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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS E TECNOLÓGIAS – DCT


CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE JEQUIÉ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

THATIANA CARNEIRO DOS SANTOS

PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DA


POLIGALACTURONASE DE ASPERGILLUS NIGER ATCC 1004
OBTIDA DO RESÍDUO DA LARANJA PERA (CITRUS SINENSIS L.
OSBECK)

JEQUIÉ – BA
SETEMBRO DE 2018

1
THATIANA CARNEIRO DOS SANTOS

PRODUÇÃO CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DA


POLIGALACTURONASE DE ASPERGILLUS NÍGER ATCC 1004
OBTIDA DO RESÍDUO DA LARANJA PERA (CITRUS SINENSIS L.
OSBECK)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-


Graduação em Química da Universidade
Estadual do Sudoeste da Bahia, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre (a)
em Química.

Área de concentração: Química Analítica

Orientador: Prof.Dr. Baraquizio B. do Nascimento Junior

Co-orientador: Prof. Dr. Gildomar Valasques Junior

JEQUIÉ – BA
SETEMBRO DE 2018

2
Ao meu Deus por seu infinito amor e benevolência.
Ao meu Pai Edson e minha Mãe Rita de Cacia.
A minha família por todo amor e apoio.
Ao meu filho Diogo Carneiro, por toda compreensão
e carinho. DEDICO

3
O Senhor é a minha força e o meu escudo;
nele o meu coração confia, e dele recebo
ajuda. Meu coração exalta de alegria, e
com o meu cântico lhe darei graças.

Salmos 28:7

4
AGRADECIMENTOS

A Deus, por proporcionar-me esta oportunidade, por me sustentar nos momentos de


fraqueza, por todo Seu amor e benevolência.
A toda minha família, minha mãe, irmã Vanessa, minha sobrinha Maria Rita e em especial
meu filho Diogo por toda compreensão, mesmo quando estive longe, sempre me
compreenderam e foram meu combustível para que nunca desistisse de minha caminhada e
dos meus sonhos.
Aos amigos que fiz neste percurso, tanto no mestrado como no laboratório, em especial
Dhiessica, Jabson, Remam, Juliana, Tatielle, Luiz Fernando, a todos meu muito obrigada, que
Deus possa iluminar os passos de cada um.
Não podendo esquecer também de Marineide Santana, Dona Eulália e ao Beco apertado,
por me acolherem no período em que estive em Jequié.
Gostaria de agradecer também ao meu amigo, anjo, faz tudo, ou seja, lá qual for a
denominação .... a você, meu amigo Romário, meus sinceros agradecimentos, pois sempre
foi atencioso, prestativo e presente. Sempre que te incomodei, para que me ajudasse ou
tirasse duvidas, estava ali, pronto para ajudar. Que Deus ilumine sua caminhada, pois você
tem luz própria e Deus sempre será contigo! Agradeço a Deus por colocar em meu caminho
pessoas como você.
Claro que não poderia esquecer de três pessoinhas maravilhosas, pois quando reunidos,
tornamos o “Quarteto Fantástico”. Obrigada a Maria da Luz, Amanda e Daniel por fazerem
parte de minha vida, o que o mestrado uniu, só Deus separa, mesmos distantes, é uma
distância sadia que sempre terá, aquela “destilação” para acalentar nossas conversas no zap
zap.
A meu orientador Prof. Baraquizio por toda ajuda, confiança e compreensão. A todos os
professores que sempre me apoiaram em especial Kátia Iro, Nívio, Gildomar. Obrigada por
orientar-me, contribuindo para meu desenvolvimento acadêmico.

A UESB, e ao Programa de Pós-graduação em Química.


A CAPES pela ajuda financeira.
Aos membros da banca.
Enfim, a agradeço a todos que tornaram este projeto possível;
5
Meus sinceros agradecimentos.

6
RESUMO

A aplicação de enzimas pectinolíticas produzidas por fungos filamentosos, têm se


ampliado cada vez mais em vários processos industriais tais como têxtil,
processamento de fibras vegetais, extração de óleo, tratamento de águas residuais
industriais, etc. Partindo deste pressuposto, este trabalho de pesquisa teve como
principal objetivo a produção, caracterização e aplicação de poligalacturonase (PG)
produzida por Aspergillus niger ATCC 1004, por fermentação em fase submersa,
utilizando o resíduo da Laranja como meio para crescimento do microrganismo. Para
determinar as condições ótimas de produção da PG o delineamento experimental
utilizado foi o Doehlert, com aplicação da metodologia de superfície de resposta
(MSR). A atividade da PG nas condições ótimas de 30 ° C, 96h e concentração de
indutor de 0.6 mg, foi de 8.77 UA. A PG se mostrou termoestável até 70°C por um
tempo de 30 min. A PG apresentou atividade e estabilidade máxima em pH 4.0. O íon
de Ca2+ teve um efeito estimulador sobre a atividade da PG em comparação aos
outros íons metálicos estudados. A determinação dos parâmetros cinéticos foram, Km
de 0.088398 mg/ml e Vmax 55.248 μmol/ml/min.. Após a purificação a massa
molecular da PG foi de aproximadamente 45 kDa. A PG produzida foi aplicada para
reduzir a viscosidade da polpa de umbu, alcançando uma redução aproximada de
28,17% em relação a viscosidade controle.

Palavras-chave: Poligalacturonase, Redução da Viscosidade, Resíduo da Casca de


Laranja.

7
ABSTRACT

The application of pectinolytic enzymes produced by filamentous fungi has been increasingly
extended in several industrial processes such as textiles, vegetable fiber processing, oil
extraction, industrial waste water treatment, etc. Based on this assumption, the main
objective of this research was the production, characterization and application of
polygalacturonase (PG) produced by Aspergillus niger ATCC 1004, by submerged phase
fermentation, using the Orange residue as medium for growth of the microorganism. To
determine the optimal conditions of PG production, the experimental design used was
Doehlert, with application of surface response methodology (MSR). The PG activity in the
optimum conditions of 30 ° C, 96h and inducer concentration of 0.6 mg was 8.77 AU. PG was
thermostable to 70 ° C for a time of 30 min. PG showed activity and maximum stability at pH
4.0. The Ca 2+ ion had a stimulatory effect on the PG activity in comparison to the other metal
ions studied. The kinetic parameters were determined to be Km of 0.088398 mg / ml and Vmax
55,248 μmol / ml / min. After purification the molecular weight of the PG was approximately
45 kDa. The PG produced was applied to reduce the viscosity of the umbu pulp, achieving an
approximate reduction of 28.17% relative to the control viscosity

Key words: Polygalacturonase, Viscosity Reduction, Orange Peel Residue.

8
SUMÁRIO

1 - Introdução........................................................................................................ 14

2 – Objetivos......................................................................................................... 17

2.1 – Objetivo Geral ............................................................................................. 17

3 - Revisão Bibliográfica....................................................................................... 18

3.1 - Resíduos Agroindustriais ............................................................................. 18

3.2 - Cultura da Laranja Pera (Citrus Sinensis L. Osbeck) ................................. 19


3.3 - Enzimas.............................................................................................. 20
3.4 – Pectina ......................................................................................................... 21

3.5 – Pectinase ...................................................................................................... 23

3.6 – Poligalacturonases ........................................................................................ 24

3.7 - Fermentação em Fase Submersa .................................................................. 26

3.8 - Aspergillus niger ............................................................................................. 28

Referências Bibliográficas ..................................................................................... 30

4 - Produção e Caracterização da Poligalacturonase Termoestável de Aspergillus


niger ATCC 1004 Obtida do Resíduo da Laranja Pera (Citrus Sinensis L. Osbeck) 35

Resumo.................................................................................................................... 35

4.1- Introdução ........................................................................................................ 36

4.2 - Materiais e Métodos ...................................................................................... 37

4.2.1 - Microrganismo ........................................................................................... 37


4.2.2 - Preparo do resíduo ........................................................................ 37
4.2.3 - Inoculo do Aspergillus niger e Fermentação .............................................. 38

4.2.4 - Obtenção do Extrato Enzimático Bruto ........................................................ 39

4.2.5 Planejamento experimental Doehlert para Otimização da produção de


Poligalacturonase..................................................................................................... 39

9
4.2.6 - Determinação de Poligalacturonase .......................................................... 40

4.2.7- Determinação da proteína total .................................................................... 41


4.2.8 - Caracterização Enzimática................................................................ 41
4.2.8.1 - Determinação do pH e Temperatura Ótimos da Poligalacturonase......... 41

4.2.8.2 – Termoestabilidade ................................................................................... 42

4.2.8.3 - Efeito de Cátions Sobre a Atividade da Poligalacturonase ....................... 43

4.2.8.4 - Determinação dos Parâmetros Cinéticos................................................... 43

4.2.9 – Purificação .................................................................................................. 43

4.2.10 - Eletroforese............................................................................................... 44

4.2.10.1 - Preparo de Gel de Fixação...................................................................... 44

4.3 - Resultados e Discussão....................................................................... 45

4.3.1 - Caracterização físico-química do resíduo da casca de laranja.................... 45


4.3.2- Avaliação do Planejamento Experimental Doehlert para Otimização da
Produção de PG ................................................................................................... 46
4 . 3 . 3 - Caracterização Enzimatica....................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.3.3.1- pH x Temperatura................. ..................................... 50

4.3.3.2 - Influência de Sais ...................................................................................... 53

4.3.3.3 – Termoestabilidade da PG......................................................................... 54

4.3.3.4 - Parâmetros cinéticos (Km – Vmax) .......................................................... 55

4.4 - Determinação da Atividade Especifica da Poligalacturonase.......................... 57


4.5 - Eletroforese ..................................................................................................... 57
4.6 - Conclusão ....................................................................................................... 58
60
Referências Bibliográficas........................................................................................

5 - Aplicação de Poligalacturonase de Aspergillus Niger ATCC 1004 obtida do


Resíduo da Laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck) na Polpa de umbu (Spondias
tuberosa Arruda Câm) ...................................................................... 64

64
Resumo...................................................................................................................

10
5.1- Introduçâo...................................................................................................... 65

5.2 - Materiais e Métodos....................................................................................... 67

5.2.1 – Enzimas..................................................................................................... 67

5.2.2 - Suco De Umbu (Spondias Tuberosa Arruda Câm) ...................................... 67

5.2.3 - Planejamento Experimental e Otimização............................................... 67

5.2.4 - Purificação (Fracionamento Com Sulfato De Amônio Do Extrato


Enzimático) .............................................................................................................. 68

5.2.5 - Determinação Da Viscosidade...................................................................... 68

5.3 - Resultados e Discussão................................................................................ 69

5.4 - Conclusão........................................................................................................ 76

5.5 - Agradecimentos ................................................................................... 77


Referências Bibliográficas........................................................................................ 78

11
LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Estrutura simplificada da pectina................................................................. 22

Figura 02: Modo de ação das enzimas poligalacturonases; hidrólise das ligações
glicosídicas α-(1→4) dos resíduos de ácidos
25
poligalacturônicos.........................................................................................................

Figura 03: Micro morfologia do Aspergilus Níger Macro morfologia............................ 29

Figura 04: etapas do preparo do Indutor: a) Resíduo de laranja; b) cortes para serem
acondicionados na estufa com circulação de ar, c) Resíduo seco; d) após o processo 38
de moagem....................................................................................................
Figura 05: Processo de fermentativo (Incubação) ...................................................... 39

Figura 06: Meio de cultura para utilização otimização da produção de enzimas......... 41

Figuras 07: Rendimento da atividade enzimática (poligalacturonase) produzido pelo


48
Aspergillus Níger em função concentração de indutor e do tempo................................
Figura 08: Diagrama de Pareto para atividade especifica............................................ 50

Figuras 0 9 : Rendimento da atividade enzimática (poligalacturonase) produzido pelo


52
Aspergilus Níger em função da Temperatura e pH.............................................
Figuras 1 0 : Influência dos sais em concentrações variadas................................... 54

Figuras 1 1 : Termoestabilidade (atividade residual x tempo) ................................... 55

Figuras 1 2 : Gráfico de Km Vmax............................................................................. 56

Figura 13: Eletroforese da poligalacturonase purificada de Aspergillus Níger ATCC


58
1004............................................................................................................................
Figura 14: Etapas do processo de produção de polpa de fruta congelada.................. 67

Figura 15: Viscosímetro............................................................................................... 69

Figura 16: Superfície de resposta enzima Sigma, em função concentração enzimática


e do tempo.................................................................................................
71

Figura 17: Superfície de resposta da poligalacturonase produzida por Aspergillus


74
Níger ATCC 1004, em função concentração enzimática e do tempo...........................
Figura 18: Gráfico de Pareto........................................................................................ 76

LISTA DE QUADROS E TABELAS


12
Quadro 1: Produção laranja nacional ...................................................................... 20

Quadro 2: Comparação entre as fermentações no estado sólido e a submersa.... 27

Tabela 01: Caracterização físico-química da casca de laranja............................... 45

Tabela 02: Matriz de Doehlert com valores reais (entre parênteses) finais
codificados para os fatores: concentração do indutor (X1) e Tempo (h) e a
resposta: atividade do PG (UA, μmol/min) .............................................................. 47

Tabela 03: Análise de variância (ANOVA) para atividade PG.................................. 49

Tabela 04: Matriz Doehlert usada para a otimização do pH e temperatura da PG


de Aspergillus niger ................................................................................................. 51

Tabela 05: Análise de variância (ANOVA) para a atividade de temperatura x pH.. 53

Tabela 06: Resultados obtidos na determinação da atividade, proteína total e


atividade específica da Poligalacturonase nos extratos......................................... 57

Tabela 07: Planejamento experimental para pectinase industrial Sigma................. 70

