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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

APOSTILA DE
AULAS PRÁTICAS

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
DE ÁGUA E ALIMENTOS

Profa. Dra. Sandra Maria Oliveira Morais Veiga


Prof. Dr. Luiz Carlos do Nascimento

ALFENAS
2018
NORMAS DE CONDUTA NO LABORATÓRIO

Laboratório – Análises microbiológicas e físico-químicas.


Normas: minimizar os riscos de contaminação: Alimentos/Amostras e Manipuladores

Normas Gerais:
1. Ocupar sempre o mesmo lugar.
2. Usar avental, touca, luvas, máscara, touca e sapato/tênis nas aulas práticas. Cabelos presos.
3. Guardar pertences no armário.
4. Não utilizar celular, adornos ou outras fontes de contaminação.
5. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: antes de iniciar os trabalhos práticos e após a realização dos
mesmos, retirar adornos e LAVAR AS MÃOS COM ÁGUA E SABÃO.
6. Lavar imediatamente quaisquer ferimentos provocados durante o trabalho.
7. Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver se contaminado; indicando o material ou a
cepa com a qual estava trabalhando.
8. Ter o máximo cuidado para que não ocorram acidentes e/ou auto-contaminações.
9. Observar rigorosamente o horário das aulas práticas.
10. Qualquer dúvida quanto à colocação dos materiais: forno, estufa, banho-maria etc. recorrer aos
professores ou aos funcionários da disciplina.
11. Contribuir com adequada organização do Laboratório e realizar os trabalhos práticos com dedicação
para um melhor aproveitamento.

Observações importantes:
➢ Nosso trabalho é realizado em equipe e, portanto, todos devem contribuir com o melhor de si, para
que possamos chegar a eficiência, ou seja, devemos trabalhar de forma inteligente e não exaustiva.
➢ Toda equipe precisa ser harmoniosa e se espelhar no voo dos gansos (solidariedade).

PROCEDIMENTOS ROTINEIROS:
1-Esterilização – uso de agentes físicos e/ou químicos para eliminar totalmente os organismos vivos
presentes em um material.
2-Desinfecção – uso de agentes químicos germicidas para destruição da infecciosidade potencial de
um dado material, não implicando, portanto, na eliminação total dos organismos vivos.
3-Ambiente asséptico - bico de Bunsen ou câmara de fluxo laminar

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LAVAGEM DAS MÃOS
I. INTRODUÇÃO
Mãos:
• 1848 Semmelweis – importância da lavagem das mãos.
• Microbiotas: Residente:
• Bactérias Gram+ (estafilococos coagulase negativa – Staphylococcus epidermidis)
• Localizam-se nas fendas das mãos, no interior do folículo piloso e principalmente, em
volta e sob as unhas
• Não são facilmente removidos
• São de baixa virulência (problemas com imunodeprimidos ou quando se realizam
procedimentos invasivos)
• Podem ser inativados por antissépticos
Transitória:
• Bactérias Gram- e o estafilococo coagulase positiva (S. aureus)
• Superfície da pele, junto às gorduras e sujidades (contaminantes)
• Micro-organismos passageiros e viáveis apenas por um curto período de tempo
• Esta microbiota é frequentemente responsável pelas infecções hospitalares e
contaminação de alimentos
• Pode ser reduzida com a lavagem básica das mãos.
Higiene das mãos
a) Lavar as mãos no início e fim dos trabalhos práticos.
b) Lavar as mãos após o contato com materiais contaminados, tendo utilizado ou não luvas.
c) Retirar adornos: anéis, pulseiras, relógios.

TÉCNICA

Lavagem básica:
a) Abrir a torneira
b) Ensaboar as mãos, punhos e antebraços, fazendo fricção por 30 segundos, especialmente entre
os espaços interdigitais e unhas.
c) Enxaguar com água corrente
d) Secar com papel toalha
e) Fechar a torneira com o próprio papel

Antissepsia:
Álcool 70% p/p ou 77% v/v, glicerinado, friccionando até secar espontaneamente.

II. OBJETIVO
Realizar a lavagem básica das mãos e antissepsia.

III. MATERIAL
Água corrente, sabão líquido e antisséptico ou degermante (PVPI), papel toalha.

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NORMAS PARA A COLETA DE AMOSTRAS DE ÁGUA

- Lavar as mãos.
- Utilizar EPIs (máscara, touca e luvas)
- Sempre que possível, verificar cloro (0,2 a 2,0 mg/L), pH (6,0-9,5) e turbidez (< 5,0 uT).
- Utilizar recipiente de boca larga, estéril, com capacidade para 250 mL.
- Não abrir os frascos até o momento da colheita.
- Colher assepticamente 200 mL da amostra.
- Os frascos para coleta de água clorada devem ser adicionados de tiossulfato de sódio (0,1 mL de solução
a 1,8% (2%) para cada 100 mL de amostra).
- Identificar a amostra.
- Transporte: caixa isotérmica, “tipo isopor”, com gelo.
- Tempo entre a coleta e o início das análises: até 24h para águas tratadas, 12h para águas não tratadas e
06 para águas muito poluídas (em refrigeração).
- Ideal: 02h.

Tipos de Coleta:
1 Torneira – Limpar a parte externa com etanol a 70% e flambar, deixar a água fluir por 2 a 3 minutos,
coletar a amostra assepticamente.
2 Reservatórios – utilizar o próprio frasco de coleta com auxílio de uma pinça de braços longos.

PIPETAGEM COM AUXÍLIO DE PERAS


I. INTRODUÇÃO
De acordo com as normas técnicas para prevenção da transmissão de doenças nos serviços de
saúde (Ministério da Saúde, 1989), as pipetas mecânicas ou eletrônicas devem ser usadas de rotina, não
sendo permitido pipetar material biológico com a boca.
Água e os alimentos não representam materiais biológicos, porém podem estar contaminados
com micro-organismos patogênicos.

II. OBJETIVO
Treinar pipetagens com auxílio de peras ou pipetas mecânicas (pipetador do tipo seringa).

III. MATERIAL
Pipetas, peras, béquer, água destilada e papel absorvente.

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ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA

1 - CONTAGEM DE AERÓBIOS MESÓFILOS


(CONTAGEM PADRÃO EM PLACA E SUBSTRATO DEFINIDO)

I. INTRODUÇÃO

➢ Antigamente – aspectos físicos.


➢ Avanços da bacteriologia – prova concreta de que a água poderia veicular doenças.
➢ Doenças causadas por agentes físicos, químicos e microbianos.
➢ Doenças infecciosas e parasitárias.
Via oral → cólera, febre tifoide, febre paratifoide
→ disenteria bacilar, disenteria amebiana
→ hepatite infecciosa, poliomielite, helmintose, Tuberculose.
Via cutânea → esquistossomose, leptospirose
→ conjuntivites, otites, micoses
➢ Ensaios:
➢ A pesquisa de agentes etiológicos → não é usual / problemas.
➢ Indicadores de contaminação:
➢ Indicadores químicos: NH3, NO2.
➢ Indicadores biológicos: algumas bactérias ou grupos.

Indicadores biológicos de contaminação da água:


1-Bactérias heterotróficas – aeróbias mesófilas
2-Coliformes totais e termotolerantes (fecais)
3-Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis) Má qualidade sanitária da água
4-Pseudomonas aeruginosa Perigo de infecção.
5-Clostrídios sulfito-redutores

CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS (AERÓBIOS MESÓFILOS)

Bactérias heterotróficas – utilizam nutrientes orgânicos e energia química derivada de reação de oxido-
redução.
Aeróbios mesófilos – micro-organismos heterotróficos aeróbios que crescem bem a uma temperatura
média de 35ºC.
• Indicam a qualidade microbiológica da água e alimentos.
• Número elevado é sinal que podem existir bactérias patogênicas na água ou alimento analisado.

Contagem de bactérias heterotróficas - determinação da densidade de bactérias que são capazes de


produzir unidades formadoras de colônias (UFC), na presença de compostos orgânicos contidos em meio
de cultura apropriada, sob condições pré-estabelecidas de incubação: 35,0, ± 0,5°C por 48 horas;

Importância da quantificação das bactérias heterotróficas na água:


• Acusa um aumento repentino do nº de micro-organismos presente num poço ou manancial.
• Verifica a eficiência do tratamento da água (etapas/todo).
• Completa as informações sobre a qualidade da água de um novo manancial.
• Deve ser realizada em 20% das amostras do S.A.A. (sistema de abastecimento de água) colhidas
mensalmente para a pesquisa de coliformes.
• O limite máximo aceitável é de 500 UFC/mL.
Excedidas 500 unidades formadoras de colônia (UFC) por mL, devem ser providenciadas
imediata recoleta, inspeção local e, se constatada irregularidade, outras providências cabíveis.

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II. OBJETIVO
➢ Realizar o exame bacteriológico da água através da:
Contagem Padrão em Placa e Substrato Definido.

1-CONTAGEM PADRÃO EM PLACA (CPP):

- Diluições seriadas 10-1, 10-2 e 10-3.


- Diluente: Água peptonada a 0,1% ou Salina a 0,85%.
- Inocular em profundidade por meio da técnica pour-plate em placas e adicionar o Ágar padrão ou
nutriente.
Depositar 1 mL do inóculo no centro da placa e adicionar 15 a 20 mL do meio de cultura
fundido e resfriado a 45ºC.
Realizar movimentos circulares, 8 a 10 vezes, a fim de homogeneizar o inoculo.
Esperar aproximadamente 15 minutos para solidificar o ágar.
Incubar as placas invertidas, em estufa bacteriológica a 35ºC/48h.
Proceder a leitura e interpretação das mesmas.

Material:
➢ Tubos de ensaios de tamanhos variados, placa de Petri, vidro com rolha esmerilhada para coleta
de água, pipetas, bico de Bunsen, água peptonada estéril (ou Salina estéril).
➢ Meio de cultura: Ágar para contagem padrão (PCA).

Método: Plaqueamento em profundidade (Pour-Plate).

