BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Air adalah materi esensial di dalam kehidupan. Tidak satupun mahluk hidup
di dunia ini yang tidak memerlukan dan tidak mengandung air. Sel hidup, baik
tumbuhan maupun hewan, sebagian besar tersusun oleh air, seperti di dalam sel
tumbuhan terkandung lebih dari 75% atau di dalam sel hewan terkandung lebih dari
67%. Dari sejumlah 40 juta mil-kubik air yang berada di permukaan dan di dalam
tanah, ternyata tidak lebih dari 0,5% (0,2 juta mil-kubik) yang secara langsung dapat
digunakan untuk kepentingan manusia. Karena 97% dari sumber air tersebut terdiri
dari air laut, 2,5% berbentuk salju abadi yang baru dalam kedaan mencair dapat
digunakan (Widianti dan Ristianti, 2004).
Keperluan sehari-hari terhadap air, berbeda untuk tiap tempat dan untuk tiap
tingkatan kehidupan. Yang jelas, semakin tinggi taraf kehidupan, semakin meningkat
jumlah keperluan akan air (Widianti dan Ristianti, 2004). Maka dari itu, kualitas air
harus benar-benar diperhatikan.
Kualitas air dapat dilihat dari indikator mikrobiologi, fisik dan kimia di
dalamnya. Pemeriksaan air secara mikrobiologis sangat penting dan dapat dilakukan
terhadap semua jenis air yang ada, terutama dilakukan untuk menentukan standar
kualitas air. Mengingat bahwa air merupakan sumber kehidupan yang utama bagi
semua makhluk hidup.
Air merupakan habitat yang secara alaminya sangat mudah tercemar oleh
faktor biotik dan abiotik. Dalam air, terutama air yang digunakan dalam keperluan
sehari-hari apabila ditemukan adanya mikroorganisme apalagi mikroorganisme
phatogen tentu dapat membahayakan kesehatan penggunannya. Indicator adanya
pencemaran bakteri dalam air adalah bakteri coliform dan fecal coli.
Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indicator
adanya polusi kotoran dan kondisi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu, dan
produk-produk susu. Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri

1
berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerob dan anaerob fakultatif
yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam
pada suhu 35oC. Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi 2 grup yaitu: koliform
fekal misalnya Escherichia coli dan koliform non fekal misalnya Enterobacter
aerogenes.
Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau
manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau
tanaman-tanaman yang sudah mati. Jadi, adanya Escherichia coli dalam air minum
menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi feses manusia dan
mungkin dapat mengandung pathogen usus. Oleh karena itu, standar air minum
mensyaratkan Escherichia coli harus nol dalam 100 ml.
Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam sampel digunakan metode Most
Probable Number (MPN), pemeriksaan kehadiran bakteri coli dari air dilakukan
melalui beberapa uji, antara lain uji presumtif, dan uji konfirmatif. Output dari kedua
uji ini adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth
unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Namun untuk
lebih memastikan jenis bakteri tersebut maka dilanjutkan dengan uji pelengkap.

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1. Bagaimanakah teknik pemeriksaan bakteriologi air?
1.2.2. Bagaimanakah higienitas sampel air yang diujikan dengan metode mpn
dan uji biokimia?

1.3 Tujuan
1.3.1. Tujuan Umum
Mahasiswa dapat melakukan pemeriksaan nilai MPN pada sampel air
sehingga dapat ditentukan kualitas air tersebut secara mikrobiologi dan
mengidentifikasi bakteri melalui uji biokimia.

2
 1.3.2. Tujuan Khusus
a. Bagaimanakah teknik pemeriksaan bakteriologi air?
b. Bagaimanakah higienitas sampel air yang diujikan dengan metode
mpn dan uji biokimia?

1.4 Manfaat
1.4.1 Manfaat Praktis
Dari praktikum ini diharapkan akan dapat bermanfaat bagi mahasiswa
sehingga dapat menambah keterampilan mahasiswa dalam pemeriksaan MPN
dan uji biokimia pada sampel air dan dapat mentukan keadaan hiegenitas sampel
air tersebut berdasarkan hasil pemeriksaan MPN
1.4.2 Manfaat Teoritis
a. Memperluas pengetahuan mahasiswa khususnya mengenai
pemeriksaan bakteriologis pada sampel air.
b. Menjadi referensi di bidang keilmuan khususnya mikrobiologi dalam
hal teknik pemeriksaan nilai MPN pada sampel air dan pengujian
biokimia bakteri pada sampel air.

3
 BAB II
DASAR TEORI

2.1. Pengertian dan Peranan Air

Air merupakan sesuatu yang esensial bagi berlangsungnya kehidupan. Makhluk
hidup tidak akan bertahan hidup tanpa adanya air. Air merupakan kebutuhan yang
tidak dapat di tinggalkan bagi kehidupan manusia, karena air di gunakan untuk
bermacam-macam kegiatan misalnya minum, makan, mencuci, pertanian industri,
perikanan, rekreasi dan juga pembangkit listrik. Bagi tubuh manusia, air merupakan
materi penting karena jika tubuh kehilangan cairan maka akan berakibat buruk bagi
manusia seperti dehidrasi dan kematian (Prasetyo, 2009).

2.2. Standar Kualitas Air Bersih

Berdasarkan Peraturan Menteri Kesehatan No. 416 Tahun 1990 Tentang ”Syarat-
syarat Dan Pengawasan Kualitas Air “, air bersih adalah air yang digunakan untuk
keperluan sehari-hari yang kualitasnya memenuhi syarat kesehatan dan dapat
diminum apabila telah dimasak. Adapun syarat-syarat kesehatan air bersih adalah:
1. Persyaratan Biologis
Persyaratan biologis berarti air bersih itu tidak mengandung mikroorganisme
yang nantinya menjadi infiltran tubuh manusia. Mikroorganisme itu dapat dibagi
dalam empat group, yakni parasit, bakteri, virus, dan kuman. Dari keempat jenis
mikroorganisme tersebut umumnya yang menjadi parameter kualitas air adalah
bakteri seperti Eschericia coli. Berdasarkan Permenkes No 416 / Menkes / Per /
IX / 1990 tentang syarat-syarat dan pengawasan kualitas air menyebutkan bahwa
syarat-syarat mikrobiologis untuk air minum adalah MPN Koliform/100 cc
sampel = 0. Sedangkan untuk air bersih = 10 ( untuk air perpipaan ) dan 50 (
untuk air bukan perpipaan ) ( Permenkes No. 416 Tahun 1990 Tentang ”Syarat-
syarat Dan Pengawasan Kualitas Air “, dalam Anoname,Tt).

4
 Air tanah mengandung zat organik dan anorganik merupakan tempat yang
baik bagi kehidupan mikroorganisme. Mikroorganisme yang autotrof merupakan
pertama dalam air yang mengandung zat organik. Sinar matahari terutama sinar
ultraviolet memang dapat melemahkan bakteri tapi daya tembus sinar UV dalam
air tidak seberapa. Air yang mengalir deras dan bergerak menerjang batu-batuan
kurang baik untuk kehidupan bakteri. Air sumur dalam hal ini tergantung
lingkungannya, pada umumnya lebih bersih daripada air permukaan. (Anoname,
Tt)
2. Persyaratan Fisik
Persyaratan fisik air bersih terdiri dari kondisi fisik air pada umumnya, yakni
derajat keasaman, suhu, kejernihan, warna, bau. Aspek fisik ini sesungguhnya
selain penting untuk aspek kesehatan langsung yang terkait dengan kualitas fisik
seperti suhu dan keasaman tetapi juga penting untuk menjadi indikator tidak
langsung pada persyaratan biologis dan kimiawi, seperti warna air dan bau
(Permenkes No. 416 Tahun 1990 Tentang ”Syarat-syarat Dan Pengawasan
Kualitas Air “, dalam Anoname,Tt).
3. Persyaratan Kimia
Persyaratan kimia menjadi penting karena banyak sekali kandungan kimiawi
air yang memberi akibat buruk pada kesehatan karena tidak sesuai dengan proses
biokimiawi tubuh. Bahan kimiawi seperti nitrat, arsenic, dan berbagai macam
logam berat khususnya air raksa, timah hitam, dan cadmium dapat menjadi
gangguan pada faal tubuh dan berubah menjadi racun (Permenkes No. 416 Tahun
1990 Tentang ”Syarat-syarat Dan Pengawasan Kualitas Air “, dalam
Anoname,2009).
4. Persyaratan Radioaktif
Persyaratan radioaktif sering juga dimasukkan sebagai bagian persyaratan
fisik, namun sering dipisahkan karena jenis pemeriksaannya sangat berbeda, dan
pada wilayah tertentu menjadi sangat serius seperti di sekitar reaktor nuklir (
Permenkes No. 416 Tahun 1990 Tentang ”Syarat-syarat Dan Pengawasan
Kualitas Air “, dalam Anoname,Tt).