Tabela 08: Análise de variância (ANOVA) para a atividade pectinase Sigma em


função da concentração x tempo......................................................................... 72

Tabela 09: Planejamento experimental para poligalacturonase produzida em


laboratório............................................................................................................... 73

Tabela 10: Análise de variância (ANOVA) para a atividade poligalacturonase


produzida por Aspergillus Níger ATCC 1004 em função da concentração x
75
tempo......................................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

13
atm – Atmosfera
°C – Graus Celsius
DNS: Ácido 3,5 – dinitrosalicílico
Endo-PGs: Endo- Poligalacturonases
Exo-PGs: Exo-Poligalacturonases
FDA – Fibra em Detergente Ácido
FDN – Fibra em Detergente Neutro
GalA – Ácido Galacturônico
PGs: Poligalacturonases
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
LABRA - Laboratório de Aproveitamento de Resíduos Agroindustriais
MM – Matéria Mineral
MS – Matéria Seca
Rpm – Rotação por minuto
R2 – Coeficiente de Determinação
SDS - (Docecil Sulfato de Sódio)

1 INTRODUÇÃO
14
Os setores agroindustriais e de alimentos produzem grandes quantidades de
resíduos. A observação ao longo dos anos demonstrou que esse material pode
apresentar elevado problema de disposição final, tornando-se, um potencial poluente
para o meio ambiente, além de representar, maiores perdas de biomassa e de
nutrientes de alto valor agregado. Em contrapartida, na atualmente estes detritos
estão cada vez mais sendo reaproveitados, uma vez que estas matérias-primas
apresentam características bioquímicas que podem ser utilizadas como fontes para
biossínteses de produtos úteis (Ahmed, 2016). O Brasil detém o título de maior
produtor e exportador do suco frutas tropicais e durante o processamento destas
frutas, as cascas e sementes correspondem de 65 a 70% da massa, o que faz com
que este tipo de indústria gere toneladas de resíduos de processo (Dias, 2017; Ferrari
e col., 2004).
Dentre estas frutas podem-se destacar os citrinos (laranjas, tangerinas, lima,
toranja e limões) sendo que, essas espécies estão entre as culturas de rendimento
mais importantes nas zonas tropicais e subtropicais. Desta forma, o consumo de
laranjas frescas tem aumentando exponencialmente em muitos países em
desenvolvimento, como México, Índia, Argentina, Brasil e China (Sharma, 2017).
Segundo dados do IBGE, a perspectiva de plantio de laranja no ano de 2017 é de 15
983 273 hectares plantados, produção de 14 653 571 toneladas em 2017 (IBGE,
2017).
Cerca de 40% de toda a produção de laranja mundial são convertidas em suco
concentrado, sendo que os Estados Unidos e o Brasil produzem 90% do suco de
laranja processado, no entanto, apenas 50% do peso bruto da fruta é convertido em
suco; o resto é considerado o subproduto (Okino-Delgado, 2014). O Brasil é o maior
produtor de suco de laranja no mundo, seguido por EUA (Lerma-García, 2016).
O desenvolvimento de processos eficientes, com potencial para agregar valor
aos resíduos agroindustriais, torna-se um dos maiores desafios da biotecnologia.
Atualmente o uso de resíduos como fonte de matérias primas de autovalor agregado,
veem’ sendo utilizado cada vez mais para a produção de produtos como etanol,
proteína monocelular, enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabolitos
secundários biologicamente ativos, etc. (Diaz, 2016).

15
No entanto os resíduos de cítricos na maioria das vezes não possuem valor
econômico, apesar de sua composição ser rica em açúcares solúveis, celulose,
hemicelulóse, pectina e óleos essenciais que poderiam formar a base de vários
processos industriais. Em virtude desses fatores, esses subprodutos industriais
podem ser utilizados como matéria prima para produção de ração animal, Óleos
Essenciais, Pectinas, Bioetanol e produção de Enzimas; desta forma agregando valor
econômico ao mesmo. Uma forma de agregar valor aos resíduos da agroindústria é a
produção de enzimas. Estas são proteínas especializadas que funcionam na
aceleração de reações químicas e utilizadas como catalisadores biológicos
extremamente eficientes (Mamma, 2014).
Enzimas são compostos bioativos que regulam muitas mudanças químicas em
tecidos vivos. As pectinases são um grupo heterogêneo de enzimas relacionadas com
a hidrólise das substâncias de pectina, presentes principalmente em plantas. A
aplicação de enzima pectinolítica varia de acordo com a disponibilidade de condições
físicas. Com o passar do tempo, as pectinases têm sido utilizadas em vários processos
industriais convencionais, tais como têxtil, processamento de fibras vegetais, chá,
café, extração de óleo, tratamento de águas residuais industriais, contendo material
pectinoso, etc. (Sharma, 2012; Mamma, 2014).
O processo desenvolvido no cultivo para a produção de enzimas dá-se a partir
de processos fermentativos, estes podem variar dependendo da espécie de
microrganismo utilizado, do substrato que está sendo fornecido e dos tipos de
enzimas. Várias espécies de fungos filamentosos têm sido utilizadas em processos
industriais para a produção de metabólitos e enzimas, como ácido cítrico e
glucoamilase. As vantagens do uso de fungos filamentosos incluem suas habilidades
naturais para secretar uma variedade de proteínas em grandes quantidades e seu uso
intensivo no bioprocessamento (Li, 2008).
A pectina é responsável pela turbidez e consistência do suco; por esta razão, a
degradação das substâncias específicas requer a adição de enzimas pectinolíticas
apropriadas para aumentar o rendimento da clarificação do suco, reduzir a
viscosidade e diminuir o tempo de filtração (Sassi, 2016). As pectinases
desempenham um papel crucial para reduzir a viscosidade, aumentar o rendimento e
clarificação do suco por liquefação de polpas (Garg, 2016). Sendo produzidas tanto
por microrganismos procarióticos, que sintetizam principalmente pectinases alcalinas,

16
como por microrganismos eucarióticos, tais como fungos, que sintetizam pectinases
ácidas. A produção máxima de pectinase de Aspergillus níger foi obtida usando como
substrato casca banana, de laranja e abacaxi, farelo de trigo e amido de batata como
substrato (Pedrolli, 2014).
Desta forma percebesse que, o uso de enzimas no mercado de suco é de suma
importância. Uma vez que, as polpas de frutas sem o tratamento enzimático podem
ter baixa aceitação no mercado por conta de seu aspecto e são difíceis de pasteurizar
e concentrar. Deste modo, as enzimas são aplicadas para a degradação de todos os
carboidratos poliméricos permitindo assim, um melhor processamento da polpa e
máximo de rendimento das substâncias contidas no fruto, obtendo um melhor
rendimento de extração, e garantindo um aspecto conforme os padrões de qualidades
exigidos do mercado consumidor (Rosmine, 2017).
O uso de fungos filamentosos para a produção de poligalacturonase por
fermentação submersa é de suma importância, pois a utilização de resíduos da
agroindústria como meio de crescimento para microrganismos, tem como objetivo
retirar esses resíduos do meio ambiente, uma vez que estes, na maioria das vezes
são descartados em lixões e aterros. Partindo deste pressuposto, este trabalho busca
propor um caminho alternativo para utilização de resíduos agroindustriais, buscando
diminuição de possíveis problemas ambientais que estes venham a gerar, bem como,
agregar valores para essa matéria-prima, por meio da produção de substâncias de
interesse econômico. Partindo deste pressuposto, este trabalho tem como principal
objetivo a produção de poligalacturonase a partir do resíduo de laranja Pera,
produzida por Aspergillus niger ATCC 1004, buscando a diminuição de possíveis
problemas ambientais que estes resíduos venham a gerar, bem como, agregar valores
para essa matéria-prima por meio da produção de substâncias de interesse
econômico.

2 OBJETIVO GERAL

17
Produção e caracterização da poligalacturonase produzida pelo fungo Aspergillus
niger ATCC 1004 por fermentação em fase submersa utilizando com fonte de carbono
o resíduo da Laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck).

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Avaliar a utilização do resíduo da Laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck), como


meio de cultivo na fermentação em fase submersa para produção de enzimas
Poligalacturonase, utilizando o fungo Aspergillus niger ATCC 1004;
 Otimizar o processo de produção da enzima Poligalacturonase
 Purificar e Caracterizar a enzima Poligalacturonase;
 Avaliar a aplicação da poligalacturonase de Aspergillus niger ATCC 1004 para
diminuição da viscosidade em suco de umbu (Spondias tuberosa Arruda Câm)
.

18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Durante o processamento de frutas e vegetais, ocorre uma enorme produção


de resíduos, este em sua maioria são descartados em aterros. No entanto, a busca
por uma forma de gerenciar os resíduos produzidos durante o beneficiamento é o um
grande desafio da atualidade. A reutilizações mais valiosas de subprodutos seriam um
benefício significativo, principalmente para a biomassa, onde ainda existem alguns
conteúdos úteis, que podem ser extraídos das cascas de cítricos (Liu, 2006).
Atualmente, mais de 40% das laranjas produzidas são utilizadas para produção
de produtos comerciais, tais como cítricos desidratados, marmeladas, compotas,
sucos frescos e agentes aromatizantes para bebidas. Tendo como resultado do
processamento, resíduos com grandes quantidades de águas residuais após
lavagem, resíduos sólidos (principalmente cascas, membranas e sementes) e
resíduos semi-sólidos após a extração de suco, sob a forma de polpa de centrifugação
(sharma, 2017).
Os resíduos de frutas cítricas, são ricos em minerais, pectinas, que tornam o
alimento rico em propriedades funcionais podendo ser utilizado no enriquecimento e
desenvolvimento de novos produtos, como pães, biscoitos, bolos, barra de cereais,
entre outros com alto valor agregado (De Farias, 2016). Outra finalidade para a
utilização destes resíduos e a aplicação em alimentação de animais, após secagem,
no entanto, o teor de proteína cai para apenas 6%, o que não faz deste um meio ideal.
Além disso, a diminuição do seu teor de umidade de 80% para 10% é altamente
intensiva em termos energéticos e dispendiosa, tornando as aplicações para resíduos
de cascas de cítricos apenas marginalmente rentáveis (Mamma, 2013).

3.2 CULTURA DA LARANJA PERA (CITRUS SINENSIS L. OSBECK)

19
Originária da Ásia, especialmente da China e do arquipélago malaio, as mudas
de laranja chegaram pela primeira vez no Brasil no século XVI com os portugueses,
que as plantaram ao longo da costa. Entre as variedades, a laranja Pera ou doce
(Citrus sinensis L.Osbeck) se destaca, por ser uma fruta de casca fina, sabor doce,
aroma característico, agradável e baixa acidez (Silva e col., 2016).
A laranja pode ser ingerida frescas ou processadas, o seu suco ou casca
perfumada, têm sido valorizadas por suas propriedades nutritivas saudáveis e, em
virtude de sua abundância em vitaminas, antioxidantes e minerais, tendo benefícios
para a saúde comprovada (Lerma-García, 2016). Considerada como uma das culturas
mais importantes e com alto rendimento nas zonas tropicais e subtropicais e países
em desenvolvimento, como México, Índia, Argentina, Brasil e China. Tendo o Brasil
como maior produtor mundial de laranja doce. O mesmo processa 47% dos citrinos
do mundo (o principal país processador de citrinos do mundo), seguido dos Estados
Unidos da América (29%) (Sharma e col., 2017).
O plantio de citros (laranja) está presente em vários estados brasileiros, sendo
que a Bahia, se destaca como segundo maior produtor de laranja, com 63.199
hectares, produzindo 994.817 toneladas de laranja (Embrapa, 2013). Segundo o
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2018), o clima favoreceu o
rendimento por hectare de laranja, que cresceu 4,9% de 2015 para 2016, chegando a
26.180 kg/ha, o que levou a produção nacional a 17,3 milhões de toneladas, 1,8% a
mais do que no ano anterior, a Bahia ficou na segunda posição entre os maiores
estados produtores, ultrapassando Minas Gerais, com uma produção de 1,2 milhão
de toneladas. No quadro 1, temos a previsão da produção de laranja no estado da
Bahia, na região Nordeste e a produção nacional em janeiro de 2017 segundo (IBGE,
2017).

Quadro 1: Produção laranja nacional Fonte: IBGE (2017).

20
IBGE/CEPAGRO -LEVANTAMENTO SISTEMÁTICO DA PRODUÇÃO AGRÍCOLA
janeiro/2017
Região Produção 2016 Perspectivas para 2017
ÁREA Plantada ÁREA Plantada
70 950 61 500
(Hec) (Hec)
ÁREA Colhida ÁREA Colhida
60 950 61 500
BAHIA (Hec) (Hec)
PRODUÇÃO PRODUÇÃO
985 650 930 000
(Ton) (Ton)
REND.MÉDIO 16 171 REND.MÉDIO 15 122
ÁREA Plantada ÁREA Plantada
32 245 116 610
(Hec) (Hec)
ÁREA Colhida ÁREA Colhida
115 406 113 301
Nordeste (Hec) (Hec)
PRODUÇÃO PRODUÇÃO
1 601 857 1 501 901
(Ton) (Ton)
REND.MÉDIO 13 880 REND.MÉDIO 13 256
PRODUÇÃO NACIONAL DE LARANJA – 667.529 hectares plantados em 2016. 663.274
perspectivas para hectares plantados em 2017. 15 983 273 toneladas em 2016 – perspectivas
para 2017 de 14 653 571 toneladas.