▪ RESULTADO:

▪ CONCLUSÃO:


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2- TECNOLOGIA DO SUBSTRATO DEFINIDO
QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS – ÁGUA
SimPlate (IDEXX)

O SimPlate também pode ser utilizado para contagem de bactérias heterotróficas em água. Esta
metodologia baseia-se no do Substrato Definido, a qual detecta bactérias viáveis na água por meio de
enzimas sabidamente presentes nesses micro-organismos.
O SimPlate utiliza vários substratos combinados ao MUG para as múltiplas enzimas bacterianas,
que produzem fluorescência quando metabolizados pelas bactérias heterotróficas presentes na água.
A amostra e o sistema reagente são adicionados na placa SimPlate e incubados. Posteriormente,
a leitura é feita com o auxílio de uma lâmpada de UV, verificando as cavidades fluorescentes. O número
de cavidades fluorescentes deve ser correlacionado em tabela específica para a determinação do Número
Mais Provável de bactérias heterotróficas /mL de amostra analisada. A técnica SimPlate corresponde à
técnica da contagem padrão em ágar 35 – 37°C por 48 horas de incubação.
Material:
• Tubos com o substrato definido para • Incubadora
amostras de 10 mL • Lâmpada UV (365nm e 6 Watts)
• Placas SimPlate estéreis • Tabela específica
• Pipetas de 10 mL
Procedimento de análise:
1-Adicionar 10 mL de amostra ao tubo contendo o meio de cultura;
2-Transferir o conteúdo do tubo para o centro da placa SimPlate;
3-Fechar a placa e fazer movimentos circulares a fim de espalhar a amostra nas cavidades. Bolhas nas
cavidades não interferem no resultado;
4-Inverter a placa e incubar a 35ºC por 48 horas;
5-Após 48 horas, retirar as placas da incubadora e contar as cavidades fluorescentes, colocando uma
lâmpada de UV 365 nm sobre a placa;
6-Observar a contagem correspondente na tabela de conversão. Essa tabela é utilizada para corrigir a
contagem em função do volume inicial de amostra, já que descartamos o excesso da mesma com o
meio de cultura no algodão absorvente da placa.
Observações:
1-Os procedimentos devem seguir técnicas assépticas;
2-Amostras contendo cloro devem ser tratadas com tiossulfato de sódio;
3-Caso seja necessário, os resultados podem ser lidos até 72 horas depois de iniciado a análise;
4-Depois da incubação, as placas podem conter bactérias viáveis, portanto devem ser esterilizadas;
5-Caso necessário, as amostras podem ser diluídas antes da análise, desde que se obtenha um volume
final de 10 mL para se transferir para os tubos. O resultado lido na tabela deverá, portanto, ser
multiplicado pelo inverso da diluição realizada;
6-O resultado obtido na tabela já está ajustado para 1 mL da amostra. Portanto, o resultado é o NMP/mL
de amostra, com ou sem diluição.

III. RESULTADO:

IV. CONCLUSÃO:

1. No tubo de ensaio com o meio SimPlate for HPC, adicionar 10mL da amostra de água. Tampar
e agitar para dissolver.
2. Colocar o conteúdo do tubo no centro da placa do SimPlate.
3. Fazer movimentos circulares, até que preencha todos as cavidades.
4. Inclinar a placa mais ou menos 120º, para verter o excesso no algodão absorvente.
5. Inverter a placa e incubar durante 24-48 h, 35±0,5 ºC.
6. Contar o número de cavidades que apresentar fluorescência sob lâmpada de U.V.
7. Consultar a tabela de N.M.P. do SimPlate, para encontrar o número de UFC de bactérias
heterotróficas/mL de água.

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2 - PESQUISA QUALITATIVA DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES

Bacteriologia convencional para coliformes totais e termotolerantes:


Ensaio presuntivo, prova de confirmação, prova completa.

Enterobactérias
Coliforme (fermentador)
Não fermentador
Bethesda Ballerupi

1. Coliformes
coliformes totais (bactérias do grupo coliforme) - bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios
facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presença de sais
biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35,0 ±
0,5 °C em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima ß -galactosidase. A maioria das
bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter,
embora vários outros gêneros e espécies pertençam ao grupo;
coliformes termotolerantes - subgrupo das bactérias do grupo coliforme que fermenta a lactose a 44,5
± 0,2°C em 24 horas; tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente
fecal;
Escherichia coli - bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol, com produção de ácido
e gás a 44,5 ± 0,2°C em 24 horas; produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, não hidrolisa a
uréia e apresenta atividade das enzimas ß galactosidase e ß glucoronidase, sendo considerada o mais
específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos;

Vantagens:
➢ Encontram-se normalmente no intestino do homem e de animais de sangue quente (são eliminadas
regularmente).
➢ Apresentam-se nas excretas, na proporção de 300 milhões de bactérias por grama.
➢ Apresentam-se em alta prevalência no esgoto, sendo prontamente isoladas em águas, recentemente
poluídas por matéria fecal.
➢ São de fácil cultivo e identificação.
➢ Os testes necessários são de baixo custo.
➢ São mais resistentes na água que as outras bactérias patogênicas provenientes das fezes.
Desvantagem:
➢ Reside na existência de coliformes termotolerantes (fecais) e ambientais, que devem ser
diferenciados através de provas complementares.

Etapas da pesquisa:
Ensaio presuntivo para coliformes totais (Teste de Presença ou Ausência)
Caldo lauril sulfato triptose ou Caldo lactosado (enriquecimento)
Falso (+) bastonetes aeróbios Gram  do gênero Bacillus
Bastonetes anaeróbios Gram  do gênero Clostridium
Leveduras e fungos filamentosos
Sinergismo microbiano.
Ensaio confirmativo para coliformes totais:
Meios seletivos e indicadores (Caldo lactosado Biliado Verde brilhante, Teague ou EMB e ENDO)
Prova para coliformes termotolerantes (meios seletivos)
Caldo E.C. ou C.L.A.B.
Repicar as colônias do Teague ou ENDO, ou 1 a 2 alças de platina do C.L.B.V.B. para o E.C. e incubar
em B.M. a 44,5º C por 24h.
Dos coliformes, só os de origem fecal desenvolvem e produzem gás.

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II- OBJETIVO:
➢ Realizar o ensaio presuntivo, confirmativo e completo para coliformes totais e termotolerantes
(fecais) e deste modo, avaliar possível contaminação da água por matéria de origem fecal.

III- MATERIAL E MÉTODO:


➢ Caldo lactosado, Caldo Lauril Sulfato Triptose, Caldo Lactosado Biliado Verde Brilhante, Endo-
C Ágar, Teague e Caldo E.C.
➢ Método: Fermentação da Lactose e características das colônias.

Caldo Lactosado OBS : Atualmente, utiliza-se o Caldo lauril


Extrato de carne...................................3-5g sulfato triptose (Caldo LST)
Peptona ................................................... 5g Meio rico que facilita o crescimento de
Água destilada .................. ...............1000 mL micro-organismos. Oferece a Lactose como
Lactose: 1% fonte de carbono, e ainda o lauril sulfato que
Aquecer para dissolver, ajustar pH a 7,4 ou 7,6 e inibe consideravelmente a microbiota
filtrar. acompanhante.
Distribuir em tubos e esterilizar em autoclave a
121ºC - 20'.
Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2% (*Este meio já é fornecido desidratado)
Peptona especial .................................10g Modo de preparo: dissolver 40g em 1 litro
Lactose ...............................................10g de água destilada. Autoclavar a 121ºC por
Bile bovina dessecada ........................20g 20'. Depois de esfriar, distribuir nos tubos.
Verde brilhante ............................0,0133g

Endo-C Ágar
Peptona de carne ................................10g Sulfite de sódio .................................2,5g
Lactose ...............................................10g Fucsina básica ...................................0,4g
Ágar..................................................20,0g
Teague ou EMB
Ágar simples ............................... 100 mL Preparar uma solução de lactose a 10% e
Lactose ...............................................1g* acrescentar ao meio depois de pronto.
Eosina 2% ....................................... 2 mL Modo de preparo: autoclavar a 121ºC por 20’.
Azul metileno 0,5%......................... 2 mL Distribuir em tubos.

CaldoE.C.
Triptose ......................................................... 20g Modo de preparo: dissolver 37g em um
Lactose ............................................................ 5g litro de água destilada e autoclavar a 121ºC
Sais biliares .................................................. 1,5g por 20 minutos. Distribuir em tubos. pH
Fosfato dipotássico .......................................... 4g final 7,2.
di-hidrogenofosfato de potássio ................... 1,5g Observação:
Cloreto de sódio .............................................. 5g Na falta do caldo E.C., é possível substituí-lo pelo
Este meio é fornecido desidratado. Caldo Lactosado Ácido Bórico.

Caldo Lactosado Ácido Bórico (substitui o E.C.)


Proteose peptona ........................................... 10g Modo de preparo: depois de adicionado em
Lactose ............................................................ 5g 1 litro de água destilada, autoclavar a
Fosfato ácido de potássio (K2HPO4) ............ 3,5g 121ºC por 20’. Distribuir em tubos com o
Fosfato biácido de potássio (KH2PO4) ......... 1,5g tampão manchado de azul, para que possa
Ácido bórico ............................................... 3,25g ser diferenciado do Caldo Lactosado
Simples.

RESULTADO: CONCLUSÃO:

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3 IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTÉRIAS (PRESUNTIVO).

I – IMVIC (Provas Presuntivas de Identificação).


1- Água de peptona
– Indol → Avalia a capacidade da bactéria em decompor o Aminoácido triptofano e produzir o Indol
que é relevado pelo Reativo de Kovaks, dando cor rosada ou vermelha ao meio (anel do
indol).

– H2S → Avalia a capacidade da bactéria em produzir H2S através da utilização de substratos que
contém enxofre. É revelado pelo precipitado negro que se forma no papel impregnado de
acetato de chumbo, acoplado a tampa rosqueada.
2- Clark Lubs (Caldo Glicosado)
– VM / VP → Cultiva-se a bactéria em caldo glicosado (Clark Lubs) por 4 dias a 37º C e pelas
reações de VM e VP determina-se qual a via utilizada pelas bactérias para
metabolizar a glicose:
➢ fermentação ácido mista → VM
ácidos + vermelho de metila → vermelha (VM +)
➢ fermentação butileno – glicolítica → VP (Voges Proskauer)
Acetoína (neutra) + alfa naftol + KOH → vermelho fluorescente → “diacetila”.
3- Citrato de Simmons
- Citrato → Avalia a capacidade da bactéria em utilizar o citrato como única fonte de “C”. Esta
bactéria precisa dispor da enzima citrato permease.
O Citrato é transportado para dentro da célula e vai ser intermediário no ciclo de Krebs:

