiSeq dengan mode PE125. Data sekuensing
dari dua sampel dipetakan ke genom referensi sapi (UMD3.1.1) dengan BWA (Versi 0.7.10-
r789), dan Indels dipanggil oleh GATK (Versi 3.5-0-g36282e4). Kami memeriksa ZFNs -speci
 c indels ke dekat situs-situs o -target potensial dengan skrip Perl kustom. Brie y, jarak antar
lengan ZFNs diizinkan menjadi 4 –16 bp, ketidaksesuaian masing-masing monomer ZFN (17
bp) hingga 5 bp. Untuk semua urutan pencocokan yang dihitung, kami mengekstraksi
informasi yang sesuai untuk perbandingan-com dengan de novo indels # 111027. BEDTools
diadopsi untuk nd de novo indels dalam jarak 20 bp dari target potensial yang diprediksi untuk
hewan yang diedit.

MOET assay. Prosedur untuk MOET dijelaskan sebelumnya 33 . Brie y, di

pagi hari pertama dari siklus estrus, CUE-Mate disuntikkan pada hari ke-0. Dari hari ke 5
sampai hari ke 8, Folltropin-V disuntikkan dua kali sehari pada jam 8 pagi dan 8 malam, dan
konsentrasi masing-masing adalah 24,0 mg, 18,0 mg, 12,0 mg, dan 6,0 mg. Propilen glikol
(PG), 4,0 mL, disuntikkan pada hari ke 7 setelah injeksi Folltropin-V dan penarikan steker
selama injeksi Folltropin-V pada pagi hari ke-8. estrus dini diamati pada hari ke 9. Pemuliaan
pertama dilakukan 12 ha estrus. Pemuliaan kedua dilakukan pada interval 12 jam. Embrio
donor non-bedah ditanamkan pada hari ke-16 dan ditransplantasikan ke sapi penerima pada
hari ke-7 sebagai estrus.

Analisis statistik. Analisis statistik data dilakukan menggunakan GraphPad Prism versi 5.0
untuk Windows (Inc.7825 Fay Avenue, Suite 230 La Jolla, CA 92037 USA). One-way
ANOVA diikuti dengan uji perbandingan mulely Tukey digunakan untuk perbandingan antara
kelompok dengan distribusi normal. Perbedaan antara kelompok eksperimental dianggap
sebagai signifikan ketika P ≤ 0,05.

Referensi
\ 1. \ El-Agamy, EI e tantangan alergi protein susu sapi. Umminan kecil 68 , 64 –72 (2007).
\ 2. \ Wong, GW Epidemiologi: sudut pandang internasional, dari kecil hingga dewasa, alergen makanan. Imunologi
dan alergi kimia 101 , 30 –37 (2015).
\ 3. \ Wang, J. & Sampson, HA Alergi makanan: kemajuan terbaru dalam patofisiologi dan pengobatan. Alergi,
asma & penelitian imunologi 1 , 19-29 (2009).
\ 4. \ Karatzas, CN Designer susu dari klon transgenik. Nat.Biotechnol. 21 , 138 –139 (2003).
\ 5. \ Sabikhi, L. Susu perancang - Sebuah peristiwa penting dalam bioteknologi susu. Curr Sci India 87 ,
1530 –1535 (2004).
\ 6. \ van Berkel, PHC dkk . Produksi besar laktoferin manusia rekombinan dalam susu sapi
transgenik. Alam bioteknologi 20 , 484 –487 (2002).

\ 7. \ Maga, EA, Cullor, JS, Smith, W., Anderson, GB & Murray, JD Lisozim manusia yang diekspresikan dalam
kelenjar susu kambing perah transgenik dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang menyebabkan mastitis
dan pembusukan-dingin dari susu. Patogen bawaan makanan dan penyakit 3 , 384 –392 (2006).
\ 8. \ Yang, P. et al . Sapi bioreaktor ternak yang dihasilkan oleh prosedur baru kloning transgenik untuk produksi
skala besar laktoferin manusia fungsional. PloS one 3 , e3453 (2008).
\ 9. \ Wang, M. et al . Produksi besar lactoferrin manusia rekombinan dari sapi kloning transgenik berekspresi
tinggi dan berekspresi tinggi. Sci ep-U 7 , 10733 (2017).
10. Brophy, B. et al . Ternak transgenik yang dikloning menghasilkan susu dengan tingkat beta-kasein
dan kappa-kasein yang lebih tinggi. Nat.Biotechnol. 21 , 157 –162 (2003).
\ 11. \ Wall, RJ et al . Sapi yang diperkuat secara genetik menahan infeksi Staphylococcus aureus
intramammary. Bioteknologi alam 23 , 445 –451 (2005).

