ISOLASI DNA GENOM PROKARIOT DAN EUKARIOT

A. Tujuan Praktikum
Mahasiswa dapat memahami teknik isolasi DNA genom manusia
(eukariot) dan genom bakteri (prokariot) dengan baik.

B. Dasar Teori
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat di dalam nucleus, mitokondria, dan kloroplas.
Perbedaan diantara ketiganya adalah: DNA nucleus berbentuk linear dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria
berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Dilihat dari
organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA
eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon, berbentuk sirkular
serta terletak di dalam sitoplasma karena sel tidak memiliki membran inti,
sedangkan DNA eukariot berbentuk linear, memiliki protein histon dan
terletak di dalam nucleus.
DNA juga dapat diisolasi, perbedaan struktur dan letak DNA pada sel
menjadi salah satu pertimbangan dalam memilih teknik isolasi DNA yang
tepat. Untuk DNA manusia, dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia
terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat,
protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbondioksida). Plasma
darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan
trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel
darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nucleus, dimana terdapat DNA
di dalamnya.
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan berada di atas. Teknik
sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam mesin sentrifugasi dengan kecepatan
yang bervariasi. Sedangkan pesipitasi dilakukan untuk menggumpalkan
materi yang akan dipisahkan sehingga mudah dipisahkan dengan sentrifugasi.
Secara umum, ada lima tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu:
1. Isolasi jaringan/sel
Pada tahap ini ditentukan jaringan atau sel yang akan diisolasi
DNAnya. Tahapan ini penting untuk menentukan teknik yang akan dipilih
untuk mengisolasi DNA.
2. Lisis dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membrane sel.
Dinding perlu dilisis jika ingin mengisolasi DNA dari organisme yang
memiliki dinding sel yang kompak seperti tumbuhan. Melisis dinding sel
dapat dilakukan secara mekanik seperti sinofikasi, tekanan tinggi,
menggerus, dan lain-lain. Sedangkan secara enzimatis dinding sel dapat
dilisis dengan menggunakan detergen keras seperti Triton-X atau Sodium
Deodecyl Sulfat (SDS).
3. Ekstraksi dalam larutan
Tujuan ekstraksi ini adalah untuk memisahkan DNA dari debris-
debris sel sisa proses lisis dinding dan membrane sel. Dapat dilakukan
dengan melakukan sentrifugasi, dimana protein dan sisa sel yang memiliki
berat molekul yang lebih besar akan menggumpal di bagian bawah sebagai
pellet dan DNA berada di dalam cairan sebagai supernatant,
4. Purifikasi
DNA dalam bentuk laturan supernatant masih mengandung protein.
Oleh karena itu, protein dihilangkan dengan cara mempurifikasi DNA
dengan menggunakan fenol atau proteinase yang akan mempresipitasi
protein. Juga dapat ditambahkan RNAse untuk menghilangkan RNA yang
ada dalam larutan. Selanjutnya DNA dan protein yang sudah terpresipitasi
dipisahkan dengan cara sentrifugasi. DNA berada dalam larutan
supernatant.
 5. Presipitasi DNA
Untuk mendapatkan DNA terkonsentrasi maka DNA dalam
supernatant tersebut dipresipitasi dengan menggunakan isopropanol.
Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya
tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pellet DNA pada dasar tabung
yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali.
Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-
pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali.
Hasil akhirnya adalah DNA yang terdapat pada tepi dasar tabung. langkah
akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk
melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi. DNA yang diperoleh siap
digunakan untuk langkah selanjutnya dalam proses rekombinan DNA.

C. Alat dan Bahan

1. Tabung ependorf 1.5 ml
2. Sentrifus
3. Mikro pipet
4. Tips
5. Ethanol 70%
6. Ethanol absolute
7. Bakteri Staphilococcus aureus
8. Pembakar Bunsen
9. Buffer TE
10. EDTA

D. Cara Kerja
1. Sebanyak 300-500 𝜇l TE buffer dimasukkan ke dalam tabung ependorf.
2. Masukkan 2-3 ose koloni bakteri ke dalam larutan TE buffer tersebut
3. Masukkan ependorf yang berisi suspensi bakteri ke dalam water bath
pada suhu 100℃ selama 15-30 menit untuk memisahkan DNA dan
menonaktifkan bakteri
4. Kemudian disenrifuge ada 12.000 rpm selama 1 menit
5. Selanjutnya supernatan yang mengandun DNA dipindahkan ke tabung
ependorf baru dan disimpan dalam suhu -20℃ sampai digunakan pada
tahap berikutnya.