Citrato permease
Citrato Ác. pirúvico e CO2

CO2 + Na → Na2CO3
do meio Alcaliniza o meio

Verde → Azul

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Meios de Cultura e Reagentes
01 – Água de Peptona:
Peptona .................................................. 15g
Cloreto de sódio ....................................... 5g
Água destilada ................................ 1000 mL
Ajustar o pH entre 7,4 e 7,6. Distribuir em tubos e esterilizar a 121º C durante 15 minutos.
02 – Meio de Clarck & Lubs.
Peptona ................................................. 0,5g
Fosfato monoácido de potássio ............. 0,5g
Água destilada .................................. 100 mL
Autoclavar a 120º C durante 15 minutos. Deixar esfriar e acrescentar e 5 mL de solução de
glicose a 10 % previamente esterilizada por filtração. Distribuir o meio em tubos de ensaio em
porções de 10 mL.
03 – Ágar Citrato de Simmons. (Este meio é fornecido desidratado).
Fosfato biácido de amônio ...................... 1g.
Fosfato monoácido de potássio ............... 1g.
Cloreto de sódio ...................................... 5g.
Citrato de sódio ....................................... 2g.
Sulfato de magnésio ............................. 0,2g.
Azul de bromotimol ............................ 0.08g
Ágar....................................................... 15g.
Água destilada ............................... 1000 mL
Fundir o ágar na água destilada. Dissolver os outros componentes e acertar o pH em 6,9.
Distribuir o meio em tubos de ensaio em volume suficiente para uma placa de Petri. Autoclavar
a 121º C por 15 minutos.
04 – Soluções de Barrit “A” .
Alfa naftol ............................................... 5g.
Álcool etílico absoluto ....................... 95 mL
05 – Solução de Barrit “B”.
Hidróxido de potássio ........................... 40g.
Creatina ................................................ 0,3g.
Água destilada ................................. 100 mL
Dissolver o hidróxido de potássio na água destilada.
06 – Solução de Vermelho de Metila
Vermelho de metila ............................... 0,1g
Álcool etílico 95 % .......................... 300 mL
Água destilada ................................. 200 mL
Dissolver o vermelho de metila no álcool. Acrescentar a água destilada.
07 – Reativo de Kovacs.
Álcool amílico.................................... 75 mL
p-dimetilaminobenzaldeído...................... 5g
Ácido cloridrico concentrado ................. 25g
Dissolver o p-dimetillaminobenzaldeído no álcool amílico e, a seguir acrescentar o ácido
cloridrico.
08 – Tira de Papel de Filtro impregnada com solução saturada de Acetato de Chumbo.
Preparar uma solução saturada de acetato de chumbo;
Colocar as tiras de papel de filtro em uma placa de Petri grande e molhar as mesmas com a
solução de acetato de chumbo.
Levar a placa com as tiras para secar na estufa a 37º C.
Transferir as tiras secas para um vidro com tampa de baquelite rosqueável (vidro de maionese).
Autoclavar a 121º C por 15 minutos.

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II - Outros meios: Meios c/ multiprovas bioquímicas
Pessoa e Silva, BacTray e API 20E

No Pessoa e Silva ou Rugai modificado:


Técnica: Com a agulha de platina longa picar a colônia suspeita. A seguir, introduzir no tubo, de
modo a perfurar a camada de separação até atingir o meio de cultura inferior do tubo. Voltar a
semear em estrias na superfície inclinada do meio, tampar o tubo com o seu próprio tampão de
algodão, incubar por 18-24h a 35-37º C. Após a incubação, proceder a identificação comparando o
tubo com o quadro padrão de reações. Pode-se observar:
➢ Produção do indol ➢ Produção de H2S
➢ Fermentação ou não da glicose e sacarose ➢ Desaminação do L – triptofano
➢ Produção de gás ➢ Descarboxilação da L – Iisina
➢ Hidrólise da Ureia (urease) ➢ Motilidade

Meio de Pessoa e Silva

API
BACTRAY

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4 CONFECÇÃO DE LÂMINAS E COLORAÇÃO DE GRAM

I. INTRODUÇÃO
O Método de Gram tem como princípio a composição da parede celular bacteriana.
Bactérias Gram positivas (roxas) – espessa lâmina mucopeptídica (retém o iodopararrosanilina).
Bactérias Gram negativas (vermelhas) – fina lâmina mucopeptídica e grande quantidade de lipídeos
(retém a coloração de fundo).

II. OBJETIVO
➢ Preparar as lâminas e proceder a coloração de Gram, a fim de comprovar morfológica e
tintorialmente os micro-organismos isolados.

III. MATERIAL
➢ Lâminas, suportes para lâminas, alças de platina, bico de Bunsen.
➢ Corantes: Cristal Violeta Fenicada, Lugol, Álcool a 95º C, Fucsina Diluída.

MÉTODO: GRAM
➢ Corar 1 minuto com sol. de Cristal violeta fenicada.
➢ Escorrer o corante e cobrir com lugol durante 1minuto.
➢ Lavar a lâmina em um filete de água corrente.
➢ Diferenciar com álcool absoluto a 95º (tempo delicado).
➢ Lavar em um filete água corrente.
➢ Corar o fundo rapidamente com fucsina diluída (1/10).
➢ Lavar, secar e examinar.

CORANTES:
Cristal Violeta Fenicada: (Seg. Nicolle).
Cristal violeta (ou violeta genciana) ........ 1g
Álcool a 95º................................. .......10 mL
Fenol fundido ........................................... 2g
Água destilada .................................. 100 mL
Dissolver num Gral o corante no álcool. Adicionar aos poucos o ácido fênico, misturando sempre,
de modo a obter uma mistura bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral.
Filtrar após 24 horas de repouso.
Sol. de Lugol:
Iodo .......................................................... 1g
Iodeto Potássio ......................................... 2g
H2O destilada ................................... 300 mL
* Dissolver os dois sais normalmente com a água.
Fucsina Fenicada (seg. Ziehl).
Fucsina Básica ......................................... 1g
Álcool a 95º............................................ 10g
Fenol Fundido .......................................... 5g
H2O destilada ................................... 100 mL
OBS: Compras: dar preferência para corantes não preparados a partir de fenol.

RESULTADO

CONCLUSÃO

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5 PESQUISA QUANTITATIVA DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES

5.1- COLIMETRIA

Determinação do Número Mais Provável de coliformes totais em 100 mL de Água (N.M.P.)

I. INTRODUÇÃO
Este método baseia-se no conhecimento do tipo de distribuição das bactérias suspensas num
líquido e na teoria das probabilidades. O resultado (NMP) sai em função da combinação matemática do
número de tubos positivos em cada diluição. Na tabela de Hoskins esses cálculos já estão prontos e basta
comparar a combinação encontrada.
Limite de confiança: 95%.

A presença de coliformes na água indica poluição ou contaminação.


A ausência é evidência de água bacteriologicamente segura.

Lembretes:
Água com cloro residual: tiossulfato de sódio a 10% (0,1 mL/100 mL de H2O).
Água com metais pesados: EDTA a 15% (0,3 mL/100 mL de H2O);

Legislação brasileira: Portaria Consolidada n. 5/MS/2017, anexo XX (antiga Portaria 2914 de


dezembro de 2011)

II. OBJETIVO:
Colimetria: Determinar o número mais provável de coliformes totais e termotolerantes (fecais) em
100 mL de água.

III. MATERIAL:
Bateria de 15 tubos de ensaio com tubos de Durhan, pipetas, bico de Bunsen e vidro com tampa
esmerilhada para coleta de água.
Meio de cultura: Caldo Lactosado Biliado Verde Brilhante (como alternativa, poderá ser utilizado
o Caldo Lauril Sulfato MUG, que detecta E. coli, pela formação de fluorescência).

Método: Fermentação dos tubos múltiplos

IV. RESULTADO:

V. CONCLUSÃO:

Observação: o modo de preparo do meio de cultura utilizado nesta prática já se encontra descrito em
aulas anteriores.

17
Após verificar os tubos de Caldo Lactosado Biliado Verde Brilhante, repicar os tubos com resultado
positivo (turvação e produção de gás) em Caldo EC. Incubar a 44,5ºC, em banho-Maria, por 24h.
Verificar o número de tubos positivos neste meio e prosseguir com a determinação do NMP/100 mL
na mesma Tabela de Hoskins.

18
TABELA DE HOSKINS

Tubos NMP/ Tubos NMP/ Tubos NMP/ Tubos NMP/ Tubos NMP/ Tubos NMP/
positivos 100mL positivos 100mL positivos 100mL positivos 100mL positivos 100mL positivos 100mL
10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 <1.8 1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23
0 0 1 1.8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31
0 0 2 3,8 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76
0 0 5 9 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 35 5 0 5 95
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46
0 1 2 5,5 1 1 2 8 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 63
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 36 5 1 4 110
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49
0 2 1 5,5 1 2 1 8 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 94
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 55 5 3 4 210
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 26 4 4 2 47 5 4 2 220
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430
0 5 0 9,7 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920
0 5 4 17 1 5 4 29 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81 5 5 5 >1600

19
5.2-MEMBRANA FILTRANTE

I. INTRODUÇÃO

A técnica da filtração em membrana torna possível a determinação mais rápida das densidades
de coliformes, utilizando maiores volumes de amostras do que no caso dos tubos múltiplos de
fermentação. O processo fornece um resultado direto da concentração de bactérias, ao invés de uma
estimativa matemática.
Neste método, realiza-se uma filtração a vácuo, utilizando-se de membranas de filtro porosa, na
qual as bactérias ficam retidas e serão cultivadas quando aderidas às placas com meios de cultura
adequados.
Poro da membrana: 0,45m / Bactérias: 0,8 a 11m
Após a incubação, verifica-se o número de UFC/100 mL de água analisada.
Pode ser realizado para os coliformes totais e para os Estreptococos fecais.
O método tem grande utilidade na vigilância da água tratada.

* LIMITAÇÕES PARA O MÉTODO:

- Presença de turbidez (algas e outros materiais capazes de interferir na filtração).


- Interferência de grande número de micro-organismos que não seja do grupo coliforme.

* VANTAGENS:

- Maior precisão que o N.M.P. (resultado direto);


- Maior sensibilidade, permitindo examinar volumes maiores de água que o N.M.P;
- Resultado em tempo mais curto;
- Filtração da amostra no campo e envio da placa já com a membrana para o laboratório de referência.

II. Objetivo

Realizar o exame bacteriológico, qualitativo e quantitativo da água através da técnica da


membrana filtrante.

III. MATERIAL E MÉTODO


Filtros de acetato de celulose, portas filtros, equipamentos para filtragens a vácuo (bomba de
vácuo), placas de millipore, placa de Petri comum, vidro c/ rolha esmerilhada p/ coleta de água, pinças,
lamparinas, álcool e membrana filtrante.
Meios de cultura: ENDO-C-AGAR ou E.A.M. (Teague)= Cor Roxa / vinho acastanhado
Enterococcus Agar = Cor Branco Amarelado (Estreptococos fecais).

MÉTODO: Filtração à vácuo e bacteriologia.

Observação importante: Sempre que mudar a amostra de água exame, deve-se lavar o porta-filtro c/ água
destilada quente ou de preferência, utilizar outro porta-filtro, já esterilizado (Autoclave ou Ultravioleta).

20
21
MEIOS DE CULTURA:
01 – Endo-C-Agar: Modo de preparo, em aulas anteriores.(ou Teague )

02 – Enterococus Agar:
Triptose ................................................. 20 g
Extrato de levedura ................................. 5 g
Dextrose .................................................. 2 g
Fosfato dipotássico.................................. 4 g
Azida sódica ........................................ 0,4 g
Ágar....................................................... 10 g
2,3,5-cloreto trifenil tetrazólio .............0,1 g
* Este meio nos é fornecido desidratado:
Modo de Preparo: Dissolver 42 g. em um litro de água destilada, aquecer em B.M. até ebulição. Após
dissolvido, ajustar pH = 7,2, distribuir em placas.
Observação: Após o crescimento das colônias e interpretação dos resultados, deve-se confeccionar
lâminas (Gram), a fim de confirmar os resultados encontrados.