\ 12. \ Richt, JA et al . Produksi ternak kekurangan protein prion. Bioteknologi alam 25 , 132-138 (2007).

\ 13. \ Wu, HB et al . Tale ST110 knaskin yang dimediasi oleh SP110 memberi makan sapi dengan resistensi yang
meningkat terhadap tuberkulosis. P Natl Acad Sci USA 112 , E1530 –E1539 (2015).
\ 14. \ Carlson, DF et al . Produksi sapi perah tanpa cula dari garis sel yang diedit genom. Nat.Biotechnol. 34 ,
479 –481 (2016).

\ 15. \ Tan, WF et al . Efektivitas pengalihan alel nonmeiotik pada ternak menggunakan endonuklease khusus. P
Natl Acad Sci USA 110 , 16526 –16531 (2013).

\ 16. \ Wal, JM Pembaruan pada alergen - Alergen susu sapi. Alergi 53 , 1013 –1022 (1998).
\ 17. \ Apps, JR & Beattie, RM Alergi susu sapi pada anak-anak. Bmj 339 , b2275 (2009).

18. Hattori, M. et al . Menurunkan imunogenisitas beta-laktoglobulin melalui konjugasi dengan

oligosakarida asam. J Agr Food Chem 52 , 4546 –4553 (2004).
19. \ Ehn, BM, Allmere, T., Telemo, E., Bengtsson, U. & Ekstrand, B. Modifikasi dari IgE yang mengikat beta-
laktoglobulin dengan fermentasi dan proteolisis susu sapi . J Agr Food Chem 53 , 3743 –3748 (2005).

\ 20. \ Yu, SL et al . Modifikasi gen beta-laktoglobulin (BLG) yang sangat efisien melalui nuklease seng-jari pada
sapi. Sel es 21 , 1638 –1640 (2011).
 \ 21. \ Jabed, A., Wagner, S., McCracken, J., Wells, DN & Laible, G. Target ekspresi microRNA pada sapi perah
mengarahkan produksi beta-laktoglobulin, susu kasein tinggi. P Natl Acad Sci USA 109 , 16811 –16816 (2012).

22. Sun, N. et al . Pendekatan bobot-bukti yang dimodifikasi untuk mengevaluasi potensi alergen protein
makanan. Toxicol es-U 4 , 476 –485 (2015).
\ 23. \ Perrier, C., ierry, AC, Mercenier, A. & Corthesy, B. Allergen-speci c antibodi dan tanggapan sitokin,
reaktivitas sel mast dan permeabilitas usus pada tantangan oral tikus peka dan ditoleransi. Clin Exp Allergy 40 ,
153 –162 (2010).

24. Zhou, C. et al . BALB / c tikus dapat digunakan untuk mengevaluasi alergenisitas ekstrak protein makanan yang
berbeda. Makanan Agr Immunol 27 , 589 –603

(2016).
\ 25. \ Chen, C., Lu, LH, Sun, NN, Li, YN & Jia, XD Pengembangan model tikus BALB / c untuk alergi makanan:
perbandingan tanggapan terkait alergi terhadap aglutinin kacang, beta-laktoglobulin dan asam fosfatase
kentang. Toxicol es-U 6 , 251 –261 (2017).

\ 26. \ Amigo-Benavent, M., Clemente, A., Ferranti, P., Caira, S. & del Castillo, MD Digestibilitas dan
immunoreactivity kedelai beta-conglycinin dan bentuk deglycosylated nya. Food Chem 129 , 1598 –1605
(2011).

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 9

www.nature.com/scientificreports/

\ 27. \ Crowe, SE, Soda, K., Stanisz, AM & Perdue, MH Permeabilitas Usus pada Tikus Alergi - Keterlibatan Saraf
pada Perubahan yang Diinduksi Antigen. Am J Physiol 264 , G617 –G623 (1993).

\ 28. \ Sicherer, SH & Sampson, HA 9. Alergi makanan. Te Journal of alergi dan imunologi klinis 117 , S470-
475 (2006).