Conforme os dados do IBGE (2018) a produção de laranja em 2017 foi de


18.666.928 toneladas e em 2018 é esperado uma produção de 18.510.052 toneladas
com uma redução de -0.8 % em comparação a safra de 2017.
Geralmente, os resíduos cítricos ainda não possuem valor econômico, mesmo
sua composição sendo rica em açúcares solúveis, celulose, hemicelulose pectina e

21
óleos essenciais. Desta forma, pesquisas que visem à valorização desses resíduos
cítricos que são produzidos em larga escala no Brasil são necessárias. Dentre os
produtos que podem ser produzidos a partir deste material que é descartado pode-se
citar a extração de óleo essencial, pectina, produção de enzimas a partir do bagaço,
bioetanol, metano, ácidos orgânicos, proteína de célula única, antioxidantes naturais,
pré-bióticos, fibras dietéticas (Mamma e col., 2014).

3.3 ENZIMAS

As enzimas têm um papel indispensável na degradação da matéria orgânica,


são consideradas proteínas e atuam como catalisadoras de reações químicas
(Orlandelli, 2012). São produzidas por todos os organismos vivos, tendo como
principal função a catalise biológica de reações químicas, atuando de forma
fundamental no processo metabolitos essenciais a vida (BRASIL, 2015). O uso de
enzimas na indústria permite o desenvolvimento de processos tecnológicos muito
próximos aos eficientes processos executados pela natureza (Hasan e col., 2006). A
produção de enzimas de interesse industrial permite o reaproveitamento de resíduos
agroindustriais como fonte de matéria prima nos processos biotecnológicos. Após a
descoberta de que certos microrganismos podem produzir enzimas, foram
desenvolvidos processos técnicos para a produção de enzimas microbianas em
escala comercial. Desde essa época, reconhece-se que as enzimas têm composição
proteica e são biocatalisadores responsáveis por uma gama de reações que permitem
que as células vivas sobrevivam (Harger, 1982).
Preparações enzimáticas comerciais (geralmente complexos multe
enzimáticos) têm sido utilizadas por vários pesquisadores para a extração de pectina
de subprodutos cítricos. As enzimas pectinolíticas são de importância significativa na
atual era biotecnológica, com suas aplicações na extração de suco de frutas e sua
clarificação, lavagem de algodão, degomagem de fibras vegetais, tratamento de
águas residuais, extração de óleo vegetal, fermentações de chá e café,
branqueamento de papel, em aditivos para aves de capoeira e nas indústrias de
bebidas alcoólicas e alimentos (Mamma, 2014).

22
3.4 PECTINA

Na natureza, a pectina é degradada por sistemas enzimáticos produzidos por


uma imensa variedade de microrganismos saprofíticos e fito-patogênicos, incluindo
bactérias, leveduras e fungos (Tounsi, 2016). A parede das células vegetais é
composta de pectina e celulose, que constituem os polímeros mais abundantes na
natureza (Hadj-taieb e col., 2006). A pectina é um heteropolissacarídeo encontrado
na lamela média da parede celular das plantas e é degradada pela ação de várias
enzimas incluindo as pectinases (Anarudha, 2014). Sendo um polissacarídeo
complexo, encontrado na parede celular primária e na lamela média de plantas
superiores, composta principalmente em ácido D-galacturônico (GalA) e
monossacarídeos, L-rhamnose (Rha), L-arabinose (Ara), D-galactose (Gal) e D-
xilose (Xil) (Raji e col., 2017).
Sendo um grupo complexo e estruturalmente diversificado de polímeros, as
estruturas finas das pectinas podem ser amplamente heterogêneas entre as plantas,
entre os tecidos e mesmo dentro de uma única parede celular (Al-Najada, 2014).
Sendo o principal constituinte de cereais, vegetais, frutas e fibras. Estando presente
em frutas e vegetais (Kohli; Gupta, 2015), extraídas na maior parte das cascas de
citrinos, polpa de beterraba açucarada e bagaço de maçã. A estrutura da cadeia de
pectina, como mostra a figura 01, é formada principalmente de unidades de ácido α-
(1-4)-D-galacturônico constituindo longas correntes homogalacturônicas intercaladas
por série de rhamonogalacturonano em que os resíduos de ramnose e ácido
galacturônico alternam (Abid, e col. 2017).

23
Figura 1: Estrutura simplificada da pectina. (Adaptado de BARRETO, 2016).

A maior parte da pectina é obtida de subprodutos da indústria de alimentos,


tendo aplicações em formulações farmacêuticas. No entanto, é na indústria de
alimentos a sua maior aplicação. Esta estrutura discreta, confere características
relevantes para pectina em termos de propriedades tecnológicas onde a mesma é
utilizada como agente gelificante, espessante, emulsionante, texturizador,
estabilizador em geleias, produtos lácteos e como substitutos de gordura em sorvetes,
molhos para saladas; reduzindo a ingestão calórica (Muñoz-almagro e col., 2016; Raji,
2017). Atualmente, os resíduos alimentares e agroindustriais também estão sendo
utilizados para a obtenção de pectina (Naqash, 2017).

3.5 PECTINASE

Uma gama de microrganismos produz pectinases, como fungos filamentosos,


bactérias e leveduras. Entretanto, para a produção de pectinases comerciais são
utilizados fungos filamentosos, tendo como destaque o gênero Aspergillus, uma vez
que estes fungos oferecem a vantagem de secretar 90% das enzimas que produzem
no meio de cultura, simplificando assim a recuperação e a purificação da mesma
(Reginatto, 2017). As substâncias pécticas podem ser degradadas por enzimas
pectinolíticas, produzidas em diferentes combinações pelas plantas e por
microrganismos como fungos, leveduras e bactérias (Uenojo, 2007).

24
As pectinases são um grupo heterogêneo de enzimas que hidrolisam as
substâncias de pectina, presentes principalmente em plantas, e estão amplamente
distribuídas em plantas superiores e microrganismos, sendo de primordial
importância, pois ajudam na extensão da parede celular e no amolecimento de alguns
tecidos vegetais durante a maturação e armazenamento. As enzimas pectinolíticas
são amplamente utilizadas em processos industriais, representando cerca de 75% das
vendas globais de enzimas que são comercializadas na indústria alimentar (Anuradha,
2014). As pectinases, são as enzimas mais importantes da indústria de suco de frutas,
formando um consórcio de enzimas essenciais para a hidrólise da pectina de tecidos
vegetais (Dey, 2014).
Esta classe de enzimas eliminam a turbidez imediata. Qualquer ação de
despectinização tem dois efeitos: degradar as pectinas solúveis viscosas e induzir a
agregação de partículas de nuvem. A pectina forma um revestimento protetor em torno
de proteínas em suspensão e carrega uma carga negativa em ambientes ácidos que
os fazem repelir uns aos outros. As pectinases degradam a cadeia das pectinas,
expondo assim proteínas positivamente carregadas. A repulsão eletrostática entre as
partículas da nuvem é assim reduzida para que elas se agreguem. (Cerreti, 2016)
A primeira aplicação comercial de pectinases foi relatada em 1930 por Kertesz
para a clarificação de suco de maçã (Garg, 2016). As pectinases produzidas por
diferentes microrganismos são classificadas em enzimas despolimerizantes e
enzimas saponificastes. As enzimas de polimerização são aquelas que catalisam a
clivagem hidrolítica das ligações α (1-4) -glicósidas nas porções de ácido D-
galacturónico das substâncias pécticas (Anarudha, 2014).
Com base no mecanismo de degradação da pectina, são classificados
principalmente a pectina esterase (PE), pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG).
Entre eles, a PG hidrolisa α-1, 4 ligações glicosídicas da cadeia de ácido
poligalacturônico e libera resíduos de ácido galacturônico (Kant et al, 2013). As
poligalacturonases hidrolisam a cadeia do ácido poligalacturônico por adição de água
e são as mais abundantes entre todas as enzimas pectinolíticas (Sharma 2013).

3.6 POLIGALACTURONASES

25
As poligalacturonases (PGs) são as enzimas pectinolíticas mais estudadas e
utilizadas em produtos comerciais, sendo presentes em plantas, bactérias, leveduras,
fungos filamentosos e podem ser encontradas em nematoides e insetos (Sassi,2016).
Esta enzima hidrolisa as ligações glicosídicas de poligalacturonatos (pectatos)
por ambos os mecanismos de divisão exo e endo. A atividade da PG pode ser
quantificada pela medição dos açúcares redutores formados devido à hidrólise ou pelo
método de redução da viscosidade (Sharma, 2013). É classificada como glicosil
hidrolases, com base no modo de ação classificado como Endo-PGs EC (3.2.1.15) e
Exo-PGs EC (3.2.1.67) (Anand, 2017). As endo-PGs atuam na síntese de
oligossacarídeos de curto tempo de polimerização, como os ácidos tetra e tri-
galacturônico, obtidos como produtos da hidrólise final quando atuam sobre ácido
poligalacturônico (PGA), as exo-PGs atua sintetizando principalmente ácidos mono e
di-galacturônicos (Tounsi 2016).
As exo-PGs catalisam a clivagem de α-1,4-ligações de ácido poligalacturônico
e regiões homogêneas de proteínas, como mostra a figura 2. Sendo que as Ex-PGs
catalisam a libertação hidrolítica do resíduo de ácido galacturónico saturado a partir
de sua extremidade não redutora de homogalacturonan, sendo produzidas por
bactérias e fungos. As exo-PGs fúngicas produzem o ácido monogalacturônico como
o principal produto final e possuem pH ótimo de 4.0 - 6.0 (Anand, 2017; Sassi, 2016).
Figura 2: Modo de ação das enzimas poligalacturonases; hidrólise das ligações glicosídicas α-(1→4)
dos resíduos de ácidos poligalacturônicos. (Adaptado de BARRETO, 2016).

Dependendo do perfil dos produtos de hidrólise liberados após a clivagem de


substâncias pécticas, as PGs podem secretar enzimas do tipo endo liberando
oligossacarídeos de curto prazo de polimerização, como os ácidos tetra e tri-
galacturônicos, como produtos de hidrólise final quando atuam sobre o ácido
poligalacturônico, enquanto a exo-PGs libera principalmente ácidos mono e di-
galacturônicos (Tounsi, 2016). PGs fúngicas são geralmente proteínas monoméricas
26
com um hidrato de carbono com teor de 5-85% e massas moleculares na faixa de 20
a 95 kDa (Ma, 2016).
A PG é produzida por várias espécies de fungos, tais como, Penicillium
occitanis (Maktouf, 2014), Aspergillus aculeatus (Silva, 2015), Penicillium occitanis
(Sassi,2016), Penicillium janthinellum (Ma, 2016), Aspergillus niger (Ahmed, 2016;
Finkler, 2017), Aspergillus flavus (Anand, 2017), Aspergillus kawachii (Byrne, 2017)
dentre outros.
As pectinases representam cerca de um quinto do mercado mundial de
enzimas, devido a sua ampla gama de aplicações biotecnológicas sendo obtidas
exclusivamente de fontes microbianas (Habrylo, 2018). Esta enzima tem sido aplicada
em vários processos na indústria de alimentos para a clarificação e diminuição da
viscosidade de sucos, maceração de fibras vegetais, na extração de azeite de oliva, e
no tratamento de águas residuais proveniente da indústria (Amid e col., 2014, Amin,
2017).
As PG podem se aplicadas para o clarificação de sucos de frutas como
demostrado por, Ajayi (2015) que utilizou a poligalacturonase obtida de Aspergillus
niger para a clarificação de suco de tomate. Cerreti (2017), utilizou pectinase de
Aspergillus niger, juntamente com Protease de cisteína vegetal na clarificação de suco
de romã. Desta maneira nota-se que a PG desempenha um papel crucial no mercado
de sucos.
No processo de esmagamento e maceração de frutas como mamão e banana
por tratamento enzimático resultou na extração de 60 a 95 ml de suco por 100 g de
material, melhorado significativamente pelo uso do tratamento com pectinase, o peso
seco residual do resíduo sólido diminuiu na faixa de 5 a 64% (Garg, 2016).

3.7 FERMENTAÇÃO EM FASE SUBMERSA

Para o cultivo de microrganismo, o ambiente onde ocorre a fermentação e as


condições fornecidas pelo meio de cultura precisam atender às necessidades
específicas dos microrganismos, afim de obter uma alta produtividade dos produtos
desejados (Chiang, 2013). Uma grande parte dos fabricantes de enzimas produzem
seus produtos utilizando técnicas de fermentação em fase submersa. Esta técnica

27
possui um custo de recuperação do produto satisfatório em relação à concentração
em um caldo de fermentação (Viniegra, 2003).
Na fermentação submersa, é utilizado o meio liquido que contem fontes de
nutrientes para o desenvolvimento do microrganismo, que se dá em presença de água
livre, sendo o conteúdo de água superior a 95% (Orlandelli, 2012). Esta agrega
vantagens no controle do processo e possui fácil recuperação de enzimas
extracelulares, micélios ou esporos.
A fermentação submersa apresenta algumas vantagens em relação a
fermentação em estado sólido que apresentam algumas dificuldades, como por
exemplo: os microrganismos que crescem em baixos níveis de umidade, a dificuldade
para a remoção do calor gerado pelo processo de respiração do microrganismo,
dificuldade no controle de umidade, pH, oxigênio, gás carbônico e produtos formados,
etc. (Phandey,1991).
A produção de enzimas por fermentação submersa é preferida pela indústria
devido ao melhor controle de parâmetros de todo o processo de produção. O ponto
importante para este tipo de processo é que parâmetros como temperatura, agitação,
aeração, espuma, pH entre outros fatores podem ser facilmente controlados,
dependendo do tipo de reagente específico. A mesma apresenta vantagens em seu
processo e a base tecnológica bem estabelecida para escalar em produção industrial,
este fato se dá principalmente devido ao controle de pH, temperatura, oxigênio e
disponibilidade de nutrientes, dentre outra vantagem em relação à fermentação em
estado solido (Hansen, 2015).
No quadro 2 abaixo, temos a comparação entre as fermentações no estado
sólido e a submersa, de acordo com Paris (2008):

Quadro 2: Comparação entre as fermentações no estado sólido e a submersa


Fermentação em estado sólido Fermentação submersa

Meio de cultura não flui livremente Meio de cultura sempre flui livremente

Profundidade do meio limitada Profundidade do meio variável como


Biorreator
Consumo limitado de água, baixa aw, Grandes quantidades de consumo de
sem efluentes água e descarte de efluentes
Baixa capacidade de transferência de Fácil controle de temperatura
calor

28
Aeração requer elevado fluxo Fácil aeração e grande área de contato
ar/substrato
Substrato tampão Fácil controle de pH

Condições estáticas Boa homogeneização

Necessita projetos Equipamentos industriais disponíveis

Fonte: PARIS (2008)

Monteiro (2009), também faz um comparativo entre a fermentação submersa,


está se destaca frente a fase sólida, oferecendo várias vantagens como: facilidade na
manipulação, maior volume de meio, a massa de microrganismo fica totalmente
submersa no meio de maneira uniforme, a absorção de nutrientes e excreção de
metabólitos são executados com mais eficiência, o que acarreta menor tempo de
fermentação e, consequentemente, maior produtividade.

