Anda di halaman 1dari 15

ISOLASI POLIFENOL

I. Tujuan :
1. Dapat melakukan ekstraksi lemak dari tempe dengan pelarut n-
hexan untuk memperoleh tempe bebas lemak;
2. Dapat melakukan ekstraksi isoflavonoid dari tempe bebas lemak
dengan pelarut etanol;
3. Dapat melakukan pemekatan ekstrak dengan menggunakan
rotavapor;
4. Dapat menentukan konsentrasi isoflavonoid di dalam tempe dengan
metode spektrofotometri sinar tampak berdasarkan analisis kurva
standar menggunakan pereaksi Prussian Blue.

II. Alat dan Bahan


1. Alat
i. Gelas kimia 600 mL - Labu takar 50 mL
ii. Erlenmeyer 250 mL - Pipet ukut 1 mL
iii. Gelas Ukur - Pipet ukur 5 mL
iv. Corong Kaca - Pipet ukur 10 mL
v. Batang Pengaduk - Lumpang
vi. Labu alas bulat rotavapor - Gelas kimia 100 mL
vii. Labu peer rotavapor
viii. Rotavapor
ix. Labu takar 100 mL

2. Bahan
 Etanol
 n-heksan
 Tempe
 K3Fe(CN)6
 FeNH4(SO4)2
 Aquadest
III. Dasar Teori
1. Isoflavonoid
Obesitas dengan permasalahannya telah merupakan
masalah epidemic didunia, kondisi mana juga mencuat di
Indonesia. Survei morbidilitas yang merupakan bahagian dari
Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) tahun 2001 di Indonesia
memperlihatkan kecenderungan kenaikan prevalensi obesitas
khususnya pada wanita sejalan dengan pertambahan usia
(mencapai 41-50% pada usia di atas 55 tahun).
Studi epidemiologis oleh Imdonesia Society for the Study of
Obesity ( ISSO, HISOBI ) yang dilaksanakan pada tujuh kota besar
di Indonesia Termasuk Medan dan melibatkan 6318 subjek usia 20
tahun ke atas dari berbagai suku memperlihatkan prevalensi
kumulatif overwight (menggunakan batasan IMT 23- 24,9 kg/m2)
rata-rata 46,45%. Sebagai perbandingan, prevalensi kombinasi
overwight dan obesitas pada orang dewasa di Malaysia berkisar
antara 26%-53% (rata-rata 39%).
Selain risiko diabetes mellitus tipe-2 dan penyakit
kardiovaskular, tingginya angka kematian pada obesitas juga
dikaitkan dengan beberapa penyakit lain. Dikemukan bahwa
jaringan visera merupakan factor risiko independent obesitas
abdominal pada inti problem sindrom metabolic (MetS). Penelitian
di Eropa dan Jepang memperlihatkan bahwa salah satu factor
risiko penyebab emboli paru pada populasi wanita adalah
kelompok yang memiliki IMT ≥ 25,0 kg/m2.
Penguatan potensi terjadinya trombisit akut berpengaruh
pula terhadap meningkatnya resiko penyakit kardiovaskular,
dihubungkan dengan hiperinsulinemia dan toleransi glukosa
terganggu yang dapat berlangsung pada obesitas. Lebih lanjut
dikemukakan bahwa obesitas visera ( dalam kondisi
hiperinsulinemia) berhubungan dengan penurunan konsentrasi
sex hormone binding (SHBG) dan kenaikan konsentrasi androgen
bebas.
Ditemukan leptin (suatu protein) dalam riset jaringan
adiposit khususnya pada bagian visera abdomen, membuktikan
bahwa jaringan adipose juga merupakan organ endokrin. Pada
penelitian lanjut ditemukan pula beberapa substansi protein
lainnya berupa sitokin atau molekulmenyerupai sitokin yang
dikelompokan sebagai adipositokin atau adipokin. Beberapa dari
protein in berperan sebagai sitokin imflamasi, fungsi
metabolism lemak, sementara yang lainnya berperan dalam
hemostasis vascular, siste komplemen serta beberapa senyawa
bioaktif lain yang bertanggung jawab terhadap potofisiologi
konsekuensi atau kamorbid obesitas. Efek dari protein spesifik
ini adalah paracrine atau autocrine, atau bhkan di tempet jauh
dari jaringan adiposa.
2. Tempe kedelai sebagai Bahan Makanan
Beberapa bahan makanan tradisional di Indonesia diketahui
mempunyai indeks glikemik rendah, seperti misalnya tempe
sebagai produk utama kedelai. sejarah Jawa kuno yang ditulis oleh
