Anda di halaman 1dari 49

ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DARI

EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN MENGKUDU (Morinda


citrifollia L) DENGAN METODE PERKOLASI

MINISKRIPSI
Disusun untuk memenuhi tugas akhir mata kuliah Praktikum Farmakognosi
Fitokimia III

Disusun oleh Kelompok 3 A :


Fathfani Aulia 11161020000001
Gita Andriani 11161020000007
Mahliga Dwi Rezky Putri 11161020000008
Dinda Chairun Nisa 11161020000011
Nurapni Hidayanti 11161020000012
Millatul Amalia 11161020000020
Rara Praba Andari 11161020000025
Aditya Rahmansyah 11161020000040

PROGRAM STUDI FARMASI


FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2018

1
KATA PENGANTAR

Assalamua’alaikum wr.wb
Alhamdulillah, puji syukur atas segala nikmat dan karunia yang telah
Allah SWT berikan, sehingga kami dapat menyelesaikan miniskripsi ini dengan
judul “Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Dari Ekstrak Etil Asetat Daun
Mengkudu (Morinda Citrifollia L) Dengan Metode Perkolasi”. Penulisan
miniskripsi ini dilakukan dalam rangka untuk memenuhi tugas akhir mata kuliah
Praktikum Farmakognosi Fitokimia III
Kami mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam kelancaran dalam penulisan miniskripsi ini, baik berupa
dorongan moril maupun materil. Kami mengucapkan terimakasih kepada seluruh
Dosen mata kuliah Praktikum Farmakognosi Fitokimia III yang telah
membimbing kami selama praktikum serta teman-teman satu kelompok yang
telah menyelesaikan tugas miniskripsi ini dengan baik.
Kami menyadari bahwa miniskripsi ini masih terdapat kekurangan atau
belum sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran yang bersifat membangun
sangat kami harapkan guna penyempurnaan miniskripsi ini.
Sekian.
Wassalamu’alaikum wr.wb

Tangerang, 14 Desember 2018

Penyusun

2
DAFTAR ISI

Halaman Judul …………………………………………………………….… 1


Kata Pengantar …………………………………………………………….… 2
Daftar Isi ………………………………………………………………….…. 3
BAB 1 Pendahuluan……………………………………………………….… 4
1.1 Latar Belakang Masalah……………………………………………….… 4
1.2 Tujuan Percobaan …………………………………………………….…. 6

BAB 2 Tinjauan Pustaka ……………………………………………….…… 7


2.1 Klasifikasi Tanaman ………………...…………………………….……. 7
2.2 Dasar Teori …………………………...………………………....………. 7

BAB 3 Metodologi Penelitian……………...……………….……………….. 19


3.1 Tempat dan Waktu penelitian …………….…………………………..…. 19
3.2 Alat dan Bahan ………………………………………………………….. 19
3.3 Cara Kerja ……………………………………………………………….. 20

BAB 4 Hasil dan Pembahasan ………………………….…………………… 28

BAB 5 Penutup ……………………………………………………………… 46


5.1 Kesimpulan ……………………………………………...…………….… 46
5.2 Saran ……………………………………………………..…………….... 48
Daftar Pustaka ……………………………………………….……………… 49
Lampiran …………………………………………………….……………… 51

BAB 1

3
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah


Di Alam begitu berlimpah sumber daya alam yang dapat
dimanfaatkan. Salah satunya di Indonesia, dimana Indonesia merupakan
salah satu dari 10 kawasan yang memiliki keanekaragaman hayati.
Keanekaragaman tersebut banyak dikembangkan dan diteliti menjadi
produk-produk herbal yang berguna sebagai obat. Berbagai jenis tanaman di
Indonesia memiliki potensi besar karena pada umumnya setiap tanaman
memiliki kandungan kimia yang spesifik dan dapat memberikan efikasi.
Berbagai tanaman obat dan ribuan tanaman berpotensi obat di Indonesia
mengandung beraneka ragam jenis senyawa kimia alami (Saifudin dkk,
2011). Penggunaan tanaman obat merupakan salah satu alternative dalam
bidang pengobatan dan kesehatan, alasanya karena penggunaan bahan alami
yang berasal dari tanaman meminimalisir efek samping yang ditimbulkan
(Yuliani, 2001). Tanaman digunakan sebagai obat-obatan dikarenakan
mengandung senyawa yang disebut sebagai metabolit sekunder dengan
struktur molekul dan aktivitas biologic yang beraneka ragam. Hal tersebut
menunjukkan bahwa senyawa metabolit sekunder memiliki potensi yang
sangat baik untuk dikembangan menjadi obat (Pandiangan, 2009).
Salah satu tanaman di Indonesia yang banyak digunakan sebagai
sumber obat alami dan sudah banyak diteliti serta dikembangkan untuk
menjadi produk obat herbal yang memberikan efikasi yaitu tanaman
Mengkudu (Morinda citrifolia L.). Tanaman Mengkudu (Morinda citrifolia
L.) diperkirakan mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antivirus,
antituberkulosis, antitumor, analgesic, hipotensif, imunologi (Wang et al,
2002; Usha et al., 2010), antikanker, antioksidan, antiinflamasi, dan aktivitas
kardiovaskuler (Chan-Blanco et al., 2006). Pada tanaman Mengkudu
(Morinda citrifolia L.) bagian yang paling banyak dimanfaatkan adalah
bagian daunnya. Dalam daun Mengkudu terkandungan senyawa-senyawa
yang bersifat polar yang dapat diektraksi dengan menggunakan air seperti
glikosida, karbohidrat, protein, vitamin, dan mineral. Mengkudu juga

4
mengandung saponin, scopoletin, acubin, asperuloside, alizarin, dan
antrakuinon (Peter, 2005).
Senyawa- senyawa metabolit sekunder dalam daun mengkudu
berbeda-beda dan beraneka ragam. Hal tersebut dikarenakan dipengaruhi
oleh faktor-faktor seperti; daerah asal tanaman ditanam, waktu pengambilan
sampel, kondisi lingkungan tanaman, metoda isolasi yang dipilih, serta
fraksi isolasi yang dipilih. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk
mengetahui kandungan metabolit sekunder dari tanaman daun Mengkudu
dengan cara mengisolasi dan melakukan identifikasi terhadap kandungan
kimianya. Pada proses mengisolasi kandungan kimia dalam sampel bahan
alam, terdapat beberapa tahapan isolasi seperti; tahap ekstraksi, tahap
kromatografi, tahap skrining fitokimia, tahap purifikasi, dan tahap penentuan
struktur molekul menggunakan spektroskopi. Pada tahap ekstraksi terdapat
banyak pilihan teknik yang dapat dipilih baik secara modern maupun
konvensional seperti; teknik maserasi, perkolasi, infudasi, sokhletasi,
sonikasi, microwave, dan destilasi. Teknik-teknik tersebut masing-masing
memiliki kelebihan dan kekurangan. Teknik ekstraksi dilakukan untuk
memperoleh ekstrak dari tanaman daun Mengkudu. Sementara, untuk tahap
kromatografi dapat menggunakan teknik yang umumnya digunakan yaitu;
Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Kolom Vaccum (KVC),
Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG), dan Kromatoreon (Centrifugal
Chromatography). Teknik kromatografi digunakan untuk pemisahan
komponen-komponen yang terdapat dalam ekstrak. Teknik ini didasarkan
pada perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium baik pada
fase diam dan fase gerak. Tahap skrining fitokimia dilakuakan untuk
mengetahui secara kualitatif kandungan dalam ekstrak yang diperoleh
seperti uji sterol dan triterpenoid, uji alkaloid, uji saponin, dan uji flavonoid.

1.2 Tujuan Percobaan


1. Mahasiswa dapat menrancang proses isolasi senyawa dari bahan alam.
2. Dapat melakukan uji identifikasi pendahuluan terhadap kandungan
metabolit sekunder yang terdapat pada simplisia tumbuhan

5
3. Mampu melakukan mengekstraksi kandungan kimia dari bahan alam
menggunakan berbagai metoda dan mampu menghitung jumlah
rendemen dari ekstrak yang dihasilkan pada tiap metoda
4. Dapat melakukan pemisahan ekstrak bahan alam berdasarkan
perbedaan kelarutannya dalam pelarut organic
5. Dapat menganalisa komponen kimia dalam ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
6. Dapat memahami proses pembuatan kolom
7. Mampu melakukan Isolasi senyawa dari ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan metode kromatografi kolom
8. Dapat memahami cara untuk memonitoring hasil isolasi suatu senyawa
9. Dapat melakukan penyiapan KLT preparative dan melakukan uji KLT
subfraksi
10. Dapat melakukan isolasi senyawa kimia dari ekstrak bahan alam
dengan menggunakan plat KLT Preparatif
11. Dapat melakukan proses rekristalisasi sebagai salah satu metode
purifikasi senyawa murni dalam suatu bahan alam

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Klasifikasi Tanaman


Klasifikasi atau taksonomi ilmiah :
Mengkudu (Morinda citrifolia . L)
Kingdom : Plantae

6
Subkingdom : Tracheobionta
Divisi : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Subclass : Asteridae
Ordo : Rubiales
Family : Rubiaceae
Genus : Morinda
Spesies : Morinda citrifolia. L
Tanaman mengkudu merupakan jenis tanaman yang berbentuk
pohon dengan batang bengkok serta memiliki daun yang tunggal. Ujung
dan pangkal dari daun mengkudu umumnya berbentuk runcing, daun
mengkudu memiliki panjang 10-40 cm. selain itu, mengkudu juga
memiliki bunga yang majemuk, bentuk bongkol, bertangkai, benang sari
berjumlah 5 buah dan memiliki buah yang permukaannya tidak teratur
berwarna hijau kekuningan. (Syamsul hidayat dkk, 1991)

2.2 Dasar Teori


Simplisia adalah bahan alam yang telah dikeringkan yang
digunakan untuk pengobatan dan belum mengalami pengolahan. Suhu
pengeringan simplisia tidak lebih dari 60◦C (DIKJEN POM, 2008).
Sebagai sumber simplisia, tanaman obat dapat berupa tumbuhan liar atau
tanaman budidaya. Dasar dalam pembuatan simplisia meliputi beberapa
tahap, diantaranya adalah :
a. Pengumpulan bahan baku
Kadar senyawa aktif dalam suatu simplisia berbeda-beda dan
tergantung pada factor-faktor yang mempengaruhinya (bagian tumbuhan,
umur tumbuhan atau bagian yang digunakan, waktu panen, dan
lingkungan tempat tumbuh). Menggunakan bagian daun sebagai bahan
untuk simplisia, kadar air harus <5% (Sirait, 1985).

b. Sortasi basah
Bertujuan untuk menghilangkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan
asing lainnya dari bahan simplisia (Sirait, 1985).
c. Pencucian