3.8 ASPERGILLUS NIGER

Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos, obtendo sua nutrição a


partir de matéria orgânica. Apresentam-se sob a forma multicelular, filamentosa. A
forma filamentosa é formada de um conjunto de estruturas tubulares, denominadas
de hifas, que quando agrupadas, formam o micélio. A relação da indústria com os
fungos filamentosos é muito antiga sendo que esses estão associados à tecnologia
de alimentos desde os primórdios das civilizações mais antigas conhecidas, como no
preparo de bebidas por indígenas americanos, e no preparo de alimentos na cultura
oriental (Da Silva, 2017).
Os bioprocessos econômicos, viáveis e controláveis para organismos
filamentosos, em particular os fungos, são de suma importância para a produção em
grande escala para uma vasta gama de produtos com valor agregado, incluindo ácidos
orgânicos, enzimas, antibióticos (Posch, 2013). Na recuperação de áreas
contaminadas por petróleo e seus derivados, “biorremediação” (Lima, 2011). Na
indústria, a vantagem para uso de fungo filamentoso inclui sua habilidade natural para
secretar uma variedade de Enzimas e em grandes quantidades, o que implica na
utilização dessas culturas em escalas variadas durante o processo de produção
desejado (Li, 2008).

29
Sendo de fácil cultivo, e por secretarem suas enzimas de forma extracelulares
diretamente no meio de produção, evitando assim, a ruptura celular para sua
liberação. (Martins, e col., 2014). Outro ponto que merece destaque é o fato destes
fungos crescerem em substratos relativamente baratos sendo capazes de produzir e
secretar quantidades notáveis de proteínas recombinantes (Madhavan, 2017).
O fungo filamentoso Aspergillus niger tem-se tornado uma cepa amplamente
utilizada para uma gama de diversos processos industriais no ramo alimentício e
farmacêutico (Wucherpfennig e col., 2012). Partindo deste aspecto, o Aspergillus níger
veem sendo objeto de pesquisa e uso industrial há várias décadas. Se desenvolve na
forma de coagulo ou agregação, conforme a figura 3, onde seu cultivo se dá por
agregados de esporos e hifas que crescem em pellets, esse processo de formação
ocorre no estágio inicial do cultivo, formando agregados que consistem em esporos e
hifas (Kelly 2004).

Figura 3: Micro morfologia do Aspergilus níger Macro morfologia


Fonte:HTTP://WWW.MYCOLOGY.ADELAIDE.EDU.AU/DESCRIPTIONS/HYPHOMYCETES/ASPERG
ILLUS/

Primeiro estudo foi em 1919, quando sua capacidade de sintetizar o ácido


cítrico foi industrialmente utilizada. No entanto, só a partir da década de 1960, o A.
Níger tornou-se uma fonte rentável para a produção de uma variedade de enzimas
que são utilizadas como auxiliares na transformação de frutas, no cozimento e nas
indústrias de fécula e alimentos. (Schuster e col., 2002). O Aspergillus níger é bastante
utilizado na produção de enzimas, polissacarídeos, proteínas, na degradação lipídica,

30
tendo um uso estável na produção de enzimas e ácidos orgânicos (Florencio e col.,
2016).

31
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36
4 - PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA POLIGALACTURONASE
TERMOESTÁVEL DE ASPERGILLUS NIGER ATCC 1004 OBTIDA DO
RESÍDUO DA LARANJA PERA (CITRUS SINENSIS L. OSBECK)

Resumo
Neste trabalho, foi investigado o uso do resíduo da laranja Pera (Citrus sinensis L.
Osbeck) como principal fonte de carbono, para a produção de poligalacturonase por
fermentação submersa utilizando o Aspergillus níger ATCC 1004. O delineamento
experimental utilizado para otimizar o processo de produção foi o Doehlert, com
aplicação da metodologia de superfície de resposta (MSR). A atividade enzimática
encontrada nas condições ótimas, em 30 ° C com 120 Rpm em 96h, tendo a
concentração de indutor de 0.6 mg, obteve um valor predito de 8,47 UA sendo o valor
real de 8.77 UA, possuindo um erro experimental de 3,5 % entre o valor predito e o
valor real. A PG de peso molecular de 45 KDa, mostrou-se termoestável até 70°C por
um tempo de 30 min. O valor de Km de 0.088398 mg/ml e Vmax de 55.248 μmol /ml
/min respectivamente.

Palavras Chaves: Poligalacturonase, Redução da Viscosidade, Resíduo da Casca


de Laranja Pera.

37
4.1 INTRODUÇÃO

Conhecer as principais características das enzimas é fundamental para


determinar a maneira como a mesma atua. Com uma vasta posibilidades de
aplicações biotecnológicas, as enzimas pectinolíticas desencadeiam uma busca
constante por novas enzimas compatíveis com a demanda da indústria, tendo como
fatores os requisitos para melhorar a eficiência no processamento de pectina (Habrylo,
2018).
Uma das pectinases comerciais amplamente utilizadas é a poligalacturonase.
Produzida comercialmente e distribuída como um pó branco a castanho claro,
principalmente extraído de frutas cítricas (Sharma 2013). Desempenhando um papel
significativo em várias indústrias, com variadas aplicações em diferentes processos
industriais, tais como extração de sucos de frutas, processamento de têxteis,
fabricação de papel, tratamento de águas residuais contendo pectina, desengomagem
de fibras de plantas, clarificação de vinho, extração de óleo, café e chá (Rehman,
2016).
Por muitas vezes, existe a necessidade de se otimizar várias respostas ao
mesmo tempo, por conta deste fator, o uso da metodologia de superfícies de respostas
(MSR) possui uma alta eficiência e vem sendo aplicada para a otimização de trabalhos
acadêmicos, por possuir um satisfatório poder de modelagem e capacidade de
exploração dos sistemas estudados. A partir de ensaios experimentais que são
realizados e a triagens das variáveis significativas são evidenciadas e quantificadas,
desta forma evidenciando suas interações. (Bezerra, 2008).
Assim, O objetivo deste trabalho foi investigar o uso do resíduo de laranja Pera
(Citrus sinensis L. Osbeck) como principal substrato de baixo custo, para a produção
de enzimas poligalacturonase por Aspergillus níger ATCC 1004 através da
fermentação submersa. O delineamento experimental Doehlert foi utilizado com
aplicação da metodologia de superfície de resposta (MSR), para determinar as
condições ótimas e a caracterização da produção da enzima poligacturonase. Desta
forma, buscando contribuir para a transformação de um residuo de baixo valor
comercial em um produto de alto valor agregado.

4.2 MATERIAIS E MÉTODOS


38
4.2.1 Microrganismo

O Aspergillus niger ATCC 1004 utilizado neste trabalho foi doado pela Coleção
de Microorganismos de Referência em Vigilância Sanitária (CMRVS, Fundação
Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil). O cultivo dos microorganismos
foram feitos em placas de Petri utilizando meio PDA (Potato dextrose Agar) (Himedia,
Mumbai, Índia) a 30 °C. A solução estoque foi armazenada a 4 oC até o início dos
experimentos.

4.2.2 Preparo do Resíduo

Os resíduos das laranjas do tipo Pera (Citrus sinensisL. Osbeck), foram


adquiridas a partir dos rejeitos das lanchonetes da cidade de Itapetinga - Bahia. Estes
foram higienizados, cortados e em seguida secos em estufa de secagem e circulação
de ar (SOLAB SL 102, Piracicaba, SP- Brasil) há 30 ° C por 60 horas, em seguida
triturados em moinho de facas tipo Willey (ACB Labour, São Paulo, Brasil) com
granulométrica aproximada de 2 mm. A figura 4, mostra a sequência utilizada para o
tratamento do resíduo. Em seguida, foi realizada a caracterização físico-química do
resíduo no laboratório Forragicultura no campus de Itapetinga, para verificação da
presença de material mineral (MM), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), cinzas
(CZ), celulose (CL), hemicelulose (HC), lignina (LG), fibra em detergente neutro (FDN)
e fibra em detergente ácido (FDA).

Figura 4: etapas do preparo do Indutor: A) Resíduos de laranja; B) cortes para serem acondicionados
na estufa com circulação de ar, C) Resíduos secos; D) após o processo de moagem. Fonte: autora

39
A B

C D

4.2.3 Inóculo do Aspergillus niger e Fermentação

O fungo foi incubado em um meio de cultura de BDA para ativação durante 5


dias a 30ºC (BOD SL200 / 90 Incubadora - SOLAB). Para o cultivo, do inoculo foi feito
um meio líquido utilizando frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de tampão
citrato/fosfato (pH 6,0), sendo suplementado com 0,3 g/L de extrato de levedura em
pó, 0,3 g/L de extrato de malte, 0,5 g/L de peptona, 1,0 g/L de extrato seco de indutor,
seguindo a metodologia descrita por Manera (2011), com algumas modificações. Para
o inoculo, foram utilizados três discos de 2 cm de diâmetro contendo o microrganismo
conforme utilizado por Sena (2011). A fermentação foi realizada a 120 rpm, 30°c nos
tempos determinados pelo planejamento experimental, em um agitador rotativo
(Incubadora shaker SL 222, SOLAB) conforme demostrado na figura 5.

Figura 5: Processo de fermentativo (Incubação) Fonte: Autor

40
4.2.4 Obtenção do Extrato Enzimático Bruto

Após a fermentação, o meio de cultura líquido inoculado foi filtrado a vácuo


(bomba de filtro de vácuo TE-0582, TECNAL), e o filtrado foi acondicionado em
refrigeração para as análises por um período máximo de trinta dias.

4.2.5 Planejamento experimental Doehlert para Otimização da produção


de Poligalacturonase

Um Projeto Doehlert de dois fatores foi desenvolvido, tendo três e cinco níveis
, num total de 9 conjuntos de experimentos (ensaios), como mostrado na figura 6,
sendo o ponto central realizado em triplicata, este planejamento foi utilizado para
determinar a concentração do indutor e o tempo de fermentação ideal para a produção
da PG por A. niger ATCC 1004. A análise da superfície de resposta baseou-se em
regressões lineares múltiplas, levando em consideração os principais efeitos
quadráticos e de interação, de acordo com a seguinte equação 1.

em que Y é a resposta prevista; βo, a constante; β1 e β2, os efeitos lineares; β11 e


β22, os efeitos de segunda ordem; e β12, o efeito de interação entre as variáveis 1 e
2. A quantidade de indutor de (0.1, 0.6, 1.1 g/L), nos tempos de fermentação (48, 72,
96, 120 e 144 horas). Todos os experimentos foram realizados com temperatura fixa
41
em 30° C em 120 rpm para o processo de produção. Os erros experimentais foram
avaliados no ponto central, sendo que os dados experimentais foram processados
usando o software STATISTICA 10.0. Todos os ensaios foram realizados em ordem
aleatória. O mesmo programa foi utilizado para propor a falta de ajuste do modelo para
os dados experimentais através da análise de variância (ANOVA).

Figura 6: Meio de cultura para utilização otimização da produção de enzimas. Fonte: Autor

4.2.6 Determinação de Poligalacturonase

A atividade da Poligalacturonase foi determinada através da dosagem dos


açúcares redutores utilizando o método do ácido dinitrosalicílico (DNS), de acordo
com Miller (1959) com pequenas modificações realizadas conforme Maldonade
(2013). Para analisar a degradação do açúcar foi utilizado o ácido poligalaturônico
(Sigma-Aldrich) a 1% p/v, diluído previamente em solução tampão de cítrato/fosfato
com o pH 5,0 a 50 mM. Os ensaios reacionais foram realizados em tubos de ensaio,
onde foram adicionados 350µL de extrato enzimático e 250µL de solução de ácido
poligalaturônico (1% p/v) (Sigma). O branco contendo 350µL de extrato enzimático e
250µL de solução tampão citrato/fosfato pH 5. Todas as amostras em seguida
incubadas em banho Maria (Cientec CT-266, Belo Horizonte, Mg, Brasil) 50° C,
durante 15 minutos. Em seguida, foi realizada a adição de 600 µL DNS, com a
submersão dos tubos em banho Maria há 100 °C (SOLAB SL - 150/4ª, Piracicaba, SP,
Brasil) por 5 minutos e posterior adição de 6,0 ml de água destilada para a interrupção
da reação. A leitura da absorbância foi realizada a 540nm, no espectrofotômetro (BEL
Photonics SP 2000 UV). A atividade enzimática da PG é definida como a quantidade
de enzima capaz de liberar 1μmol de ácido galacturônico nas condições por minutos

42
de reação. Os resultados foram expressos em unidades de atividade por grama de
meio úmido fermentado (U/A), conforme equação 2.