Ranggasutrasno mencatat awal mula pembuatan tempe sebagai
produk fermentasi menggunakan laru temped an termasuk dalam
pola makan sehari-hari pada populasi di Jawa Tengah sejak
tahun 1700. Kurun waktu setelah itu tempe yang dibuat dari
kacang kedelai (soybean, glacine max, glysine soya) telah
dimanfaatkan sebagai penganti atau penambah sumber protein
hewani atau nabati dalam pola makanan sehari-hari.
Yang dimaksudkan dengan tempe kedelai adalah yang
diperoleh melalui proses penanaman mikroba dari jenis kapang
pada media kedelai sehingga terjadi fermentasi. Fermentasi dapat
berlangsung lancar apabila didukung oleh beberapa persyaratan
seperti ketersediaan ragi tempe, terdapat unsur bahan pangan
yang akan difermentasi : zat tepung, gula dan protein, adanya
enzim katalisator proses fermentasi, suhu ideal antara 280C-300C
pada kondisi ruangan yang gelap, derajat keasaman media yang
cukup (pH 4-5) dan kondisi kedelai sudah cukup lunak.
Diketahui bahwa pemanfaatan kedelai sebagai bahan
pangan mengalami beberapa kendala: tekstur yang keras, adanya
zat antitripsin yang menyebabkan protein terkandung didalamnya
tidak dapat dicerna secara langsung , kandungan enzim lipoksidase
yang menyebabkan timbulnya bau dan rasa langu; kendala mana
yang akan dapat diatasi dengan proses menjadi produk
olahan/awetan terlebih dahulu. Walaupun analisis komposisi
tempe kedelai menunjukkan defisit pasangan asam amino
metionin-sistin, secara menyeluruh mengandung unsur zat gisi
yang cukup tinggi: 25% protein (17 gram protein/100 gram),5%
lemak,4% karbohidrat dan 66% air,sumber vitamin B12 yang
cukup tinggi;rendah lemak jenuh,bebas kolesterol.
Disamping itu diketahui pula pemanfaatan tempe kedelai
sebagai sumber makanan rendah lemak jenuh, menurunkan
kadar kolesterol,mudah dicerna, sumber utama mineral, efek
antibiotik dan stimulasi pertumbuhan, bebas toksin kimia dan
dapat terjangkau dari segi ekonomis.24,25,26,27 Kedelai sebagai
bahan pangan secara alamiah memiliki kandungan isofloavonic
phyroestrogens(isoflavones,subkelas dari flavonoid) yang cukup
tinggi;mencapai 5,1-5,5 mg isoflavon total/gram protein kedelai
tergantung jenis kedelai ,area penanaman ataugeografi dan proses
penanaman. Satu porsi hidangan makanan tradisional terbuat dari
kedelai dapat memberikan sekitar25-60 mg isoflavon. Pada tempe
kedelai mentah didapati kandungan 3,1 mg isoflavon/gram
proteinnya,lebih tinggi daripada tahu mentah (tofu) (2,1 mg/gram
protein) atau susu kedelai (soymilk) (2,0 mg/gram
protein).26Komponen flavonoid sendiri memiliki inti flavon
sebagai struktur dasar,tersusun dari 2 cincin benzen (A dan B)
yang dihubungkan oleh cincin C Heterosiklik.
Posisi dari cincin Benzoid B mendasari penggolongan kelas
flavonoid atas flavonoids(posisi kedua) dan isoflavonoids (posisi
ketiga).Dikenal tiga isoflavon utama dari kedelai yaitu genistein
(4’,5,7- trihidroksiisoflavon),daidzein (4’,7-dihidroksiisoflavon)
serta unsur terkait seperti ß-glikosida dan glycetin (Gambar 1).
Pada manusia, genistein akan di metabolismekan menjadi
dihidrogenistein dan 6’-hidroksi-O-desmetilangolensin. Diantara
ketiga unsur ini ternayata efek genistein telah terbukti sebagai
penghambat tirosin kinase yang kuat, enzim mana berperan pada
kaskade pembentukan thrombin serta gangguan yang
ditimbulkannya.
Waktu paruh plasma dari ginistein dan daidzein pada
orang dewasa adalah 7,9 jam dan mencapai kadar puncak 6-9
jam setelah pemberian komponen murni. Sebagai
konnsekuensinya, konsumsi terus menerus dari diet yang
mengandung kedelai pada akhirnya akan menghasilkan
konsentrasi isoflavon plasma yang tinnggi dan menetap.
3. Pengaruh Tempe Kedelai terhadap Profil Lipid