7
Bertujuan untuk memebersihkan kotoran yang melekat pada bagian
tumbuhan, terutama bahan bahan yang berasal dari dalam tanah dan yang
terkena pestisida.
d. Perajangan
Bertujuan untuk mempermudah proses-proses yang akan dilalui
selanjutnya yaitu proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan
(Sirait, 1985)
e. Pengeringan
Menurut gunawan (2010), Proses pengeringan bertujuan untuk:
i. Menurunkan kadar air
ii. Menghilangkan aktivitas enzim
iii. Memudahkan dalam proses yang akan dilakukan
selanjutnya
f. Sortasi kering
Bertujuan untuk memisahkan benda-benda asing yang tidak
diinginkan dan pengotor yang masih tertinggal (Sirait, 1985).
g. Penyimpanan
Simplisia ditempatkan dalam suatu wadah tersendiri agar tidak
saling bercampur antara simplisia satu dengan lainnya (Gunawan, 2010).
Bahan dan bentuk pengemsannya harus dapat melindungi simplisia.
Proses awal pembuatan ekstrak adalah tahapan pembuatan serbuk
simplisia kering. Proses ini dapat mempengaruhi mutu ekstrak dengan
dasar beberapa hal sebagai berikut :
a. Makin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi makin efektif-
efisien, namun makin halus serbuk maka makin rumit secara
teknologi peralatan untuk tahapan filtrasi.
b. Selama penggunaan peralatan penyerbukan dimana ada
gerakan dan interaksi dengan benda keras, maka akan timbul
panas (kalor) yang dapat berpengaruh pada senyawa
kandungan (DEPKES RI, 2000).
Uji fitokimia terhadap kandungan senyawa metabolit sekunder
merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai
tumbuhan obat atau dalam hal pencarian senyawa aktif baru atau menjadi
prototypese nyawa aktif tertentu. Metode uji fitokimia yang banyak
digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan (Iskandar et al,
2012).

8
Aktivitas biologi tanaman dipengaruhi oleh jenis metabolit sekunder
yang terkandung didalamnya. Aktivitas biologi ini ditentukan oleh struktur
kimia dari senyawa (lisdawati et al, 2007). Penapisan fitokimia dilakukan
untuk mengetahui komponen kimia pada tumbuhan secara kualitatif
(Pratiwi et al, 2006).
Penapisan fitokimia dapat dilakukan terhadap sampel segar, simplisia
atau ekstrak yang prinsip kerjanya hampir sama. Penapisan kimia dengan
sampel segar biasanya dilakukan untuk menguji kandungan kimia ketika
dalam keadaan pengambilan sampel dialam terbuka. Pengujian kandungan
kimia dari tumbuhan dialam terbuka biasanya dilakukan oleh kolabolator
ahli kimia dari tumbuhan. Keuntungan pengujian dialam terbuka adalah
hanya akan ditemukan sampel yang positif dengan kandungan kimia
tertentu saja yang dapat diperoleh.
Tanaman mengkudu diketahui banyak memiliki kandungan kimia
yang berkhasiat bagi kesehatan terutama pada bagian buah dan daun dari
tanaman mengkudu. Kandungan kimia dari daun mengkudu banyak
diperoleh melalui proses ekstraksi.
Proses ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan suatu zat
berdasarkan perbedaan kelarutan. Proses ekstraksi dilakukan untuk
mendapatkan suatu ekstrak. Banyak metode yang dapat dilakukan pada
proses ekstraksi salah satunya adalah metode perkolasi.
Dalam praktikum ini, kami menggunakan, metode perkolasi adalah
salah satu cara ekstraksi (penyarian) yang dilakukan dengan cara
mengalirkan cairan (pelarut) melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi.
Metode ini menggunakan alat yang menyerupai botol terbalik pada bagian
tutup botol diberi lubang kecil agar perkolat dapat keluar. Metode ini
dipengaruhi oleh gaya berat, viskositas, daya larut, teganggan permukaan,
difusi, osmosis, adesi, daya kapiler dan daya gesekan .
Berdasarkan penelitian, Daun mengkudu terdapat kandungan kimia
yang berupa flavonoid dan zat antrakuinon yang dapat berfungsi sebagai
antibiotic atau antibakteri. Selain itu, juga terdapat kandungan colopektin,
senyawa terpenoid, dan dapat digunakan sebagai obat kanker, anti-

9
inflamasi, memperlancar sirkulasi darah, serta membantu mengobati
penyakit pada saluran pencernaan.
Pada umumnya, metode ini lebih baik dibandingkan dengan metode
maserasi dikarenakan aliran pelarut yang mengalami pergantian berulang
pada perkolasi menyebabkan larutan atau sampel yang memiliki
konsentrasi rendah, sehingga menyebabkan derajat perbedaan konsentrasi
antara pelarut dan sampel. Namun, metode ini juga memiliki kekurangan
yaitu akan banyak menggunakan pelarut sehingga biaya akan lebih mahal
dari pada metode maserasi.
Ekstrak awal dari daun mengkudu merupakan campuran dari
berbagai macam senyawa. Ekstrak awal sulit dipisahkan melalui teknik
pemisahan tunggal untuk mengisolasi senyawa tunggal. Oleh karena itu,
ekstrak awal perlu dipisahkan ke dalam fraksi yang memiliki polaritas dan
ukuran molekul yang sama. Fraksinasi dapat dilakukan dengan metode
ekstraksi cair-cair atau dengan kromatografi cair vakum (KCV),
kromatografi kolom (KK), Size-Exclution Chromatography (SEC), Solid-
Phase Extraction (SPE) (Sarker, 2006).
Pemisahan dengan cara partisi atau dikenal juga dengan pemisahan
cair-cair merupakan metode pemisahan suatu senyawa berdasarkan tingkat
kelarutannya di dalam dua pelarut yang bercampur. Dalam proses isolasi
kandungan kimia dari bahan alam, penggunaan metoda partisi
dimaksudkan untuk memisahkan campuran komponen kimia yang terdapat
dalam ekstrak dengan menggunakan dua pelarut yang tidak saling
bercampur. Komponen kimia yang ada pada ekstrak tumbuhan akan larut
ke dalam pelarut yang sesuai dengan tingkat kepolaran yang dimiliki oleh
senyawa tersebut.
Satu hal yang paling penting dalam proses memisahkan senyawa
dengan menggunakan metoda partisi ini adalah langkah dalam pemilihan
pelarutnya. Dimana pelarut yang dipilih merupakan campuran dua pelarut
yang tidak saling bercampur. Beberapa contoh campuran pelarut yang
digunakan adalah air-diklorometana, air-eter, air-heksana. Pada umumnya
dalam proses partisi, pelarut yang digunakan melibatkan air, karena air
sangat polar dan tidak bercampur dengan pelarut organic. Perlu menjadi

10
catatan disini bahwa pelarut etanol / methanol bercampur dengan air,
sehingga pelarut ini tidak bisa digunakan untuk memisahkan senyawa
dengan metoda partisi.
Pemisahan dengan metoda partisi dilakukan dengan menggunakan
corong pisah. Densitas dari pelarut akan memprediksikan posisi lapisan
pelarut di dalam corong pisah. Pada umumnya pelarut organic yang tidak
terhalogenasi memiliki densitas dibawah 1 g/mL, sedangkan pelarut
organic yang terhalogenasi memiliki densitas di atas 1 g/mL.
Lalu, hasil ekstrak dengan metode partisi selanjutnya, dilakukan
pemeriksaan senyawa dengan metode selanjutnya yaitu metode pemisahan
kromatografi lapis tipis (KLT).
Kromatografi adalah proses pemisahan yang tergantung pada
perbedaan distribusi campuran komponen antara fase gerak dan fase diam.
Fase diam dapat berupa pembentukan kolom dimana fase gerak dibiarkan
untuk mengalir (kromatografi kolom). Perlu diperhatikan bahwa senyawa
yang berbeda memiliki koefisien partisi yang berbeda antara fase gerak
dan diam. Senyawa yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan
bergerak lebih cepat melalui sistem kromatografi. Senyawa dengan
interaksi yang kuat dengan fase diam akan bergerak sangat lambat
(Christian, 1994; Skoog, 1993).
Silika gel adalah fasa diam yang paling sering digunakan untuk
pemisahan produk alam. Permukaan silika gel mengandung gugus silanol.
Gugus hidroksil ini adalah pusat aktif dan berpotensi dapat membentuk
ikatan hirogen yang kuat dengan senyawa yang dipisahkan. Silika gel
membentuk ikatan hidrogen terutama dengan donor H seperti alkohol,
fenol, amina, amida, dan asam karboksilat (Palleros, 2000).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah salah satu metode
pemisahan komponen menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan
bahan adsorbend inert. KLT merupakan salah satu jenis kromatografi
analitik yang sering digunakan untuk identifikasi awal karena terdapat
beberapa keuntungan diantaranya adalah sederhana dan murah, KLT juga
dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis

11
fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil (Fessenden, 2003).
Terjadinya pemisahan komponen – komponen pada KLT dengan
nilai Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan
komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan
sebagai fase diam dapat digunakan silica gel serta eluen yang digunakan
berdasarkan hasil yang diperoleh dari KLT, akan lebih baik jika eluen yang
digunakan pada kolom kromatografi sedikit dibawah dari eluen pada KLT
(Lenny, 2006). Cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat
terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan
suatu benda penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat
berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna) (Kennedy, 1990). Penggunan
KLT ini berdasarkan prinsip adsorbs.
Kromatografi kolom adalah metode pemisahan yang didasarkan
pada pemisahan daya adsorbs suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik
pengotornya maupun isolasinya. Kromatografi kolom biasa disebut
kromatografi cair - padat. Penyerap yang biasa digunakan silika gel dan
alumina (Kasiman, 2006).
Untuk kromatografi kolom, kolom yang diisi dengan bahan
penjerap disebut kolom pemisah. Penggunaan kolom tergantung dari
masalah pemisahan yaitu kolom berfilter dengan gelas berpori, yang pada
ujung bawah menyempit dan dilengkapi dengan keran. Perbandingan
Panjang tabung terhadap diameter umunya 40:1. Pengisian kolom dengan
adsorben disebut pengemasan kolom. Agar pemisahan rata, tabung diisi
sambal diketuk – ketuk dengan benda lunak. (stahl, 1991)
Penyiapan sampel yang akan dielusi terbagi dua cara yaitu dengan
melarutkan sampel ekstrak dengan pelarut yang sesuai kemudian
dituangkan hati-hati diatas packing kolom serta cara kedua yaitu
mencampur sampel ekstrak dengan fase diam. Pada kromaografi ini
sampel sebagai lapisan terpisah diletakkan diatas fase diam. Sampel
dihomogenkan dengan fase diam sehingga membentuk serbuk kering. Fase
diam dan sampel ini berada dalam kolom yang terbuat dari kaca/gelas
selama elusi fase gerak dialirkan dari atas, mengalir karena gaya gravitasi

12
atau ditekan dan juga disedot dari arah bawah. Komponen sampel akan
terpisah selama bergerak dibawa oleh fase gerak dalam kolom (fase diam).
Komponen yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan keluar lebih
dahulu dan diikuti oleh komponen lain.
Elusi (pengembangan) dengan menggunakan fase gerak. Fase
gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit demi
sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom sehingga
fase gerak mengalir dengan sendirinya. Elusi terbagi menjadi elusi
isokratik dan elusi gradien (bertahap). Elusi isokratik yaitu selama proses
elusi menggunakan fase gerak dengan polaritas tetap. Sedangkan elusi
gradien (bertahap) yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak
berubah-ubah polaritasnya. Untuk membuat polaritas berubah-ubah maka
komposisi fase gerak berubah. pada umumnya dimulai fase gerak non
polar kemudian berubah kepelarut polar.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan teknik kromatografi
yang berdasar pada prinsip adsorpsi, bedanya dengan kromatografi kolom
yaitu konfigurasi KLT yang berbentuk planar (plate). Fasa diam berupa
padatan yang diaplikasikan berbentuk datar pada permukaan kaca atau
aluminum sebagai penyangganya, sedangkan fasa gerak berupa zat cair
seperti yang digunakan dalam kromatografi kolom atau kromatografi
kertas (Rubiyanto, 2017).
Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya
merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas, sehingga
didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan cara trial and
error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi)
yang diperoleh (Gritter, 1991).Identifikasi secara kulitatif pada
kromatografi kertas khususnya kromatografi lapis tipis dapat ditentukan
dengan menghitung nilai Rf. Nilai Rf merupakan ukuran kecepatan
migrasi suatu senyawa. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan
antara jarak senyawa titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal
(Gholib, 2008).
Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu.
Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan

13
senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti
mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut
dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang
rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi,
yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya
(Ewing, 1985).