Equação 2. Sendo:

UA a unidade de atividade enzimática, a concentração é o valor encontrado


na curva padrão e o tempo é o tempo de reação em minutos.

4.2.7 Determinação da proteína total

A concentração de proteína foi determinada a partir do extrato enzimático de


acordo o método proposto por Bradford (1976), utilizando albumina de soro bovino
(BSA) como padrão. A atividade específica foi calculada a partir da divisão da
atividade enzimática pelo valor de proteína total (Bradford, 1976). Para o cálculo da
atividade especifica foi utilizada a equação 3.

Equação 3 sendo:

AE = µmol de glicose liberado por min/mg de proteína (UA/mg).

4.2.8 CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA

4.2.8.1 Determinação do pH e Temperatura Ótimos da Poligalacturonase.

Um Projeto Doehlert de dois fatores foi desenvolvido, tendo três e cinco níveis
, num total de 9 conjuntos de experimentos (ensaios), sendo o ponto central realizado
em triplicata, para determinar o pH e a temperatura ideal. A análise da superfície de
resposta baseou-se em regressões lineares múltiplas, levando em consideração os
principais efeitos quadráticos e de interação, de acordo com a seguinte equação 4.

(4)

43
em que Y é a resposta prevista; βo, a constante; β1 e β2, os efeitos lineares;
β11 e β22, os efeitos de segunda ordem; e β12, o efeito de interação entre as variáveis
1 e 2. O pH ótimo da atividade da Poligalacturonase foi ensaiado em pH 3,0, 4,0, 5,0,
6,0 e 7,0. A atividade da PG foi testada sob condições padrão de ensaio sob a faixa
de temperatura de 30, 50 e 70 ° C para determinar a temperatura ótima. As
temperaturas foram controladas usando banho de água Maria (Cientec CT-266, Belo
Horizonte, Mg, Brasil), em seguida a atividade da PG foi determinada conforme o item
4.2.6.

4.2.8.2 Termoestabilidade da Poligalacturonase

Uma termoestabilidade ótima da enzima produzida é uma característica


desejável, uma vez que está enzima pode ser utilizada em processos industriais, onde
na maioria dos casos são requeridas altas temperaturas. A termoestabilidade, refere-
se tanto à termoestabilidade dinâmica quanto à estabilidade cinética, onde (Tm)
representa 50% da enzima desdobrada (perde a estrutura dimensional) e a
termoestabilidade cinética reflete a meia vida (T ½) da enzima, a uma determinada
temperatura (Gomes, 2007; França,2009).
As amostras da poligalacturonase foram incubadas em banho maria (Cientec
CT-266, Belo Horizonte, Mg, Brasil), a diferentes temperaturas (50, 60,70 80, 90 °C)
e durante diferentes períodos de tempo (0, 10, 20, 30 min,) em tubos de ensaio de
tamanho uniforme e vedados para avaliar a estabilidade da enzima em varias
temperaturas. Os tubos foram resfriados em banho de gelo após o aquecimento e a
medição da atividade residual foi conforme o item 4.2.6.

4.2.8.3 Efeito de Cátions Sobre a Atividade da Poligalacturonase

As enzimas possuem tendência de serem influenciadas quando expostas à


metabolitos químicos diferentes como por exemplo íons metálicos. Sendo assim, o
efeito de vários íons metálicos sobre a produção das PG foi avaliado, tendo em vista
a determinação do efeito destes no aumento ou inibição da atividade das enzimas
(Pedrolli, 2014). O efeito Na+, K+ , Ca+ e F3+ e na atividade da PG foi investigado.
Foram utilizadas as seguintes sais, NaCl, CaCl2, KCl e FeCl3. As concentrações
44
testadas para cada substância foram 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 a 0.25 mol/L. A atividade
da Poligalacturase foi determinada conforme o item 4.2.6.

4.2.8.4 Determinação dos Parâmetros Cinéticos

O estudo da constante de Michaeli-Menten (Km) foi realizado através da análise


de regressão da curva de Lineweaver–Burk. Onde, Vmax é o valor máximo da
velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão ocupados, Km é a constante de
Michaelis. Conforme a concentração do substrato aumenta, a velocidade aumenta até
atingir um valor máximo constante (Vmáx), sendo de ordem zero em relação a
quantidade de PG. Nesta região constante, ocorre uma saturação dos sítios ativos da
enzima com o substrato (Lehingener e col., 2011. Voet, 2013).
Para a produção da poligalacturonase, utilizou-se as concentrações de 0,75%,
1,0%, 1,25%, 1,50% e 1,75 % de ácido poligalacturônico (Sigma-Aldrich) para a
determinação da atividade enzimática conforme item 4.2.6 (Lineweaver-Burk, 1934).

4.2.9 PURIFICAÇÃO

O procedimento de purificao para PG de Aspergillus niger ATCC 1004 envolveu


dois passos:

Passo 1: Precipitação com Sulfato de Amônio

Ao extrato enzimático, foi adicionado sulfato de amônio (Sigma) para fornecer


70% de saturação. O sal foi adicionado lentamente com agitação branda e a mistura
permaneceu em repouso por 24 horas a 4°C. Em seguida o extrato foi centrifugado
em centrífuga (TECNAL) a 5000 rpm durante 10 min. O precipitado foi suspenso em
tampão fosfato de sódio 50mM pH 7, utilizando (10% do volume inicial do extrato).

Passo 2: Cromatográfica Sephadex G-100

O extrato enzimático bruto foi aplicado a uma coluna Sephadex G-100 (20x 1,0
cm) (Sigma), previamente equilibrado com tampão fosfato de sódio (0,05mol L-1, pH
45
7,0), que também foi usado como eluente. Foram coletadas frações de 1,5 ml e
verificado a quantidade de proteína pelo método de Bradford.
Seguidamente foi realizada uma nova leitura no espectrofotômetro (BEL
Photonics SP 2000 UV) de proteínas totais, as frações que apresentaram proteínas,
foram lidas novamente com DNS para determinação de poligalacturonase (Byrne,
2017; Yu, 2017). O fator de purificação (X) foi usado como a medida da purificação
proporcionada pelo fracionamento, sendo definido conforme a Equação 5.

4.2.10 Eletroforese

4.2.10.1 Preparo do Gel de separação e Fixação

A eletroforese SDS-PAGE foi realizada no Laboratório de Bioquímica da Uesb


campus Jequié, conforme Laemmli (1970): Para o gel de separação, foi adicionado
em um béquer 1740 uL de água destilada em 2600 uL de acrilamida-Bis. Em seguida,
foi adicionado a mistura anterior 1560 uL de tampão Tri-HCl pH = 8,8, 56 uL de SDS
10%, 7 uL do catalizador TEMED (100%). Foi preparada uma solução de PSA (10%)
e adicionada 34 uL dessa solução a anterior. Para o gel de fixação, foi adicionado em
um béquer 2960 uL de água, 650 uL de acrilamida-Bis, adicionar 250 uL de tampão
Tris-HCl pH= 6,8. Em seguida adicionou-se 40 uL de SDS (Docecil Sulfato de Sódio)
(10%), 35 uL de PSA (10%) e 5 uL de de TEMED (100%).
Para o Preparo do Marcador de Peso Molecular (Padrão Sigma Marker),
utilizou-se o padrão em 100 uL de solução STOP com BETA (Solução preparada com
(1,25 mL de Tampão Tris-HCl pH = 6,8 e 0,0625 M), (0,2 g de SDS (correspondente
a 2%), (1 mL de glicerol 10%), (0,5 mL de b-mercapto (5%) em etanol), (0,001% de
bromofenol (0,0001 g)) e 10 mL de água deionizada). Para o preparo da Amostra A
amostra foi resuspendida em 20 uL de água destilada, por conta do excesso de sais,
adicionada 50% do volume resuspendido de solução STOP com Beta, aquecida a 100
°C para favorecimento da desnaturação. Para a corrida da proteína, foram
adicionados 20 uL do padrão no gel de fixação e 20 uL da enzima e colocados em
46
cuba de eletroforese, sobe as seguintes condições: Amperagem de 20 mA, potência
de 0,30 W.
Para a revelação, fez-se a Coloração do gel de acrilamida, O gel de acrilamida
foi revelado com solução corante (Preparada com: 0,2 g de Comassie Blue R-250 em
50 mL de metanol e 50 mL de água destilada), durante duas horas. Após a coloração
do gel foi retirado o corante e lavado com água para tirar o excesso de solução
reveladora, em seguida adicionado 200 mL de solução descorante (preparada com 20
mL de ácido acético, 60 mL de Etanol e 120 mL de água destilada), até o gel se tornar
transparente e aparecer as bandas de marcador e proteína (Laemmli, 1970).

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4. 3. 1 Caracterização físico-química do resíduo da casca de laranja

A caracterização físico-química realizada no resíduo da laranja Pera é


mostrada na Tabela 1 a seguir:

Tabela 1: Caracterização físico-química do resíduo de laranja.


COMPONENTE VALOR
PROTEÍNA BRUTA 15.77
EXTRATO ETÉREO 1.09
MATÉRIAL MINERAL 5.21
FIBRA EM DETERGENTE 26.81
NEUTRO (FDN)
FIBRA EM DETERGENTE 20.90
ÁCIDO (FDA)
CINZAS 0.95
LIGNINA 13.46
CELULOSE 7.43
HEMICELULOSE 5.91

Por sua composição rica em açúcares solúveis, celulose, hemicelulose,


pectinas, proteínas e metais, o residuo de laranja desempenham um papel importante,
apresentando grande potencial para ser aplicado na produção de produtos de alto
valor agregado, como na produção de enzimas, de ácido cítrico e outros produtos,

47
utilizando os fungos em especial do gênero Aspergillus em processos fermentativos.
(RIVAS e Col., 2008).
Hemiceluloses são utilizadas na produção de enzimas, e produtos de
fermentação, no entanto uma alta concentração de hemicelulose não favorecerá a
hidrolise enzimática (GUERRIERO e Col., 2016). Desta maneira, nota-se que o valor
de 5,91%, será favorável para a produção de enzimas a partir da utilização de farelo
da casca de laranja.
O resíduo de laranja apresentou um teor de proteína bruta de 15.77%. O
resultado para FDN chegou próximo do encontrado por Cavichiolo (2015) que foi de
21.76% sendo este resultado para o resíduo úmido em comparação com obtido neste
estudo que foi analisado a partir do resíduo seco utilizado nesta pesquisa que foi de
20.90%. Este resultado demonstra que o nível de FDN para o extrato seco não obteve
perda relevante.
A partir dos dados apresentados na tabela 1, o resíduo da laranja possui uma
boa quantidade de nutrientes, que são essenciais para sua utilização como
suplemento para a produção de enzimas extracelulares.

4.3.2 Avaliação do planejamento experimental Doehlert para otimização


da produção de PG

O Planejamento experimental Doehlert proposto para avaliar a produção de PG


de Aspergillus niger ATCC 1004 através da fermentação submersa em função da
variação da concentração do indutor e tempo de fermentação no processo
fermentativo do resíduo de laranja, com as respostas dadas pelas atividades da PG
em valores reais e estatisticamente previstos. Uma análise preliminar da Tabela 2,
permitiu verificar que o fungo Aspergillus niger ATCC 1004 foi capaz de produzir
Poligalacturonase utilizando o resíduo da casca de laranja Pera como substrato de
acordo com todas as combinações das variáveis investigadas em concordância com
planejamento.
Tabela 2: Matriz de Doehlert com valores reais (entre parênteses) finais codificados para os fatores:
concentração do indutor (In) e Tempo (h) e a resposta: atividade da PG (UA, µmol/min)

UA
Ensaios Indutor (mg) Tempo (min) Real Predito

1 +1(1.1) -1 (72) 7.213 ± 0.059 6.769


48
2 +1 (1.1) +1(120) 5.350 ±0.052 5.794

3 +1 (0.6) +1 (48) 4.769 ± 0.005 5.212

4 +1 (0.6) +1 (96) 8.195 ±0.061 8.476

5 0 (0.6) -0,866 (96) 8.461 ± 0.065 8.476

6 0 (0.6) 0 (96) 8.773 ± 0.031 8.476

7 0 (0.6) 0,866(144) 4.698 ± 0.040 4.254


8 -1 (0.1) -1 (72) 5.899 ± 0.111 5.454

9 -1 (0.1) +1 (120) 5.028 ± 0.028 5.472

Um modelo polinomial de segunda ordem (com p <0,10) foi obtido através da


análise de regressão, de acordo com a eq. (5):

UA= -9,6196+10,809 In -6,6725 In2 +0,3143 T - 0,001624 T2 -0,02066 In x T (5)

Sendo In = Indutor, e T = Tempo


Esta equação ilustra a relação entre essas duas variáveis (Indutor e tempo) e
a atividade enzimática da PG em (UA). Os dados obtidos geraram as superfícies de
resposta, conforme mostra a figuras 7ª e 7B.