Beberapa penelitian terkait menunjukan bahwa


penambahan protein kedelai pada konsumsi minimal protein
hewani dapat mempengaruhi kadar lipid plasma, selain berperan
pada hemostasis dan fungsi trombosit. Dalam kaitan ini pola diet
rendah lemak tinggi protein (20-25% energy dari protein) telah
dikemukan sebagai alternative pengganti pola diet rendah lemak
tinggi karbohidrat, khususnya pada hipertrigliseridemia.
Penambahan 25 sampel 50 gram protein kedelai/hari dalam hal
ini dapat memperbaiki factor-faktor risiko penyakit
kardiovaskular.

Dilaporlkan bahwa dengan pemberian 25 gram protein


kedelai yang mengandung 37-62 mg isoflavon tyerbukti bermakna
menurunkan kadar kolestrol –total dan LDL- kolesterol.26,28,31
Cassidy et al. Melaporkan dari penelitiannya pada sekelompok
wanita usia muda bahwa 45 mg isoflavonoid dan bukan 23 mg
isoflavonoid, menyebabkan penurunan konsentrasi kolesterol total
dan LDL kolesterol yang bermakna. Nestle et al. 1997 (dikutip dari
Lichtenstein) sebaliknya mengemukakan bahwa pemberian 45 mg
genistein selama 4-10 minggu ternyata tidak memberikan
pengaruh bermakna pada konsentrasi lipid darah. Meta analisis
dari beberapa penelitian menunjukan bahwa konsunsi protein
kedelai setiap hari dapat menurunkan masing-masing 9,3 % kadar
kolesterol-total serum, 12,9 % kadar LDL kolestrol dan 10,5%
kadar trigliserida; pengaruh mana terutama diperlihatkan pada
keadaan hiperkolesterolemia, tidak pada subjek dengan kadar
kolesterol normal atau kurang dari 200 mg/dl.

Perubahan konsentrasi trigliserida dalam hal ini juga sangat


tergantung pada konsentrasi di awal penelitian. Dikemukakan pula
efek langsung protein kedelai yang dapat menekan sekresi insulin
dan glucagon sehingga menghambat lipogenesis, serta
pengaruhnya terhadap reseptor LDL selain pengaruh positif
isoflavon, kandungan seratnya dapat menurunkan kadar
kolesterol.
Isoflavonoid adalah senyawa 15 karbon yang mirip seperti
flavonoid hanya saja cincin B pada isoflavonoid tertempel pada
atom karbon posisi ketiga pada cincin karbon di tengah.
Isoflavonoid terutama terdapat pada anggota subfamili kacang-
kacangan yaitu Papilionoideae contohnya kacang kedelai (Glycine
max) atau semanggi (Trifolium spp).\