Menurut Rubiyanto (2017), meskipun sistem KLT yang digunakan


sudah ideal, namun hal itu tidak menjamin diperolehnya pemisahan yang
juga ideal mengingat beragamnya variasi interaksi yang mungkin terjadi
selain adsorpsi dan juga sifat, kemampuan, dan karakter fasa gerak yang
boleh jadi sangat dominan dalam menentukan nilai Rf nya. Beberapa
faktor yang mempengaruhi Rf adalah
1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan
Kemampuan permukaan adsorben dikaitkan dengan banyak sedikitnya
pori, luas, dan volume porinya sehingga besar kecilnya struktur senyawa
akan berpengaruh langsung pada aktivitas adsorpsinya.
2. Sifat dari adsorben dan derajat aktivitasnya
Perbedaan adsorben memberikan perbedaan dalam menentukan harga Rf
demikian pula perbedaan perlakuan aktivasi adsorben. Untuk memperoleh
reprodusibilitan yang tinggi, semua komponen dalam sistem KLT harus
dibuat sama diantaranya perlakuan awal, jenis adsorben, dan sistem
pelarut.
3. Tebal dan kerataan permukaan adsorben
Meski tidak berpengaruh besar, namun kondisi fisik plat KLT penting
dalam pengukuran Rf, karena noda yang berada pada bagian plat yang
tidak sama rata akan menyulitkan dalam menentukan titik tengah noda
sebagai batas pengukuran jarak.
4. Kemurnian pelarut
Untuk menjamin proses elusi yang
optimal, pelarut harus benar-benar murni. Jika tidak, berarti pemisahan

14
tidak sempurna dan umumnya ini terlihat dari bentuk noda yang melebar
atau terjadinya pengekoran (tailing).

Kromatografi lapis tipis preparatif, digunakan untuk memisahkan


campuran reaksi, sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah
pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan
alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit serta untuk
memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis
tipis kuantitatif (Nasution, 2010). Proses isolasi kromatografi lapis tipis
preparative terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta
kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti
kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen
kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang
berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Munson,
2010).
Adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis
tipis adalah silika gel dan Gipsum Fluorensi. Fase diam ini dapat
digunakan sebagai fase polar maupun non polar. Untuk fase polar,
merupakan silika yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit asam. Silica gel
perlu ditambah gips (kalsiumsulfat) untuk memperkuat pelapisannya pada
pendukung. Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa fluoresensi, agar
bila disinari dengan sinar UV dapat berfluoresensi atau berpendar,
sehingga dikenal dengan silica gel GF254 yang berarti silica gel dengan
fluoresen yang berpancar pada panjang gelombang 254 nm.
kromatografi lapis tipis preparative digunakan untuk memisahkan
campuran reaksi, sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah
pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan
alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit serta untuk
memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis
tipis kuantitatif. Cara isolasi menggunakan KLTP yaitu : cuplikan yang
akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan
besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga
campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan

15
cara yang tidak merusak jika senyawa itu berwarna, dan penyerap yang
mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan
dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. (Nasution, 2010).
Adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis
tipis adalah silika gel dan Gipsum Fluorensi. Fase diam ini dapat
digunakan sebagai fase polar maupun non polar. Untuk Silica gel perlu
ditambah gips (kalsium sulfat) untuk memperkuat pelapisannya pada
pendukung, Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa fluoresensi, agar
bila disinari dengan sinar UV dapat berfluoresensi atau berpendar,
sehingga dikenal dengan silica gel GF254 yang berarti silica gel dengan
fluoresen yang berpancar pada panj,gelombang 254 nm.
Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca
yang dapat menampung beberapa plat. Koefisien pemisahan dapat
ditingkatkan dengan cara pengembangan berulang. Harus diperhatikan
bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap maka semakin
besar kemungkinan penguraiannya (Nasution, 2010).
Kelebihan KLTP ini adalah biaya yang digunakan murah dan
memakai perlatan yang dasar ,kekurangan adanya kemungkinan senyawa
yang diambil dari plot adalah senyawa yang beracun, waktu yang
diperlukan dalam proses pemisahan cukup lama, rendemen yang diperoleh
berkurang dari 40%-50% dari bobot awal
Proses rekristalisasi merupakan salah satu metode yang dapat
dipilih dalam proses purifikasi senyawa murni dalam suatu campuran
ekstrak bahan alam. Metode ini digunakan untuk proses pemurnian
komponen dalam larutan organik. Metode rekristalisasi dapat digunakan
sebagai metode yang paling efisien karena tidak membutuhkan alat-alat
khusus dan mudah didapatkan senyawa major dalam suatu sampel bahan
alam. Selain itu, keuntungan lainnya ketika kristal yang diperoleh
merupakan kristal yang murni dapat dilakukan proses lebih lanjut seperti
menggunakan instrumen X-Ray untuk memperoleh kerangka dari senyawa
tersebut. Metode-metode dalam proses rekristalisasi yaitu memilih
pelarut, melarutkan zat terlarut, menghilangkan warna larutan,

16
memindahkan zat padat, mengkristalkan larutan, mengumpulkan dan
memcuci kristal, serta mengeringkan produk/hasil.
Metode rekristalisasi didasarkan pada prinsip reaksi pengendapan
dimana proses yang terjadi yaitu proses pengendapan zat-zat padat yang
tidak terlarut akibat larutan terlampaui jenuh. Hal-hal yang dapat
dilakukan untuk memperoleh larutan jenuh yaitu Melakukan pemanasan
pada sampel yang telah larut dengan yang cocok, kemudian dilakukan
proses pendinginan secara perlahan. Pada proses ini kristal akan
mengendap karena padatan/sampel akan mengendap pada kondisi
perubahan suhu. Namun, pada proses ini diharapkan bahwa pengotor tidak
ikut mengkristal. Faktor kemudahan pelarut menguap dan lama penguapan
pelarut akan mempengaruhi bentuk kristal. Dimana semakin sulit pelarut
untuk menguap dan penguapan yang dilakukan semakin lama maka akan
menghasilkan kristal yang bagus. Untuk melakukan metode rekristalisasi
dibutuhkan keterampilan dan pengalaman untuk keberhasilan diperolehnya
kristal dalam suatu sampel (Sukardjo, 1989).

17
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu penelitian


Penelitian / praktikum ini dilakukan di Laboratorium Farmasi yaitu di
Laboratory Natural Product (PNA) Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam
Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta , Mulai dari September sampai
Desember 2018

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : timbangan bahan,
timbangan analitik, labu erlenmeyer, corong, kolom kromatografi,plat
KLT,vial,batang pengaduk,spatula,pipet ukur,pipet tetes,kertas saring,kapas,cawan
penguap,jepitan ,vacuum rotary evaporator ,melting point,water bath dan alat
gelas lainnya

3.2.2 Bahan
Bahan yang akan diteliti adalah Tumbuhan Morinda Citrifolia L sebanyak
2,9 kg yang diperoleh dari Lingkugan Sekitar Fakultas Ilmu Kesehatan Uin Syarif
Hidayatullah Jakarta

3.2.3 Bahan Kimia

18
Bahan – bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah: etil asetat,n-
heksana,methanol,(HCL) asam klorida,amonia encer,(H2SO4) asam sulfat,besi
florida,lempengan KLT,silika gel, pereaksi kimia lainya : Pereaksi Godin’s (reagen
A : 1% vanili,dilarutkan dalam etanol : 3% HCLO3 dalam aquadest 1:1 dan
Reagen B 10 % H2SO4 ),Pereaksi Mayer, Pereaksi Dragendorff.

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Penyiapan Bahan


Sejumlah 2,9 kg Daun Morinda citrifolia L disortasi basah untuk
menghilangkan kotoran- kotoran atau bahan – bahan asing sehingga dapat
mengurangi jumlah pengotor yang ikut terbawa dalam bahan uji, cuci dengan air
hingga bersih,lalu ditiriskan hingga tidak ada airnya. lakukan Perajangan,
perajangan ini dilakukan untuk mempercepat pengeringan Tumbuhan, kemudian
dikeringkan dengan cara di angin – anginakan pada suhu ruang saja, tidak boleh
terkena sinar matahari langsung, setelah kering dan bebas dari air lakukan sortasi
kering ( untuk melihat adakah simplisia yang busuk pada saat pengeringan
simplisia ) lalu timbang simplisia kering yang telah di sortasi kering tadi,
haluskan simplisia tadi menjadi serbuk, kemudian simpan dalam wadah yang
bersih dan tidak lembab dan yang terlindung dari cahaya adapun simplisia yang
dihasilkan adalah seberat 600 gram

3.3.2 Proses Ekstraksi (Perkolasi)


Siapkan perkolator yang kami gunakan adalah botol bekas yang telah
dilubangi bawahnya, sumbat ujung botol dengan kapas. Agar, simplisia tidak jatuh
ke hasil ekstraknya. Lalu, pindahkan massa sedikit demi sedikit kedalam
percolator sambil di tekan hati-hati Sejumlah simplisia 114 gram. Tuangkan cairan
penyari (methanol) secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia
masih terdapat selapis kira – kira 1 cm cairan penyari (methanol)