\ 29. \ Du Toit, G. dkk . Konsumsi awal kacang tanah pada masa bayi dikaitkan dengan rendahnya prevalensi alergi
kacang. J Allergy Clin Immun 122 , 984 –991 (2008).
\ 30. \ Caubet, JC et al . Signi cance dari ovomucoid- dan ovalbumin-speci c IgE / IgG (4) rasio dalam alergi telur. J
Allergy Clin Immun 129 , 739 –747 (2012).
\ 31. \ Carlson, DF et al . Perkelahian gen TALEN-mediated yang efektif di peternakan. P Natl Acad Sci
USA 109 , 17382 –17387 (2012).
\ 32. \ Zhou, XQ et al . Generasi babi yang ditargetkan-CRISPR / Cas9-mediated gen melalui transfer inti sel
somatik. Sel Mol Life Sci 72 , 1175 –1184 (2015).
\ 33. \ Guerra, AG, Tribulo, A., Yapura, J., Singh, J. & Mapleto, RJ Pemanjangan protokol pengobatan
superstimulatory meningkatkan respons ovarium dan jumlah embrio yang dapat dipindahkan pada sapi
sapi. Teriogenology 78 , 353 –360 (2012).

\ 34. \ Fu, TT, Abbott, UR & Hatzos, C. Gestibilitas alergen makanan dan protein nonalergenik dalam cairan
lambung terstimulasi dan cairan usus simulasi - Sebuah studi komparatif. J Agr Food Chem 50 , 7154 –7160
(2002).

\ 35. \ Kontopidis, G., Holt, C. & Sawyer, L. Diundang Ulasan: beta-lactoglobulin: Mengikat sifat, struktur, dan
fungsi. J Dairy Sci 87 , 785 –796 (2004).
\ 36. \ Le Maux, S., Bouhallab, S., Giblin, L., Brodkorb, A. & Croguennec, T. Bovin beta-laktoglobulin / kompleks
asam lemak: mengikat, struktural, dan sifat biologis. Dairy Sci Technol 94 , 409 –426 (2014).

\ 37. \ Olson, EN, Arnold, HH, Rigby, PWJ & Wold, BJ Tahu tetangga Anda: ree phenotypes di mutan null gen
myogenic bHLH MRF4. Sel 85 , 1 –4 (1996).

\ 38. \ Meyers, EN, Lewandoski, M. & Martin, GR An Fgf8 mutan seri alelik yang dihasilkan oleh rekombinasi Cre-
dan Flp-mediated.
 Nat Genet 18 , 136 –141, https://doi.org/10.1038/Ng0298-136 (1998) .
\ 39. \ Hai, T., Teng, F., Guo, RF, Li, W. & Zhou, T. Generasi satu langkah dari babi knockout oleh injeksi zygote
sistem CRISPR / Cas. Sel es 24 , 372 –375 (2014).
40. Proudfoot, C. et al . Genome menyunting domba dan ternak. Transgenik es 24 , 147 –153 (2015).

\ 41. \ Wei, JW et al . Efikasi intransgression varian alel dengan editing embrio genom bovin. Sci ep-
U 5 (2015). \ 42. \ Chen, FJ et al . Generasi babi-sel B yang berkualitas dengan sangat efisien penargetan gen
CRISPR / Cas9-dimediasi. Es transgenik 25 ,
114 –115 (2016).
\ 43. \ Fu, YF et al . Frekuensi tinggi mutagenesis o-tarung yang disebabkan oleh nukleus CRISPR-Cas dalam sel
manusia. Bioteknologi alam 31 , 822 –826 (2013).

\ 44. \ Hsu, PD et al . DNA menargetkan kota nukleus Casia RNA yang dipandu RNA. Bioteknologi alam 31 ,
827 –832 (2013).

45. Mali, P. et al . Aktivator transkripsi CAS9 untuk skrining target khusus kota dan pasangan yang
dipasangkan untuk teknik genom kooperatif. Bioteknologi alam 31 , 833 –838 (2013).

46. Pattanayak, V. et al . Hasil pengukuran tinggi dari pembelahan DNA o-tarek mengungkapkan Casing
RNA yang terprogram nuclease speci city. Bioteknologi alam 31 , 839 –843 (2013).
47. Yuan, Y. et al . Efisiensi empat kali lipat dalam produksi babi yang dimodifikasi secara genetika
melalui peningkatan pematangan oosit. P Natl Acad Sci USA 114 , E5796 –E5804 (2017).
48. Cong, L. et al . Rekayasa Genom Multipleks Menggunakan Sistem CRISPR / Cas. Ilmu 339 , 819 –
823 (2013).
49. Mali, P. et al . RNA-Guided Human Genome Engineering melalui Cas9. Ilmu 339 , 823 –826 (2013).
50. Tomita, M. et al . Dua puluh tahun penelitian tentang aplikasi laktoferin sapi. Biochimie 91 , 52 –57
(2009).
\ 51. \ Franco, I., Castillo, E., Perez, MD, Calvo, M. & Sanchez, L. Pengaruh penambahan laktoferin bovin susu
dalam pembuatan yogurt. J Dairy Sci 93 , 4480 –4489 (2010).

