BAB III

METODOLOGI

3.1 Bahan
 Siklosporin yang dibeli dari GenWay BioTech Inc ( San Diego, California,
USA).
 a-Cyclodextrin dan g-Cyclodextrin dibeli dari Wacker Chemie ( Munich,
Jerman).
 Polivinil Alkohol 87-91% terhidrolisis dan Benzalkonium klorida dari
Sigma-Aldrich (ST Louis, MO, USA).
 Disodium Edetat Dehidrat (EDTA) dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman).
 Natrium Pentobarbital 400mg/ml (Exagon1) dibeli dari Richter Pharma ag
(Wells, Australia).
 Air Milli-Q (Millipore, Billerica, MA) digunakan untuk persiapan semua
larutan.
3.2 Formulasi Tetes Mata
Langkah pertama dalam persiapan pembuatan tetes mata siklosporin
adalah persiapan pembuatan larutan stok yang mengandung 12,5 % (b/v)
siklodextrin, 0,02% (b/v) benzalkonium klorida dan 0,1% (b/v) EDTA dalam
larutan PVA 1,4% (b/v) larutan. Selanjutnya 20 ml dari 5 formulasi yang
berbeda disiapkan dan dibuat 3, masing – masing mengandung 0,2% CyA dan
berbagai jumlah gCD mulai dari nol hingga 12,5% (w/v) dan volume yang
disesuaikan dengan stok.

11
Formulasi disterilisasi dalam wadah tertutup didalam autoclav pada 121ºC selama
20 menit. Suspensi didinginkan kesuhu kamar dibawah sonication (ultrasonik
Branson 5800, Emerson Industrial 165 Automation, Danbury, CT, USA).
Kemudian suspensi dikeluarkan dari sonikator dan dibiarkan ekuilibrium pada
suhu kamar dibawah agitasi konstan untuk 7 hari dan terlindung dari cahaya.
3.3 Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif CyA dilakukan pada sistem komponen kromatografi cair
kinerja tinggi (HPLC) reversedphase ultimate series 3000 dari Dionex Softron
GmbH (Germering, Jerman) yang terdiri dari pompa LPG-3400SD, SR-3000 rak
pelarut, plat autosampler WPS-3000/TLS, TCC-3000SD kompartemen kolom,
detektor refractomax 521 dan detektor DAD-3000, dan Phenomenex Luna C-18
150 mm x 4,60 mm, kolom 5mm, dengan kolom penjaga yang cocok. Fase gerak
terdiri dari asetonitril, metanol dan air (60:20:20), laju airnya 1ml/menit, suhu
oven kolom 80ºC dan pendeteksian panjang gelombang adalah 205 nm, dimana
metode ini telah divalidasi.

(kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) reversedphase Ultimate 3000

Series dari Dionex Softron GmbH, Germering, Jerman)

3.4 Fraksi Obat Padat

1,5 ml dari setiap formulasi disentrifugasi pada 13.300 g ( Heraeus Pico 17
Centrifuge, Thermo Scientific, MA, USA) pada suhu kamar selama 90 menit.

12
 (Heraeus Pico 17 Centrifuge, Thermo Scientific, Ma, USA)
Jumlah CyA dalam supernatan ditentukan oleh HPLC. Kandungan obat dalam
fase padat dihitung sebagai berikut :
% solid drug fraction = (Total drug - Dissolved drug) X 100
Total drug content
3.5 Pengukuran Spektroskopi
Pengukuran spektroskopi yang terlihat dilakukan untuk supernatan setiap
formulasi, dengan ataupun tanpa CyA untuk yang diukur jika ada agregat
dalam supernatan yang tidak mengendap selama sentrifugasi. Alat yang
digunakan adalah Multiskan ascent microplate dari Thermo Scientific
(Walthman, MA, USA) yang digunakan dan absorbansi diukur pada 450 nm.