19
Tutup percolator, kemudian dibiarkan cairan menetes dengan kecepatan 1
ml per menit. tambahkan berulang ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu
terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia.
Diperas massa, dicampurkan cairan perasan kedalam perkolat, tambahkan
ciran penyari hingga diperoleh volume yang diinginkan. Lalu, dipindahkan
kedalam Erlenmeyer. Kemudian, di evaporator rotary vacuum untuk mendapatkan
ekstrak encer yang pelarutnya sudah terambil atau sudah dipisahkan. Kemudian
dituang kedalam cawan penguap dan diuapkan diatas waterbath hingga diperoleh
ekstrak kental. Didapat ekstrak kental 12,09 gram dan % rendemen sebesar :
10,59%

3.3.3 Penapisan Skrining fitokimia


Pada simplisia Mengkudu ini dilakukan skrining fitokimia kandungan kimia
antara lain yaitu : alkaloid,flavonoid,terpenoid,saponin,Kuinon,kumarin dan
fenolik
A. Identifikasi Alkaloid
1 1 gram simplisia + 5 ml ammonia 30% (gerus pada lumpang) + 20 ml etil
asetat (gerus dan saring). Filtrate diambil (tabung A), Sebagian dari larutan
pada tabung A + 10 ml Hcl (kocok ringan). Diambil lapisan atas (tabung
B), kemudian Larutan pada tabung A ditetesi diatas kertas saring +
pereaksi dragendorf, menghasilkan warna orange atau jingga. Positif
alkaloid
2 Larutan pada tabung B dinagi menjadi dua bagian + masing-masing
pereaksi mayer dan dragendorf , hasil (negative) tidak mengandung
alkaloid kemukina keslahan praktikan

B. Identifikasi flavonoid
3 gram simplisia + 35 ml air panas (saring). Ambil filtrate,lalu 5 ml dari
filtrate + 1 ml Hcl pekat + 3-4 butir lempeng mg + 5 ml amil alcohol, hasil
Perubahan warna pada larutan amil alcohol menandakan (+) flavonoid

C. Identifikasi Saponin
10 ml dari larutan filtrate dikocok secara vertikal selama 10 detik dan
diamkam selama 10 menit, kemudian akan Terbentuknya busa

20
menunjukkan adanya senyawa saponin + 1 tetes Hcl busa tetap stabil, hasil
negative karna tidak terbentuk busa

D. Identifikasi tanin
Larutan filtrat dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi, Tabung 1 + larutan
ferri (III) clorida 1%, Tabung 2 + 15 ml pereksi stiasny, Tabung
dijenuhkan dengan natrium asetat + larutan ferri (III) clorida 1% hasil
negative karna tidak terbentuk endapan

E. Identifikasi kuinon
5 ml larutan filtrate + NaOH 1N (diteteskan), hasil negative karna tidak
terbentuk endapan warna merah

F. Identifikasi steroid dan terpenoid


1 gram simplisia serbuk dimaserasi dengan 20 ml heksana selama 30
menit (saring), ambil filtrat, Uapkan 5 ml filtrat dalam cawan penguap + 2
tetes pereaksi liebermann bouchardat hasil Positif karna adanya perubahan
warna menjadi warna hijau

G. Identifikasi kumarin
Masukan 2 gram simplisia dalam tabung reaksi + 10 ml CHCl3, Siapkan
corong yang disumbat kapas, tuang kedalamnya, lalu Panaskan 20 menit
dalam penangas air dinginkan dan saring (menggunakan kertas saring),
Filtrat diuapkan + air panas 10 ml, kemudian masukkan larutan kedalam
tabung reaksi + 0.5 ml NH4OH 10% Amati dibawah sinar uv (365 nm)
hasil positif karna Terbentuk flouresensi warna hijau

3.3.4 Ekstraksi Partisi


3.3.4.1 Partisi dengan n-heksana
Dilarutkan ekstrak methanol yang merupakan hasil dari proses
ekstraksi (perkolasi ) menggunakan sedikit methanol hingga dapat dituang
ke dalam corong pisah. Masukkan n-heksana ke dalam corong pisah yang
didalamnya telah berisi ekstrak sebanyak 15 ml, lalu diberi pengocokan
atau guncangan dengan sesekali membuka katup corong untuk
mengeluarkan gas dan proses dilakukan selama beberapa menit.
Didiamkan hingga terlihat adanya bidang batas antara pelarut heksana dan
methanol. Bila tidak terbentuk bidang batas, maka diulangi proses

21
guncangan dengan menambahkan sedikit air. Dilakukan hingga terbentuk
bidang batas. pisahkan pelarut dengan membuka kran corong pisah.
Pemisahan dilakukan dengan mengambil terlebih dahulu bagian lapisan
bawah, lalu lakukan pemisahan hingga bagian lapisan bawah sampai pada
batas pemisahan lapisan pertama, kemudian lakukan proses partisi ini
secara berulang hingga pelarut n- heksana yang dihasilkan bening,
mengindikasikan bahwa tidak terdapat senyawa non polar yang larut.

3.3.4.2 Partisi dengan Etil Asetat


Tambahkan pelarut etil asetat pada lapisan methanol yang tersisa,
lakukan pemisahan komponen dalam ekstrak dengan prosedur yang sama
saat pemisahan dengan menggunakan n-heksana, sebagai indicator
didapatkannya senyawa semipolar dalam pelarut etil asetat, Sisa dari
partisi merupakan senyawa yang larut dalam pelarut polar, kemudian
lakukan proses penguapan dengan menggunakan vacuum rotary
evaporator pada setiap ekstrak hasil partisi n-heksana, etil asetat, dan sisa
partisi sehingga didapatkan ekstrak kental.

3.3.5 Isolasi dan Pemurnian Senyawa


a. Pengujian dengan Kromatografi Lapis Tipis
Pertama, Potong plat KLT sesuai dengan ukuran yang diinginkan dan beri
tanda 0,5 cm dari atas dan 0,5 cm dari bawah, totolkan larutan ekstrak
sampel, N-Heksan, Etil Asetat dan Methanol dengan posisi digaris batas
bawah, lalu masukkan eluent (pelarut) dengan perbandingan tertentu ke
dalam chamber, masukkan kertas saring, tutup chamber biarkan sampai
kertas saring terbasahi semua (jenuh), Kemudian masukkan plat KLT
kedalam chamber, amati hingga aliran pelarut mencapai batas atas, angkat
plat KLT, biarkan kering di udara lakukan pengamatan pada lampu UV
dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Beri tanda pada spot
yang terlihat. Lakukan pengamatan dengan menyemprotkan reagen godin
A dan B , kemudian hitung nilai Rf dari tiap spot yang terlihat

b. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

22
Pertama buat terlebih dahulu kolom silika gel dengan menggunkan silika
sebanyak 30 mg dan n- heksan , basahi silika gel dengan n- heksan lalu
tuangkan bubur silika kedlam kolom,ketuk ketuk dinding kolom agar
bubur silikayang dituangkan tersebar merata,kemudian tunggu kolom
silika hingga siap dipakai.
Setelah kolom siap untuk dipakai hal pertama yang perlu dilakukan adalah
:
 Penyiapan ekstrak ke dalam kolom
Serbuk ekstrak dimasukkan ke dalam kolom melalui bagian atas
kolom dengan cara preabsorbsi. Kolom disiapkan dengan cara
membuat bubur silika (silika gel 60) dengan menggunakan pelarut
heksana. Sampel ekstrak di siapkan sebanyak 2 gram dengan cara
preabsorbsi dicampurkan silika gel 60 dengan perbandingan 1:1 (2
gram : 2 gram) sampai berbentuk serbuk. Sampel yang telah
disiapkan dituang ke dalam kolom, kemudian dielusi dengan fase
gerak heksana yang kepolarannya dinaikkan bertingkat.
 Membuat sistem pelarut
Pelarut dibuat dengan perbandingan antara pelarut non polar, semi
polar dan polar sehingga terjadi peningkatan polaritas. Pelarut yang
digunakan:
1. N – heksan 100% : 100 ml
2. N – heksan : etil asetat ( 90 :10 )
3. N – heksan : etil asetat ( 80 :20 )
4. N – heksan : etil asetat ( 70 :30 )
5. N – heksan : etil asetat ( 60 :40 )
6. N – heksan : etil asetat ( 50 :50 )
7. N – heksan : etil asetat ( 40 :60 )
8. N – heksan : etil asetat ( 30 :70 )
9. N – heksan : etil asetat ( 20 :80 )
10. N – heksan : etil asetat ( 10 :90 )
Etil asetat 100 %
 Proses isolasi
Pelarut yang telah dibuat sesuai tingkat kepolaran dimasukkan
kedalam kolom kromatorafi dengan cara sebagai berikut :
1. Masukkan pelarut n-heksan 100 % ke dalam kolom
kromatografi sedikit demi sedikit dengan bantuan corong pisah,
buka kran kolom sehingga pelarut turun melalui kolom,

23
tampung hasil pemisahan kolom dengan vial-vial yang diberi
nomor secara urut.
2. Pemisahan dengan kolom terus dilanjutkan hingga memenuhi
keseluruhan perbandingan pelarut n-heksan dan etil asetat
dengan perlakuan yang sama dan sesuai
3. Hasil eluat yang telah ditampung dalam vial selanjutnya
dianalisis dengan KLT untuk melihat spot noda yang
menandakan adanya komponen kimia yang telah terisolasi

c. Penggabungan Fraksi Etil Asetat


Untuk menggabungkan fraksi etil asetat dilakukan uji KLT untuk setiap
perbandingan di sitem pelarut yang telah di coba pada Kromatografi
Kolom dengan cara :
1. Dilarutkan larutan cuplikan dalam pelarut yang sesuai
2. Diberikan tanda batas pada bagian atas dan bawah pada plat KLT
dengan jarak 1 cm dari masing-masing tepi
3. Ditotolkan larutan sampel menggunakan pipa kapiler keatas plat KLT
4. Disiapkan chamber beserta larutan eluen dan dijenuhkan dengan
indikator kertas saring
5. Dimasukkan plat KLT kedalam chamber dan biarkan proses pemisahan
terjadi
6. Bila pemisahan plat KLT sampai pada bidang batas bagian atas,
diangkat plat KLT dan keringkan di udara
7. Dilakukan pengamatan dengan lampu UV. Diberi tanda pada pita yang
muncul
8. Evaluasi hasil dari tiap-tiap perbandingan dengan menghitung nilai rf
masing-masing kelompok perbandingan

d. Isolasi Senyawa dengan Kromatografi Preparatif


Sebelum memulai isolasi dibuat terlebih dahulu kromatorafi Preparatifnya.
Dengan cara Timbang silika gel sebanyak 30 gram, masukkan kedalam
Erlenmeyer bertutup dengan volume 250 ml, tambahkan aquadest 60 ml, kocok
sampai terbentuk suspense, suspensi silika dituangkan ke dalam plat kaca dan
diratakan, plat kaca yang sudah dilapisi dikeringkan dengan membiarkannya
semalam (8-12 jam) di dalam ruangan. pelat kaca dikeringkan dahulu selama 30
menit di dalam oven dengan suhu 110°C dengan posisi tegak dalam rak
pengering, Pelat kering disimpan ditempat yang tidak lembab dan bebas dari uap

