Perubahan yang terjadi pada kedua medium tersebut diamati .

Bila pada medium TSIA

berwarna kuning dan terdapat udara didalamnya (agar terpecah) dan dipermukaan medium
semi solid terdapat gumpalan seperti awan, maka uji indol dilakukan pada medium semi solid
dengan meneteskan pereaksi indol sebanyak 5 tetes. Setelah ditunggu beberapa menit akan
terjadi lingkaran berupa cincin yang berwarna merah muda, berarti uji indol positif. Koloni
pada TSIA yang uji indolnya positif diambil dan ditumhuhkan pada medium urea dan Simon
sitrat, dengan menggunakan ose bermata digoreskan pada permukaan medium agar, setelah itu
diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam.Sesudah diinkubasi diamati adanya perubahan pada
medium urea dan medium Simon sitrat . Bila medium urea berwarna merah berarti terdapat
hakteri yang memproduksi enzym urease dan media Simon sitrat berwarna biru terang
dinyatakan positif, tetapi apabila tidak terjadi peruhahan, berarti negatif.

Uji kepekaan antibiotika Uji kepekaan antibiotika dilakukan dengan menggunakan metode
difusi cakram (disk diffusion method). E.coli inaktif yang diperoleh dari spesimen diuji
kepekaannya terhadap berbagai antibiotik (golongan β-laktam, aminoglikodida, kuinolon dan
golongan antibiotika lainnya). Hasil uji kepekaan tersebut dibaca berdasarkan ketentuan
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).(8) Seluruh cakram antibiotik
merupakan produk Oxoid, kecuali meropenem dari Becton, Dickinson and company (BD). Uji
kepekaan terhadap antibiotik digolongkan ke dalam tiga kriteria sesuai dengan NCCLS, yaitu
resisten (R) bila besarnya zona hambatan 0-10 mm, intermediate (I) bila besarnya zona
hambatan 11-19 mm, dan sensitif (S) bila besarnya zona hambatan di atas 20 mm.

Bakteri ini dapat tumbuh dengan baik pada media bakteri sederhana, seperti agar MacConkey,
dan membentuk koloni besar berwarna merah. Selain itu, dapat pula diidentifikasi dengan
reaksi positif pada uji indol, reaksi negatif pada uji produksi urease, dan hidrogen sulfida
(Gyles 2010).

DNA girase adalah enzim yang terdapat pada bakteri yang menyebabkan terbukanya dan
terbentuknya superheliks pada DNA sehingga menghambat replikasi DNA (Stringer 2006),
Persiapan Kultur Masing-masing isolat Escherichia coli dan Klebsiella pneumonia
diinokulasikan ke media Trypsin Soy Agar untuk pertumbuhan isolat yang umum dan
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Bakteri yang telah ditumbuhkan kemudian diambil
dengan menggunakan ose dan di inokulasikan ke media agar Mac Conkey Agar dan kemudian
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Media ini digunakan untuk pertumbuhan isolat
selektif atau khusus Gram negatif. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut, diambil dengan
menggunakan ose dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl steril 9 ml sebanyak masing-masing
1 tabung. Lalu larutan tersebut dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit untuk membuat
suspensi dengan konsentrasi 3.0x108 CFU/ml sesuai dengan kontrol cairan suspensi Mcfarland
Tipe 1 dari CLSI (2008). Diffusion Test Suspensi bakteri disebarkan ke atas permukaan media
Mueller Hinton Agar dengan menggunakan cotton swab steril dan masing-masing sebanyak 10
cawan Petri untuk setiap satu bakteri. Setiap cawan Petri tersebut dibagikan kepada 4 bagian,
masing-masing bagian tersebut ditempelkan lembaran kertas cakram yang mengandung
antibiotika yang berbeda-beda untuk diuji tahap sensitivitasnya. Cawan Petri tersebut
kemudian ditutup dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Hasil uji ditentukan dengan
mengamati dan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk di sekeliling kertas cakram
menggunakan penggaris. MHA merupakan media differensial yang digunakan untuk uji
sensitivitas terhadap antibiotika dengan biakan bakteri menggunakan swab steril.

Gyles CL, Thoen CO. 2010. Escherichia coli; Pathogenesis of Bacterial Infection in Animal.
2nd Edition. Ames: Iowa State University Press.p: 164-187
[CLSI] Clinical and Laboratory Standards Institute. 2008. Performance standards for
antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals approved
standard [Internet]. [diunduh pada 2015 Oktober 15] Tersedia pada:
http://antimicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/ 2012/ 11/ M100S22E. pdf
Stringer JL. 2006. Konsep Dasar Farmakologi Panduan untuk mahasiswa. [editorial].
Huriawati. Jakarta (ID): EGC.

Identifikasi bakteri E. coli Uji identifikasi dilakukan terhadap koleksi isolat bakteri FKH IPB
yang telah dibiakkan kembali (peremajaan bakteri) pada media agar miring TSA. Diagram alur
metode identifikasi bakteri Gram negatif untuk mengidentifikasi E. coli dapat dilihat pada
Gambar 1

