CÓDIGO: SGC.DI.

505
GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, VERSIÓN: 2.0
FECHA ULTIMA REVISIÓN:
TALLER O CAMPO 12/04/2017

Ciencias de la Vida Y la
DEPARTAMENTO: CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
Agricultura
PERIODO
ASIGNATURA: Enzimología 201811 NIVEL: 5to
LECTIVO:
PRÁCTICA
DOCENTE: Dr. Rodrigo Avalos NRC: 1
N°:
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ
Laboratorio N°2 de Docencia.
LA PRÁCTICA:
TEMA DE LA Evaluación de la actividad enzimática de la fitasa obtenida y purificada de Aspergillius
PRÁCTICA: Niger, cultivado en sustrato de Glycine max (soya).
INTRODUCCIÓN:

Las fitasas son enzimas que se pueden encontrar en plantas, bacterias, hongos, levaduras y animales. Sin embargo, la
actividad de la fitasa en microorganismos se ha encontrado con mayor frecuencia en los hongos, en particular, en las
especies de Aspergillus (Meyland, 2016).
Aspergillus Níger (A. niger) crece aeróbicamente en materia orgánica y tolera un amplio rango de temperatura y pH,
es un hongo filamentoso que comúnmente se presenta en el medio ambiente y generalmente se considera no patógeno.
Produce diversos compuestos de gran interés para las industrias farmacéuticas y es el principal productor de ácido
cítrico a nivel industrial por cultivo líquido (Ocampo, 2016).
(Meyland, 2016)A pesar de que la suplementación con fitasas mejora la calidad nutricional al tiempo que disminuye el
desperdicio de fósforo, el alto costo de las preparaciones enzimáticas de las fitasas causa que no sea la mejor
alternativa, por lo que se necesitan alternativas económicas. Las fitasas son un aditivo importante en alimentos
elaborados a base de cereales y legumbres. La mayoría de los estudios sobre la producción de fitasa se han llevado a
cabo con fermentación de sustrato sólido (SSF), en este caso el sustrato es Glycine max (soya).

OBJETIVOS:
 Establecer la efectividad de la soya ( Glycine max) como sustrato para la fermentación de Aspergillius Niger.
 Determinar la actividad enzimática de la inoculación del hongo y de la fitasa obtenida.
 Generar un extracto semipurificado de fitasas a partir de Aspergillius Niger.
MATERIALES:
REACTIVOS: INSUMOS:
 Caldo nutriente  Micropipetas
 PDA  Cajas Petri
 Tween 80%  Vasos de precipitación
 Ácido Láctico  Balón de 25mL
 Agua destilada  Pinzas
 Agua  Bisturí
 Erlenmeyer 500mL
 Parafilm

EQUIPOS:
 Balanza analítica
 Plancha de calentamiento
 Autoclave
 Agitador
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MUESTRA:
 Soya Molida
 Cepa de Aspergillus Niger
INSTRUCCIONES:

1. Utilice ropa de protección: vestimenta apropiada, mandil, guantes, gafas de seguridad, cabello recogido.
2. Mantenga su área de trabajo limpia para evitar contaminación.
3. Verificar la disponibilidad de insumos, reactivos, muestras y equipos para utilizar en la práctica.

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

1. Preparación del medio solido PDA
 Preparar 1L de PDA
 Autoclavar
 Dispensar en cajas Petri
 Agregar ácido láctico para evitar la contaminación
2. Inoculación del medio PDA con Aspergillus Niger
 Limpiar el área de trabajo con sablón.
 Encender mecheros en el área que se va a realizar la inoculación
 Tener listo el bisturí, las pinzas, el medio de PDA preparado en el paso 1 y la cepa de Aspergillus
Niger
 Cerca de los mecheros tomar con bisturí de la cepa de Aspergillus Niger un fragmento y colocarlo con
las pinzas en el PDA.
 Sellar las cajas Petri con parafilm
 Incubar a 37°C
3. Elaboración de Tween 80 al 0.1%.
 Tomar 25ul de Tween
 Homogeneizar la solución con 10mL de agua destilada y aforarlo a 25mL
4. Preparación del caldo nutriente.
 Pesar 8 g de caldo nutritivo, aforar a 250ml.
 En una plancha de calentamiento con ayuda de perlas de agitación disolver
 Tapar la solución y auto clavarla
5. Inoculación del caldo nutriente.
 Limpiar el área de trabajo
 Prender 3 mecheros alrededor del área en la que se va a inocular
 Destapar el recipiente con el caldo nutriente, flamear la boquilla
 Agregar 1ml de Tween en el caldo y mezclar
 Destapar la caja Petri con cuidado y con un bisturi previamente esterilizado recortar un pequeño
cuadrado de 1cm x 1cm y ubicarlo en el caldo nutriente con ayuda de una pinza previamente flameada
 Flamee nuevamente la boquilla y tápela
 Ponerla en agitación durante 24h
6. Preparación de sustrato
 Pesar 20 g de semilla de soya molida.
 Colocar la soya dentro de 16 recipientes de vidrio de 113 g.
 Auto clavar los recipientes con el sustrato.
7. Inoculación de sustrato
 Limpiar el área de trabajo
 Prender 3 mecheros alrededor del área en la que se va a inocular
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 Añadir 5ml de caldo nutriente a todos los recipientes que contienen la soya.
 Guardar 8 recipientes en un contenedor de cartón sometido a una fuente de calor y los 8 restantes en un
contenedor con ausencia de calor.

RECOMENDACIONES:
 Cuide que el material que va a utilizar esté completamente limpio.
 Cuide las cantidades de reactivos usados
 Tenga cuida al trabajar con el material caliente utilice guantes o franelas.
 Sellar adecuadamente los envases con caldo nutriente
 Agregar el ácido láctico después de autoclavar el caldo nutriente.
 Inocular con materiales totalmente estériles
 Incubar Aspergillus Niger en cámara húmeda y a 37°C
 Trabajar con guantes y mascarilla para evitar contaminación
FIRMAS

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Nombre: Nombre: Patricia Jiménez Ph. D.

Nombre: Dr. Rodrigo Ávalos. COORDINADOR ÁREA COORDINADOR DE
DOCENTE CONOCIMIENTO LABORATORIOS

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

Meyland, D. (2016). Phytase from aspergillus niger expressed in a. niger. 2-5.

Ocampo. (2016). Un análisis del metabolismo de Aspergillus niger en un sustrato sólido.