5
2.3. Bakteri Indikator Keamanan Air
Dalam bidang mikrobiologi pangan dikenal istilah bakteri indikator sanitasi.
Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan
menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh feses manusia.
Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan
hidup pada usus manusia. Jadi, adanya bakteri tersebut pada air atau makanan
menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah
mengalami kontak dengan feses yang berasal dari usus manusia dan oleh karenanya
mungkin mengandung bakteri patogen lain yang berbahaya (Widyanti dan Ristianti,
2004).
Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indicator
adanya polusi kotoran dan kondisi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan
produkproduk susu. Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri
berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik dan anaerobic
fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam
waktu 48 jam pada suhu 35oC. Adanya bakteri koliform di dalam makanan/minuman
menunjukkan kemungkinan adanya mikroba yang bersifat enteropatogenik dan atau
toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan (Widyanti dan Ristianti, 2004).
Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi 2 grup yaitu : (1) koliform fekal
misalnya Escherichia coli dan ( 2 ) koliform nonfekal misalnya Enterobacter
aerogenes. Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau
manusia, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau
tanam-tanaman yang telah mati. Jadi, adanya Escherichia coli dalam air minum
menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi feses manusia dan
mungkin dapat mengandung patogen usus (Fardiaz, 1993 ).
Jenis mikroorganisme ini sering di jumpai pada alat-alat pencemaran hewan dan
burung, baik yang sudah di ternakkan atau yang masih liar. Tempat di perolehnya

6
jenis organisme yang terbanyak yang sehubungan dengan suplay bahan pangan
manusia adalah sapi, domba, babi dan ayam (Edwards,1987).
Kuman Coliform merupakan segolongan besar dan heterogen kuman-kuman
batang gram negatif yang dalam batas-batas tertentu mirip Escerechia Coli.
Disamping Escerechia Coli yang berasal dari saluran pencernaan, golongan-golongan
organisme berikut sering di masukkan dalam “Coliform” (Fardiaz,1993).
a. Golongan Klebsiella – Enterobacter – Serratia :
 Klebsiella Pneumoniae, yang khas semula di kenal kuman patogen bagi
pernafasan, sekarang sering di temukan pada infeksi-infeksi saluran
pernafasan, dan saluran air kemih di rumah sakit. Kuman ini di tandai
pertumbuhan mukoid, kapsul polisakarida yang besar dan tidak bergerak.
 Enterobacter Aerogenes, sering dapat bergerak, pertumbuhan yang kurang
mukoid, mempunyai kapsul kecil, di temukan hidup bebas dalam saluran
pencernaan,saluran air kemih dan pada septis. Serratia Marcoscens, batang
kecil gram negatif, hidupnya bebas, dapat menghasilkan pigmen merah
kuat dalam biakan , Serratia biasanya meragikan laktosa sangat lambat.
(Ryadi,1984)

1. Ciri Organisme
Kuman Coliform adalah kuman batang pendek gram negatif yang dapat
membentuk rantai. Pembiakan yang tidak cocok terjadi dalam bentuk filamen
panjang. Kapsul jarang ada pada E. Coli, lebih sering pada Enterobacter.
Berbentuk besar dan teratur pada Klebsiella Pergerakan terdapat sebagian besar
strain E.Coli dan beberapa strain Enterobacter. Pergerakan tidak ada pada
Klebsiella (Prasetyo, 2009).
2. Biakan
E.Coli membentuk koloni bulat konveks, halus dengan pinggir-pinggir yang
nyata. Koloni Enterobacter sama tetapi sedikit lebih mukoid. Koloni Klebsiella
besar, sangat mukoid dan cenderung bersatu pada pengeraman yang lama
(Prasetyo, 2009).

7
3. Sifat-sifat pertumbuhan
E.Coli dan Enterobacter memecahkan banyak karbohidrat dengan membentuk
asam dan gas E.Coli menghasilkan CO2 dan H2. Tes-tes khusus (IMVIC) yang di
pergunakan untuk differensiasi E.Coli dan E.Aerogenes :
a Tes indol E.Coli menghasilkan indol pada kaldu yang mengandung triptofan.
b Test Merah Metil. Tes ini menunjukan pH biakan pada kaldu glukosa 0,5%
setelah 4 hari pada 370C. Bila pH di bawah 4,5 merah metil positif.
c Reaksi Voges Proskaver, tergantung pada pembentukan asetil metil karbinal
dari dekstrosa. Dengan adanya Alkali, zat ini di oksidasi menjadi diasetil dan
memberikan warna merah muda (khususnya Enterobacter.
d Tes Sitrat, mempergunakan natriun sitrat sebagian sumber tunggal karbon
(organisme hidup bebas)
(Prasetyo, 2009).
4. Patogenesis dan Patologi
Kuman Coliform merupakan sebagian besar flora erobik usus normal. Di
dalam usus, umumnya kuman ini tidak menyebabkan penyakit dan malahan dapat
membantu fungsi normal dan nutrisi, organisme ini menjadi patogen bila
mencapai jaringan di luar saluran pencernaan. E.Coli dapat menyebabkan
penyakit diare dengan 2 mekanisme yang nyata. Klebsiella Pneumoniae terdapat
dalam saluran pencernaan dan dalan tinja dari kira-kira 5% orang normal dan
adalah penyebab sebagian kecil(kira-kira 0,3%) Pneumonia oleh kuman
(Prasetyo, 2009).
5. Epidemi,Pencegahan dan Pengawasan
Kuman Coliform merupakan normal saluran pencernaan, beberapa hari
setelah lahir dan sejak itu merupakan bagian utama Coliform jasad renik erobik
normal dari tubuh. E.Coli adalah suatu prototipe. Ditemukannya Coliform dalam
air atau susu di terima sebagai bukti adanya kontaminasi tinja. Adanya spesies

8
 Escerechia atau Enterobacter atau “intermediate”nya dalam jumlah besar dalam
air minum menunjukan adanya kontaminasi permukaan (Prasetyo, 2009).
Tindakan pengawasan tidak mudah di lakukan pada flora endogen normal.
Erotipe enteropatogenik E.Coli dan kuman “parakalon” harus di awasi seperti
Salmonella. Coliform merupakan masalah pokok infeksi rumah sakit saat ini.
Yang penting untuk di ketahui adalah bahwa banyak kuman koliform gram
negatif adalah “Kopartunis” yang dapat menimbulkan penyakit bila masuk ke
dalam penderita yang lemah dalam rumah sakit atau lembaga-lembaga lainnya.
Kuman ini sering di tularkan oleh pegawai, alat-alat atau pengobatan perenteral.
Pengawasan kuman tergantung pada cuci tangan, aseptis yang teliti, sterilisasi
alat-alat, desimfeksi dan pengendalian perintah pengobatan intravena dan
tindakan pencegahan yang teliti dalam mempertahankan saluran air kemih agar
tetap steril (Jawest, Ernest dkk,1986).