\ 52. \ Ran, FA dkk . Double Nicking oleh RNA-Guided CRISPR Cas9 untuk Peningkatan Genome Editing Speci city
(vol 154, pg 1380, 2013).

Sel 155 , 479 –480 (2013).

\ 53. \ Fu, YF, Sander, JD, Reyon, D., Cascio, VM & Joung, JK Meningkatkan CRISPR-Cas nuclease speci kota
menggunakan RNA panduan terpotong. Bioteknologi alam 32 , 279 –284 (2014).
\ 54. \ Rodriguez-Osorio, N., Urrego, R., Cibelli, JB, Eilertsen, K. & Memili, E. Memrogram ulang sel somatik
mamalia. Teriogenology 78 , 1869 –1886 (2012).

\ 55. \ Yum, SY et al . Generasi yang efektif dari sapi transgenik menggunakan transposon DNA dan analisis mereka
dengan sequencing generasi berikutnya.

Sci ep-U 6 (2016).

56. Yang, B. et al . Karakterisasi lisozim rekombinan bioaktif manusia yang diekspresikan dalam susu
ternak transgenik kloning. PloS satu 6 , e17593 (2011).
57. Lu, D. et al . Produksi besar lisozim manusia fungsional dari sapi kloning transgenik bebas penanda. Sci ep-
U 6 (2016). \ 58. \ Smith, SL et al . Ekspresi gen global yang pro les mengungkapkan pemograman ulang nuklir yang
signifikan oleh blastocyst tahap kloning er. Proc

Natl Acad Sci USA 102 , 17582 –17587 (2005).

59. Jiang, Z. et al . Pengaruh Tekanan Hidrostatik Tinggi pada Ekspresi Pro lesi In Vitro yang Diproduksi
Vitri ed Blastokista Bovin. Sci ep 6 , 21215 (2016).

60. Liu, X. dkk . H3K9 demethylase KDM4E adalah regulator epigenetik untuk perkembangan embrio
bovine dan faktor yang rusak untuk pemrograman ulang nuklir. Pengembangan 145 (2018).
\ 61. \ Standar Cina NO. 869-2 Pengumuman Departemen Pertanian Deteksi keamanan pangan organisme yang
dimodifikasi secara genetika dan produk turunannya: Metode stabilitas protein target dalam cairan usus dan
usus simultan (2007).

Ucapan terima kasih

Kami berterima kasih kepada Dr. Yujun Zhang dari ICMM untuk bantuan dalam analisis
data. Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Liang Ma dan Meili Wang atas bantuan
teknis proaktif mereka dan semua rekan yang memberi kami saran dan komentar berharga
tentang percobaan dan naskah kami. adalah pekerjaan yang didukung oleh Proyek Pemuliaan
Transgenik Nasional China (2018ZX08007001).

Kontribusi Penulis
ZS, NL, HC dan YD mendesain proyek dan merencanakan eksperimen. ZS, MW, SH, SM,
ZZ, FD, XL, LL, BT dan HW melakukan percobaan. e naskah ditulis oleh ZS, HC dan YD
Semua penulis meninjau naskah.
 informasi tambahan
Informasi tambahan menyertai makalah ini di https://doi.org/10.1038/s41598-018-32024-
x.

Minat Bersaing: e penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.

RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 10

www.nature.com/scientificreports/

Catatan penerbit: Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi
dalam peta yang diterbitkan dan afliasi institusional.

Akses Terbuka Artikel ini dilisensikan di bawah Lisensi Creative Commons Attribution
4.0 International , yang memungkinkan penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi dan
reproduksi dalam medium atau format apa pun, selama Anda memberikan kredit yang sesuai
kepada penulis asli dan sumbernya, menyediakan tautan ke Cre

Lisensi Common Commons, dan tunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak
ketiga lainnya dalam artikel ini termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel, kecuali
dinyatakan sebaliknya dalam batas kredit untuk materi. Jika materi tidak termasuk
dalam lisensi Creative Commons artikel dan penggunaan yang Anda maksudkan tidak
diampuni oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang diizinkan,
Anda harus mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi
ini, kunjungi http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ .

© e Penulis 2018
RUMUS ILMIAH | (2018) 8: 15430 | DOI: 10.1038 / s41598-018-32024-x 11