24
laboratorium, Pelat kaca yang sudah dibuat pada praktikum yang sebelumnya di
aktivasi dengan di oven selama 30 menit pada suhu 110ᵒC
Saat memulai isolasi hal yang perlu dilakukan adalah Larutkan cuplikan
dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, beri batas atas dan bawah pada plat KLT
sepanjang 1 cm, totolkan larutan sampel dengan menggunakan pipet kapiler diatas
lempeng KLT sampai membentuk pita, siapkan larutkan eluen yang sesuai di
dalam chamber dan jenuhkan dengan menambahkan kertas saring (pelarut dipilih
dengan bantuan KLT analitik), masukkan plat KLT kedalam chamber dan biarkan
proses pemisahan terjadi sampai bidang batas atas, angkat plat KLT dan keringkan
di udara, Lakukan pengamatan dengan lampu UV. Pita yang terlihat pada lampu
UV ditandai dengan spatula, Lakukan pengikisan tiap pita dan pisahkan hasil
pengikisan tiap pita tersebut,
Ekstraksi hasil pengikisan dengan menggunakan pelarut etil asetat, Proses
ekstraksi dilakukan menggunakan pipet tetes, Hasil ekstrak yang didapat di
uapkan terlebih dahulu kemudian di ujikan kembali menggunakan KLT analitik.

e. Rekristalisasi
Rekristalisasi dilakukan dengn 3 cara yaitu :
1. Purifikasi Metode Pemanasan
Sampel ekstrak (partisi etil asetat) yang sudah dikelompokkan dalam vial
dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (metanol/n-heksan), goyang tabung dan
diamati apakah sampel larut dalam pelarut tersebut pada suhu kamar. Diamati
dan dicatat pengamatannya. Kemudian dianaskan tabung reaksi berisi sampel
yang tak larut, lalu digoyang tabung tersebut dan dicatat bilamana sampel
tersebut larut dalam pelarut panas, biarkan larutan menjadi dingin dan diamati
pembentukan kristalnya, catat masing-masing vial apabila ada kristal yang
terbentuk.

2. Purifikasi metode pendinginan

25
Sampel ekstrak yang sudah dikelompokkan dalam vial dilarutkan dengan pelarut
yang sesuai (metanol,heksan), sampel dikristalkan kembali dengan cara
didinginkan dalam es agar kristal lebih cepat terbentuk, pisahkan / dipartisi
kristal dengan campuran pelarut sehingga didapat kristal utuh dalam vial.,
lakukan uji titik leleh (melting point) dan KLT analitik pada sampel yang sudah
di purifikasi.

3. Purifikasi metode Pemilihan Pelarut


masukkan masing-masing sampel yang telah dipartisi dan dikelompokan ke
dalam 8 tabung reaksi atau vial, tambahkan 1 ml aquades, etanol 95%, etil
asetat, aseton, toluene, dan heksan pada masing-masing tabung reaksi tadi dan
beri nomor secara berurutan, goyang tabung dan amati apakah sampel larut
dalam pelarut tersebut pada suhu kamar. Diamati dan dicatat pengamatannya,
panaskan tabung reaksi berisi sampel yang tak larut, lalu digoyang tabung
tersebut dan dicatat bilamana sampel tersebut larut dalam pelarut panas.

BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan Sampel


Pada proses isolasi senyawa dari bahan alam dibutuhkan rangkaian
untuk mendapatkan isolate dari bahan alam yang diinginkan. Secara garis
besar, tahapan dalam proses isolasi senyawa murni adalah sebagai berikut :
a. Persiapan sampel atau simplisia
b. Skrinning fitokimia
c. Isolasi senyawa murni
Proses pertama yang menentukan hasil isolat yaitu proses penyiapan
sampel atau simplisia. Dalam proses ini dibutuhkan ketelitian karena
terjadinya kesalahan kesil akan memberikan dampak yang besar dalam proses
isolasi bahan alam yang dilakukan. Dalam proses ini dilakukan pendekatan

26
fitokimia dan etnobotani sebagai dasar dalam pemilihan tanaman, daun
mengkudu sudah banyak digunakan oleh masyarakat sebagai obat.
Faktor-faktor yang memepengaruhi kadar aktif suatu senyawa seperti
bagian tanaman yang diambil, waktu pengambilan, umur tanaman, dan
lingkungan tempat tumbuh adalah hal-hal yang perlu diperhatikan. Pemilihan
bagian daun dari tanaman mengkudu didasarkan pada bahwa banyak
kandungan aktif yang dapat memberikan efikasi yang terdapat pada bagian
daun dari mengkudu. Proses ekstraksi yang cukup mudah juga menjadi salah
satu diantara factor dalam pemilihan bagian daun dari tanaman mengkudu.
Bobot dari daun mengkudu yang digunakan adalah sebesar 2.9 kg,
selanjutnya dain mengkudu mengalami proses sortasi basah yang dilakukan
dengan cara pencucian sampel dengan air mengalir. Proses tersebut bertujuan
untuk memberdihkan pengotor yang melekat pada daun mengkudu.
Proses yang dilakukan selanjutnya adalah proses perajangan dengan
cara memotong daun mengkudu menjadi bagian-bagian kecil yang
dilanjutkan dengan proses pengeringan yang bertujuan untuk mengurangi
kadar air yang akan mencegah terjadinya kontaminasi mikroorganisme yang
dapat merusak sampel. Pengeringan dilakukan dengan dua metode, yaitu :
1. Metode pengeringan alami, dilakukan tanpa bantuan alat dibawah sinar
matahari atau diamgin-anginkan
2. Metode pengeringan buatan, dilakukan dengan bantuan alat
Dalam proses pengeringan tidak dianjurkan dilakukan dibawah sinar
matahari langsung karena terdapat beebrapa senyawa yang akan rusak bila
terpapar sinar matahari langsung. Pengeringan dilakukan dengan cara
diangin-anginkan hingga kanudngan air dalam sampel berkurang,
Proses sortasi kering dilakukan segera setelah proses pengeringan
dilakukan, dengan tujuan untuk memilah bagian simplisia yang kurang baik
sehingga didapatkan hanya bagian dari simplisia yang baik dan dapat
disimpan dalam waktu yang cukup lama.
Setelah didapatkan daun mengkudu yang cukup kering, selanjutnya
adalah proses penghalusan, proses tersebut dilakukan dengan bantuan alat
berupa blender, hal yang harus diperhatikan saat proses penghalusan adalah

27
pengurangan berat sampel akibat serbuk yang terbuang atau tertinggal pada
alat.

Tabel 4.1 Data rendemen simplisia daun Morinda citrifolia L.


Berat daun mengkudu (sortasi basah) 2900 gram
Berat daun mengkudu (sortas kering) 618 gram
Berat serbuk daun mengkudu 600 gram

% Rendemen = 21.65%
4.2 Skrining Fitokimia
Hasil uji skrining fitokimia simplisia dari daun mengkudu (Morinda
citrifolia L.) dapat dilihat pada tabel 4.2, tabel 4.3, dan tabel 4.4.

Tabel 4.2 Hasil Uji Alkaloid


Alkaloid
Tabung Hasil Keterangan
A + Berubah warna menjagi
merah jingga
B -  Dragendorf
menghasilkan 2 fase
 Mayer tidak ada
endapan

Tabel 4.3 Hasil skrining fitokimia dari metode ekstraksi


dengan air panas
Konstituen Hasil Keterangan
Flavonoid + Perubahan warna
pada larutan amil
alcohol
Saponin - Tidak terbentuk busa
Tannin - Tidak terbentuk
endapan
kuinon - Tidak terbentuk
warna merah

Tabel 4.4 Hasil skrining fitokimia dari metode ekstraksi


dengan etil asetat

28
Konstituen Hasil Keterangan
Terpenoid atau + Perubahan warna
steroid hijau
fenolik - Tidak terjadi
perubahan warna
pada pemberian
FeCl3
alkaloid + Perubahan warna
merah kecoklatan
kumarin + Terbentuk
flouresensi warna
hijau

Identifikasi tanaman dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa


tanaman yang diteliti sesuai dengan pustaka atau literature. Identifikasi yang
dilakukan yaitu pengujian kandungan senyawa kimia pada serbuk daun
mengkudu. Penyiapan sampel adalah tahap awal yang telah dilalui dengan
cukup baik, sehingga sampel telah siap untuk melalui proses pengujian
kandungan senyawa.
Alkaloid merupakan suatu golongan senyawa yang tersebar luas hampir
seluruh jenis tumbuhan. Semua alkaloid mengandung paling sedikit 2 atom
nitrogen yang bersifat basa dan membentuk cincin heterosiklik. Pada
pengujian alkaloid, sampel negative terhadap senyawa alkaloid. Hal ini tidak
sesuai dengan literature yang menyatakan bahwa daun mengkudu (Morinda
citrifolia) mengandung senyawa alkaloid (Harbone, 1987).
Tannin merupakan senyawa umum yang terdapat pada tumbuhan,
memiliki gugus fenol dalam strukturnya dan memiliki rasa sepat juga
memiliki kemampuan menyamak kulit karena kemampuannya menyambung
silang protein. Tannin secara kimia dikelompokkan kedalam 2 bagian yaitu
tannin terkondensasi dan tannin terhidrolisis. Pada uji tannin terkondensasi
dilakukan dengan cara daun mengkudu berupa simplisia (serbuk) dengan
pereaksi stiasny dipanaskan diatas air mendidih dan memeberikan hasil
negative, yaitu tidak adanya tannin terkondensasi dalam senyawa mengkudu.
Uji tannin yang umum dilakukan dengan cara filtrate sampel ditambahkan

29
feCl3 1%, memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna hijau
kehitaman.
Saponin adalah glikosida triterpen dan sterol, saponin merupakan
senyawa aktif dan bersifat seperti sabun, dapat dideteksi berdasarkan
kemampuannya membuat busa yang stabil didalam air. Pada pengujian
saponin hasil yang didapat adalah negative, yang dapat diartikan bahwa
senyawa saponin tidak terdapat dalam daun mengkudu. Hal tersebut bertolak
belakang dengan literature yang menyebutkan bahwa daun mengkudu
mengandung senyawa saponin (Harbone, 1987).
Kuinon merupakan senyawa glikosida. Pada pengujian kuinon
dihasilkan daun mengkudu negative senyawa kuinon. Namun berdasarkan
literature daun mengkudu mengandung senyawa antrakuinon yang merupakan
senyawa glikosida turunan kuinon (Sirait, 2007).
Steroid merupakan senyawa metabolit sekunder dengan berbagai fungsi
biologis yang penting dan tersebar luas dalam jaringan tumbuhan.
Berdasarkan literature, daun mengkudu mengandung steroid dan alkaloid hal
tersebut dibuktikan dengan dihasilkannya warna biru yang terbentuk oleh
proses penguapan filtrate yang ditambahkan beberapa tetes pereaksi
Liebermann-bouchardat.
Fenolik dalam pengujiannya memiliki ciri khas yaitu dapat
memebentuk senyawa kompleks berwarna biru atau ungu kebiruan apabila
direaksikan dengan FeCl3. Pada hasil uji sampel daun mengkudu menunjukan
hasil negative terhadap senyawa fenolik, hal tersebut berbeda dengan
literature yang menyebutkan bahwa daun mengkudu positif terhadap senyawa
fenolik (Rahman et al, 2007).
Kumarin pada uji sampel yang telah dilakukan menghasilkan daun
mengkudu positif terhadap senyawa kumarin, dilakukan identifikasi
menggunakan sinar uv pada panjang gelombang 365 nm. Hasil tersebut
menunjukkan kesesuaian dengan literature bahwa senyawa kumarin
terkandung dalam daun mengkudu golongan skopoletin yang memiliki
aktivitas sebagai imunomodulator (Yuri et al, 2016).