2.4. Perhitungan Nilai MPN

Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam contoh digunakan metode Most
Probable Number ( MPN ). Pemeriksaan kehadiran bakteri coli dari air dilakukan
berdasarkan penggunaan medium kaldu laktosa yang ditempatkan di dalam tabung
reaksi berisi tabung durham (tabung kecil yang letaknya terbalik, digunakan untuk
menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi laktosa menjadi asam dan gas).
Tergantung kepada kepentingan, ada yang menggunakan sistem 3-3-3 (3 tabung
untuk 10 ml, 3 tabung untuk 1,0 ml, 3 tabung untuk 0,1 ml) atau 5-5-5 (Prasetyo,
2009).
Metode penentuan angka mikroorganisme dengan metode Angka Paling
Mungkin di gunakan luas di lingkungan sanitasi untuk menentukan jumlah kuman
Coliform di dalam air, susu, dan makanan lainnya. Metode ini adalah metode statistik
didasarkan pada teori kemungkinan. Serangkaian sampel diencerkan sampai titik
akhir dimana tidak ada mikroorganisme hidup. Untuk mendapatkan titik akhir,
serangkaian pengenceran di biakkan di dalam media pertumbuhan yang cocok dan

9
perkembangan atau perubahan sifat-sifat yang mudah di amati seperti pembentukan
asam, atau kekeruhan di pakai untuk mengetahui adanya pertumbuhan bakteri.
Pertumbuhan bakteri pada masing-masing tabung di sesuaikan dengan tabel indeks
MPN untuk menentukan konsentrasi mikroorganisme di dalam sampel asli. Dan batas
kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif dan negatif pada
penggunaan 3 tabung 10ml, 3 tabung 1ml, dan 3 tabung 0,1ml(Dr.Harmita,Apt.2005).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah
unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam
sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah
individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi
misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air
tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 coliform pada setiap gramnya.
Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak
minum. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap
nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi
(FDA,1989).
Uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari 3 tahap yaitu (1) Uji
penduga (presumptive test), (2) Uji penguat (confirmed test) dan Uji pelengkap
(completed test). Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan
metode MPN (Widyanti dan Ristianti, 2004).
a. Uji penduga (presumptive test)
Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri koliform
berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh
bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa,
dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara.
Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di
dalam tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat
dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas
dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung
jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam

10
hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 350C. Jika
dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham, dihitung sebagai
hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. MPN
penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN (Widyanti dan Ristianti, 2004).
b. Uji Penegas (confirmative test)
Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan/penegasan. Ada 2 cara untuk
melakukan uji ini yaitu (Ali Tamyis, 2008) :
1. Uji dapat dilakukan seperti pada uji pendugaan, hanya di dalam media perlu
ditambahkan zat warna hijau berlian (media BGLB). Kepada medium ini
kemudian dinokulasikan sejumlah ml air yang mengandung bakteri yang
menghasilkan gas. Hijau berlian berguna untuk menghambat pertumbuhan
gram positif dan menggiatkan pertumbuhan bakteri golongan kolon. Untuk
membedakan bakteri golongan coli dari bakteri golongan coli fecal (berasal
dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri
diinkubasi pada pada suhu 370C (untuk golongan coli) dan satu seri diinkubasi
pada suhu 440C (untuk golongan coli fecal). Bakteri golongan koli tidak dapat
tumbuh dengan baik pada suhu 440C, sedangkan golongan koli fekal dapat
tumbuh dengan baik pada suhu 440C.
2. Menginokulasikan air yang menghasilkan gas ke dalam cawan petri berisi
medium yang mengandung laktose dan eosin biru metilen atau laktose dan
eosin biru metilen. Jika dalam 24 jam tumbuh koloni-koloni yang berinti dan
mengkilap seperti logam maka tes ini positif.

c. Uji Pelengkap (completed test)

Uji kelengkapan ini kadang-kadang tidak dilakukan. Uji dilakukan dengan
alasan demi kesempurnaan hasil percobaan. Pada uji ini diambil inokulum dari
suatu kolon pada cawan petri (uji konfirmasi cara 2). Inokulum dimasukkan ke
dalam medium cair yang mengandung laktose dan dari inokulum tersebut dibuat
gesekan pada agar-agar miring. Jika kemudian timbul gas dalam cairan laktose,
lagipula pada agar-agar miring ditemukan basil-basil gram negatif yang berupa

11
 spora maka tes dinyatakan positif. Uji kelengkapan ini kembali meyakinkan hasil
tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop
terhadap ciri-ciri Coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidak-berspora. Jika
pada uji penduga tidak menunjukkan adanya Coliform maka tidak perlu dilakukan
uji pelengkap. Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah
perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni
(colonyforming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga
diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan,
umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g
dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan
setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai
MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum.
Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai
MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Ali
Tamyis, 2008).

2.5. Identifikasi Bakteri

1. Pemeriksaan Mikroskopis
a. Pemeriksaan Langsung
Pemeriksaan langsung digunakan untuk mengamati pergerakan, dan
pembelahan secara biner, mengamati bentuk dan ukuran sel yang alami, yang
pada saat mengalami fiksasi panas serta selama proses pewarnaan
mengakibatkan beberapa perubahan. Cara yang paling baik adalah dengan
membuat sediaan tetesan gantung.
b. Pewarnaan
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan
respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang
digunakan.
a) Untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan
pewarnaan acidfast/tahan asam untuk Mycobacterium.

12
 b) Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagel, pewarnaan kapsul,
pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau
Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies)
pada Corynebacterium diphtheriae.
Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologis dibutuhkan pembuatan
apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang
spesifik. Caranya tidak sulit tetapi membutuhkan kehati-hatian dalam
pembuatannya. Tahap-tahap yang harus dilakukan secara hati-hati, adalah
sebagai berikut :
1) Menyiapkan kaca objek: menghapus lemak atau minyak untuk membersihkan
kaca dengan menggunakan air hangat atau serbuk penggosok, selanjutnya
dengan suatu campuran air dan alkohol (alkohol 95%), kemudian kaca
dikeringkan dan disimpan di atas lap laboratorium sampai siap untuk
digunakan.
2) Pembuatan apusan: menghindari apusan yang tebal dan rapat adalah penting
secara mutlak. Suatu apusan yang baik merupakan selapis tipis. Apusan dapat
dibuat dari kultur kaldu atau medium kultur padat dengan berbagai cara:
3) Dari kultur kaldu, pengambilan satu atau dua loop kultur sel dapat langsung
dipindahkan ke kaca objek dengan loop inokulasi steril dan sebarkan secara
merata kira-kira sebesar uang logam.
4) Dari medium padat: mikroorganisme yang diambil dari medium padat
menghasilkan pertumbuhan yang tebal dan rapat, tidak dapat langsung
dipindahkan ke atas kaca objek.
(Kusnadi,dkk. Tt)
Pemindahan sel dari kultur dilakukan dengan menggunakan jarum
inokulasi steril. Hanya ujung jarum yang menyentuh kultur, untuk mencegah
pemindahan sel terlalu banyak. Pengenceran dilakukan dengan memutar ujung
jarum di atas tetesan air, sampai kelihatan semitransparan. Sebelum proses
selanjutnya , apusan dibiarkan kering. Jangan ditiup, biarkan kering di udara.
Fiksasi panas: tanpa difiksasi, apusan bakteri akan tercuci selama memasuki

13
 prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dibutuhkan selama protein bakteri mengalami
koagulasi dan melekat di atas permukaan kaca objek. Fiksasi panas dilakukan
dengan melalukan secara cepat apusan kering, sebanyak dua atau tiga kali di atas
lidah api bunsen.