A. Fungsi
Fungsi isoflavonoid sebagian besar belum diketahui, tapi
beberapa bertindak sebagai zat alelokimia. Sebagai contoh,
rotenon, isoflavonoid dari akar tuba (Derris ellipica), banyak
digunakan sebagai insektisida (senyawa pembasmi serangga).
Selain itu rumus bangun isoflavonoid mirip dengan hormon
estrogen hewan, misalnya estradiol, dan isoflavonoid tumbuhan
tertentu menyebabkan kemandulan pada ternak betina, khususnya
domba. Semanggi bawah-tanah menimbun isoflavonoid dalam
jumlah yang luar biasa tinggi.
Senyawa ini menyebabkan "penyakit semanggi" yang serius
pada domba, pertama kali tercatat di Australia Barat pada tahun
1960-an dengan menurunnya tingkat kesuburan. Isoflavonoid juga
diperkirakan merupakan faktor yang mengendalikan populasi
hewan pengerat di beberapa wilayah tertentu.
4. Aktivitas Estrogenik Protein Kedelai
Hampir seluruh produk protein kedelai mengandung
isoflavon alamia (Vitoestrogen) yang memiliki efek estrogenic
lemah pada hewan dan manusia, sehingga masi mempunyai efek
entioksidan dalam menurunkan LDL-kolesterol serta meningkatkan
HDL-kolesterol. Konsentrasi absolute isoflavon pada produk bahan
makanan sangat bervariasi, tergantung pada teknik
pengolahannya.
Masih dipertanyakan kemungkinan efek antiestrogenik
isoflavon pada kondisi lingkungan tinggi estrogen seperti keadaan
pramenopause dan sebaliknya efekestrogenik pada kondisi pasca
menopause. Ridges et al. (2001) Mendapatkan manfaat
penambahan kacang kedelai sebagai sumber isoflavon genistein
dan daidzein pada makanan yang diperkaya dengan sejenis biji-
bijian (linsit) untuk memperbaiki lipid plasma pada subjek pasca
menopause dengan hiperkolesterolemia.
Analisis molecular dari genistein kedelai ternayata
memperlihatkan struktur yang mirip dengan 17ß-ekstradiol
mendukung mekanisme kerja substansi ini dalam perbaikan profil
lipid plasma. Diketahui bahwa hormon estrogen secara langsung
dapat mempengaruhi adiposid dan jenis sel lainnya pada jaringan
adiposa wanita dan pria;serta efek tidak langsung oleh adanya
reseptor estrogen pada jaringan otak dan hati yang mengatur
keseimbangan energy maupun deposisi jaringan adiposa akibat
perubahan metabolisme. Pengaruh langsung dari ekstrogen pada
jaringan adiposa dapat melalui mekanisme modulasi keinginan
makanan atau energy expenditure; atau menghambat aktifitas
lipoprotein lipase (LPL), suatu enzim yang mengatur ambilan lipid
(lipogenesis) oleh adiposity.
Sementara genistein (17ß-estradiol eksogen) secara tidak
langsung mempengaruhi lipolisis dengan memacu lipolitik enzim
hormonesensitive lipase atau dengan meningkatkan efek lipolitik
dari epinefrin. Efek 17ß-ekstradiol terhadap ambilan kolesterol
biosintesis dan katabolismenya; hanya di dapati pada wanita, tidak
ditemukan pada pria. Mekanisme juga dapat berlangsung melalui
peningkatan ß-oksidasi asam lemak yang berperan dalam
pengurangan deposisi jaringan adipose. Berdasar struktur
kimianya, isoflavon secara biologis dapat berikatan dengan
reseptorestrogen serta bekerja agonis dan antagonis terhadap
estrogen. Hal mana masih sulit dimegerti mengingat beberapa
factor yang berperan didalamnya jumlah dan lokasi reseptor;
sehingga di sebut sebagai tissue spesifik. Dikemukakan bahwa
avinitas vitoestrogen terhadap ERß(resepton estrogen beta)
ternyata lebih kuat disbanding terhadap ERα (reseptor estrogen
alpa).
Pada umumnya konsumsi kedelai menurut jumlah yang di
anjurkan sudah dapat memberikan kadar isoflavon plasma
melebihi konsentrasi estradiol normaplasma (40 pg/ml pada pria,
80 pg/ml pada wanita). Studi interfensi pemberian diet
mengandung vitoestrogen (produk kedelai) pada wanita pra
menopausesehat dalam jangka waktu 9 bulan menunjukan efek
ekstrogen berupa pemanjangan fase folikular dan perlambatan
pencapaian puncak konsentrasi progesteron; sekaligus penekanan
puncak LH (luteinizing hormone) dan FSH (follicle stimulating
hormone) pada pertengahan siklus menstruasi.
B. Ekstraksi
Ekstraksi adalah pemisahan suatu zat dari campurannya
dengan pembagian sebuah zat terlarut antara dua pelarut yang
tidak dapat tercampur untuk mengambil zat terlarut tersebut dari
satu pelarut ke pelarut yang lain. Seringkali campuran bahan padat
dan cair (misalnya bahan alami) tidak dapat atau sukar sekali
dipisahkan dengan metode pemisahan mekanis atau termis.
Misalnya saja, karena komponennya saling bercampur secara
sangat erat, peka terhadap panas, beda sifat-sifat fisiknya terlalu
kecil, atau tersedia dalam konsentrasi yang terlalu rendah.
Dalam hal semacam. itu, seringkali ekstraksi adalah satu-
satunya proses yang dapat digunakan atau yang mungkin paling
ekonomis. Sebagai contoh pembuatan ester (essence) untuk bau-
bauan dalam pembuatan sirup atau minyak wangi, pengambilan
kafein dari daun teh, biji kopi atau biji coklat dan yang dapat
dilihat sehari-hari ialah pelarutan komponen-komponen kopi
dengan menggunakan air panas dari biji kopi yang telah dibakar
atau digiling.