IV. RESULTADO:

IV. CONCLUSÃO:

Observações:

Finalidades da Pesquisa do Grupo Coliforme


1- Fazer o controle de qualidade de águas destinadas:
a) ao abastecimento público (sem ou com simples desinfecção, ou após tratamento convencional);
b) à irrigação de hortaliças e plantas;
c) à recreação de contato primário (natação, esqui-aquático, mergulho);
d) à piscicultura e a ostreicultura;
e) à dessedentação de animais,
f) ao abastecimento industrial (alimento, medicamento),
g) ao abastecimento de serviços de saúde e de alimentação.
2 – Fazer o acompanhamento do ponto de vista bacteriológico, dos sistemas: produtor, distribuidor, de
reservação e da rede de distribuição.
3 – Para localizar focos de contaminação e realizar sua consequente eliminação.

Finalidades da pesquisa do grupo Enterococcus:


Estreptococos (Streptococcus faecalis ou Enterococcus faecalis)
➢ Cocos Gram (+), geralmente ocorrem aos pares ou em cadeias curtas, crescem bem na presença
de sais biliares, suportam bem a temperatura de 45ºC, produzem ácido a partir de glicose,
lactose e do manitol.
Vantagens:
➢ Fazem parte da microbiota intestinal normal
➢ Técnicas de cultivo são simples e de baixo custo
➢ Não se multiplicam de ordinário, fora do intestino
➢ Confirmam a origem fecal do coliforme
➢ São mais resistentes a ação do cloro.
Desvantagem: Estão no intestino, em número inferior ao dos coliformes

22
5.3- SUBSTRATO CROMOGÊNICO DEFINIDO (COLILERT- IDEXX)

Metodologia do Substrato Cromogênico para a determinação do número mais provável de


coliformes totais e E. coli, semelhante à técnica descrita no Standard Methods for Examination of
Water and Wastewater, 22ª edição.

I- Introdução:
O teste para coliformes através do substrato cromogênico utiliza substâncias cromogênicas
hidrolisáveis para a detecção de enzimas dos coliformes.
Quando a técnica cromogênica é usada, o grupo coliforme é definido por todas as bactérias
possuidoras da enzima B-D-galactosidase e capazes de quebrar o substrato cromogênico. Ao contrário
dos métodos de fermentação da lactose que permitem o crescimento de muitos micro-organismos
aeróbios e eliminam ou suprimem alguns não coliformes por meio de substâncias químicas inibitórias,
esta técnica contém nutrientes que são mais seletivos e específicos para crescimento de coliformes. O
teste pode ser usado qualitativa ou quantitativamente e é atualmente, o 3º método de escolha para a
determinação de coliformes totais, dependendo da origem da amostra.

II- Princípio:
Substratos cromogênicos, tal como o orto-nitro-fenil-B-D-galactopiranosídeo (ONPG), são
usados para detectar a enzima B-D -galactosidase, a qual é produzida por bactérias coliforme totais. A
enzima B-D-galactosidase hidrolisa o substrato (ONPG) e produz a mudança de cor, o que indica e
comprova um teste positivo dentro de 24 a 28 horas.
OBS: Bactérias não coliformes, tal como Aeromonas sp e Pseudomonas sp, que produzem pequenas
quantidades da enzima, são suprimidas e não produzirão uma resposta positiva dentro de 28 horas, a
menos que estejam presentes mais que 10.000 UFC/mL de amostra.

Meio de cultura e seu mecanismo:


O Sistema Colilert (IDEXX) é composto pelos substratos definidos como ONPG- MUG.

▪ Nutrientes para coliformes totais (ONPG):


• Açúcar: B-D-galactopiranosídeo
• Enzima: B-D-galactosidase
• Radical orgânico cromogênico: orto-nitro-fenil.
▪ Coliforme Total: hidrólise do ONPG, liberando o orto-nitro-fenol que apresenta coloração amarela;

▪ Nutrientes para E. coli (MUG):


• Açúcar: B-D-glucuronídeo
• Enzima: B-D-glicuronidase
• Radical orgânico cromogênico: 4-metil-umbeliferil
▪ E. coli: hidrólise do MUG, liberando o 4-metil-umbeliferone que produz fluorescência.

III- Aplicações:
O teste é recomendado para as análises de água tratada e água natural. Inicialmente, os
laboratórios planejaram usar esse procedimento, procurando determinar se havia reprodutibilidade,
quando comparado aos testes padrões, obtendo resultados satisfatórios.

IV- Interferentes:
Água natural contendo matéria orgânica ou apresentando cor: deve-se comparar as cartelas
incubadas com cartelas contendo apenas a amostra.
OBS: Não se usa o teste substrato cromogênico para identificar culturas presuntivas de coliformes ou
colônias coliformes da membrana filtrante, porque o substrato pode ser parcialmente metabolizado pelo
inóculo com produção de pequena quantidade de B-galactosidase produzida por não coliformes,
causando falso positivo.

23
▪ V- Material:
▪ Seladora Quanti-Tray;
▪ Cartelas Quanti-Tray:
• 51 cavidades: faz contagem direta até 200,5 NMP;
• 97 cavidades de dois tamanhos: faz contagem direta de até 2419 NMP.
▪ Frasco estéril de 100 mL para coleta de água;
▪ Frasconete com meio de cultura desidratado (contendo substrato ONPG-MUG);
▪ Incubadora a 35º C;
▪ lâmpada UV (365nm e 6 Watts);
▪ Tabela específica.

VI- Técnica:
▪ Adicionar o conteúdo dos frasconetes (Colilert) em 100 mL da amostra;
▪ Agitar o frasco no mínimo25 vezes para homogeneizar micro-organismos, flagelos que poderiam
estar aderidos ao frasco;
▪ Passar a mistura (100 mL da amostra + Colilert) para a cartela;
▪ Introduzir a cartela contendo a mistura na seladora para a selagem;
▪ Incubar a cartela por 24 a 28 horas a 35º C;
▪ Fazer a leitura sob luz natural e lâmpada UV.

VII- Resultados:
Célula transparente na cartela = Negativo para coliformes Totais e E. coli
Célula amarela na cartela = Positivo para coliforme total
Célula Fluorescente na cartela = Positivo para E. coli

VIII- Vantagens do Método Colilert através da Cartela:


▪ Tempo de manipulação: 2 minutos;
▪ Detecção simultânea para coliforme total e E. coli;
▪ Resultados prontos em 24 horas;
▪ Resultados fáceis de serem interpretados e não necessitam de confirmação;
▪ Detecção de um único organismo em 100 mL de amostra;
▪ Recupera as bactérias lesadas e estressadas.

IX- RESULTADO:

X- CONCLUSÃO:

24
25
26
6 EXAME BACTERIOLÓGICO DOS UTENSÍLIOS DE MESA E DAS MÃOS

I. INTRODUÇÃO
Muitas vezes adquirimos doenças através dos utensílios que utilizamos e/ou dos manipuladores
de alimentos.
Por isso são muito importantes: Educação Sanitária, Legislação e fiscalização.
Mãos e utensílios fazem parte da cadeia esquemática de transmissão de doenças.

Micro-organismos Mãos
oriundos das Profissionais de saúde/
• vias aéreas Manipuladores de alimentos DOENÇAS
• excretas Artigos
• pele Superfície, equipamentos e Utensílios de mesa

Mãos:
• 1848 Semmelweis – importância da lavagem das mãos.
• Microbiota:
Residente: bactérias Gram, que não são facilmente removíveis, entretanto podem ser reduzidas por
antissépticos. Localizam-se nas fendas das mãos, no interior do folículo piloso e principalmente em volta
e sob as unhas. São de baixa virulência. (problema: imunodeprimidos em procedimentos invasivos)
Transitória: bactérias Gram  e o estafilococo, que são passageiras e viáveis apenas por um curto período
de tempo. Superfície da pele, junto às gorduras e sujidades (contaminantes). Esta microbiota é
frequentemente responsável pelas infecções hospitalares e pode ser reduzida com a lavagem básica das
mãos.

Profilaxia das doenças veiculadas pelas mãos:


➢ Educação sanitária e treinamento
➢ Exame de saúde
➢ Observação da GMP, regras básicas de higiene pessoal e do meio ambiente (lavagem das mãos, uso
de luvas, acondicionamento e destino correto do lixo...)
Lavagem das mãos:
➢ Básica: água corrente e sabão
➢ Básica + antissepsia: água corrente e sabão; antisséptico ou degermante.
Materiais necessários:
• Sabões; Sabonete; Sabão/sabonete antimicrobiano (barra pequena); Sabão líquido
• Antissépticos
• Água corrente (torneiras sensíveis a aproximação, de único toque, acionadas com o joelho)
• Papel toalha
• Lixeira com pedal
➢ Antissépticos
a. Soluções degermantes:
• PVPI a 10% (1% de iodo livre).
• Clorexidina a 4% (4% de álcool etílico)
b. Soluções alcoólicas para antissepsia das mãos
• Álcool iodado a 0,5% ou 1%, com ou sem 2% de glicerina
• Álcool etílico a 77% v/v, com ou sem 2% de glicerina

27
LAVAGEM DAS MÃOS NA ÁREA DE PRODUÇÃO DE ALIMENTOS:

Para higienização das mãos nas áreas de processamento de produtos crus e cozidos, são
necessários:
▪ Sabonete líquido + antisséptico ou degermante
▪ Papel toalha
▪ Lixeira com pedal
▪ Torneira com água potável.

Frequência:
Os funcionários devem lavar as mãos sempre que:
▪ Chegar ao trabalho
▪ Utilizar sanitários
▪ Tossir, espirrar, assoar o nariz
▪ Utilizar panos de limpeza
▪ Fumar
▪ Recolher lixo e outros resíduos
▪ Tocar em sacarias, caixas, garrafas e sapatos
▪ Tocar em alimentos não higienizados ou crus
▪ Pegar em dinheiro
▪ Houver interrupção do serviço
▪ Ao iniciar um novo serviço
▪ Antes de tocar em utensílios higienizados
▪ Antes de colocar luvas
Técnica:
Lavar mãos e antebraços, friccionando-os por pelo menos 1 minuto.

PROCESSAMENTO DE UTENSÍLIOS DE MESA:

➢ Padrões americanos (EUA/Canadá) - é permitido no máximo 100 bactérias/utensílio de mesa.


➢ Profilaxia – técnicas.
• Lavagem com água e sabão
• Enxágue
• Desinfecção dos utensílios
• Física: calor – água fervente ou a 80°C por 15’
Máquina de lavar louças:
Lavagem: 55 a 65°C
Enxágue: 80 a 90°C.
• Química
Cloro a 1% por 30’ e enxágue
Cloro a 0,02% por 60’ e secar.
Álcool 70% - friccionar e deixar secar espontaneamente.

OBJETIVOS:
Verificar a presença de contaminação bacteriana nas mãos e utensílios de mesa através do exame
bacteriológico dos mesmos.
Avaliar a importância da lavagem correta das mãos.