Gambar : Teknik dasar pewarnaan sel bakteri untuk pengamatan mikroskopik

(Kusnadi,dkk.Tt)

2. Penanaman pada Media Diferensial

a. Agar Garam Mannitol
Mengandung konsentrasi garam tinggi (7,5% NaCl), yang dapat
menghambat pertumbuhan kebanyakan bakteri, kecuali staphylococcus.
Media ini juga mengadakan fungsi differensial karena mengandung
karbohidrat mannnitol, dimana beberapa staphylococcus dapat melakukan
fermentasi , phenol red (pH indikator) digunakan untuk mendeteksi adanya
asam hasil fermentasi manitol. staphylococcusi ini memperlihatkan suatu zona
berwarna kuning di sekeliling pertumbuhannya, staphylococcus yang tidak
melakukan fermentasi tidak akan menghasilkn perubahan warna.
b. Agar Darah

14
 Darah dimasukkan ke dalam medium untuk memperkaya unsur dalam
penanaman mikroorganisme pilihan seperti Streptococcus sp. Darah juga akan
memperlihatkan sifat hemolysis yang dimiliki streptococcusi:
a). gamma hemolisis: tidak terjadi lysis sel darah merah, tidak adanya
perubahan medium di sekitar koloni
b). alpha hemolisis: terjadi lysis sel darah merah dengan reduksi hemoglobin
menjadi methemoglobin menghasilkan lingkaran kehijauan sekitar
pertumbuhan bakteri
c). beta hemolisis: terjadi lysis sel darah merah dilengkapi kerusakan dan
penggunaan hemoglobin oleh organisme, menghasilkan zona bening
sekeliling koloni.

c. Agar McConkey
Menghambat pengaruh kristal violet terhadap pertumbuhan bakteri gram-
positif, selanjutnya bakteri gram-negatif dapat diisolasi. Media dilengkapi
dengan karbohidrat (laktosa), garam empedu, dan neutral red sebagai pH
indikator yang mampu membedakan bakteri enteric sebagai dasar
kemampuannya untuk memfermentasi laktosa. Pada dasarnya bakteri enterik
dipisahkan ke dalam dua kelompok:
a) Coliform basil menghasilkan asam dari fermentasi laktosa. Bakteri
memperlihatkan warna merah pada permukaannya. E. coli menghasilkan
kuantitas asam lebih banyak dibandingkan spesies coliform yang lain.
Jika ini terjadi medium di sekitar pertumbuhan juga akan berubah
menjadi merah seharusnya pengaruh asam terjadi pengendapan garam
empedu yang diikuti penyerapan neutral red.
b) Disentri, tifoid, dan paratifoid basill tidak memfermentasi laktosa, maka
tidak menghasilkan asam. Koloni kelihatan tidak berwarna dan seringkali
transparan

d. Agar Eosin-Methylene Blue (EMB agar)

15
 Laktosa dan zat pewarna eosin serta metilen biru mampu membedakan
antara enteric fermenter laktosa dengan nonfermenter sebaik identifikasi
terhadap basilus colon Escherichia coli. Koloni E. coli tersebut kelihatan biru
kehitaman dengan kilat hijau logam/metalik yang disebabkan besarnya
kuantitas asam yang dihasilkan dan pengendapan zat pewarna di atas
permukaan pertumbuhan. Bakteri coliform lain seperti Enterobacter
aerogenes terbentuk tebal, mukoid, koloni berwarna pink diatas medium ini.
Bakteri enteric nonfermenter laktosa membentuk koloni tidak berwarna maka
kelihatan transparan, kelihatan di atas medium yang berwarna ungu (merah
lembayung). Medium ini juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram-
positif, sedangkan bakteri gram-negatif tumbuh lebih baik.

e. Agar DarahTelurit
Untuk megisolasi Corynebacterium digunakan agar darah telurit (Mc
Leod), sebagai media selektif, setelah inkubasi selama 24 jam koloni bakteri
terlihat berwarna abu-abu tua-hitam. Selanjutnya untuk biakan murni
Corynebacterium digunakan media perbenihan Loeffler dalam tabung.

f. Agar Tioglikolat/Tarrozi (Perbenihan Anaerob)

Perbenihan tioglikolat, mengandung asam tioglikolat yang dapat mengikat
oksigen sehingga tercapai suasana anaerob dalam perbenihan. Perbenihan
Tarrozi, kaya akan enzim peroksidase sehingga zat toksik (H2O2) yang
dihasilkan Clostridium tetani berubah menjadi tidak toksik (H2O dan O2)
dan kuman dapat tumbuh terus dalam perbenihan.

g. Agar TCBS dan Agar Monsur

Agar TCBS (thiosulfat citrat bile sucrose), Agar Monsur (mengandung
telurit gelatin agar atau agar bulyon alkalis yang mengandung Na-
tourokholat), digunakan untuk mengisolasi genus Vibrio. Setelah diinkubasi

16
 selama 24 jam pada suhu 37o C di atas media berwarna hijau kehitaman
koloni akan terlihat bundar berwarna kuning muda, transculent dan
permukaannya rata.

h. Agar Coklat atau Thayer-Martin

Media agar coklat (Thayer-Martin) merupakan media terpilih untuk genus
Neisseria. Untuk pertumbuhannya diperlukan suasana anaerob(fakultatif)
dengan sedikit gas CO2 dan tidak boleh kekeringan, sehingga pembiakan
yang cocok digunakan dalam eksikator yang diberi kapas basah pada bagian
bawah petri yang berisi biakan.

i. Media Agar Lowenstein-Jensen

Media padat tersebut banyak digunakan untuk perbenihan genus
Mycobacterium, bakteri ini dapat tumbuh walaupun dalam waktu relatif
lama, kecuali jenis atipik golongan “rapid growers” dapat tumbuh dalam 3-7
hari.
(Kusnadi,dkk.Tt)

3. Uji Biokimia
Metabolisme merupakan reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk
hidup. Proses metabolisme dibedakan menjadi dua jenis yaitu anabolisme dan
katabolisme. Anabolisme (Biosintesis) yaitu reaksi biokimia yang merakit
molekul-molekul sederhana menjadi molekul-molekul yang lebih kompleks.
Misalnya pembentukkan protein dari asam amino. Secara umum proses anabolik
membutuhkan energi. Sedangkan katabolisme yaitu reaksi biokimia yang
memecah atau menguraikan molekul-molekul kompleks menjadi molekul-
molekul yang lebih sederhana. Proses katabolik melepaskan energi yang
dibutuhkan oleh sel(Waluyo, 2004).
Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan
tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan

17
 eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem endoenzim
selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik.sedangkan eksoenzim yaitu
enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Sebagian
besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan
molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana.
Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan
digunakan untuk kepentingan sel(Waluyo, 2004).
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari
interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain
itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber
karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004).
E. coli adalah suatu bakteri gram negative berbentuk batang, bersifat
anaerobic fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. E. coli dibedakan atas
sifat serologinya berdasarkan antigen o (somatic), K (kapsul) dan H (flagella)
(Fardiaz,1992)
Medium selektif yang dapat digunakan untuk mengisolasi E.coli misalnya
DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) agar atau MacConkey Agar.
Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan dikelilingi
oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasi
laktosa di dalam medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya
pengendapan bile dan penyerapan indikator merah netral(Fardiaz,1992)
Uji-uji biokimia yang dilakukan terhadap E. coli termasuk karakteristik
pertumbuhan pada agar TSI (Triple Sugar Iron) dan agar SIM (Sulfite Indole
Motility) atau LIM (Lysine Indole Motility). Uji-uji biokimia ditujukan untuk
menunjukkan E.coli dan bakteri-bakteri lainnya yang mempunyai sifat-sifat
hamper sama, yaitu Klebsiella dan Enterobacter (Fardiaz,1992)

Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri

antara lain :

a. Indol

18
 Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji
indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna
merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk
indol dari tryptopan sebagai sumber carbon, yang dapat diketahui dengan
menambahkan larutan kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen
asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini
dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian
protein(Anonim, 2008)

b. MR-VP

1. Uji MR

Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah

ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran
(metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam
medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan
pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan
pada biakan tersebut dengan pH seredndah itu maka indikator tersebut
menjkadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam
campuran(Anonim, 2008)

2. Uji VP

Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium

setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi
bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin) (Anonim, 2008)

c. SIM
Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah positif, hal ini terlihat adanya
penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini
menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti

19
 bahwa bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga terlihat ada warna hitam, yang
berarti bakteri ini menghasilkan Hidrogen Sulfit (H2S) (Anonim, 2008)

d. Simmons Citrate
Hasil uji sitrat yang diperoleh negatif, yang ditandai dengan tidak terjadinya
perubahan warna. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permiase
yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel(Anonim, 2008)

e. TSIA
Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena bakteri
bersifat basa ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan
sukrosa(Anonim, 2008)
Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan Co2 dapat dilihat
dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan
adanya endapan berwarna hitam, endapan ini terbentuk karena bakteri mampu
mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H2S, dan H2S
akan bereaksi dengan Fe++ yang terdapat pada media dan menghasilkan endapan
hitam(Anonim, 2008)
Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan
bakteri memfermentasi glukosa. Media ini biasanya digunakan untuk membedakan
Salmonella dan Shigella dengan bakteri Gram negatif bentuk batang lainnya
bedasarkan pola fermentasi penghasil hydrogen sulfide. Untuk pengamatan pola-
pola pengunaan karbohidrat. TSIA agar mengadung laktosa dan sukrosa dalam
konsentrasi 1%, glukosa 0,1% dan phenol red sebagai indicator yang
menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana
asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk
penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk
membedakan bakteri H2S dengan bakteri-bakterinya(Anonim, 2008)

f. Uji gula-gula (Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)

20
 Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu
memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi perubahan
warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri
ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk
gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media,
artinya hasil fermentasi berbentuk gas (Anonim, 2008)

Perbedaan sifat-sifat E.coli, Klebsiella dan Enterobacter

(http://deethebiokidz.blogspot.com/2010/12/uji-sifat-biokimia.html)
Uji E.coli Klebsiella Enterobacter
TSI : Fermentasi Sukrosa dan (+)a + +
laktosa.

Fermentasi glukosa
+ + +
Produksi gas
(+) (+) +
Produksi H2S
– – (–)b

LIM/SIM

Dekarboksilase lisin.
(–) + (+)
Produksi indol.
(+) (–) –
Motilitas
(+) –- +
Produksi H2S.
– – –

Ket : a(+), Kebanyakan Positif.

b(–), Kebanyakan Negatif

21
 BAB III
METODE

3.1 Waktu dan Tempat

3.1.1 Waktu
Praktikum I
Hari/tanggal : Senin, 15 Oktober 2012
Jam : 09.00-12.20 WITA.
Kegiatan : Pembuatan media (LBDS dan LBSS), BGLB , EMB,
TSI, dan SIM
Praktikum II
Hari/tanggal : Senin, 29 Oktober 2012
Jam : 09.00-12.20 WITA.
Kegiatan : Pengambilan sampel air dan penanaman pada media
LBDS dan LBSS untuk uji presumtive
Praktikum III
Hari/tanggal : Selasa, 30 Oktober
Jam : 12.30-13.30 WITA.
Kegiatan : penanaman ke media BGLB untuk uji konfirmative
Pengamatan dan penanaman pada media BGLB
Praktikum IV
Hari/tanggal : Rabu, 31 Oktober 2012
Jam : 14.00-15.00 WITA.
Kegiatan : Pemeriksaan uji konfirmative dan penentuan nilai
MPN pada sampel air serta uji pelengkap I yaitu
penanaman ke media EMB

22
 Praktikum V
Hari/tanggal : Kamis, 1 Nopember 2012
Jam : 13.00-14.00 WITA.
Kegiatan : pemeriksaan uji pelengkap pada media EMB, uji
pelengkap II yaitu penanaman ke media TSI dan SIM,
serta pembuatan dan pewarnaan preparat gram dari
koloni di media EMB
Praktikum VI
Hari/tanggal : Jumat, 2 Nopember 2012
Jam : 14.00-15.00 WITA.
Kegiatan : Praktikum pemeriksaan uji pelengkap pada TSI dan
SIM serta pengamatan mikroskopis preparat gram

3.1.2 Tempat
Praktikum bakteriologi dilaksanankan di laboratorium bakteriologi
Jurusan Analis Kesehatan Politeknik Kesehatan Kemenkes Denpasar.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
a. Pengambilan Sampel Air
 Botol Steril
 Aluminium Foil
 Kapas
 Api Bunsen
 Label
b. Pemeriksaan Nilai MPN
 Tabung reaksi
 Rak tabung reaksi

23
  Tabung durham
 Incubator
 Pipet ukur
 Label
 Ose Jarum dan Ose Bulat
 Plate
 Api Bunsen
 Mikroskop

3.2.2 Sampel
a. Sampel Air Kran Kos Satya Nugraha
b. Sampel Air Kran Jurusan Kesehatan Lingkungan

3.2.3 Bahan
a. Pengambilan Sampel Air
 Alkohol 70%
b. Pemeriksaan Nilai MPN
 Lactosa Broth Single Strength
 Lactosa Broth Double Strength
 Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB)
 Eosin Metylene Blue (EMB)
 Triple Sugar Iron (TSI)
 Sulfate Indol Motility (SIM)
 Sampel air

24
3.3 Cara Kerja

Pembuatan
Media

LBDS
LB
LBSS

BGLB
Langkah Kerja

Pengambilan
Sampel Air

Pemeriksaan
Metode MPN
5:1:1

LBDS
Uji Presumtif
LBSS

Uji Konfirmatif BGLB

Uji Pelengkap EMB

SIM
Uji biokimia

TSI
Pengecatan
gram

25
1. Cara Pengambilan Sampel Air Kran
kran diputar sampai kran
dibersihkan dan difiksasi mulut kran disterilkan
terbuka sehingga air
kran dari setiap benda yang dengan cara dipanaskan
mengalir secara maksimal
mengganggu dengan kapas menggunakan lampu
dan biarkan mengalir
dan alkohol 70% spiritus
selama 1-2 menit

air kran ditampung hingga

tutup botol dibuka dengan
botol ditutup dengan hati- 3/4 bagian botol dengan
tangan kiri, botol dipegang
hati maksud air dapat dikocok
dengan tangan kanan .
sebelum dianalisa.

badan botol didisi label

yang berisi tempat, tanggal, sampel dibawa ke
jam pengambilan, dan laboratorium
petugas pengambil.

2. Pemeriksaan (Metode MPN 5:1:1)

a. Uji Presumtif

disiapkan 5 buah tabung disiapkan juga 2 tabung dengan pipet steril

yang masing-masing yang masing-masing diinokulasi masing-
berisi LBDS sebanyak 10 berisi 10 ml LBSS (tabung masing 10 ml asampel air
ml (1a s/d 5a) 1b dan 2b) ke dalam tabung 1a s/d 5

tabung-tabung digoyang
ke dalam tabung 2b ke dalam tabung 1b
perlahan agar sampel air
diinokulasikan 0,1 ml diinokulasikan 1 ml
menyebar merata ke
sampel air sampel air
seluruh bagian media

setelah diinkubasi, diamati

masing-masing tabung untuk
diinkubasi pada suhu 370
melihat ada tidaknya gas dalam
Celcius selama 48 jam
tabung durham. adanya gas
menunjukkan presumtif positif

26
 b. Uji Konfirmatif

satu seri tabung BGLB pembacaan (dicocokkan dengan

dari tiap-tiap tabung yang
diinkubasi pada suhu 370 C dan tabel MPN5:1:1) dilakukan
presumtif dipindahkan 1-2 ose
satu seri lagi diinkubasi pada setelah 48 jam dengan melihat
ke dalam tabung konfirmatif
suhu 440 C untuk memastikan jumlah tabung BGLB yang
yang berisi 10 ml BGLB
adanya coli tinja menunjukkan positif gas

c. Uji Pelengkap

Salah satu hasil Diinikulasi pada

positif uji media EMB
konfirmatif

Single Colony
(hijau metalyc)

Preparat gram TSI SIM

Pengamatan Uji biokimia Uji biokimia

Mikroskopis
E. coli
E. coli E. coli

Gas asam
Basil + garam - Pergerakan ( zona
putih di sekitas
bekas tusukan)

27
 BAB IV
PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Dari hasil pengamatan yang dilakukan terhadap dua sampel dari dua tempat
yang berbeda didapatkan hasil sebagai berikut:
1. Uji Presumtif
Tabung Sampel Air Kran Sampel Air di Kost
Kesling Mahasiswa