4.3 Ekstraksi
Dalam mengekstrak daun mengkudu (Morinda citrifolia L.), kelompok
kami menggunakan metode perkolasi. Perkolasi bertujuan supaya zat

30
berhasiat tertarik seluruhnya. Perkolasi banyak digunakan untuk ekstraksi
metabolit sekunder dari bahan alam, terutama untuk senyawa yang tidak
tahan panas (termolabil). Kelebihan dari perkolasi adalah simplisia dialiri
pelarut secara berulang, tidak terjadi kejenuhan, pengaliran meningkatkan
difusi (dengan dialiri cairan penyari sehingga zat terdorong untuk keluar dari
sel). Kelemahannya yaitu diperlukan banyak pelarut, waktunya lama dan
pelarut akan kesulitan menjangkau semua area, simplisia tidak homogen
(Mukhriani, 2014). Digunakan botol kaca yang diletakan terbalik dengan
bagian bawahnya dipotong untuk memasukan simplisia, leher botolnya diberi
kapas, dan bagian tutup botolnya dilubangi sedikit untuk jalan keluar pelarut
yang sudah melawati simplisia.
Dalam pengerjaannya, serbuk simplisia sebanyak 114.13 gram
dimasukkan ke dalam botol kaca yang sudah dilubangi dan diberi kapas
tersebut. Kemudian dituangkan pelarut methanol dari atas botol, dan
dibiarkan turun hingga tertampung pada gelas beaker. Hasil tampungan
kemudian dituang kembali ke atas botol dan dibiarkan turun hingga
tertampung kembali pada gelas beaker. Proses ini dilakukan berulang hingga
seluruh metabolit sekunder habis tersari, dimana apabila pelarut sudah tidak
lagi berwarna biasanya metabolit sudah tersari. Kemudian, dilakukan
evaporasi hingga menjadi ekstrak kental. Ekstrak kental tersebut ditimbang
untuk menghitung nilai rendemennya. Ekstrak yang didapat sebesar 12.09
gram. Sedangkan nilai rendemennya yaitu 10.59 %. Menurut Armando
(2009), semakin tinggi nilai rendemen yang dihasilkan menandakan nilai
ekstrak yang dihasilkan semakin banyak. Namun, semakin tinggi nilai
rendemen, ekstrak yang dihasilkan memiliki mutu yang rendah dan
sebaliknya, ekstrak yang bermutu tinggi nilai rendemen rendah. Maka dapat
disimpulkan ekstrak yang dihasilkan sedikit namun bermutu tinggi.
Tabel 4.5 Berat Sampel, berat ekstrak, dan nilai rendemennya
Berat Sampel 114,13 gram
Berat Ekstrak 12.09 gram

% Rendemen = x 100%

31
% Rendemen = x 100%
% Rendemen = 10.59 %

4.4 Partisi
Partisi cair-cair merupakan cara pemisahan satu atau lebih senyawa
dengan menggunakan dua pelarut yang tidak bercampur dimana senyawa
tersebut akan terdispersi diantara dua fase sesuai dengan derajat kelarutannya
sehingga terjadi pemisahan. Tujuan dilakukan partisi yaitu untuk memisahkan
komponen kimia dari sampel berdasarkan tingkat kepolarannya.
Pada pengerjaan awal, dilakukan penimbangan terhadap sampel ekstrak
kental daun megkudu (Morinda citrifolia L.) sebanyak 12 gram, kemudian
dilarutkan secukupnya dengan methanol dan dimasukkan ke dalam corong
pisah, lalu ditambahkan kurang lebih 580 ml n-heksana. Fungsi penambahan
n-heksan yaitu sebagai pelarut non-polar, sehingga senyawa yang bersifat non
polar dapat tertarik dengan adanya penambahan n-heksana ini. Setelah itu,
dilakukan pengocokan satu arah hingga homogen dan sesekali membuka
keran corong pisah untuk mengeluarkan gas dari hasil pengocokan.
Pengocokan dilakukan hingga larutan n-heksan menjadi bening, dimana
menandakan bahwa larutan n-heksana sudah jenuh atau tidak adanya lagi
senyawa non polar yang tertarik oleh n-heksan. Setelah pengocokan,
didiamkan selama beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan pelarut,
dimana lapisan atas merupakan lapisan n-heksana dan lapisan bawah adalah
lapisan ekstrak methanol. Hail ini disebabkan karena methanol memiliki masa
jenis yang lebih besar daripada n-heksan. Selanjutnya lapisan n-heksan
ditampung dan diuapkan untuk mendapatkan ekstrak kental, sedangkan untuk
lapisan ekstrak methanol dimasukkan kembali ke corong pisah. Setelah partisi
menggunakan n-heksan, kemudian dilanjutkan dengan etil asetat. Proses yang
dilakukan sama dengan cara kerja partisi n-henksan. Etil asetat merupakan
pelarut semi polar. Apabila tidak terjadi pemisahan antara fase methanol dan
fase etil asetat, maka dapat ditambahkan dengan garam (salting out) atau

32
12.09 g ekstrak kental, dilarutkan
dalam methanol ± 170 ml

larutan NaCl. Salting out adalah peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang
mempunyai kelarutan lebih besar dibandingkan dengan zat utama, dan akan
menyebabkan penurunan kelarutan zat utama atau terbentuknya endapan
karena ada reaksi kimia. Setelah didapatkan ekstrak cair partisi, maka
diuapkan dengan rotary evaporator hingga menjadi ekstrak kental.
Dari 12 gram ekstrak methanol, didapatkan 7.51 gram ekstrak n-heksan
(non polar), 2.08 gram, ekstrak etil asetat (semi polar), dan 3.12 gram ekstrak
methanol (polar). Untuk skema dapat dilihat dibawah ini :

Partisi
n-heksan ± 580 ml

Ekstrak methanol Ekstrak kental


70 ml n-heksana 7.51 gram

Partisi

Etil asetat

Ekstrak Etil Asetat


2.08 gram

4.5 Kromatografi Lapis Tipis


Pada proses isolasi suatu senyawa dari bahan alam, setelah dilakukan
partisi dan didapatkan ekstrak kental kemudian dilakukan pemisahan dengan
menggunakan proses Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada KLT
menggunakan fase diam berupa gel silica yang bersifat polar. Fase diam
digunakan sebagai wadah agar fase gerak dapat membawa komponen sampel
sehingga proses elusi dapat berjalan. Sedangkan fase gerak yang digunakan
yaitu perbandingan antara N-heksan dan Etil Asetat. Ekstrak yang digunakan
didapat dari proses partisi berupa ekstrak kental yaitu ekstrak methanol,
ekstrak Etil Asetat, dan Ekstrak N-heksan.
Identifikasi secara kualitatif pada kromatografi kertas khususnya KLT
dapat ditentukan dengan menghitung nilai Rf. Nilai Rf merupakan ukuran

33
kecepatan migrasi suatu senyawa titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari
titik awal (Ibnu, 2007). Nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa tertentu
pada eluen tertentu.hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi
adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Nilai Rf yang baik berkisar antara
0,2 - 0,8 (Ewing, 1985). Sebelum dilakukan penotolan pada plat KLT, ekstrak
dilarutkan terlebih dahulu dengan pelarut masing-masing dengan maksud jika
ekstrak terlalu kental maka proses elusi menjadi terganggu.
Percobaan 1 menggunakan eluen dengan perbandingan N-heksan dan
Etil Asetat 4:1. Berdasarkan rasio tersebut, hasil dari plat KLT dari ke-4
sampel menunjukkan sampel campuran, N-heksan, Etil Asetat dan Metanol
dengan nilai Rf 0,3, 0,89, 0,2 dan 0,08. Kemudian dilakukan percobaan ke-2
menggunakan eluen dengan perbandingan N-heksan dan Etil Asetat 3:2
unntuk menguji kembali dari Ekstrak Metanol dan Etil Asetat, hasil yang
didapatkan adalah nilai Rf dari ekstrak Metanol dan ekstrak Etil Asetat
sebesar 0,025 dan 0,7. Tidak munculnya noda pada percobaan ini dapat
disebabkan oleh banyak faktor, hal tersebut dapat diatasi dengan
menambahkan suatu reagen penampak warna seperti reagen Godin A dan
Godin B yang berfungsi sebagai penampak bercak yang tidak terlihat
dibawah sinar UV. Berikut ini merupakan tabel Rf yang dihasilkan :

Tabel 4.6 Tabel Rf dari ekstrak dengan eluen n-heksan : etil asetat 4 : 1

n-heksan : etil asetat (4 : 1)


Ekstrak Rf

Sampel = 0,3

n-heksan = 0,89

Etil Asetat = 0,2

Methanol = 0,08

34
Tabel 4.7 Tabel Rf dari ekstrak dengan eluen n-heksan : etil asetat 3 : 2

n-heksan : etil asetat (3 : 2)


Ekstrak Rf

Etil Asetat = 0,7

Methanol = 0,025

4.6 Pembuatan Kolom


Proses pengemasan silika dibuat dalam cara basah, karena cara basah
lebih efektif dibandingkan dengan cara kering. Mula-mula, silika dilarutkan
dengan N-heksan kemudian diaduk hingga terbentuk bubur silika, kemudian
bubur silika dimasukkan ke dalam tabung sampai ¾ tabung. Pemberian eluent
bertujuan agar silika tidak kering dan cracking. Berat silica bubuk yang
digunakan sebanyak 38.1988 gram, sedangkan untuk pelarut atau eluen
digunakan n-heksan dengan volume ± 80 mL.
Hal yang perlu diperhatikan saat pengisian kolom adalah harus
seragam. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan rongga-
rongga ditengah kolom/cracking. Adanya rongga ditengah dapat
memengaruhi proses pemisahan senyawa yang dielusi oleh kolom tersebut.
Jika hal tersebut terjadi, kolom dapat dibalut dengan kapas yang sudah
dibasahi N-heksan. Maka dari itu, diperlukan untuk mengamati kolom setiap
hari untuk mengawasi kestabilan kolom. Hasil pengamatan kolom dapat
dilihat pada tabel 4.8 :
Tabel 4.8 Hasil evaluasi kolom hari rabu, kamis, dan jumat
Hari Pengamatan
Rabu Silika tidak turun, kolom tidak pecah dan retak
Kamis Silika tidak turun, kolom tidak pecah dan retak
Jumat Silika tidak turun, kolom tidak pecah dan retak