Gambar 1 merupakan alur identifikasi bakteri E. coli. Pewarnaan gram dilakukan dengan
mengacu kepada metode Gram yang dikembangkan oleh penemunya, yaitu Hans Christian
Gram (Cappucino dan Sherman 1983). Gambar 1 Alur Identifikasi Bakteri E. coli EMBA Agar
Miring Positif:Non Enterobacteriaceae Negatif: Enterobacteriaceae Uji Biokimiawi
Sampel/isolat Pewarnaan Gram Preparat ulas - Kristal violet (1 menit) - Aquadest - Lugol (1
menit) - Aquadest - Aseton alkohol ( 15 detik) - Aquadest - Safranin (15 detik) - Amati
perbesaran 100 x 10 Bakteri Gram negatif MCA Uji Fermentasi Ujii TSIA Uji Motilitas Uji
Indol Uji Sitrat Uji Urea Glukosa Laktosa Sukrosa Maltosa Manitol Interpretasi bakteri Koloni
menciri  koloni berwarna merah, bulat, berukuran sedangbesar, keeping-cembung, dan
smooth  laktosa positif Koloni menciri  koloni berwarna biru-hitam gelap dengan kemilau
hijau metalik, berukuran sedang, keeping, dan smooth  laktosa positif Uji Oksidase 9
Identifikasi bakteri E. coli dari feses sapi dilakukan secara konvensional mengacu pada
pedoman identifikasi bakteri menurut Holt et al. (1994). Berdasarkan pengujian yang telah
dilakukan maka dapat diketahui bahwa bakteri yang telah diisolasi dari feses sapi adalah E.
coli. Hal ini dapat diketahui dari hasil positif uji fermentasi dan biokimiawi (Gambar 2).
Gambar 2 Hasil Uji Fermentasi dan Biokimiawi

Identifikasi Bakteri Escherichia coli Isolat bakteri dari stok kultur koleksi FKH IPB dibiakkan
kembali pada media TSA. Identifikasi bakteri E. coli dilakukan dengan mengacu kepada
metode menurut Markey (2013) (Gambar 2). Bakteri stok dibiakkan dalam MCA kemudian
diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Bakteri E. coli diidentifikasi berdasarkan hasil
uji laktosa, uji indol, uji MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer) dan uji sitrat.
Isolasi dan Identifikasi E. coli Penghasil ESBL Sampel dari lingkungan RPH-R Kota Bogor
diambil sebanyak 80 sampel. Tahap awal dalam isolasi bakteri E. coli adalah homogenisasi
sampel menggunakan tube shaker dengan mencampurkan sampel dan larutan buffered peptone
water (BPW) 0.1% dengan perbandingan 1:10. Selanjutnya larutan diambil sebanyak 10 ml
dan ditambahkan 20 µl sefotaksim (1 mg/l) lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ˚C.
Tahap berikutnya adalah sampel diambil 1 ose lalu digoreskan pada agar MacConkay yang
mengandung sefotaksim 1 µg/ml, diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 24 jam. Koloni dengan
bentuk bulat, berwarna merah, dan dikelilingi zona keruh diduga sebagai E. coli. Koloni yang
diduga E. coli ditanam ke media tryptic soy agar dan tryptic soy agar miring yang diinkubasi
24 jam pada suhu 37 ˚C. Koloni yang tumbuh diuji KOH, pewarnaan Gram, uji oksidase, dan
uji biokimia (indol, methyl red, VogesProskauer, dan sitrat/IMViC serta uji motilitas pada
media SIM).
Konfirmasi ESBL dan Uji Kepekaan Isolat E. coli terhadap Antibiotik Konfirmasi ESBL dalam
penelitian dilakukan dengan metode difusi cakram berdasarkan panduan dari Clinical and
Laboratory Standar Institute (CLSI) (CLSI 2014). Biakan murni disiapkan dalam bentuk
suspensi yang setara dengan kekeruhan 0.5 McFarland (1-2x108 cfu/ml). Biakan tersebut
diambil menggunakan cotton swab steril dan digoreskan pada Mueller Hinton agar (MHA)
sampai seluruh permukaan cawan petri tertutup. Selanjutnya dengan metode Kirby-Bauer
kertas cakram yang berisi antibiotik diletakkan di atas MHA dengan jarak antara 25-30 mm
dan diinkubasikan pada suhu 35 ˚C selama 24 jam. Antibiotik yang digunakan dalam penelitian
adalah penisilin, amoksisilin, ampisilin, seftazidim, sefpodoksim, sefotaksim, sefalotin,
siprofloksasin, norfloksasin, trimetropim sulfametoksasol, kanamisin, streptomisin,
gentamisin, tetrasiklin, doksisiklin.

Pengambilan sampel swab trakea Pengambilan sampel swab trakea ayam broiler dilakukan
dengan cara mengoleskan cotton bud steril pada trakea ayam. Selanjutnya, cotton bud tersebut
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah diberi label, lalu disimpan di dalam
coolbox. Coolbox yang telah berisi tabung eppendorf kemudian dibawa ke laboratorium.
Setelah itu, tabung eppendorf dikeluarkan dari coolbox untuk dipindahkan ke dalam kulkas.
Isolasi dan identifikasi bakteri E. coli dari sampel swab trakea Isolasi dan identifikasi bakteri
E. coli dilakukan dengan mengacu kepada metode kultur menurut Markey et al. (2013) dalam
Clinical Veterinary Microbiology yang disajikan dalam Gambar 1. Isolat E. coli dari sampel
swab trakea dibiakkan dalam media blood agar dan MCA, lalu diinkubasi pada suhu 37 °C
selama 24-48 jam. Koloni yang terpisah dan berbeda kemudian disubkultur ke agar miring
TSA. Bakteri E. coli diidentifikasi berdasarkan hasil uji oksidase, uji laktosa dan uji
biokimiawi.

Markey B, Leonard F, Archambault M, Cullinane A, Maguire D. 2013. Clinical Veterinary

Microbiology. 2nd Edition. London (UK): Mosby Elsevier.