Figuras 7A e 7B. 7A - Superfícies de respostas e 7B - Curva de nível, para a produção de PG de


Aspergillus niger ATCC 1004 por fermentação submersa do resíduo da laranja pera (Citrus sinensisL.
Osbeck)

49
Analisando os gráficos de superfície de resposta figura 7- A, pode-se observar
que o mesmo se apresenta como uma função quadrática de concavidade voltada para
baixo apresentando, um ponto de máximo.
A avaliação do modelo foi feita também através da ANOVA (Análise de
Variância), que estima a significância dos efeitos principais e das interações entre as
variáveis com nível de confiança de 95%. O teste F apresenta a razão entre o F
calculado e o F tabelado. Sempre que esta relação for maior que 1, a regressão é
estatisticamente significativa, havendo relação entre as variáveis independentes e
dependentes, estes dados são avaliados na Tabela 3. Pois para que uma regressão
seja não apenas estatisticamente significativa, mas também útil para fins preditivos, o
valor da razão deve ser no mínimo maior que 4. (SANTOS, 2008).
Conforme a Tabela 3, a partir do teste F de Fisher verifica-se que o F calculado
(9,4) foi superior ao F tabelado (9.01), para um nível de confiança de 95% o que
corresponde a um valor de p < 0,10. Esta sugere que o modelo é estatisticamente
significativo. O modelo não apresentou falta de ajuste significativo, tendo o valor de F
calculado (14.13) inferior ao valor de F tabelado (18.51), desta maneira a regressão é
significativa. O coeficiente de correlação (R2) 0,94 indica um ajuste adequado dos
resultados dos experimentos na resposta para a produção de PG por Aspergillus níger
ATCC 1004. O modelo não apresentar falta de ajuste, os resultados obtidos podem
indicar as tendências que levam a otimização do método (Novaes, 2017).
Tabela 3: Análise de variância (ANOVA) para atividade PG.

Fonte variação SQ GL MQ F F
Calculado Tabelado
Regressão 21.13476 5 4.226952 9.400 9.01

50
Resíduos 1.349 3 0.449667

Falta de Ajuste 1.18175 1 1.1819 14.132 18.51

Erro Puro 0.16725 2 0.08363


Total 22.48376 8

R2 0.94
2
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;F=Teste de Fisher; R =
Coeficiente de Determinação.

Após otimização da produção da PG, produzida pelo Aspergillus niger ATCC


1004 e a realização da caracterização enzimática para determinação das condições
ótimas de produção da Poligalacturonase. Foi realizada a validação da metodologia,
utilizando as condições avaliadas, as análises foram realizadas em triplicata tendo
como tempo de fermentação de 96 horas, com 06 g/L de indutor, para a medida da
atividade da PG utilizou-se a temperatura de 60°C com o pH 4 conforme os dados da
caracterização do pH e temperatura ótimos, levando-se em conta a termoestabilidade
da enzimática. A partir de tais parâmetros para produção enzimática, realizou-se a
leitura em espectrofotômetro obtendo-se uma atividade de 5,87 UA para a PG nas
condições ótimas de produção.
Analise do gráfico de Pareto, admitindo em um nível de confiança de 95%
demonstra que o tempo e a concentração de indutor foram quadraticamente
significativos, desta forma as duas variáveis investigadas influenciam no modelo.
Sendo assim, o modelo quadrático explica de forma significativa em relação ao
modelo linear para estes resultados. Para avaliar o modelo apresentado na figura 8,
foi utilizado o gráfico de regressão de valores preditos versos valores observados.

Figura 8: Diagrama de Pareto para atividade da PG

51
De acordo com o planejamento experimental adotado, as condições ótimas para
produção da PG foram com 96 h de fermentação e concentração de indutor de 0.6
mg, obtendo assim um valor predito de 8,47 UA. O valor predito foi validado através
de um experimento em triplicata encontrado um valor real de 8.77 UA, com um erro
experimental de apenas 3,54 %.

4 . 3 . 3 Caracterização Enzimática

4.3.3.1 pH x Temperatura

A t a b e l a 4 m o s t ra o Planejamento experimental Doehlert proposto para


avaliar o comportamento da PG produzida porAspergillus niger ATCC 1004 através
da fermentação submersa em função da variação do temperatura e pH. As respostas
são dadas pelas atividades da PG em valores reais e estatisticamente previstos.

Tabela 04: Matriz Doehlert usada para a otimização do pH e temperatura da PG de Aspergillus niger
ATCC 1004

UA
Ensaios Temperatura (°C) pH
52
Real Predito

1 +1(30) -1 (6) 1.913 ± 0.005 1.873

2 +1 (30) +1(4) 1.805 ± 0.001 1.846

3 +1 (50) +1 (7) 2.333 ± 0.015 2.374

4 +1 (50) +1 (5) 2.466 ± 0.015 2.370

5 0 (50) -0,866 (5) 2.354 ± 0.012 2.370

6 0 (50) 0 (5) 2.288 ± 0.013 2.370

7 0 (50) +0,866(3) 2.449 ± 0.010 2.409

8 -1 (70) -1 (6) 2.485 ± 0.021 2.445

9 -1 (70) +1 (4) 2.466 ± 0.020 2.507

Valores codificados e reais das variáveis independentes em função da variável temperatura e pH.

Um modelo polinomial de segunda ordem (com p <0,10) foi obtido através da


análise de regressão, de acordo com a eq. (6):

UA= +0,2028 -0,007292pH +0,005417pH2 +0,0728C -0,000519C2 -0,001113pHC (6)

Sendo: pH= a atividade hidrogênio iônica e C= a temperatura em °C.

Esta equação ilustra a relação entre essas duas variáveis independentes (pH e
temperatura) em relação a vareiavel dependente para atividade enzimática da PG em
(UA). Os dados obtidos geraram a superfície de resposta e o gráfico de curva de níveis
apresentados abaixo figura 9.

Figura 0 9 : Rendimento da atividade enzimática (poligalacturonase) produzido pelo Aspergilus Níger


em função da Temperatura e pH.

53
A) B)

Para avaliação de ajuste do modelo empregado, os resultados foram tratados


conforme análise de variância (ANOVA) ao nível de confiança de 95%. Conforme e
demostrado na Tabela 5, a partir do teste F de Fisher, verifica-se que o F calculado
(11.106) foi superior ao F tabelado (9.01), para um nível de confiança de 95% o que
corresponde a um valor de p < 0,10. Sugere que o modelo é estatisticamente
significativo. Desta forma, o modelo não apresentou falta de ajuste, tendo o valor de
F calculado (1.222) é inferior ao valor de F tabelado ( 18.51). O coeficiente de
correlação (R2) 0,94 indica um ajuste adequado dos resultados em relação aos
experimentos para a produção de poligalacturonase em pH4 com temperatura na área
em torno de 70°C.
Tabela 5: Análise de variância (ANOVA) para a atividade de temperatura x pH.
Fonte variação SQ GL MQ F F
Calculado Tabelado
Regressão 0.482792 5 0.096558 11.106 9.01

Resíduos 0.026082 3 0.008694

Falta de Ajuste 0.009894 1 0.009894 1.222 18.51

Erro Puro 0.016188 2 0.008094


Total 0.508874 8
2
R 0.94
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;
2
F=Teste de Fisher; R = Coeficiente de Determinação.

De acordo com o planejamento experimental adotado, as condições


ótimas para a máxima atividade da PG foram encontrada num pH 4.0 na

54
temperatura de 70 °C. Estes dados demonstram que a PG de Aspergillus niger tem
caráter ácido. Resultados similares de PG ácidas foram encontrados por Ahmed
(2016), em seu trabalho obteve um pH de 5,5 para pectinase suplementada com casca
de laranja, sob processo de fermentação submersa por Aspergillus niger. Outros
autores também produziram PG ácidas, tais como: Byrne, (2017) onde o mesmo
obteve um pH ótimo de 4 para PG de Aspergillus kawachii, cultivada em bagaço de
limão.
Sandri (2015), relata em seu estudo que valores de pH iniciais mais baixos (3,0
e 4,0) em 60°C resultaram em maiores atividades de poligalacturonase de Aspergillus
fumigatus. Mahesh (2016), obteve condições ideais para a produção de pectinase em
pH, 4,0 a temperatura 40 ° C para o Aspergillus ibericus. Desta forma, nota-se que o
fungo do gênero Aspergillus consegue produzir PG ácidas em variadas temperaturas.
Segundo Anand (2017), poligalacturonases microbianas tem seu pH ótimo na faixa
ácida, sendo utilizadas para extração e clarificação de sucos de frutas. Partindo deste
pressuposto, é notório que, fungos do gênero Aspergillus possuem a características
de produzir PGs ácidas.

4.3.3.2 Influência de Sais

O comportamento da PG de Aspergillus niger na presença de alguns íons (ou


sais) foi investigado utilizando sais de cloreto dos metais de Ca2+, Na+, K+, Fe2+ em
diferentes concentrações em tampão citrato-fosfato (pH 7, 0,05 mM). Os resultados
são expressos na Figura 10 abaixo:

Figura 1 0 : Influência dos sais em concentrações variadas.

55
A partir da análise da figura 10, percebe-se que, ocorreu um aumento superior
a 100% na atividade da PG com a adição de íons de Ca2+, conforme ocorre o
aumento da concentração deste íon. Barreto (2016), em sua pesquisa, conseguiu um
aumento de 94% da atividade da PG utilizando íons de Ca²+. Este fato se deve porque
os íons metálicos são considerados um cofator enzimático, atuando favoravelmente
com a enzima, estabilizando suas estruturas, evitando sua desnaturação, em outros
casos esses íons podem estimular ou mesmo inibir a atividade enzimática
(Lehninger, 2011; Silva, 2016; Rehman, 2015; Coutinho, 2017). Os íons metálicos
divalentes como o Ca2+, Zn2+ e Mg2+ estimulam a atividade do PG, provavelmente
estabilizando os grupos carboxilo negativamente carregados nas pectinas
(Prasanna, 2006).
Para os demais íons estudados, o gráfico demonstra que os íons Na+, em
qualquer concentração, não favoreceu significativamente a atividade enzimática nas
condições estudadas, apenas os íons de k+ na concentração de 0,05 mol/L e Fe2+
nas concentrações de 0,15, 0,20 mol/L possui uma influência na atividade da PG.
Desta maneira, o tipo de interação entre cátions e as enzimas é dependente de
cátions envolvidos (Rashad, 2010; Celus, 2017).

4.3.3.3 Termoestabilidade da PG

A termoestabilidade foi estudada incubando-se o extrato em diferentes


temperaturas (50°C, 60°C, 70°C ,80°C e 90°C) em determinados intervalos de tempo

56
(10, 20 e 30 min.), retirando-se alíquotas durante o tempo de incubação determinado.
As alíquotas retiradas foram submetidas a ensaios conforme descrito no item 4.2.6. A
partir da análise da figura11, é evidente que, até a temperatura de 70°C, a atividade
residual da PG manteve-se superior a 50%. Sendo que em temperaturas superiores
a 70°C a atividade da PG começa a declinar, conforme demostrado na figura 11. Desta
forma, a partir da análise destas temperaturas, esta enzima mostra-se termoestável
em uma temperatura em torno 70°C em um tempo de aquecimento de 30 min.
Outros pesquisadores obtiveram a produção de PG em temperatura próximas
a deste estudo, dentre os quais pode-se destacar: Ma, e col.(2017), em seus estudos
relata a produção de exo-poligalacturonase de Aspergillus niger SW06 com
estabilidade abaixo de 60º C. já Tounsi (2016), trabalhando com Penicillium occitanis
e Li (2017) realizando estudos com Talaromyces leycettanus, ambos obtiveram PG
termoestável com temperaturas em torno de 70° C. Desta maneira, a produção de
poligalacturonase com características termoestáveis é de grande interesse para a
indústria, por possuirem uma vasta aplicação nos processos de extração de sucos de
frutas e pasteurização de sucos, na indústria de processamento de material vegetal,
no processamento e desengomagem de fibras têxteis (Gomes 2007).

Figuras 1 1 : Termoestabilidade (atividade residual x tempo)

4.3.3.4 Parâmetros cinéticos (Km – Vmax)

57
A afinidade da PG pelo substrato utilizado foi avaliada através dos resultados
de Km e Vmax. A Figura 12, apresenta um gráfico de Lineweaver-Burk para a
determinação dos parâmetros cinéticos.

Figuras 1 2 : Gráfico de Km Vmax


0.3

0.25

0.2

0.15
1/UA

0.1

0.05

0
-50 0 50 100 150
-0.05
1/concentração

Os valores foram determinados como sendo Km = 0.088 (mg.mL-1) e Vmax =


55.248 (μmol / mL / min). Comparados com valores de outras PG como demostrado
no trabalho de Anand (2017), este encontrou o valor de Km para a PG purificada
produduzida por Aspergillus niger MTCC 48 foi de 2,3 mg / mL. Já Patidar (2017),
obteve uma PG de Aspergillus niger AN07 com valores de Km e Vmax de 2,6 mg/ml
e 181,8 μmol / ml / min, respectivamente (Patidar, 2017).
De Oliveira (2018), em seu Trabalho com PG produzida por Aspergillus
aculeatus e empregada em sucos de maçã e umbu, obteve o Km de 39,31 μmol / mL
e Vmax de 454,54 μmol / mL / min (De oliveira, 2018).
Partindo deste pressuposto, conclui-se que, a PG produzida por Aspergillus
niger ATCC 1004 apresentou uma afinidade considerável ao substrato em relação aos
descritos na literatura. Desta maneira, a mesma também demostra uma capacidade
de catalisar reações de forma mais favorável. Logo, a PG estudada pode ser aplicada
na indústria de alimentos e em especial para a clarificação e diminuição da
viscosidade de sucos de frutas. O gráfico com as constantes cinéticas foi determinado
conforme procedimento proposto por Lineweaver e Burk (1934). Conforme
apresentado na (figura 12), pode-se concluir que o mesmo segue os parâmetros
cinéticos para a produção de PG.

58
4.4 Purificação da PG

Os resultados da purificação da PG são mostrados na tabela 6 abaixo:

Tabela 6: Resultados obtidos na purificação da PG produzida por Aspergillus nigerATCC 1004.