4.7 Kromatografi Kolom


Dalam preparasi sampel untuk kromatografi kolom, dilakukan metode
preabsorbsi. Mula-mula, sampel ekstrak disiapkan sebanyak 2 gram dan
dicampurkan silika gel dengan perbandingan 1:1 (2 gram : 2 gram) sampai

35
berbentuk serbuk. Sampel yang telah disiapkan dituang ke dalam kolom,
kemudian dielusi dengan fase gerak heksana yang kepolarannya dinaikkan
bertingkat.
Fase gerak dimulai dengan pelarut non polar 100% yaitu menggunakan
heksan, fase gerak dilewatkan ke dalam kolom dan ditampung dalam vial,
saat menggunakan heksan 100% warna dari pelarut heksan tersebut masih
sama antara sebelum dituang dan sesudah dituang ke kolom, selain itu kolom
masih bewarna putih, hal tersebut menandakan belum adanya ekstrak yang
terbawa oleh fase gerak yang bersifat 100% non polar.
Kemudian kepolaran dari fase gerak ditingkatkan dengan perbandingan
Heksan:Etil Asetat yaitu 9:1, setelah fase gerak tersebut di lewatkan kedalam
kolom, ekstrak mulai terbawa oleh fase gerak, ditandai dengan mulai
berwarna hijau bagian kolom yang berdekatan dengan sampel dan juga hasil
fase gerak yang ditampung dalam vial tidak bewarna bening lagi. Proses
tersebut dilanjutkan dengan terus menambah tingkat kepolaran fase gerak.fase
gerak dilanjutkan dengan perbandingan Heksan : Etil Asetat 8:2, 7:3, 6:4, 5:5,
4:6, 3:7, 2:8, 1:9, dan yang terakhir 100% Etil asetat. Semua fase gerak yang
dilewatkan dalam kolom di tampung dalam vial dan diberi nomor secara urut
seperti yang tertera pada tabel 4.9.
Tabel 4.9 Jumlah dan nomor vial yang digunakan dengan perbandingan
pelarutnya
Perbandingan pelarut
Pelarut Perbandingan Jumlah vial
N-heksan 100% 2 (vial 1-2)
N-heksan : etil asetat 90 : 10 3 (vial 3-5)
N-heksan : etil asetat 80 : 20 4 (vial 6-10)
N-heksan : etil asetat 70 : 30 7 (vial 11-17)
N-heksan : etil asetat 60 : 40 6 (vial 18-23)
N-heksan : etil asetat 50 : 50 7 (vial 24-30)
N-heksan : etil asetat 40 : 60 8 (vial 31-38)
N-heksan : etil asetat 30 : 70 9 (vial 39-47)
N-heksan : etil asetat 20 : 80 9 (vial 48-56)
N-heksan : etil asetat 10 : 90 9 (vial 57-65)
Etil asetat 100 % 9 (vial 66-74)

4.8 Penggabungan Fraksi Etil Asetat Dari Tanaman Daun Mengkudu


(Morinda citrifolia) Berdasarkan Profil KLT

36
Hasil KLT dari setiap vial ganjil dapat dilihat pada tabel 4.10 berikut.
Tabel 4.10 Hasil KLT dari setiap vial ganjil dan pengelompokkannya
Jarak Noda
Via
Perbandingan Godin A dan Rf Warna
l
B
4:1 1
4:1 Tidak ada noda Tidak ada nilai Rf 3 Bening
4:1 5
4:1 1.6;2.1;2.6;3 0.75;0.65;0.525 7
4:1 1.2;1.7;2.5;3 0.3;0.425;0.625;0.775 9
4:1 1.2;2.6;3.1 0.3;0.625;0.775 11
4:1 1.3;2.8;3.7 0.325;0,7;0,925 13
4:1 2.9;3.7 0,725;0.925 15
4:1 0.3;1.5;2.9;3.7 0,075;0.375;0.725;0.925 17
4:1 0.2;1.5;2.9;3.7 0,075;0.375;0.725;0.926 19
4:1 1.2;1.4;2.9;3.7 0.3;0.375;0.755;0.925 21 Sedikit
4:1 0.3;2.9;3.7 0.075;0.725;0.925 23
4:1 0.1;2.9;3.5 0.025;0,725;0,925 25 hijau
4:1 0.1;2.8;3.5 0.025;0,725;0,926 27
4:1 0.1;3.5 0,025;0,925 29
3:2 1,2 0,3 29
3:2 0.5;1.2; 0.125;0.3 31
3:2 0.5;1.2; 0.125;0.3 33
3:2 0,4;0,8 0.1;0.2 35
3:2 0.3;0.6 0.125;0.7;0.875 37
3:2 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 39
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 41
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 43
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 45 Hijau
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 47
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 49 Samar
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 51
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 53
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 55
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 57
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 59
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 61
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 63 Hijau
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 65
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 67 Pekat
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 69
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 71
4:1 0.5;2.8;3.5 0.125;0.7;0.875 73

37
Dalam praktikum diperoleh isolat dengan nomor ganjil yaitu 1, 3, 5, 7,
9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49,
51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71. Kemudian fraksi isolat tersebut
ditotolkan ke plat KLT. Kemudian diamati dibawah sinar UV 254 nm dan UV
365 nm. Lalu, plat KLT tersebut disemprotkan dengan pereaksi godin A dan
B, serta dihitung nilai Rf-nya. Apabila didapat nilai Rf-nya sama atau pola
nodanya sama kemungkinan senyawa tersebut adalah sama. Oleh karena itu,
dari hasil monitoring tersebut dapat dilakukan penggabungan fraksi sehingga
diperoleh sebanyak 9 kelompok fraksi. Penggabungan terdiri dari kelompok A
vial 1-5, kelompok B vial 6-9, kelompok C vial 11-13, kelompok D vial 15-
19, kelompok E vial 21-27, kelompok H vial 28-37, kelompok I vial 38-52,
kelompok F vial 53-73, dan kelompok G vial 35-37.

4.9 Pembuatan Plat KLT Preparatif dan Uji KLT terhadap Subfraksi
Dilakukan pembuatan plat KLT untuk praktikum KLT Preparatif. Mula-
mula ditimbang silica gel GF254 sebagai fase diam sebanyak 30 gram. Silica
gel GF254 digunakan karena jenis tersebut mampu berflourosensi dibawah
lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan terdapat gipsum sebagai
bahan pengikat. Kemudian Silica Gel GF254 dijadikan dalam bentuk bubur
dengan cara dilarutkan dan diaduk dengan air sebanyak 80 mL. Pengadukan
harus berjalan cepat agar silica gel GF254 tidak cepat mengeras. Setelah
menjadi bubur, Silica Gel GF254 dituang dan diratakan ke plat kaca berukuran
10x10 cm. Plat kaca tersebut kemudian dikeringkan dengan cara dibiarkan
pada suhu ruang. Selain itu juga diamati setiap harinya hingga praktikum
selanjutnya. Pengamatan plat KLT yang telah dibuat tidak menunjukkan
keretakan dan kotoran sehingga bisa dipakai di praktikum berikutnya.
Selain pembuatan plat KLT preparatif, dilakukan pula uji KLT pada
subfraksi ekstrak daun mengkudu (Morinda citrifolia L.). Uji ini dilakukan
untuk menentukan subfraksi mana yang akan digunakan dalam KLT
preparatif. Dalam uji ini ditotolkan sebanyak 11 totolan subfraksi, yaitu
totolan A, B, C, D, E1, E2, F, G, H, I1, I2. Eluen yang digunakan yaitu n-
heksan-etil asetat dengan perbandingan n-heksan : etil asetat 4 : 1 dan 3 : 2.
Hasil Rf-nya dapat dilihat di tabel 4.11 dan 4.12 sebagai berikut :

38
Tabel 4.11 Nilai Rf plat KLT dengan perbandingan heksan : etil asetat
4:1
Noda Rf
A 1. 0.74
2. 0.875
B 0.875
C 0.875
D 0.875
E1 1. 0.75
2. 0.875
E2 1. 0.75
2. 0.875
3. 0.125
F 1. 0.875
2. 0.125
G 0.75
H 0.75
I1 0.75
I2 0.75

Tabel 4.12 Nilai Rf plat KLT dengan perbandingan heksan : etil asetat
3:2
Noda Rf
A 0.83
B 0.90
C 1. 0.90
2. 0.81
3. 0.71
4. 0.62
D 1. 0.86
2. 0.48
E1 1. 0.86
2. 0.48
E2 1. 0.86
2. 0.48
3. 0.40
4. 0.26
F 1. 0.83
2. 0.45
3. 0.36
4. 0.29
5. 0.21
G 1. 0.83

39
2. 0.33
3. 0.24
4. 0.19
5. 0.12
6. 0.05
H 0.83
I1 0.83
I2 0.83

Menurut Mulja (1995), noda kromatogram tiap-tiap komponen yang


terpisah setelah visualisasi tampak sebagai noda yang bulat apabila terjadi
proses pemisahan dengan baik. Pengekoran noda kromatogram terjadi apabila
proses pemisahan yang terjadi tidak sempurna yang digambarkan dengan noda
yang tidak bulat (berekor). Ketidaktepatan pemilihan fase mobil terhadap jenis
fase mobil dan macam sampel yang dianalisis merupakan penyebab
pengekoran kromatogram. Maka dari itu, dipilihlah subfraksi E2 dengan eluen
heksan-etil 4 : 1 karena noda E2 memiliki bentuk noda yang lebih bulat
daripada noda subfraksi lain yang cenderung tailing atau berekor. Hal ini
menandakan bahwa subfraksi E2 dapat terpisah dengan baik pada eluen
heksan-etil 4 : 1.