II. MATERIAL
Utensílios de mesa, mãos de voluntários, tubos de ensaios e de Durhan, estantes, estufa a 37ºC, pipetas,
tubos com 9 mL de água destilada fosfatada estéril, placas de Petri, zaragatoa estéril, béquer, tubos de
ensaio com 4 mL de água tamponada fosfatada estéril e bico de bunsen.

28
Meios de cultura: Ágar Simples, Caldo Lactosado ou LST e Caldo Glicose Azida.

(PCA) Ágar para a contagem padrão e Caldo Lactosado – preparo – aulas anteriores

Caldo Glicose Azida


Extrato de carne....................4,8g
Peptona ..................10g
Caseína…………………15g
Glicose………………….7,5g Obs: acrescentar púpura de bromocresol.........0,013g
NaCl................................7,5
Azida sódica...................0,2g
Se os Estreptococos estiverem presentes – ocorre turvação do meio com viragem de cor (roxo-
amarelo) e surgimento de precipitado branco. Para dar continuidade pode-se utilizar do caldo etil violeta
azida.

Método: diluição seriada, fermentação e plaqueamento em profundidade.

III. RESULTADO

IV. CONCLUSÃO

29
30
COLETA E PREPARO DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS PARA EXAME
MICROBIOLÓGICO
1-Coleta da amostra:
-Constitui a primeira fase da análise do produto.
-Planejar a coleta/remessa de acordo com a possibilidade do laboratório de executar as análises.
-Colher as amostras, sempre que possível, em sua embalagem original, e em quantidade nunca inferior
a 200g ou 200 mL por unidade amostral.
-Na impossibilidade de atender o item anterior, a colheita de amostra deve ser feita em condições
assépticas.
-Deve-se proceder à limpeza e a desinfecção da embalagem do alimento a ser analisado, com solução de
álcool iodado ou outro desinfetante, abrangendo uma área que alcance pelo 10cm da extremidade da
abertura.
-O acondicionamento da amostra, quando retirada de sua embalagem original, deve ser feito em
recipiente íntegro, previamente esterilizado e identificado, capaz de resguardar de qualquer alteração.
-As amostras devem ser mantidas em condições que impeçam o desenvolvimento de micro-organismos,
sem, contudo, impedir que estes continuem viáveis até o momento da análise. Assim, os alimentos
deterioráveis devem ser mantidos sob refrigeração e os de baixa atividade aquosa (desidratados) em
lugar seco e fresco.
2-Tipos de amostras
Amostra indicativa: é a amostra composta por um número de unidades amostrais inferior ao
estabelecido em plano amostral constante na legislação específica.
Amostra representativa: é a amostra constituída por um determinado número de unidades amostrais,
estabelecido de acordo com o plano de amostragem.

3 Retirada da amostra
Todo o material a ser utilizado para a retirada da amostra deverá estar estéril, seja por calor seco
(estufa a 180ºC / 2 horas), seja por calor úmido (autoclave a 121ºC / 15 minutos).
Todos os procedimentos de análise devem ser efetuados em condições assépticas (Capela de
Fluxo Laminar ou próximo de um bico de bunsen com a chama a meia altura.

4 Preparo das diluições


No preparo de diluições sucessivas podem ser utilizados diversos diluentes, tais como: soluções
de salina peptonada, citrato de sódio, ou salina a 0,85% estéril. Para obtenção da diluição inicial (1/10)
procede-se da seguinte forma:
• Retirar assepticamente porções de 25g ou 25 mL da amostra, colocando-se em
homogeneizadores esterilizados.
• Adicionar 225 mL do diluente escolhido.
• Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida.
• Posteriormente realizar diluição 1/10, 1/1000.....1/1000000.

5 Soluções diluentes
5.1 Solução salina a 0,85%
Cloreto de sódio 8,5g
Água destilada 1000 mL
5.2 Solução salina-peptonada
Para todas as Soluções:
Cloreto de sódio 8,5g Dissolver os componentes em água
Peptona 1,0g destilada, distribuir em frascos com volumes
Água destilada 1000 mL apropriados e esterilizar em autoclave a 121ºC /
1.3 Solução de citrato de sódio 15min.
Citrato de sódio 12,5g
Água destilada 1000 mL

31
DILUIÇÔES SUCESSIVAS DE AMOSTRAS

32
ANÁLISE DO LEITE

I. INTRODUÇÃO
1. Leite: conceito: Denomina-se leite sem outra especificação, o produto normal, fresco, integral,
oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem
alimentadas e descansadas, excluindo o leite de retenção e o colostro.
Leite de retenção: o produto de ordenha, a partir do 30º dia antes do parto.
Colostro: o produto da ordenha obtido após o parto.

2. Classificações:
➢ Cru: aquele que não foi submetido ao todo ou em parte às operações habituais de processamento
(filtração, refrigeração, congelamento ou pré-aquecimento)
➢ Pasteurizado: submetido à filtração, aquecimento, refrigeração, incluindo técnicas para o
transporte e distribuição ao consumo.
• Pasteurização lenta: aquecimento 63-65ºC – 30’ resfriamento brusco*
• Pasteurização curta duração: aquecimento 72-75ºC - 15-20” e resfriamento brusco entre 2 e
5ºC e envase logo em seguida.
➢ Esterilizado (UHT): O leite homogeneizado e submetido a 130 - 150°C por 2 a 4”, resfriado a
32°C e envasado assepticamente em embalagens estéreis e hermeticamente fechadas. Conserva
por 4 a 6 meses.
➢ Desidratado- pó.

2.1 Classificação do leite pasteurizado (Instrução Normativa n.62/2011/MAPA):


➢ Tipo A (granja leiteira): a legislação prevê, para a produção deste tipo de leite uma série de
recomendações, dentre as quais, o padrão bacteriológico de aeróbios mesófilos que deve ser de
até 10.000 UFC/mL antes da pasteurização e de n = 5; c = 2; m = 5,0x102 M = 1,0x103 UFC/mL
após, sendo que os Coliformes e Salmonella devem estar ausentes.
➢ Leite pasteurizado: o padrão bacteriológico deve ser de até 600.000 UFC/mL antes da
pasteurização (até 30/06/2015). Após a pasteurização:
Contagem Padrão em Placas (UFC/mL) n = 5; c = 2; m = 4,0x104; M = 8,0x104
Coliformes, NMP/mL (30/35oC) n = 5 ; c = 2 ; m = 2; M =4
Coliformes, NMP/mL(45oC) n = 5; c = 1; m = 1;M = 2
Salmonella spp/25mL n = 5; c = 0; m= ausência

Obs.: veja legislação ANVISA - Resolução 12 de 02/01/2001.

3. Composição do leite:
O leite de vaca possui as seguintes proporções:
Água ...................................................... 87%
Carboidratos ......................................... 4,9%
Lipídeos................................................ 3,9%
Proteínas............................................... 3,2%

Além de vitaminas (B1, B2, niacina, B6, B12, ácido pantotênico, ácido fólico, inositol, ácido
ascórbico, A, K, E), sais e íons inorgânicos (Ca, Mg, K, PO4, citratos, Cl-, SO4-2), lactatos,
bicarbonatos; gases (CO2, O2, nitrogênio), hormônios, enzimas (catalase, peroxidase, fosfatase etc.)
e elementos em traços (Ba, Sr, Mn, Al, Zn, B, Cu etc.).

*
Coxiella burnetti – bactéria intracelular - causa febre Q (febre, dores musculares, cefaleia, pneumonite intersticial, mal-
estar - endocardite) – leite contaminado ou inalação.
33
4. Microbiota Bacteriana normal:
Quando o leite deixa o úbere do animal sadio, o produto contém poucas bactérias, que não vão
desenvolver se o leite for obtido e conservado de modo correto. Esta Microbiota é constituída pelos
micro-organismos existentes no úbere clinicamente sadio. Ex.: Streptococcus, Corynebacterium,
além do Lactobacillus, Micrococcus.
A microbiota patogênica do leite varia de acordo com o grau de contaminação e as fontes
contaminantes, inclusive o próprio animal doente. Teoricamente o leite, por sua composição e suas
propriedades físico-químicas, apresenta condições de albergar vários agentes patogênicos e constitui um
importante veículo de transmissão de doenças. Bactérias do esterco, solo, poeira e da água podem
contaminar o leite, principalmente na ordenha manual.
A obtenção higiênica do leite é de fundamental importância porque os micro-organismos
contaminantes utilizam seus componentes e deixam metabólitos em troca.

5. Vias de contaminação do leite:


O leite contém micro-organismos oriundos do interior do úbere da vaca e contaminantes
provenientes de fontes diversas durante a produção e a manipulação.
Muitos micro-organismos são inócuos à saúde e muitos deles são mesmo utilizados em indústria
de alimentos. Outros, como os provenientes de contaminação externa ou de doenças do gado podem
causar doenças no homem ou alterar significativamente a composição do leite determinando o
aparecimento de acidificação, odores indesejáveis, espessamentos etc.
A obtenção higiênica do leite é de capital importância, mesmo quando ele se destina à parte do
seu valor nutritivo, porque os micro-organismos presentes utilizam dos seus componentes e deixam em
troca seus produtos metabólicos.
a) Animal doente ou portador de sujidades.
b) Ordenhador (despreparo quanto aos cuidados higiênicos; ser ele também, doente ou portador). O
ordenhador deve ser pessoa que preze a limpeza e portadora de ficha de sanidade, vestir roupa limpa
e usar avental e gorro branco. As mãos e antebraços devem ser lavados com água e sabão antes da
ordenha, bem como trazer unhas aparadas e não fumar.
c) Meio ambiente inclui aqui todos os fatores que possibilitam a introdução de micro-organismos no
leite relacionados com o meio ambiente tais como, poeiras, vasilhames mal cuidados, água de má
qualidade usada nas lavagens, moscas, terra, esterco, pelos, transporte de latões e equipamentos não
higienizados.

6. Acidificação do Leite.
A decomposição do leite se dá quase que exclusivamente pela ação das bactérias de contaminação
que mesmo com a pasteurização ainda sobrevivem na ordem de 0,1 % da contagem inicial.
O que ocorre é que o leite vai acidificando até coagular. Em geral, a microbiota causadora da
decomposição do leite não é patogênica para o homem; no entanto, não devemos esquecer das brucelas,
M. tuberculosis, Streptococcus grupo A, Staphylococcus aureus e dos bacilos diftéricos que podem estar
presentes em número suficiente para vencer nossas resistências orgânicas.
A acidez do leite para consumo deve apresentar entre 15º a 20º Dornic (º D) (pH = 6,6 a 6,8)
➢ Acidez superior a 20º D- leite ácido (Constituição alterada – microbiota bacteriana)
➢ Acidez Inferior a 15ºD – leite alcalino (adulterado com água).