Etapa de Proteínas Atividade Atividade Fator de Fator de
Purificação Totais Total (U) Específica Purificação Recuperação
(mg) (U/mg) (x) (%)

Extrato 6,54 2,66± 0,071 0,406±0,0076 - 100%


Bruto
Sulfato de 41,87 4,88 ± 0,17 0,116 ± 0,003 0.051 0.285%
amônia 70%

Gel Filtração 0,1414 1,30± 0,024 9,23 ± 0,64 1.633 22.73%


(Sephadex
G-100)

Nota-se uma variação acentuada entre os valores do extrato bruto, a porção


purificada por fracionamento com sulfato de amônio e a fração PG purificada com
Sephadex. Conforme apresentado na tabela 6, com a adição do sulfato, supõe-se ter
ocorrido uma concentração das possíveis enzimas presentes no meio, uma vez que
estas, podem interferir na leitura da PG, diminuindo desta forma a atividade especifica
de 0,406 U/mg (extrato bruto) para 0,116 U/mg (Extrato purificado com Amônia). Após
a purificação utilizando a cromatografia, pode ser observada que ocorreu um aumento
da atividade especifica da PG para 9,23 U/mg, com fator de recuperação de 22.73% .

4.5 Eletroforese

A amostra com atividade de PG, proveniente da etapa da purificação, foi


submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida. Este experimento demostrou que
o peso molecular aproximado da poligalacturonase produzida pelo Aspergillus níger
ATCC 1004 é de 45Kda, confome a unica banda apresentada na Figura 13.
A maioria das PG conhecidas do gênero Aspergillus foram relatadas como
tendo massas moleculares na faixa de 30 a 60 kDa, tais como as determinadas pelos
trabalhos com fungos: Aspergillus niger, com 30KDa (Ahmed, 2016), Aspergillus
japônicas, com peso de 38KDa (Semenova, 2003). Outras Poligalacturonases de
fungos filamentosos variados, apresentam massas moleculares em torno do mesmo
59
valor: Penicillium occitanis com 42 KDa (Sassi, 2016), Penicillium occitanis, entre 40
e 60 KDa (Tounsi, 2016).
Como demostrado na figura 13, o aparecimento de uma única banda de
proteína após a purificação comprova a homogeneidade da enzima e eficiência do
método cromatográfico de separação utilizado neste trabalho.

Figura 13: Eletroforese da poligalacturonase purificada de


Aspergillus níger ATCC 1004. Fonte: autor.

4.6 CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou o potencial para a produção da enzima


Poligalacturonase, produzida por Aspergillus níger utilizando o resíduo de laranja,
sendo o mesmo um material de baixo custo com alto valor agregado. O uso do
planejamento experimental do tipo Doehlert para a análise de superfície de resposta,
permitiu avaliar a quantidade adequada de indutor para o tempo ideal a partir da
fermentação submersa, tendo a máxima atividade de produção de PG por Aspergillus
níger ATCC 1004 no tempo ideal para otimização, nas condições ótimas em 30 ° C
com 120 Rpm em 96h com a concentração de indutor de 0.6 mg obtendo-se de 8.47
UA para a PG.
Quanto a caracterização da enzima PG, está mostrou possuir características
termoestáveis até 70°C, com o pH em torno de 4 com peso molecular de

60
aproximadamente 45KDa e uma afinidade considerável ao substrato, com valor de
Km = 0.088 (mg.mL-1) e Vmax = 55.248 (μmol / mL / min). Após a caracterização da
PG, foi realizada a purificação encontrando uma atividade específica no valor de 9,23
U/mg. Desta maneira, mostrando-se uma enzima com características satisfatórias
para uma aplicação no mercado, possuindo uma produção utilizando resíduos de
baixo custo e alto valor agregado.

61
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65
CAPITULO 5 - APLICAÇÃO DE POLIGALACTURONASE DE
ASPERGILLUS NIGER ATCC 1004 OBTIDA DO RESÍDUO DA
LARANJA (CITRUS SINENSIS L. OSBECK) PARA DIMINUIÇÃO DE
VISCOSIDADE DE POLPA DE UMBU (SPONDIAS TUBEROSA
ARRUDA CÂM)

Resumo
Este trabalhou avaliou a aplicação de enzimas para a redução da viscosidade da polpa
de umbu (Spondias tuberosa Arruda Câm), a enzima Poligalacturonase produzida por
Aspergillus níger ATCC1004, através da fermentação submersa, utilizando como fonte
de carbono os resíduos da laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck), e a enzima
comercial Pectinase (Sigma-Aldrich,São Paulo, Brasil). Para avaliação dos resultados
da viscosidade foi utilizado um planejamento experimental Doehlert contendo duas
variáveis e três repetições no ponto central, levando a um total de 9 experimentos. A
polpa de umbu utilizada como controle apresentou uma viscosidade de 2.190 cP, após
a aplicação da poligalacturonase purificada por sulfato de amônio, produzida por
AspergillusNiger ATCC 1004, ocorreu uma diminuição de aproximadamente 28,17%
na viscosidade (1.573 cP) em relação a polpa controle.

Palavras Chaves: Poligalacturonase, Polpa de umbu, viscosidade, Aspergillus


niger.

66
5.1 INTRODUÇÂO

As frutas tropicais representam uma ótima fonte de compostos bioativos, com


amplo mercado nacional e internacional de consumo, graças a seu valor nutricional e
terapêutico. No Brasil, existe uma grande variedade de frutas comestíveis, já que o
país é um dos três maiores produtores de frutas do mundo (Zeraik, 2016). Dentre as
principais frutas utilizadas para a fabricação de sucos e polpas, pode-se destacar, a
laranja, uva, abacaxi, goiaba, cajá, umbu, dentre outras variedades. Para a fabricação
de sucos, vários fatores são levados em conta, como afirma BRASIL (2000); tais como
composição, características físicas, químicas e organolépticas, higiene dentre outros.
Sucos de frutas são preparados de forma simples, obtidos a partir de simples
extração, sendo que alguns são turvos e viscosos devido à presença de
polissacarídeos como amido, pectina, celulose, hemiceluloses (Rosmine, 2017).
Polpa de fruta é o produto obtido por esmagamento das partes comestíveis de frutas
carnosas sem fermentação e diluição por processos tecnológicos adequados
(ANVISA, 2018).
O umbu possui sabor muito apreciado, pode ser consumido diretamente e é
usado para fazer sucos, sorvetes, doces, polpas, geleia e na forma da umbuzada
tradicional (polpa de frutas cozida com leite e açúcar) (Neto 2010; Lins, 2012). O IBGE
mostra um aumento de 12,6 % na produção do umbu no período de 2015/2016 (IBGE,
2018). Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) ocorreu o
crescimento da produção do umbu, sendo o estado da Bahia, considerado o maior
produtor nacional, tendo como destaque na produção baiana a cidade de Manoel
Vitorino situada no Sudoeste baiano (CONAB, 2018).
Alguns métodos convencionais de clarificação de suco envolvem filtração e
centrifugação simples (obtendo um suco clarificado, mas não estabilizado), agentes
de compensação como por exemplo o tratamento enzimático é considerado uma
abordagem alternativa para o beneficiamento da polpa, atuando como um passo
avançado na produção industrial de sucos (Cerreti, 2017). Sendo esta etapa
importante e necessária no processamento do suco de frutas para melhorar sua
aparência e comercialização para o mercado consumido (Yousefnezhad, 2017).
A pectina, polímero composto em grande parte por ácido galacturônico, sendo
um componente da parede celular vegetal, provavelmente o polissacarídeo estrutural

67
mais complexo da natureza (Paniagua, 2017). É responsável pela turbidez e
consistência do suco; provocando deste modo um aumento na viscosidade
prejudicando a clarificação e a filtração; desta forma, a degradação da pectina requer
a adição de enzimas pectinolíticas apropriadas para aumentar o rendimento da
clarificação do suco, reduzir a viscosidade e diminuir o tempo de filtração (Sassi,
2016).
As pectinases, em especial a poligalacturonase (E.C.3.2.1.15) são um grupo
enzimático envolvido na catálise e degradação da pectina durante as reações de
despolimerização e desesterificação, com a quebra das ligações α-1,4-glicosídicas do
ácido galacturônico, tendo uma aplicação comercial na produção de sucos de frutas
e vinhos, principalmente para clarear suco e melhorar a prensagem e extração de
suco de frutas e vegetais (Rajdeo, 2016; De Oliveira, 2018). Desempenham um papel
crucial para reduzir a viscosidade, aumentar o rendimento e estabilização do suco por
liquefação de polpas, remover as cascas (Garg, 2016).
Os produtos derivados de frutas (néctar, polpas concentradas, sorvete), são
constituídos por um sistema bifásico, compostos por partículas sólidas dispersas no
meio. Para controle e desenvolvimento de produtos beneficiados pela a indústria, a
obtenção das características reológicas é um fator relevante no controle de qualidade,
processo e concepção das linhas de processamento e desenvolvimento de novos
produtos nas indústrias de alimento (Bezerra, 2013; Rodrigues, 2016). O
comportamento reológico de produtos alimentares envolvendo diferentes
hidrocolóides, dentre este a pectina, tem sido estudado usando medidas reológicas
fundamentais, considerando o seu papel no ajuste da viscosidade e textura das
formulações de alimentos de um modo em geral (Cevoli, 2013).
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi investigar a aplicação da enzima PG
produzida por Aspergillus níger ATCC ATCC 1004, através da fermetação submersa
utilizando o residuo da laranja pera (Citrus sinensis L. Osbeck) para reduzir a
viscosidade da polpa de umbu (Spondias tuberosa Arruda Câm), comparando a
atuação da mesma em relação a enzima comercial (Sigma-Aldrich,São Paulo, Brasil).

5.2 MATERIAIS E MÉTODOS

5.2.1 Enzimas
68
Foi adquirida a enzima comercial Pectinase (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil)
para efeito de comparação com a poligalacturonase (PG) produzida por Aspergillus
Níger ATCC 1004 a partir do resíduo da laranja (Citrus sinensis L. Osbeck) a partir da
fermentação em fase submersa; ambas utilizadas para a aplicação em polpa de umbu,
utilizando a adaptação da metodologia para suco de uva aplicada por Rizzon, (2007)
para propor as concentrações enzimáticas.

5.2.2 Suco De Umbu (Spondias Tuberosa Arruda Câm)

Os umbus foram adquiridos em fazenda da região de Manoel Vitorino, região


Sudoeste da Bahia. Em seguida foram higienizados, em soluções à base de
hipoclorito de sódio, e a polpa de umbu foi preparada conforme Da Matta (2015),
conforme descrito na figura 14.

Figura 14: Etapas do processo de produção de polpa de fruta congelada. (Adaptado de Da Matta,
2015)

5.2.3 Planejamento Experimental e Otimização

Um projeto experimental Doehlert contendo duas variáveis, e três repetições


no ponto central, levando a um total de 9 experimentos conforme as Tabelas (1) e (2),
69
foi aplicado para avaliar os resultados de viscosidade. Os erros experimentais foram
avaliados no ponto central, sendo que os dados experimentais foram processados
usando o software STATISTICA 10.0. Todos os ensaios foram realizados em ordem
aleatória e em triplicatas.

5.2.4 Purificação (Fracionamento Com Sulfato de Amônio do Extrato


Enzimático)

O extrato enzimático bruto obtido foi levado a 70% de saturação por adição de
amônia sólido e deixado em overnight. Após o processo de overnight, o extrato foi
submetido levado a centrifugação em centrífuga (TECNAL) em 6000rpm por 15
minutos, em seguida o precipitado obtido foi resuspenso com tampão fosfato-citrato
pH 7. Em seguida foi feito a medida de açúcares redutores e proteínas totais.

5.2.5 Determinação da Viscosidade

Foram utilizados 30 ml de polpa de umbu para a realização dos ensaios, em


seguida adicionadas as frações determinadas pelo planejamento experimental
conforme as tabelas, estes foram homogeneizados no vortex (Tecnal, Electromagnetic
shaker – B-agit) em seguida colocas em banho maria (Cientec CT-266, Belo
Horizonte, Mg, Brasil) 60° C, durante o tempo determinado no planejamento
experimental. A interrupção da reação foi realizada com a submersão dos tubos em
banho Maria há 100 °C (SOLAB SL - 150/4ª, Piracicaba, SP, Brasil) por 5 minutos. Em
seguida as leituras da viscosidade foram realizadas conforme adaptação da RTIQ,
(Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade dos Produtos Lácteos -
PORTARIA 146/1996). Sendo utilizado para aferição da viscosidade uma rotação de
12 Rpm por 30 segundos com temperatura de 25 º C para medir a tensão de
cisalhamento em um viscosímetro, mostrado na figura 15, (Brookfield Digital
Viscometer DV-I Model LDVI+, Middleboro, Massachusetts, EUA). Foi utilizada a
enzima comercial Pectinase from Aspergillus Níger aqueous solution, purificada
(Sigma-Aldrich) como controle e a enzima produzida em laboratório a
poligalacturonase sintetizada por fungo filamentoso (Aspergillus Níger ATCC 1004).

Figura 15: Viscosímetro Brookfield

70
A redução da viscosidade foi expressa em % de redução, calculada com base
na medida da viscosidade (Visc) do suco controle (sem adição de enzima) e do suco
tratado (com adição de enzima), de acordo com a equação 6.

(6)

5.3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram realizados dois planejamentos experimentais para avaliação da redução


da viscosisdade da polpa de umbu. O primeiro planejamento experimental Doehlert
foi proposto para avaliar a redução da viscosidade da polpa de umbu (Spondias
Tuberosa Arruda Câm), com a aplicação da enzima comercial pectinase industrial
(Sigma-Aldrich) conforme apresentado na Tabela 7, com as respostas dadas pela
viscosidade cP (centipoise) em valores reais e estatisticamente previstos.