LBDS 1 (1a) + +
LBDS 2 (2a) + +
LBDS 3 (3a) - +
LBDS 4 (4a) - +
LBDS 5 (5a) + +
LBSS 1 (1b) - +
LBSS 2 (2b) - -
Jumlah
2 6

2. Uji Konfirmatif
a. Sampel Air Kran Kesling
Tabung Interpretasi Hasil
370C 440C
BGLB 1 (1a) + -
BGLB 2 (2a) + -
BGLB 3 (5a) - -
Jumlah 3 0

28
 b. Sampel Air di Kost Mahasiswa
Tabung Interpretasi Hasil
370C 440C
BGLB 1 (1a) + +
BGLB 2 (2a) + +
BGLB 3 (3a) + +
BGLB 4 (4a) + +
BGLB 5 (5a) + +
BGLB 6 (1b) + +
Jumlah 6 6

Hasil Perhitungan Nilai MPN

Uji Uji Nilai MPN
No Sampel Presumtif Konfirmatif
370C 440C Non fecal Fecal
1 Air Kran 3 00 3 0 0 0 0 0 9/100ml 0
Kesling
2 Air di Kost 5 1 0 5 1 0 5 1 0 265/100ml 265/100ml
Mahasiswa

3. Uji Pelengkap dan Uji Biokimia

Keterangan
Uji
Gambar Sampel Kesling Sampel Kost
Biokimia
Mahasiswa

Media Bentuk Koloni : Bentuk Koloni :

EMB Agar Bulat Bulat
(Uji
Pelengkap) Warna : Gelap Warna : Gelap
metalik metalik

Permukaan : Halus Permukaan : Halus

Mengkilap Mengkilap

29
Media TSI Warna lereng : Warna lereng :
Agar (Uji kuning kuning
Biokimia)
Warna Dasar : Warna Dasar :
kuning kuning

Gas Asam : (+) Gas Asam : (+)

H2S : (-) H2S : (-)

Media SIM H2S : (-) H2S : (-)

(Uji
Biokimia) Indol : Tidak Indol : Tidak
diamati diamati

Motility : (+) Motility : (+)

4. Pengecatan Gram

Sampel Gambar Keterangan

Air Kran Kesling
Basil (+)

Gram (-)

30
Air di Kost Mahasiswa
Basil (+)

Gram (+)

4.2. Pembahasan
4.3.1 Teknik Pemeriksaan Bakteriologi Air
Air merupakan komponen yang tidak terlepas dari kehidupan manusia.
Sebagai komponen yang penting, kualitas air yang akan digunakan harus
memenuhi standar baik secara fisik, kimia, dan bakteriologi. Pemeriksaan air
secara bakteriologi perlu dilakukan terutama pada air yang digunakan sehari-hari
untuk mengetahui tingkat pencemaran bakteri terhadap air tersebut serta
menentukan layak atau tidaknya untuk digunakan berdasarkan jumlah bakteri
paling mungkin yang terdapat pada air tersebut apakah melewati ambang batas
yang telah ditentukan atau masih dalam ambang batas yang diperbolehkan.
Pemeriksaan air secara bakteriologi dapat dilakukan dengan salah satu metode
yaitu metode yaitu metode MPN (Most Probable Number). Metode MPN
merupakan metode pemeriksaan air yang digunakan untuk mengetahui angka
bakteri paling mungkin yang terdapat pada air yang di uji. Bakteri yang dapat
diketahui melalui pemeriksaan air dengan metode MPN ini yaitu Coliform non-
fecal dan Coliform fecal (e-coli).
Untuk menentukan secara pasti, apakah bakteri yang terkadung dalam sampel
air yang diujikan merupakan bakteri coliform, maka dilakukan uji lanjutan
setelah uji MPN tersebut yaitu uji biokimia dimana pada praktikum ini uji
biokimia yang dilakukan meliputi uji dengan media TSI dan SIM. Selain uji
biokimia, koloni bakteri yang terdapat di cat dengan cat gram untuk mengetahui
ciri – ciri dari bakteri yang terdapat dari sampel air tersebut serta dapat diketahui

31
apakah bakteri tersebut termasuk ke dalam bakteri gram positif atau bakteri gram
negatif.
Metode MPN dalam tahap pemeriksaannya melalui 3 tahap uji, yaitu uji
presumtif (uji penduga), uji konfirmatif (uji penegas) dan uji pelengkap. Uji
presumtif merupakan uji tahap awal keberadaan coliform masih dalam tingkat
probabilita rendah dan masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat permentatif
coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain coliform juga
memiliki sifat permentatif, dimana uji ini menggunakan media Lactosa Broth
yang dibuat dalam bentuk Lactosa Broth Double Strength (LBDS) dan Lactosa
Broth Single Strength (LBSS). Media LB dibuat dalam bentuk LBDS dan LBSS
karena jumlah sampel yang diinokulasikan ke dalam media akan berbeda, yaitu
untuk LBDS jumlah sampel diinokulasikan akan lebih banyak dibandingkan
pada LBSS.
Uji konfirmatif untuk mengetes kembalinya kebenaran adanya coliform
dengan bantuan medium selektif diferensial yaitu media Briliant Green Lactosa
Bile (BGLB) Broth. Sedangkan untuk uji pelengkap dilakukan untuk
meyakinkan kembali hasil yang diperoleh dari uji konfirmatif dengan
menginokulasikan bakteri pada tabung BGLB positif pada media Eosin Methylen
Blue (EMB), kemudian koloni yang tumbuh pada media EMB dibuat dalam
bentuk preparat yang diwarnai dengan cat gram dan diamati dibawah mikroskop.
Selain itu, koloni pada media EMB diinokulasikan pada media TSI dan SIM
untuk uji biokimia terhadap bakteri tersebut.
Dalam pemeriksaan air dengan metode MPN ini, ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan. Mulai dari pembuatan media, pengambilan sampel, uji MPN yang
meliputi uji presumtif , uji konfirmatif, dan uji pelengkap hingga uji biokimia.
Dalam pembuatan media, hal yang perlu dipehatikan yaitu memastikan bahwa
media yang dibuat yang nantinya akan digunakan dalam uji MPN dan uji
biokimia sudah dalam keadaan steril. Sehingga tidak ada bakteri lain yang telah
mengkontaminasi media sebelum media tersebut digunakan. Selain itu, hal yang
perlu diperhatikan adalah memastikan bahwa setelah sterilisasi, tabung durham

32
pada media yang akan digunakan dalam uji presumtif dan uji konfirmatif dari uji
MPN dalam keadaan penuh terisi media dan tidak terdapat ruang kosong maupun
gelembung udara. Sebab, apabila sebelum digunakan tabung durham telah berisi
gelembung udara, dan setelah sampel diinokulasikan pada media serta diinkubasi
menunjukkan adanya gelembung, media tidak dapat memberikan hasil yang
sesungguhnya. Karena dapat terjadi kemungkinan bahwa pada tabung
menunjukkan hasil yang negatif dan seungguhnya tidak terdapat gelembung
udara hasil fermentasi bakteri, Namun karena dari awal sebelum penggunaan
media sudah terdapat gelembung udara pada tabung durham, yang dapat
memberikan hasil positif palsu.
Dari segi pengambilan sampel, hal yang perlu diperhatikan yaitu kran
dibersihkan dari debu dengan kain bersih agar pada saat pengambilan sampel
tidak ada pengotor yang ikut masuk ke dalam botol sampel. Mulut kran difiksasi
dengan api bunsen untuk membuat keadaan dalam mulut kran bebas dari bakteri
sebelum akhirnya nanti air melewati mulut kran sehingga bakteri yang terdapat
pada sampel air yang diperoleh murni dari bakteri yang terdapat pada sampel air
itu sendiri, tanpa adanya kontaminasi dari bakteri lain yang terdapat pada mulut
kran. Hal lain yang perlu diperhatikan juga yaitu sebelum sampel air diambil, air
kran dialirkan dahulu 1 sampai 2 menit, dimana hal ini bertujuan apabila dalam
kran terdapat kotoran maupun debu maka kotoran dan debu tersebut akan ikut
mengalir bersama dengan air tersebut. Dan dalam pengambilan sampel air, botol
sampel hanya diisi ¾ bagiannya saja dan ¼ bagian atasnya dibiarkan kosong. Hal
ini dilakukan dengan tujuan agar air dapat dikocok sebelum dianalisa, disamping
itu memberikan oksigen bagi bakteri (coliform dan e-coli) yang merupakan
bakteri aerob yang membutuhkan oksigen.
Untuk uji presumtif, hal yang perlu diperhatikan yaitu setelah inokulasi
sampel air ke dalam media LBDS dan LBSS, tabung reaksi digoyangkan secara
perlahan agar sampel air dan media homogen serta sampel air tersebar merata
diseluruh bagian media. Sebelum dan setelah pemipetan sampel, pipet difiksasi