7. Densidade.
➢ A densidade normal varia de 1.028 a 1.034.
A densidade aumenta com a desnatagem e diminui com a aguagem.
➢ A densidade deve ser corrigida para 15º C.
Ex.: Leitura de 1.026 a 12º C
15 – 12 = 3 x 0,2 = 0,6 → 1.026-0,6 = 1.025,4
Leitura de 1.026 a 30º C
30 – 15 = 15 x 0,2 = 3,0 → 1.026 + 3,0 = 1.029

34
8. Fiscalização
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
DIPOA – Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal
RIISPOA – regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Anima,
incluindo os decretos 1812/96; 2244/97.
Instr. normativa nº 51, de 18/09/2002 Regulamento técnico de produção, identidade e qualidade do
leite.
Instr. Normativa nº 62, de 2011, do MAPA (altera a Instr. Normat. 51/2002/MAPA).

Ministério da Saúde
ANVISA - Resolução Nº 12, de janeiro de 2001.

RIISPOA – Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal


Artigo 475 – conceito.
Denomina-se leite, sem outra especificação, o produto normal, fresco, integral, oriundo da ordenha
completa e ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas.

Artigo 476
Considera-se leite normal, o produto que apresenta:
1. Caracteres normais;
2. Teor de gordura mínimo de 3% (três por cento);
3. Acidez em graus Dornic entre 15-20ºD (quinze e vinte);
4. Densidade a 15ºC (quinze graus centígrados), entre 1.028 e 1.034;
5. Lactose – mínimo de 4,3% (quatro e três décimos por cento);
6. Extrato seco desengordurado – mínimo 8,5% (oito e cinco décimos por cento);
7. Extrato seco total – mínimo –11,5% (onze e cinco décimos por cento);
8. Índice crioscópio mínimo -0,55º (menos cinquenta e cinco graus centígrados);
9. Índice refratométrico no soro cúprico a 20ºC (vinte graus centígrados) não inferior a 37º Zeiss.

Artigo 543
Considera-se fraudado, adulterado ou falsificado o leite que:
1. For adicionado de água;
2. Tiver sofrido subtração de qualquer dos seus componentes, exclusive a gordura nos tipos “C” e
“magro”;
3. For adicionado de substâncias conservadoras ou de quaisquer elementos estranhos à sua composição;
4. For de um tipo e se apresentar rotulado como de outro de categoria superior;
5. Estiver cru e for vendido como pasteurizado;
6. For exposto ao consumo sem as devidas garantias de inviolabilidade.

Artigo 517
Entende-se por pasteurização o emprego conveniente do calor com o fim de destruir totalmente a
microbiota patogênica sem alteração sensível da constituição física e do equilíbrio químico do leite, sem
prejuízo dos seus elementos bioquímicos, assim como de suas propriedades organolépticas normais.

35
EXAME BACTERIOLÓGICO DO LEITE
CONTAGEM DE AERÓBIOS MESÓFILOS E COLIMETRIA

I- INTRODUÇÃO

b)Contagem total de aeróbios mesófilos:


Quando se juntam um inóculo de leite com certa quantidade de determinado meio de cultura em
uma placa de petri e se incuba esta placa num período de tempo e temperatura de incubação adequados,
surgirão colônias de micro-organismos que poderão ser contadas.
Utiliza-se o leite em diluições decimais crescentes para que as colônias cresçam bem separadas,
facilitando assim, a contagem.
Esse é o método considerado mais exato para avaliar o conteúdo bacteriano total do leite, embora
seja caro, demore bastante (24 a 48 h de incubação das placas) e exija pessoal técnico treinado.

c)Determinação quantitativa do grupo de Coliformes:


Consiste em detectar na amostra do leite, determinado grupo de bactérias – os Coliformes que
podem ser de origem fecal.
No Brasil, a Colimetria é feita apenas no leite pasteurizado a fim de se avaliar a eficiência da
pasteurização bem como os cuidados higiênicos e sanitários da indústria.
Uma amostra de leite colhida no varejo, que apresenta uma contagem de bactérias alta e número
elevado de Coliformes, pode significar o seguinte:
➢ leite não foi corretamente pasteurizado
➢ leite foi corretamente pasteurizado, mas a conservação posterior foi inadequada em relação a
temperatura e/ou tempo (distribuição/armazenamento)
➢ leite foi corretamente pasteurizado, mas a contagem inicial do produto cru era excessivamente
alta.
➢ leite foi pasteurizado corretamente, mas ocorreu uma recontaminação nos processos finais de
empacotamento.

II- OBJETIVO
Determinar o N.M.P. de Coliformes totais e realizar a contagem total dos mesófilos para a amostra
de leite dada.

III- MÉTODO
Método: Descoramento do azul de metileno; diluição seriada, fermentação dos tubos múltiplos e
desenvolvimento de colônias.
Técnica: ver ilustração.

IV- RESULTADO

V- CONCLUSÃO

36
37
TABELA DE NMP (Alimentos em geral)

NMP por grama ou mililitro de amostra


Semeando porções de 1 – 0,1 – 0,01 em cada tubo

Nº de tubos positivos Nº de tubos positivos


NMP NMP
1,0 0,1 0,01 1,0 0,1 0,01
0 0 0 0,0 2 0 0 0,91
0 0 1 0,3 2 0 1 1,4
0 0 2 0,6 2 0 2 2,0
0 0 3 0,9 2 0 3 2,6
0 1 0 0,3 2 1 0 1,5
0 1 1 0,61 2 1 1 2,0
0 1 2 0,92 2 1 2 2,7
0 1 3 1,2 2 1 3 3,4
0 2 0 0,62 2 2 0 2,1
0 2 1 0,93 2 2 1 2,8
0 2 2 1,2 2 2 2 3,5
0 2 3 1,6 2 2 3 4,2
0 3 0 0,94 2 3 0 2,9
0 3 1 1,3 2 3 1 3,6
0 3 2 1,6 2 3 2 4,4
0 3 3 1,9 2 3 3 5,3
1 0 0 0,36 3 0 0 2,3
1 0 1 0,72 3 0 1 3,9
1 0 2 1,1 3 0 2 6,4
1 0 3 1,5 3 0 3 9,5
1 1 0 0,73 3 1 0 4,3
1 1 1 1,1 3 1 1 9,5
1 1 2 1,5 3 1 2 12,0
1 1 3 1,9 3 1 3 16,0
1 2 0 1,1 3 2 0 9,3
1 2 1 1,5 3 2 1 15,0
1 2 2 2,0 3 2 2 21,0
1 2 3 2,4 3 2 3 29,0
1 3 0 1,6 3 3 0 24,0
1 3 1 2,0 3 3 1 46,0
1 3 2 2,4 3 3 2 110,0
1 3 3 2,9 3 3 3 >110,0
Fonte: Manual de análises microbiológicas de alimentos. 1.ed. FDA – Washington.

38
CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

Os fungos e leveduras provocam alterações nos alimentos de origem animal e vegetal,


principalmente quando armazenados à temperatura ambiente. É importante relatar que alguns gêneros
de fungos como, por exemplo, os Aspergillus, além de danos físico-químicos nos alimentos, podem
causar também problemas sérios para a saúde dos homens e animais, pois são responsáveis pela produção
de Aflatoxinas.
Fungos filamentosos e leveduras são capazes de se desenvolverem em produtos com baixa
atividade de água (0,80 e 0,88). Algumas leveduras são osmofílicas e alguns fungos filamentosos são
xerofílicos, sendo capazes de se multiplicarem em produtos com menor atividade de água (cerca de
0,62); o grupo, portanto, é de importância em alimentos conservados pelo uso do açúcar, do sal e
desidratados.
Estes micro-organismos crescem dentro de uma ampla faixa de pH (2,0 e 8,5), tornando o grupo
importante também para produtos ácidos (frutas e produtos de frutas, conservas ácidas, vegetais
fermentados e outros).
A temperatura ótima de crescimento está entre 25 e 30°C. Espécies psicrotróficas, especialmente
de fungos filamentosos, são problemas como deteriorante de produtos refrigerados e congelados (carnes
e derivados e produtos de laticínio).
Em decorrência da atividade pectinolítica e celulolítica de muitas espécies de fungos
filamentosos, este grupo está frequentemente associado à deterioração de vegetais.

Fungos filamentosos (bolores)


São multicelulares e obtém sua alimentação de matéria orgânica inanimada ou nutrem-se, como
parasitas de hospedeiros.
Estão bem difundidos na natureza (solo, ar, água e matéria orgânica em decomposição).
Alguns são benéficos ao homem, auxiliando na indústria alimentícia (maturação de queijos-
fermentação) e na indústria farmacêutica (produção de antibióticos).
Outros são prejudiciais, causando doenças em vegetais, animais e em humanos, e dentro deste
grupo encontram-se aqueles produtores de micotoxinas.

Leveduras (fungos não filamentosos)


Como os fungos filamentosos, certas leveduras são benéficas, sendo utilizadas na produção de
pães, cervejas, vinhos e outras bebidas alcoólicas em geral; na síntese de certas vitaminas, e outros
produtos; entretanto existem aquelas que deterioram alimentos ou provocam doenças nos vegetais e
animais.
Estes fungos não filamentosos estão bem difundidos na natureza, sendo disseminados por insetos
vetores, pelo vento e pelas correntes aéreas.

Significado nos alimentos:


A presença de fungos filamentosos e leveduras viáveis e em índice elevado nos alimentos, pode
fornecer informações, tais como, condições higiênicas deficientes de equipamentos; multiplicação no
produto em decorrência de falhas no processamento e/ou estocagem; matéria prima com contaminação
excessiva.

Cultura:
Os meios de cultura mais indicados são o Ágar batata dextrose (Potato Dextrose Agar) PDA
acidificado ou PDA antibióticos ou ainda, PCA suplementado com 100mg/L de cloranfenicol.
Recomenda-se que seja realizado o plaqueamento em superfície, o que permite uma máxima exposição
ao ar, benéfica para os bolores (aeróbios em sua maioria). As placas, após semeadura com diluições
apropriadas, são incubadas a 22°  2°C durante 03 a 05 dias, dependendo da quantidade de colônias
desenvolvidas. Não inverter as placas. São escolhidas para a contagem, placas apresentando entre 30 e
100 colônias.

39
Material
-Água peptonada a 0,1%
-Ágar Batata Dextrose (acidificado ou Suplementado com antibióticos).
-Solução aquosa de ácido tartárico a 10% estéril (utilizar 1 mL para cada 100 mL de meio)
-Solução de antibióticos (dissolver assepticamente 500 mg de clorotetraciclina-HCL e -500 mg de
cloranfenicol em 100 mL de tampão fosfato pH 7,2 estéril, estocando em frasco escuro, sob
refrigeração. Uma parte do material fica em suspensão, devendo ser agitado no momento do uso).
-Solução Tampão Fosfato pH 7,2: utilizar 34,0 g de KH2PO4 para 500 mL de água destilada, acertar o
pH em 7,2 com NaOH a 1 N (aproximadamente 175 mL) e completar o volume com água destilada
para 01L. Esterilizar a 121 °C/15 min e estocar em geladeira.