( Multiskan ascent microplate from Thermo Scientific from Waltham,

MA, USA)
3.6 Hamburan Cahaya Dinamis
Karakterisasi ukuran partikel formulasi tetes mata dilakukan oleh dynamic
light scattering (DLS), menggunakan Nanotrac Alat pengukur ukuran partikel

13
 gelombang dari Microtrac Inc. (Montogomeryville, USA). Pengukuran
dilakukan pada 25ºC, 180 hamburan sudut dan sinar laser 780 nm. Kedua
formulasi uncentrifuged dan supernatan dari formulasi masing – masing
diukur dalam rangkap tiga selama 5 menit.

(Nanotrac Alat pengukur ukuran partikel gelombang dari Microtrac Inc.)

(Montogomeryville, USA).
3.7 Mikroskop
Ukuran – ukuran partikel dalam setiap formulasi dievaluasi secara visual
dan dari gambar yang diambil dari mikroskop, menggunakan Olympus
Mikroskop BH2 dengan kamera digital terpasang yang dibuat di Tokyo,
Jepang.

(Olympus Mikroskop BH2, Tokyo Jepang)

14
3.8 Sifat Fisikokimia
Nilai pH ditentukan pada suhu kamar (22-23ºC) dengan pH meter orion 3
bintang ( Thermo Scientific, MA, USA)

(pH meter orion, Thermo Scientific, MA, USA)

Viskositas diukur dengan model viskometer Brookfield DV2T terpasang
dengan model air mandi Brookfield TC-150 beroperasi di 25ºC dan spindel
CPA-40Z (Middleborough, MA, USA)

(Viskometer Brookfield DV2T, Middleborough, MA, USA)

Setiap formulasi diukur dalam rangkap tiga selama satu menit. Osmolalitas
formulasi ditentukan dengan Osmomat 030 Gonotec titik beku osmometer.

15
 (Osmomat 030 Gonotec, Berlin, Jerman)

3.9 Studi In Vivo

Pada studi in vivo berpegang pada deklarasi ARVO untuk penggunaan
laboratorium hewan dalam penelitian. Hewan yang digunakan adalah kelinci
pigmentasi tanpa pembiusan, dan diberi diet biasa. Awalnya delapan kelinci
percobaan diberikan dengan 0,2% CyA/CD tetes mata (yaitu formulasi 1)
empat kali ke mata kanan selama sepuluh hari. Namun, dua dari delapan
kelinci mengalami beberapa reaksi beracun yaitu konjungtivitas dan ulkus
beracun sehingga dosis diturunkan.
Kelinci dibagi menjadi dua kelompok dari delapan kelinci. Kelompok A
menerima tetes mata CyA/CD sekali sehari dan kelompok B dua kali sehari
dimata kiri (LE) selama tiga bulan menggunakan mata kanan (RE) sebagai
kontrol.Mata kelinci diperiksa dengan lampu celah setiap bulan dan iritasi
mata itu dinilai menurut sistem skor Draize yang dimodifikasi dan dijelaskan
oleh Bozdag.
Setelah 3 bulan semua kelinci dikorbankan, untuk pemeriksaan histologis
menggunakan dosis tinggi pentobarbital natrium (3ml 400mg/ml) dan mata
ber-enukleasi segera. Mata kemudian dibebaskan dari otot-otot ekstraokuler

16
dan kelopak mata dan diperbaiki dalam solusi Bouin selama 24 jam. Mata
kemudian ditempatkan di 70% etanol. Larutan etanol sering diganti untuk
menghilangkan warna kuning. Mata disimpan dalam etanol 70% sampai
mereka dipangkas bagian mid-sagital dari masing-masing mata termasuk saraf
okuler ditempatkan pada kaset pra-label. Bagian bagiannya secara rutin
diproses, kecuali melewatkan memakai formalin dan bagian 1,5 mm diwarnai
dengan Hematoksilin-Eosin.

17