4.10 Isolasi Senyawa dengan KLT Preparatif


Dilakukan pemisahan dengan menggunakan KLT Preparatif dengan plat
yang sudah dibuat sebelumnya yaitu yang menggunakan silika GF254 (polar).
Plat tersebut diaktivasi terlebih dahulu dengan di oven selama 30 menit pada
suhu 110ᵒC. Perlakuan yang dilakukan sama dengan perlakuan pada KLT
analitik dimana diberi batas atas dan bawah (1cm) dan penotolan sampel
dilakukan secara tebal serta berdekatan atau bertumpuk menyerupai garis
lurus. Eluen yang digunakan yaitu n-heksan-etil asetat dengan perbandingan
4 : 1. Sehingga, hasil yang diperoleh berupa pisahan pita yang akan terlihat
dibawah sinar UV 254 nm dan 365 nm.
Pada sampel yang diuji hanya terlihat satu pita saja. Setelah di beri
tanda menggunakan pensil, pita tersebut dikerok dengan menggunakan spatel.
Untuk selanjutnya dilakukan ekstraksi pada silika yang mengandung senyawa
tertentu tersebut. Ekstraksi dilakukan dengan melarutkan ekstrak dengan
pelarut yang sesuai yaitu etil asetat 100%. Alasan yang digunakan etil asetat

40
dikarenakan agar seluruh senyawa yang menyerap pada silika gel akan terlarut
pada etil asetat. Untuk memisahkan silika dan etil asetat dilakukan
pengkoloman menggunakan pipet tetes yang disumbat dengan kapas.
Ekstrak yang diperoleh selanjutnya di elusi dengan KLT analitik dengan
tujuan untuk membuktikan bahwa adanya satu senyawa tertentu. Hal tersebut
dapat dilihat dari nilai Rf yang di peroleh. Nilai Rf merupakan nilai yang
menyatakan kekhasan suatu senyawa .
Pada pengujian diperoleh 2 nilai yaitu 0.875 dan 0.7. Nilai RF tersebut
dapat diartikan bahwa kemungkinan terdapat 2 senyawa yang diperoleh karena
nilai RF merupakan nilai yang spesifik untuk suatu senyawa. Untuk
mengetahui senyawa apakah yang memiliki nilai RF tersebut perlu dilakukan
pemeriksaan pendukung seperti melakukan skrining fitokimia.
Tabel 4.13 Nilai Rf KLT analitik dari isolat KLT preparatif
Noda Rf
Noda 1 = 0,875

Noda 2 = 0,7

4.11 Rekristalisasi
Sampel-sampel pada vial yang dihasilkan dari kolom kromatografi
dilakukan percobaan dengan pelarutan dengan heksan dan metanol, sehingga
didapatkan 1 sampel vial yang mengindikasikan bahwa terdapat kristal.
Kemudian sampel tersebut dipilih untuk di rekristalisasi yaitu sampel pada vial
yang setelah ditambahkan heksan dan metanol sampai jenuh terbentuk serbuk-
serbuk kecil. Setelah itu vial di panaskan dengan waterbath sehingga terdapat
sedikit kristal-kristal kecil. Setelah itu larutan yang terdapat kristal tersebut di
dalam vial di ujikan dengan menggunakan KLT analitik untuk mengetahui
adanya senyawa murni atau senyawa campuran dalam sampel tersebut. Dari
hasil KLT tersebut didapatkan 2 noda yang mengindikasikan bahwa senyawa

41
tersebut belum murni, kemudian didapatkan Rf 0.085 yang merupakan Rf
senyawa steroid, sehingga dalam percobaan rekristalisasi yang didapatkan
bukan kristal dari senyawa utamanya, melainkan kristal dari senyawa steroid
yang belum murni.

Tabel 4.14 Nilai Rf dari KLT analitik


Noda Rf
pada Kristal yang terbentuk
1 = 0,085

2 = 0,12

42
BAB 5
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
1. Tanaman alam atau bahan obat sebelum menjadi simplisia harus melalui
rangkaian proses seperti sortasi basah untuk menghindari adanya sampel
bahan alam yang kurang baik, dilanjutkan dengan sortasi kering yang
dilakukan dengan pencucian , perajangan dan proses pengeringan yang
dilakukan tanpa pemanasan menggunakan alat namun dilakuakn dengan
mengangin-anginkan sampel. Simplisia yang baik adalah simplisia yang
bersih dan bebas dari pengganggu hama, jamur dan kapang.
2. Berdasarkan skrining fitokimia simplisia Morinda Citrifollia L
menunjukan hasil positif terhadap senyawa alkaloid, falvoniod dan
kumarin.
3. Ekstraksi Morinda Citrifollia L dengan metode perkolasi memiliki nilai
rendemen sebesar 10,59%. Metode yang mampu menghasilkan jumlah
ekstrak terbesar yaitu metode sokletasi dan yang memiliki kualitas tinggi
yaitu metode microwave. Selanjutnya proses partisi ekstrak daun
mengkudu (Morinda citrifollia) dengan pelarut methanol (polar), etil
asetat (semi polar), dan n-heksana (non polar). Dari 12 gram ekstrak
methanol didapatkan 7.51 gram ekstrak n-heksan, 2.08 gram ekstrak etil
asetat, dan 3.12 gram ekstrak methanol.
4. Ekstrak dielusi pada plat KLT dengan perbandingan eluent N-heksan dan
Etil Asetat 4:1, didapatkan nilai Rf dari ekstrak sampel , ekstrak N-
heksan, Ekstrak Etil Asetat, dan ekstrak Metanol sebesar 0.3, 0.89, 0.2,
0.08. Ekstrak juga dielusi Pada kromatograi kolom, fase diam yang
digunakan yaitu bubur silika (silika gel, sedangkan fase gerak yang
digunakan yaitu n-heksan 100 %, campuran n-heksan dan etil asetat
dengan perbandingan 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 dan etil
asetat 100%. Preparasi sampel yang digunakan yaitu metode preabsorbsi,
dimana ekstrak etil asetat dicampurkan dengan fase gerak silika sampai
ekstrak menjadi kering seperti serbuk.

43
5. Nilai RF digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa
dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar mempunyai
kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.
6. Hasil monitoring isolat dengan nomor ganjil yaitu 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53,
55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 dapat dilakukan penggabungan fraksi
sehingga diperoleh sebanyak 9 kelompok fraksi. Penggabungan terdiri
dari kelompok A vial 1-5, kelompok B vial 6-9, kelompok C vial 11-13,
kelompok D vial 15-19, kelompok E vial 21-27, kelompok H vial 28-37,
kelompok I vial 38-52, kelompok F vial 53-73, dan kelompok G vial 35-
37.
7. Silika gel GF254 digunakan karena silika gel jenis ini mampu
berfluoresensi dibawah lampu UV dengan Panjang gelombang 254 nm
dan terdapat gypsum sebagai bahan pengawet. Eluen yang digunakan
yaitu N-heksan:etil asetat dengan perbandingan 4:1 dan 3:2
8. Pada pengujian KLT preparatif pada fraksi etil asetat didapatkan satu
noda atau pita dari hasil penotolan dari KLT analitik dengan konsentrasi
fase gerak yang digunakan yaitu 4:1 (heksan: etil asetat). Selanjutnya
dilakukan ekstraksi pada hasil pengikisan silika yang mengandung
senyawa tertentu tersebut. Ekstraksi dilakukan dengan melarutkan
ekstrak dengan pelarut yang sesuai yaitu etil asetat 100%. Alasan yang
digunakan etil asetat dikarenakan agar seluruh senyawa yang menyerap
pada silika gel akan terlarut pada etil asetat.
9. Ekstrak yang diperoleh selanjutnya di elusi dengan KLT analitik dengan
tujuan untuk membuktikan bahwa adanya satu senyawa tertentu yang
diinginkan.Pada pengujian diperoleh 2 nilai Rf yaitu 0.875 dan 0.7. Nilai
RF tersebut dapat diartikan bahwa kemungkinan terdapat 2 senyawa yang
diperoleh
10. Untuk memunculkan kristal, sampel dilarutkan dengan pelarut heksan
dan methanol. Didapatkan 1 sampel vial yang diindikasikan terdapat
kristal. Pada sampel, didapatkan 2 noda pada pengujian KLT yang
mengindikasikan bahwa senyawa tersebut belum murni, dimana
didapatkan Rf 0.085 yang merupakan Rf senyawa steroid. Hasil dari
percobaan rekristalisasi yang didapat, merupakan bukan kristal dari

44
senyawa utamanya, melainkan kristal dari senyawa steroid yang belum
murni.

5.2. Saran
Perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa metabolit
sekunder tanaman ini dengan fraksi yang lain, karena beberapa fraksi yang
potensial masih berpeluang untuk ditemukan senyawa-senyawa lain. Kemudian
penelitian perlu dilengkapi dengan data instrumentasi yaitu meliputi HPLC, FTIR,
LCMS.

DAFTAR PUSTAKA

45
Ditjen pom. 2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi Kesatu. Jakarta :
DEPARTEMEN KESEHATAN RI
DEPKES. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta :
DEPARTEMEN KESEHATAN RI.
Gunawan, D. 2018. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid 1. Jakarta : Penebar
Swadaya
Kiki, dkk. 2004. Farmakognosi Jilid 1. Jakarta : DEPARTEMEN KESEHATAN
RI.
Sirait, dkk. 1985. Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta : DEPARTEMEN
KESEHATAN RI.
Rachman, abdul,. dkk. 2007. Aktivitas antioksidan kandungan fenolik total daun
mengkudu (Morinda citrifolia). Angritech Vol 27 No 4. Bandung : ITB
Press
`Iskandar, susilawati. 2012. Panduan praktikum fitokimia. Bandung : Fakultas
Farmasi Universitas Pdjajaran
Syamsu hidayat,S.S dan Hutapea, J.R., 1991, Inventaris Tanaman obat Indonesia
ed II. Dapartemen Kesehatan RI. Jakarta.
Mukhriani. Ekstraksi, pemisahan senyawa dan identifikasi senyawa aktif. Jurnal
kesehatan.2014. Vol 2 : 361 – 367
Ditjen POM. 1986. Sediaan Galenik. Jakarta :Depkes RI.
Armando,R. 2009. Memproduksi 15 minyak atsiri berkualitas. Jakarta : penerbit
penebar swadaya.
Mardina,P. Pengaruh kecepatan putar pengaduk dan waktu operasi pada ekstraksi
tannin dan mahkota dewa, Jurnal kimia. 2011:5(2) : 125 – 132 .
Sarker, dkk. 2006. Natural Products Isolation 2nd Edition. New Jersey : Humana
Press Inc.
Iskandar. 2007. Pengantar Kromatografi : edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB.
Lenny. 2006. Analisis Kromatografi dan Mikroskop. Bandung: ITB.
Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi, 2007. Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.
Christian, Gary D. 1994. Analytical Chemistry. Fifth Edition. University of
Washington. John Wiley & Sons, USA.

46
Braithwaite, A and Smith, F. J. 1995.Chromatographic Methods. Kluwer
Academic Publishers, London
Cannell, R.J.P. 1998. Natural Produk Isolation. Humana Press, Totowa.
Palleros, D. R. 2000. Experimental Organic Chemistry.John Willey and Sons.
New York

LAMPIRAN

47
Proses ekstraksi dengan metode perkolasi Proses evaporasi

KLT analitik ekstrak dengan eluen n- KLT analitik ekstrak dengan eluen n-
heksan : etil asetat 4 : 1 heksan : etil asetat 3 : 2

Partisi cair-cair Pembuatan kolom

48
Pemisahan menggunakan kolom Pemisahan menggunakan kolom
Kromatografi Kromatografi

Plat KLT sub fraksi dengan perbandingan Plat KLT sub fraksi dengan
heksan : etil asetat 4 : 1 perbandingan heksan : etil asetat 3 : 2

Pembuatan KLT preparatif


Pemisahan menggunakan KLT
preparatif

49