71
Tabela 7: Planejamento experimental para aplicação da pectinase comercial Sigma

Viscosidade (cP)
Ensaios Concentração (µl) Tempo (min)
Real Predito

1 +1(46) -1 (60) 1.173 ± 0.086 1.155

2 +1 (46) +1 (120) 1.047 ± 0.035 1.091


3 +1 (31) +1 (30) 827 ± 0.057 869
4 +1 (31) +1 (90) 814 ± 0.045 854
5 0 (31) -0,866 (90) 930 ± 0.057 854
6 0 (31) 0 (90) 820 ± 0.036 854
7 0 (31) -0,866 (150) 997 ± 0.078 954

8 -1 (15) -1 (60) 1.183± 0.050 1.141

9 -1 (15) +1 (120) 1.043 ± 0.040 1.084

Um modelo polinomial de segunda ordem (com p < 0.05) foi obtido através da
análise de regressão de acordo com a equação 1.

V= 1,941 -0,00629uL +0,001014uL2 +0,00297T -0,000016T2 -0,000010uLT (1)

Sendo uL= Concentração enzimática, e T=Tempo.

Os dados obtidos pelo planejamento geraram a superfície de resposta e o


gráfico de curva de níveis apresentados abaixo.

Figura 16: Superfície de resposta enzima Sigma, em função concentração enzimática e do tempo.

72
Analise do gráfico de Pareto para a Enzima Comercial na figura 17, admitindo
em um nível de confiança de 95%. Demonstra que a concentração de enzima
comercial (Sigma), foi quadraticamente significativo. Já o efeito do tempo, tanto linear
como quadrático foi insignificante. Deste modo, o modelo quadrático explica de forma
melhor do que o modelo linear para estes resultados.

Figura 17: Gráfico de Pareto Enzima Comercial

73
Para avaliação de ajuste do modelo empregado, os resultados foram tratados
seguindo a análise de variância (ANOVA). Conforme a Tabela 08, a partir do teste F
de Fisher verifica-se que o F calculado (11.027) foi superior ao F tabelado (9.013),
para um nível de confiança de 95% o que corresponde a um valor de p < 0,05. Sugere
que o modelo é estatisticamente significativo. O modelo não apresentou falta de ajuste
significativo, tendo o valor de F calculado (1.129) inferior ao valor de F tabelado
(18.51), desta maneira a regressão é significativa. O coeficiente de correlação (R²)
0,99 indica um ajuste adequado dos resultados do experimento em resposta a
aplicação da enzima industrializada Sigma na aplicação para a diminuição da
viscosidade da polpa de umbu.

Tabela 08: Análise de variância (ANOVA) para a atividade pectinase Sigma em função da
concentração x tempo.
Fonte variação F F
SQ GL MQ
Calculado Tabelado
Regressão
164478.000 5 32895.6 11.027 9.013
Resíduos
8949.000 3 2983
Falta de Ajuste
418.00 1 4818.000 1.129 18.512
Erro Puro
8531.00 2 4265.000
Total 173427.000 8

R² 0.99
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;
2
F=Teste de Fisher; R = Coeficiente de Determinação.

A partir dos resultados obtidos, observou-se que a maior redução de


viscosidade ocorreu na concentração de 31 µL da enzima comercial (Sigma-Aldrich),
obtendo um resultado significativo para a redução da viscosidade de (997 ± 0.078) cP,
em 150 minutos. A partir deste valor foi realizado o cálculo para determinação da %
de redução da viscosidade em comparação com a viscosidade controle de 2.190 cP
(polpa de umbu sem adição de enzima), ocorrendo uma redução de (54.47%). De
acordo com a figura 16, a região ótima ocorreu na concentração de 31µl (40 ppm).
Partindo destes resultados, verifica-se que ocorreu uma diminuição significativa na
viscosidade da polpa de umbu.
Outros pesquisadores como, Lachowicz (2018), fizeram um comparativo entre
enzimas comerciais, para aferição da diminuição de viscosidade do suco de arônia, a
74
maior diminuição de viscosidade foi com adição das enzimas Pectinex SMASH XXL
(76%), Pectinex BE XXL (70%), Opti EYXL (61%), Pectinex AFP L-4 (66%), e Pectinex
ULTRA SPL (60%), e a menor diminuição estava na amostra com Pectinex XXL (18%).
Já Gouvêa (2017), utilizou duas enzimas pectinolíticas comerciais, Pectinex Ultra SP-
L® e Rapidase TF®, para promover a redução dea viscosidade da polpa de umbu,
variando a concentração entre 100 e 300 ppm nas temperaturas de 35, 45 e 55 ° C,
sendo a viscosidade inicial da polpa de 84,8 mPa s, (84,8 cP) obteve um valor de 18,9
mPa s (18,9 cP) com a enzima Rapidase. Segundo o autor, a redução viscosidade
significativa, foi quatro vezes menor que a viscosidade original em 40 min de reação,
os tratamentos enzimáticos com Pectinex e Rapidase, nas diferentes concentrações
e temperaturas.
Machado (2016), em sua pesquisa com polpa de umbu, aplicando enzima
Pectofruit de Aspergillus niger, para diminuição da viscosidade nas concentrações de
8 a 24 ppm, com pH natural do umbu de 2.3 e com pH corrigindo para 3.5 e 4.5.
Encontrou uma maior redução no ph 2,3 de 3.7cP, segundo o autor, não foi encontrada
uma melhor condição entre os tratamentos, sugerindo que seja realizado um outro
delineamento utilizando parâmetros em maiores faixas de concentração de enzimas
e em temperaturas mais baixas, a fim de atingir o ponto ideal de condições ótimas
para a aplicação da enzima em estudo.

O segundo planejamento experimental Doehlert proposto para avaliar o


comportamento da enzima PG produzida por Aspergillus niger ATCC 1004 através da
fermentação submersa, foi proposto para avaliar a redução da viscosidade da polpa
de umbu (Spondias Tuberosa Arruda Câm) com a aplicação da enzima produzida em
laboratorio. Conforme apresentado na Tabela 09, com as respostas dadas pela
viscosidade cP (centipoise) em valores reais e estatisticamente previstos.

Tabela 09: Planejamento experimental para aplicação da PG, produzida por Aspergillus níger ATCC
1004. Valores para a determinação da viscosidade, codificados e reais das variáveis independentes em
função da variável concentração (µl) e tempo (min).

75
Um modelo polinomial de segunda ordem (com p < 0.05) foi obtido através da

Ensaios Concentração Tempo Viscosidade (cP)


Real Predito

1 +1(46) -1 (60) 1.537± 0.026 1.571


2 +1 (46) +1 (120) 1.663 ± 0.021 1.628
3 +1 (31) +1 (30) 1.810 ± 0.022 1.776
4 +1 (31) +1 (90) 1.573 ± 0.052 1.607
5 0 (31) -0,866 (90) 1.627 ± 0.049 1.607
6 0 (31) - 0 (90) 1.623 ± 0.034 1.607
7 0 (31) -0,866(150) 1.810 ± 0.022 1.720
8 -1 (15) -1 (60) 1.073 ± 0.021 1.337
9 -1 (15) +1 (120) 1.250 ± 0.024 1.217

análise de regressão de acordo com a equação 2.

V= 0,4150 -0,008322uL +0,000056uL2 +0,085660T -0,001127T2 -0,000031uLT (2)

Sendo uL= Concentração enzimática, e T=Tempo.


Os dados obtidos pelo planejamento geraram a superfície de resposta e o gráfico de
curva de níveis apresentados abaixo.

Figura 18: Superfície de resposta da poligalacturonase produzida por Aspergillus Níger ATCC 1004,
em função concentração enzimática e do tempo.

76
Analise do gráfico de Pareto na figura 19, admitindo em um nível de confiança
de 95%, demonstra as variáveis tempo e concentração de enzima PG produzida em
laboratório, foram quadraticamente significativos, ressaltando que a variável
concentração nos termos linear e quadrático foi significante. Desta forma as duas
variáveis investigadas influenciam no modelo proposto. Sendo assim o modelo
quadrático explica de forma melhor do que o modelo linear para estes resultados.
Figura 19: Gráfico de Pareto Enzima Laboratório

Para avaliação de ajuste do modelo empregado, os resultados foram tratados


seguindo a análise de variância (ANOVA). Os resultados para aplicação da
poligalacturonase produzida em laboratório por Aspergillus níger ATCC 1004 foram
avaliados conforme a Tabela 10, a partir do teste F de Fisher verifica-se que o F
calculado (17.812) foi superior ao F tabelado (9.013), para um nível de confiança de
77
95% o que corresponde a um valor de p < 0,05. Sugere que o modelo é
estatisticamente significativo. O modelo não apresentou falta de ajuste significativo,
tendo o valor de F calculado (7.349) inferior ao valor de F tabelado (18.51), desta
maneira a regressão é significativa. O coeficiente de correlação (R²) 0,96 indica um
ajuste adequado dos resultados do experimento em resposta a aplicação da
poligalacturonase produzida em laboratório na aplicação para a diminuição da
viscosidade da polpa de umbu.

Tabela 10: Análise de variância (ANOVA) para a atividade poligalacturonase produzida por Aspergillus
niger ATCC 1004 em função da concentração x tempo.
Fonte variação SQ GL MQ F F
Calculado Tabelado
Regressão
0.251 5 0.050 17.812 9.013
Resíduos
0.0084 3 0.00281
Falta De Ajuste
0.0066 1 0.0066 7.349 18.512
Erro Puro
0.00 2 0.00090
Total 0.259 8

R² 0.96
SQ=Somados Quadrados; GL=Graus de Liberdade; QM=Quadrado Médio;
2
F=Teste de Fisher; R = Coeficiente de Determinação.
.

De acordo com a superfície gerada, conforme a figura 17, para a aplicação da


PG produzida em laboratório, a região ótima para de diminuição da viscosidade
ocorreu na concentração de 31µl (40ppm) com o tempo 90 min, com viscosidade de
(1.573 ± 0.052). A partir deste valor foi realizado o cálculo para determinação da % de
redução da viscosidade em comparação com a viscosidade controle de 2.190 cP
(polpa de umbu sem adição de enzima), ocorrendo uma redução de (28.17%).
Este fato demostra que, está concentração influência para diminuição da
viscosidade, em comparação a pectinase comercial a PG produzida pelo fungo
Aspergillus niger ATCC 1004, demonstra-se satisfatória para a aplicação na indústria
de sucos e polpas. Ressaltando que esta PG foi apenas purificada pelo método de
adição de sulfato de amônio e o pH natural do suco de 2,4. De Oliveira (2018), em
seu trabalho com pectinase de Aspergillus aculeatus, aplicado em suco de maçã e
umbu obteve uma redução da viscosidade de 20,80 e 26,0%. Já Maktouf (2014),
aplicando pectinase Penicillium occitanis, em várias concentrações enzimáticas no
78
tratamento de suco de limão o obteve uma viscosidade de 4,7 mPa s equivalente em
Centipoise (4,7 cP).

5.4 CONCLUSÃO

A utilização de enzimas na indústria alimentícia é de suma importância para


o processamento de alimentos e bebidas de um modo em geral, uma vez que
durante o processo de produção o excesso de pectina pode influenciar tanto no
aspecto do produto como no processamento. Desta forma, a utilização de pectinase
(PG) em sucos auxilia tanto na diminuição da viscosidade quanto em seus aspectos
físico como, cor e textura. Partindo deste pressuposto, a busca por enzimas de baixo
custo é de suma importância, este estudo demonstrou o potencial para produção da
enzima Poligalacturonase, produzida por Aspergillus níger ATCC 1004 para a
aplicação na indústria de polpa de frutas.
A enzima comercial (Sigma-Aldrich), obteve um resultado significativo para a
redução da viscosidade de (54.47%) utilizando a concentração de 31µl no tempo 150
min em comparação a viscosidade controle (2.190 cP). Já a PG produzida em
laboratório, purificada pelo método de adição de sulfato de amônio; obteve uma
diminuição de viscosidade de (28.17%) utilizando a concentração de 31µl no tempo
90 min em relação a viscosidade controle. Fazendo um comparativo entre a PG
produzida em laboratório e a comercial, a enzima Poligalacturonase produzida por
Aspergillus níger ATCC1004, através da fermentação submersa, utilizando como fonte
de carbono os resíduos da laranja Pera (Citrus sinensis L. Osbeck), apresenta-se
como uma enzima promissora e que ainda pode ser estudada em trabalhos futuros,
tendo como foco outros processos de purificação mais eficiente outras possíveis
aplicações.
Esta enzima possui um processo de fabricação relativamente fácil,
demostrando um potencial satisfatório para sua aplicação, e possuindo um fator
benéfico, por utilizar os resíduos de baixo custo com alto valor agregado como
substrato que, em sua maior parte são descartados em lixos e aterros. A mesma pode
ser aplicada no mercado consumidor regional, tendo como exemplo as pequenas
indústrias de produção de polpa de frutas.

79
5.5 - AGRADECIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA, Coordenação de


Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro; UESB,
LABRA - Laboratório de Aproveitamento de Resíduos Agroindustriais (Campus
Itapetinga), Valedourado comércio e alimentos de Itapetinga, Laboratório
Forragicultura (Campus de Itapetinga), Laboratório de Farmacotécnica (Campus de
Jequié), Laboratório de Bioquímica, Prof. Mário Sergio (campus Jequié), Prof. Willian
responsável pelo Laboratorio de Ensaios de matérias (LABEM), e Colaboradores.

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