33
dengan api bunsen dan saat inokulasi sampel selalu dikerjakan dekat dengan api
bunsen untuk mencegah terjadinya kontaminasi.
Dalam uji konfirmatif, inokulasi sampel dari tabung LBDS dan LBSS
dikerjakan dengan menggunakan ose. Jadi, hal yang perlu diperhatikan yaitu
sebelum digunakan untuk mengambil sampel, ose dipijarkan dahulu pada api
bunsen untuk membuat ose dalam keadaan bebas dari bakteri pengganggu
lainnya. Kemudian, pada saat inokulasi sampel dengan ose pada media BGLB,
diusahakan agar ose tidak menyentuh dinding tabung reaksi yang tidak terdapat
media BGLB (bagian atas tabung reaksi), sebab hal tersebut dapat menyebabkan
kemungkinan bakteri menempel pada dinding tabung reaksi.
Pada uji pelengkap dengan media EMB, hal yang perlu diperhatikan yaitu
dalam inokulasi sampel dari media BGLB, saat setelah ose dipijarkan pada api
bunsen ose tersebut tidak boleh langsung dimasukkan ke dalam media BGLB
dalam keadaan panas, sebab dapat menyebabkan bakteri yang akan diambil
dengan menggunakan ose tersebut dapat mati dan ketika digoreskan pada media
EMB, koloni tidak dapat tumbuh. Oleh karenanya, sebelum dimasukkan ke
dalam media ose yang digunakan setelah dipijarkan harus didiamkan sesaat agar
tidak panas. Selain itu, hal yang perlu diperhatikan lainnya yaitu saat mengambil
sampel pada media BGLB dengan menggunakan ose, ose harus diaduk – aduk di
dalam media BGLB tersebut agar bakteri dalam media BGLB tersebut dapat
diambil dengan baik untuk kemudian diinokulasikan pada media EMB. Pada
praktikum yang dilakukan, inokulasi pada media EMB dilakukan empat kuadran.
Dalam menggores sampel pada media EMB, penggoresan dilakukan harus
dilakukan dengan baik, sehingga pada kuadran terakhir dapat diperoleh single
koloni yang dapat diinokulasikan pada media uji biokimia dan dibuat untuk cat
gram.
Setelah uji pelengkap dilakukan, selanjutnya dilakukan pengecatan gram.
Dalam pengecatan gram, diambil satu single koloni bakteri dengan ciri – ciri
tertentu yang mengindikasikan bakteri yang dicurigai dalam sampel yang
diujikan, dimana dalam praktikum ini bakteri yang ingin diidentifikasi adalah

34
 coliform. Dalam pengecatan gram, hal yang perlu diperhatikan adalah object
glass yang digunakan harus terbebas dari debu dan juga lemak, sebab apabila
dalam object glass yang digunakan terdapat debut dan lemak, maka pengecatan
gram tidak dapat dilakukan dengan baik sebab pengecatan tersebut terganggu
oleh adanya debu dan lemak tersebut. Oleh karenanya, sebelum digunakan,
object glass harus dibersihkan terlebih dahulu dan difiksasi pada api
bunsen.Selain itu, hal yang perlu diperhatikan adalah dalam pengecatan perlu
diperhatikan waktu yang diperlukan saat mendiamkan masing - masing cat gram.
Apabila waktu tersebut terlalu cepat atau terlalu lama, maka hasil pengecatan
tidak akan menjadi baik dan dapat menggangu proses pengamatan.
Dalam uji biokimia pada praktikum ini, digunakan dua media yatu media TSI
(Triple Sugar Iron) dan SIM (Sulfat Indol Motility). Pada media TSI, koloni
bakteri pada media EMB diinokulasikan kedalam media TSI dimana hal yang
perlu diperhatikan dalam menginokulasikan koloni bakteri pada media TSI
adalah saat media akan digoreskan, koloni bakteri tersebut ditanam ke dalam
bidang media TSI dengan cara menusukkannya dengan ose jarum barulah
kemudian di goreskan pada lereng media TSI. Sedangkan pada media SIM,
koloni bakteri diinokulasikan dengan cara menusukkan koloni bakteri sedalam
1/3 bagian media SIM dengan menggunakan ose jarum untuk mengetahui
pergerakan (motility) dari bakteri tersebut.

4.2.2 Higienitas Sampel Air Yang Diujikan Dengan Metode MPN Dan Uji
Biokimia
Untuk mengetahui higienitasi dari sampel air yang diujikan, maka harus
diperhatikan hasil pengamatan dari uji MPN maupun uji biokimia yang dilakukan
terhadap sampel air tersebut. Dari praktikum yang dilakukan, pada uji presumtif
diperoleh hasil pada sampel air kos mahasiswa tabung positif pada media LBDS yaitu
sebanyak 5 tabung (1a – 5a) dan 1 tabung LBSS (1b), sedangkan pada sampel air
keran Kesling tabung positif pada media LBDS yaitu 3 tabung (1a, 2a, dan 5a) dan
tidak ada tabung yang positif pada media LBSS.

35
 Setelah itu, pada uji presumtif media BGLB dibagi menjadi dua seri yaitu seri
37oC dan seri 44oC. Pada seri 37oC, belum dapat diketahui secara pasti apakah bakteri
yang terkandung pada sampel air coliform non - fecal atau bakteri coliform fecal.
Sebab pada suhu 37oC, bakteri coliform non – fecal masih dapat tumbuh. Oleh
karenanya dibuat seri 44oC sebab pada suhu ini bakteri coliform non – fecal tidak
dapat tumbuh sehingga dapat diketahui bahwa bakteri yang terdapat pada media
BGLB yang diinkubasi pada suhu 44oC tersebut merupakan bakteri coliform fecal.
Pada sampel air kos mahasiswa, tabung BGLB positif yang diinkubasi pada suhu
370C dan suhu 440C adalah tabung 1a-5a dan tabung 1b. Pada sampel air kran
kesling, tabung positif pada media BGLB yang diinkubasi pada suhu 370C adalah
tabung 2a dan 5a. Sedangkan pada media BGLB yang diinkubasi pada suhu 440C
tidak ada tabung BGLB yang positif.
Dari hasil uji konfirmatif tersebut dapat diketahui bahwa pada sampel air kos
mahasiswa terdapat coliform non – fecal sebanyak adalah 265/100mL dan coliform
fecal sebanyak 265/100mL. Sedangkan pada sampel air kran kesling terdapat
coliform non – fecal sebanyak 9/100mL dan tidak terdapat coliform fecal pada sampel
air kran kesling. Menurut Peraturan Menteri Kesehatan No.416 Tahun 1990 tentang
Syarat – Syarat dan Pengawasan Kualitas Air, nilai ambang batas untuk jumlah
coliform pada air bersih perpipaan adalah 10 per 100 ml. Hal ini menunjukkan bahwa
jumlah koloni bakteri coliform pada sampel air kran kesling masih dalam ambang
batas sedangkan pada sampel air kos mahasiswa jumlah koloni bakteri coliform telah
melebihi ambang batas yang ditentukan.
Tabung positif media BGLB dari sampel air kos mahasiswa dan air kran
kesling, kemudian diinokulasikan dengan metode gores pada media EMB, dimana
media EMB ini merupakan media selektif untuk e-coli dan pertumbuhan e-coli pada
media ini ditandai dengan koloni yang berwarna hijau metallic dengan permukaan
yang halus. Dari kedua sampel tersebut setelah media EMB diinkubasi pada suhu
370C, keduanya menunjukkan hasil koloni yang berwarna hijau metallic yang
memberikan indikasi bahwa koloni pada media EMB tersebut merupakan koloni dari
e- coli.