Método:
-Diluição seriada e plaqueamento em superfície.

Técnica:
a) retirar assepticamente 25 g ou 25 mL da amostra e preparar as diluições sucessivas.
b) inocular, em duplicata, 1,0 mL de cada diluição em placas contendo o meio de cultura.
c) espalhar com auxílio de alça de Drigalski.
d) incubar as placas a 20-25 °C por 3 a 5 dias.

40
PESQUISA DE PSEUDOMONAS SPP.
I INTRODUÇÃO
As Pseudomonas são bastonetes Gram (-), não fermentadores de lactose. Pertencem à família
Pseudomonadaceae e constituem bacilos retos ou curvos, móveis com flagelo polar. São catalase e
oxidase positivas. Estão amplamente distribuídas na natureza, podendo ser encontradas em alimentos de
origem animal e vegetal. A P. aeruginosa produz substâncias tóxicas e é patógeno oportunista. As
Pseudomonas são importantes em alimentos devido a sua intensa atividade metabólica, sendo capazes
de utilizar uma grande variedade de compostos orgânicos, além de produzirem pigmentos
hidrossolúveis, enzimas proteolíticas e lipolíticas.
Em aves evisceradas, mantidas a 10ºC ou abaixo, a deterioração ocorre, principalmente por
Pseudomonas e leveduras (Torulopsis e Rhodotorula). Odores são comuns em pedaços de frangos
refrigerados, causados particularmente por Pseudomonas spp, embora espécies de Alcaligenes também
possam estar envolvidas.
O uso de Pseudomonas aeruginosa como um indicador de contaminação fecal tem sido sugerido.
A presença deste micro-organismo no trato intestinal das pessoas, assim como suas características
fisiológicas, levam a um possível indicador de contaminação fecal.
A Pseudomonas é utilizada no controle de qualidade de águas minerais e de águas de serviços de
saúde, UAN, serviços de alimentação, indústrias de alimentos, medicamentos e cosméticos.

II TÉCNICA 1
1- Filtrar 100 mL da amostra ou do “rinse” (amostras sólidas) em membrana de filtro porosa de 0,45µm
2- Enriquecer o material retido na membrana em 100 mL de Caldo BHI adicionado de nitrofurantoína
35-37ºC / 24 horas.
3- Repicar para o Ágar Cetrimide e incubar a 42 ºC / 18 a 24 horas. Colônias características de
Pseudomonas podem desenvolver-se neste meio, nesta temperatura.
4- Realizar o teste da Oxidase através de tiras reagentes e verificar o crescimento em Meio OF.
5- Identificar através de provas bioquímicas o micro-organismo isolado (Sistema API e/ou BacTray).

II TÉCNICA 2
1- Filtrar 100 mL da amostra ou do “rinse” (amostras sólidas) em membrana de filtro porosa de 0,45µm
2- Acplar a membrana a uma placa de ágar Cetrimide e incubar a 35-37 ºC / 24 horas. Colônias
características de Pseudomonas podem desenvolver-se neste meio.
4- Realizar o teste da Oxidase através de tiras reagentes.
5- verificar a hidrólise da caseína em ágar Leite – P. aeruginosa.

Comportamento do micro-organismo
Caldo – turvação difusa com película superficial, que posteriormente deposita.
Ágar – induto úmido e brilhante.
Culturas abandonadas há alguns dias a temperatura ambiente – pigmentação de cor azul a esverdeado:
Piocianina – azul-esverdeado
Fluoresceina ou pioverdina – amarelo esverdeado fluorescente.

41
PESQUISA DE SALMONELLAS SPP.

I INTRODUÇÃO
O gênero Salmonella pertence à família Enterobactericeae e compreende bacilos gram negativos
não produtores de esporos. São anaeróbios facultativos, produzem gás a partir de glicose (exceto S. typhi)
e são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono. Não fermentam a lactose. A maioria é
móvel, através de flagelos peretríquios, exceção feita à S. pullorum e à S. gallinarum, que são imóveis.
As Salmonellas spp são provenientes das próprias matérias-primas contaminadas, das técnicas
de processamento e também de manipuladores portadores intestinais do agente. Seu habitat natural é o
trato intestinal de seres humanos e dos animais.
As doenças causadas por Salmonella podem ser dividas em três grupos:
-febre tifoide, causada por S. typhi, que apresenta sintomas muito graves como septicemia, febre alta,
diarreia e vômito.
-febres entéricas, causadas por Salmonella paratyphi (A, B, e C), que são semelhantes à febre tifoide,
porém com sintomas mais brandos
-enterocolites (ou Salmoneloses), causadas pelas demais salmonelas, que caracterizam por diarreia,
febre, dores abdominais e vômitos.

II TÉCNICA
A metodologia empregada para a detecção de Salmonella spp, em alimentos, utiliza basicamente,
as seguintes etapas:
- pré-enriquecimento- - no qual recupera micro-organismos injuriados
- enriquecimento seletivo - para favorecer a multiplicação das salmonelas e inibir ou restringir o
desenvolvimento de outros micro-organismos presentes
- plaqueamento seletivo – plaqueamento em meios seletivos e indicadores, utilizando-se de meios
sólidos que tenham efeito inibidor da microbiota acompanhante, e que forneçam indicações, das
colônias suspeitas do gênero Salmonella
- Confirmação
- Provas bioquímica das colônias, utilizando-se de meios que forneçam indicações sobre as
características bioquímicas do micro-organismo TSI/LIA). provas bioquímicas complementares,
para a comprovação do gênero Salmonella
- provas sorológicas para a caracterização sorológica da Salmonella.

Técnica de análise:
1- 25 mL ou 25g da amostra são adicionados a 225 mL do diluente (Água peptonada tamponada 1%),
realizando a homogeneização. Posteriormente, incuba-se este a 35ºC / 24 horas.
2- Após este tempo, serão transferidas, em triplicatas, alíquotas de 10 mL do pré-enriquecimento para
90 mL de caldo selenito-cistina e tetrationato, que será Incubado a 43ºC / 24 horas em banho-maria.
3-A partir do enriquecimento seletivo, repica-se os tubos positivos para o ágar Rambach e SS ,fazendo-
se estrias com auxílio de alça de platina. O meio será incubado a 35-37ºC / 24 horas.
4- Transcorrido o período de incubação do plaqueamento seletivo, repicar as colônias suspeitas de
Salmonella com auxílio da alça de platina, fazendo estrias na parte inclinada e inoculação em
profundidade nos meios: Ágar TSI e Ágar lisina-ferro.
5- As colônias dos tubos que apresentarem crescimento sugestivo de Salmonella devem ser identificadas
através de provas bioquímicas e sorológicas.

Princípios:
No meio de Rambach ou RajHans, as colônias de Salmonella spp. são vermelhas, enquanto que
S. typhi e S. paratyphi A, Proteus spp. e Shigella spp., apresentam-se incolores. Os Coliformes
desenvolvem cor azul (E. coli, Citrobacter ) ou violeta azuladas (Klebsiella ).

No Ágar SS, as colônias suspeitas de Salmonella são incolores, transparentes com ou sem o
centro negro.
42
No Ágar Hectoen, as colônias de Salmonella são verde-azuladas com ou sem centro negro.
No TSI, as Salmonella produzem H2S e gás; o ápice do meio fica amarelo (ácido - fermentação
da dextrose); e a superfície inclinada fica vermelha (não fermentadores da lactose e sacarose)
No LIA, a maioria das Salmonella intensifica o violeta e produz H2S (fundo e rampa púrpura
com ou sem produção de H2S).

43
PESQUISA E CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS SP

I INTRODUÇÃO
Os Staphylococcus são cocos gram positivos, que se agrupam em forma de cacho de uva, não
esporulados e imóveis. Algumas cepas são produtoras de toxina e patogênicas. São bactérias anaeróbias
facultativas, porém crescem melhor em condições aeróbias. Têm como habitat natural as cavidades
nasais, garganta e trato intestinal.
Produtos de origem animal industrializados, carnes, ovos, leite, queijo pescado, massas
alimentícias, cremes, maionese, doces de confeitaria com ou sem recheio são os alimentos mais propícios
ao seu desenvolvimento.
A intoxicação por Staphylococcus é produzida pela sua toxina, que é termorresistente. O período
de incubação geralmente é de 2 a 4 horas após a ingestão do alimento contaminado. Os principais
sintomas são: náuseas, diarreia, contrações abdominais e cefaleia. A duração é de 1 a 2 dias.
A presença de Staphylococcus sp nos alimentos é interpretada, em geral, como indicativo de
contaminação a partir da pele, boca, e das fossas nasais dos manipuladores de alimentos, bem como da
limpeza e da sanificação inadequada dos materiais e dos equipamentos.

II TÉCNICA
1- 25 mL ou 25 g da amostra são homogeneizadas com 225 mL do diluente e a partir desta diluição
inicial, faz-se as demais diluições 10-1, 10-2 e 10-3.
2- 0,1 mL do material é inoculado no meio de Baird Parker e espalhado uniformemente sobre a superfície
com auxílio de alça de Drigalsky.
3- As colônias típicas serão contadas e identificadas através das provas bioquímicas auxiliares como
coagulase, catalase e DNase.
4- Repicar as colônias típicas para o caldo BHI e incubar a 35ºC / 24horas.
5- Prova da Coagulase: 0,3 mL da cultura em caldo BHI serão juntados a 0,5 mL de plasma de coelho
e incubados em Banho-maria a 37ºC / 1-4 horas (esta prova verifica a capacidade de certos micro-
organismos produzirem a coagulase, ou seja, coagular o plasma).
6- Prova da Catalase: a partir da cultura em caldo BHI, coloca-se uma gotícula deste inoculo numa
lâmina de microscópio e gotejar água oxigenada. Observar o desprendimento de bolha (catalase
positiva).
7- Transferir o tubo com crescimento em caldo BHI para o Banho-maria a 100ºC, mantendo por
15minutos. Transferir uma alçada para o orifício do Ágar azul de toluidina-DNA. Incubar a 35-37ºC /
1-4 horas. O aparecimento de um halo rosa ao redor do orifício inoculado indica a presença da nuclease
(DNase), característica marcante para a identificação do S aureus.

8- OBS: As colônias típicas de Estafilococos que se desenvolverem no Ágar Baird Parker podem ser
também repicadas para o Ágar Chapman, pois neste meio crescem somente micro-organismos que
possuem elevada tolerância ao NaCl. Os S. aureus são diferenciados neste meio através dos seguintes
critérios: degradação do manitol, produção de gelatinase, e formação de pigmento amarelo dourado
(algumas cepas desenvolvem colônias de cor branca).

Princípios:
As colônias características de S. aureus no Baird Parker são negras, lustrosas, convexas, com 1
a 5 mm de diâmetro, rodeadas por halo claro de 2 a 5 mm de largura. A formação de colônias negras
circundadas por halo é devida a redução do telurito a telúrico, e a lipólise e proteólise da gema,

44
respectivamente.

45
PESQUISA E CONTAGEM DE CLOSTRÍDIOS SULFITO-REDUTORES
O C. perfringens é um bastonete reto, gram positivo, formador de esporos ovais, subterminais,
A temperatura ótima de crescimento é 46°C, crescendo no intervalo de 20 a 50°C. Pode ser encontrado
no solo, sedimentos marinhos, fezes e ferimentos. Sua presença não é rara em carnes cruas, aves, sopas
desidratadas, vegetais crus, etc. No alimento pode ser encontrado na forma esporulada ou vegetativa. A
forma esporulada é resistente ao frio e a temperaturas elevadas. A forma vegetativa é destruída por
temperaturas baixas e altas, sendo, porém, a forma que causa toxinfecção alimentar quando em número
elevado (acima de 103/g). Cabe assinalar que este micro-organismo não altera o produto de forma a ser
perceptível pelos caracteres organolépticos nas quantidades capazes de provocar toxinfecção alimentar.
Nos meios de cultura específicos, os Clostrídios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro
e precipita na forma de sulfeto de ferro, produzindo colônias pretas.

Material:
Água salina peptonada
Ágar TSC
Caldo BHI
Peróxido de hidrogênio 3%
Sistema de geração de anaerobiose
Estufas reguladas a 46°C e 35°C.

Método:
Diluição seriada, plaqueamento em superfície
Identificação bioquímica, morfológica e tintorial

Técnica: Esquema geral de análise


a) 25g ou 25 mL da amostra são homogeneizados com 225 mL Água salina peptonada.
b) Realiza-se a diluição seriada até 10-3, utilizando tubos com 9,0 mL de Água salina peptonada.
c) Inocula-se as diluições em placas contendo Ágar Triptose Sulfito Cicloserina.
d) Incuba-se a 46°C por 24h, em jarra e kit para anaerobiose.
e) Colônias pretas típicas são quantificadas e repicadas posteriormente para o Caldo BHI e
incubadas a 35°C/24h.
f) Realiza-se o teste da catalase (+) e Coloração de gram.

Água salina peptonada (H2Osp):


Obs: para produtos
NaCl 8,5 g gordurosos, utilizar 10,0 g de
Peptona 1,0 g Tween 80 para cada litro da
Água destilada 1,0 L solução no momento do
preparo.
Autoclavar a 121°C/15 min.

46
Bastonetes Gram positivos roxos
Cl. Perfringens – esporos ovais
Cl. Botulinum – esporos semelhantes à raquete

47
MINISTÉRIO DA SAÚDE
PORTARIA DE CONSOLIDAÇÃO n. 5 / 2011 / Ministério da Saúde (anexo XX)
(PORTARIA N.º 2914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011 revogada mas critérios continuam
idênticos)
DO CONTROLE E DA VIGILÂNCIA DA QUALIDADE DA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO
E SEU PADRÃO DE POTABILIDADE (Origem: PRT MS/GM 2914/2011)

48
RESOLUÇÃO- RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001.
Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos

Leite de bovinos e de outros mamíferos e derivados:


Tolerância para amostra Tolerância para
Grupo de alimentos Micro-organismo
indicativa amostra representativa
- - - n c m M
coliformes a
4 5 1 2 4
a) Leite pasteurizado 45ºC/mL
Salmonella sp/25
Ausente 5 0 Aus -
mL
Não deve apresentar micro-
Após 7 dias de
organismos patogênicos e
incubação a 35-37º
b) Leite UHT causadores de alterações
C (embalagem
físicas, químicas e
fechada)
organolépticas do produto
n: número de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente;
c: número máximo aceitável de unidades de amostras com contagens entre os limites m e M;
m: separa o lote aceitável do produto ou lote com qualidade intermediária aceitável;
M: separa o produto aceitável do inaceitável. Valores acima de M são inaceitáveis.

49
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA
INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 51, DE 18 DE SETEMBRO DE 2002
REGULAMENTO TÉCNICO DE PRODUÇÃO, IDENTIDADE E QUALIDADE DO LEITE

Alterada pela INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 62, DE 29 DE DEZEMBRO DE 2011


Regulamento Técnico de Produção, Identidade e Qualidade do Leite tipo A, o Regulamento Técnico
de Identidade e Qualidade de Leite Cru Refrigerado, o Regulamento Técnico de Identidade e
Qualidade de Leite Pasteurizado e o Regulamento Técnico da Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu
Transporte a Granel (apenas leite de vaca)

Leite Cru tipo A


Contagem Padrão em Placas Máx.. 1x104
(UFC/mL) **
Contagem de Células De 01.1.2012 até A partir de 01.7.2014 A partir de 01.7.2016
Somáticas (CS/mL) 30.6.2014 até 30.6.2016
4,8 x 105 4,0 x 105 3,6 x 105

Leite Pasteurizado tipo A


n c m M
Contagem Padrão em Placas 5 2 5,0x102 1,0x103
(UFC/mL) **
Coliformes - NMP/mL 5 0 m<1
(30/35oC)**
Coliformes - NMP/mL 5 0 ausência
(45oC)**
Salmonella spp/25 mL** 5 0 ausência
**Padrões microbiológicos a serem observados até a saída do estabelecimento industrial produtor
Nota nº (5): imediatamente após a pasteurização, o leite pasteurizado tipo A deve apresentar enumeração
de coliformes a 30/35º C (trinta/trinta e cinco graus Celsius) menor do que 0,3 NMP/mL (zero vírgula três
Número Mais Provável/mililitro) da amostra.

Leite Cru Refrigerado


Índice medido (por propriedade rural ou por tanque comunitário A partir de 01.7.2016 Regiões: S / SE / CO A partir de 01.7.2017
Regiões: N / NE
Contagem Padrão em Placas (CPP), expressa em UFC/mL (mínimo
de 01 análise mensal, com média geométrica sobre período de 03 Máximo de 1,0 x 105
meses)
Contagem de Células Somáticas (CCS), expressa em CS/mL
(mínimo de 01 análise mensal, com média geométrica sobre período Máximo de 4,0 x 105
de 03 meses)

Leite Pasteurizado
n c m M
Contagem Padrão em Placas (UFC/mL) ** 5 2 4,0x104 8,0x104
Coliformes - NMP/mL (30/35oC)** 5 2 2 4
Coliformes - NMP/mL (45oC)** 5 1 1 2
Salmonella spp/25mL** 5 0 ausência

Testes Enzimáticos: -
prova de fosfatase alcalina Negativo
prova de peroxidase: Positiva

Imediatamente após a pasteurização (leite pasteurizado tipo A ou leite pasteurizado) o produto assim
processado deve apresentar teste negativo para fosfatase alcalina, teste positivo para peroxidase e
coliformes 30/35ºC menor que 0,3 NMP/mL (zero vírgula três Número Mais Provável /mililitro) da
amostra.

50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
APHA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for examination of
water and wastewater. 23.ed. Washington: APHA, 2017.

BEHMER, M.L.A. Tecnologia do leite. 15.ed. São Paulo: Nobel, 1984.

BRASIL. ANVISA. RDC n°12 – Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para
alimentos. Brasília: ANVISA, 2001.

BRASIL. ANVISA. Resolução RDC n° 216, de 15 de setembro de 2004. Regulamento técnico de


boas práticas para serviços de alimentação. Brasília: D.O.U. - Diário Oficial da União; Poder
Executivo, de 16 de setembro de 2004.

BRASIL. ANVISA. Resolução RDC n° 306, de 07 de dezembro de 2004. Regulamento técnico para
o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde. Brasília: D.O.U. - Diário Oficial da União; Poder
Executivo, de 10 de dezembro de 2004.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Regulamento da inspeção industrial e sanitária de produtos


de origem animal. Brasília, DF: MAPA, 1980.

BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria Consolidada n. 5, de 28 de setembro de 2017. Consolidação


das normas sobre as ações e os serviços de saúde do Sistema Único de Saúde.. Brasília: Ministério
da Saúde, 2017.

BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Lavar as mãos: informações para profissionais de saúde.


Brasília: Centro de Documentação do Ministério da Saúde, 1988.

BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Processamento de artigos e superfícies em estabelecimentos


de saúde. Brasília: Ministério da Saúde, 1994.

CARDOSO, W. M; SILVA, G. G.; CANO, V. Análise microbiológica de alimentos. MercK. 2.ed,


Rio de Janeiro, 1989.

COOPERATIVA CENTRAL DE LATICÍNIOS ESTADO DE SÃO PAULO. Manual de


laboratório: análise do leite “in natura”. São Paulo, versão de 11/08/95.

FRANCO, B. D. G. M. & LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. 2.ed. São Paulo: Atheneu,


2003.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas – métodos químicos e físicos para análise de
alimentos. 3.ed. São Paulo, 1985.

SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N. F. A.; TANIWAKI, M.H.; GOMES, R.A.R.;
OKASAKI, M.M. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. 5.ed. São
Paulo: Blucher, 2017.

SIQUEIRA, R.S. Manual de microbiologia de alimentos. Brasília: EMBRAPA-MERCK, 1995.

51
Bactéria C: Indol +, Vermelho de metila +, Voges-Proskauer -, Citrato +, Gás sulfídrico –
Bactéria A: Indol -, Vermelho de metila +, Voges-Proskauer +, Citrato -, Gás sulfídrico –
Bactéria B: Indol -, Vermelho de metila +, Voges-Proskauer +, Citrato +, Mobilidade +, Lisina descarboxilase –
Bactéria B: Indol +, Vermelho de metila +, Voges-Proskauer -, Citrato -, Motilidade -, Lisina descarboxilase –
Bactéria C: Indol +, Vermelho de metila +, Voges-Proskauer -, Citrato +, colônias rosas no Agar EMB.
Testes bioquímicos para a diferenciação de espécies bacterianas

enterocolitica
Enterobacter

Enterobacter

alcalifaciens
pneumoniae

Providencia
liquefaciens
Escherichia

Citrobacter

marcescens
Salmonella

Salmonella

aerogenes
Klebsiella

mirabilis

Yersinia
vulgaris
Serratia

Serratia
freundii

Proteus

Proteus
cloacae

Hafnia
típica

typhy

alvei
coli
Indol + - - - - - - - - - + - + V
Vermelho de metila + + + + V - - V V V + + + +
Voges-Proskauer - - - - + + + V + V - V - V
Citrato de Simmons - V - + + + + V + + V (V) + -
Gás sulfídrico - + + + - - - - - - + + - -
Ureia - - - V + V - - V V + V - +
Motilidade V + + + - + + + + + + + + -
Lisina descarboxilase V + + - + - + + + (V) - - - -
Fenilalanina desaminase - - - - - - - - - - + + + -
Lactose + - - (V) + (V) + V - V - - - -
Sacarose V - - V + + + V + + + V V +
D-manitol + + + + + + + + + + - - - +
Gás a partir de glicose + + - + + + + + V V V + V -
V=10 a 89,9% de positividade em 48 horas (V) = mais de 50% de positividade em 48 horas

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