36
 Untuk memastikan kembali bakteri yang terkandung dalam kedua sampel
tersebut, dilakukan pengecatan gram pada koloni dari kedua sampel. Pada koloni dari
sampel air kos mahasiswa, diperoleh hasil pengamatan koloni yang penataannya
single dengan bentuk basil dan berwarna ungu (gram positif). Sedangkan pada koloni
dari sampel air kran kesling diperoleh hasil koloni yang penataannya bergerombol
dengan bentuk basil dan berwarna merah (gram negative).
Pada uji biokimia yang dilakukan pada koloni kedua sampel tersebut, pada
media TSI keduanya menunjukkan warna kuning/kuning (k/k) yang menunjukkan
bahwa koloni dari kedua sampel tersebut mampun memfermentasi ketiga golongan
dari gula penyusun pada media TSI yang terdiri atas glukosa, lactose dan sukrosa.
Koloni tersebut tidak menghasilkan sulfit sehingga tidak terbentuk warna hitam pada
media TSI, hanya terbentuk gas yang membuat media TSI sedikit berlubang dan
terangkat. Sedangkan pada media SIM, koloni dari kedua sampel tersebut
menunjukkan adanya pergerakan yang ditandai dengan terbentukkan serat berwarna
putih samar dibagian dalam sekitar tusukan / inokulasi dari media SIM yang
menandakan pergerakkan aktif (motil)dari koloni kedua sampel tersebut. Sedangkan
uji Indol pada media SIM tidak dilakukan karena tidak tersedianya reagen pengujian
yaitu Erlich A dan B.
Bakteri e – coli pada cat gram akan menunjukkan warna merah (gram negative)
dan bentuk basil. Sedangkan pada media TSI akan terjadi perubahan warna media
menjadi kuning / kuning dan terbentuknya gas. Dan pada media SIM dari segi
motilitasnya akan menunjukkan pergerakkan yang aktif (motil).
Dari hasil yang diperoleh, dapat diketahui bahwa koloni bakteri pada sampel air
kran kesling merupakan koloni bakteri e-coli sedangkan pada sampel air kran
mahasiswa dicurigai sebagai koloni e-coli sebab pada cat gram tidak menunjukkan
sifat gram yang sesuai dengan sifat gram e-coli tetapi dari uji biokimia menunjukkan
hasil yang sesuai. Belum diketahui secara pasti apakah bakteri pada sampel air kos
mehasiswa merupakan e-coli atau bakteri lain. Jika benar bakteri tersebut merupakan
e-coli, kemungkinan terjadi kesalahan pada proses pengecatan gram yaitu
kemungkinan koloni yang diambil dari media EMB bukan koloni dari e-coli sehingga

37
menunjukkan hasil yang berbeda. Sedangkan dari uji biokimia sudah menunjukkan
hasil yang sesuai dengan ciri – ciri koloni e-coli

38
 BAB V
PENUTUP

5.1 Simpulan
Adapun simpulan yang diperoleh melalui pembuatan laporan mengenai
pemeriksaan air secara bakteriologi dengan metode MPN (Most Probable Number),
antara lain:
5.1.1 Dalam melakukan pemeriksaan sampel secara bakteriologi dengan metode
MPN (Most Probable Number) dan uji biokimia, ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan baik itu dari teknik pembuatan media, pengerjaan sampel,
maupun teknik dalam melakukan uji presumtif , uji konfirmatif, dan uji
pelengkap, pengecatan gram serta inokulasi koloni bakteri pada media TSI
dam SIM (uji biokimia). Sehingga proses pengerjaan berlangsung dengan baik
dan benar dan hasil yang diperoleh dalam menentukkan nilai MPN air
menunjukkan hasil yang sesungguhnya.
5.1.2 Dari pemeriksaan yang dilakukan terhadap sampel air kran kesling dengan
metode MPN diperoleh hasil coliform non – fecal yaitu 9/100mL. Sedangkan
dari pemeriksaan yang dilakukan terhadap sampel air kos mahasiswa dengan
metode MPN diperoleh hasil coliform non – fecal dan fecal yaitu 265/100mL
dan 265/100mL. Dari hasil uji pelengkap dengan menggunakan media EMB,
sampel air Kesling dan sampel air di kost mahasiswa menunjukkan hasil
positif E.coli dengan adanya pertumbuhan koloni berwarna hitam metalik.
Sedangkan pada uji biokimia menggunakan media TSI kedua sampel
jmenunjukkan hasil positif dengan perubahan warna media menjadi berwarna
kuning pada bagian lereng dan dasar media, serta timbulnya gas asam pada
media. Pada uji biokimia dengan menggunakan media SIM, kedua sampel
juga menunjukkan hasil motility positif dengan adanya zona putih di sekitar
daerah inokulasi. Namun, pada pengamatan sediaan yang diwarnai dengan
pewarnaan gram, sampel air gram Kesling menunjukkan hasil Basil (+) Gram
(-) dan sampel air di kost mahasiswa menunjukkan hasil Basil (+) Gram (+).

39
5.2 Saran

Adapun saran yang dapat diberikan melalui pembuatan laporan ini yaitu
disarankan agar teknik –teknik dalam pemeriksaan air secara bakteriologi dengan
metode MPN (Most Probable Number) dan uji biokimia lebih ditekankan lagi kepada
praktikan agar praktikan mampu melakukan penentuan nilai MPN dan hasil uji
biokimia sampel air sesuai dengan prosedur yang benar dan hasil yang diharapkan.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim. Tt. Diakses Di :

40
 http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._BIOLOGI/1968050919940
KUSNADI/BUKU_COMMON_TEXT_MIKROBIOLOGI,_Kusnadi,dkk/ientifi
kasi_bakteri.pdf). Diakses Tanggal : 2 November 2012
Anonim. 2008 dalam Anonim. 2010. Diakses di:
http://deethebiokidz.blogspot.com/2010/12/uji-sifat-biokimia.html Diakses
tanggal : 2 November 2012
Anonim, 2009, Cara Menghitung Nilai MPN, Uji Colifrm, diakses di:
Anonim, 2011, Pengukuran Coliform dengan MPN, Diakses di:
http://analiskesehatan-pontianak.blogspot.com/2011/02/pengukuran-
coliform-dengan-mpn.html, diakses tanggal: 11 April 2012
Anonim, 2011, Pentingnya Melakukan Pengambilan Sampel Air, diakses di: http:
http://dinas-kesehatan-kab-bone-bolango.co.id/2011/02/pentingnya-
melakukan-pengambilan-sampel-air, diakses tanggal: 11 April 2011
Pelczar, M.J.Jr, E. C. S Chan, and N. R. Krieg.1997. Microbiology. McGraw-Hill
Book Company Inc. New York, p:183-184.
Prasetyo, Dwi, 2009, Uji Most Probable Number (Mpn) Coliform
Pada Pengelolaan Air Mpsdh “Tirto Darmo”
Di Desa Genilangit Poncol Magetan, Akademi Analis Farmasi Dan
Makanan (Akafarma) Sunan Giri Ponorogo
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang. Penerbitan Universitas
Muhammadiyah Malang , hal 157.
Widianti dan Ristianti, 2004, Analisis Kualitatif Bakteri Koliform Pada Depo Air
Minum Isi Ulang Di Kota Singaraja Bali, Jurusan Pendidikan Biologi,
Fakultas P-MIPA IKIP Negeri Singaraja

41