C. Penyiapan bahan yang akan diekstraksi dan plarut


 Selektivitas
Pelarut hanya boleh melarutkan ekstrak yang diinginkan,
bukan komponen- komponen lain dari bahan ekstraksi. Dalam
praktek, terutama pada ekstraksi bahan-bahan alami, sering
juga bahan lain (misalnya lemak, resin) ikut dibebaskan
bersama-sama dengan ekstrak yang diinginkan. Dalam hal itu
larutan ekstrak tercemar yang diperoleh harus dibersihkan,
yaitu misalnya diekstraksi lagi dengan menggunakan pelarut
kedua.
 Kelarutan
Pelarut sedapat mungkin memiliki kemampuan
melarutkan ekstrak yang besar (kebutuhan pelarut lebih
sedikit).
 Kemampuan tidak saling bercampur
Pada ekstraksi cair-cair, pelarut tidak boleh (atau hanya
secara terbatas) larut dalam bahan ekstraksi.
 Kerapatan
Terutama pada ekstraksi cair-cair, sedapat mungkin
terdapat perbedaan kerapatan yang besar antara pelarut dan
bahan ekstraksi. Hal ini dimaksudkan agar kedua fasa dapat
dengan mudah dipisahkan kembali setelah pencampuran
(pemisahan dengan gaya berat). Bila beda kerapatannya kecil,
seringkali pemisahan harus dilakukan dengan menggunakan
gaya sentrifugal (misalnya dalam ekstraktor sentrifugal).
 Reaktivitas
Pada umumnya pelarut tidak boleh menyebabkan
perubahan secara kimia pada komponen-kornponen bahan
ekstraksi. Sebaliknya, dalam hal-hal tertentu diperlukan adanya
reaksi kimia (misalnya pembentukan garam) untuk
mendapatkan selektivitas yang tinggi. Seringkali Ekstraksi juga
disertai dengan reaksi kimia. Dalam hal ini bahan yang akan
dipisahkan mutlak harus berada dalam bentuk larutan.

 Titik didih
Karena ekstrak dan pelarut biasanya harus dipisahkan
dengan cara penguapan, distilasi atau rektifikasi, maka titik didih
kedua bahan itu tidak boleh terlalu dekat, dan keduanya tidak
membentuk aseotrop. Ditinjau dari segi ekonomi, akan
menguntungkan jika pada proses ekstraksi titik didih pelarut
tidak terlalu tinggi (seperti juga halnya dengan panas penguapan
yang rendah).
D. EKSTRAKSI DENGAN PELARUT
Ekstraksi adalah jenis pemisahan satu atau beberapa bahan
dari suatu padatan atau cairan. Proses ekstraksi bermula dari
penggumpalan ekstrak dengan pelarut kemudian terjadi kontak
antara bahan dan pelarut sehingga pada bidang datar antarmuka
bahan ekstraksi dan pelarut terjadi pengendapan massa dengan
cara difusi. Bahan ekstraksi yang telah tercampur dengan
pelarut yang telah menembus kapiler-kapiler dalam suatu bahan
padat dan melarutkan ekstrak larutan dengan konsentrasi lebih
tinggi di bagian dalam bahan ekstraksi dan terjadi difusi yang
memacu keseimbangan konsentrasi larutan dengan larutan di luar
bahan.
Ekstraksi dengan pelarut dapat dilakukan dengan cara
dingin dan cara panas. Jenis-jenis ekstraksi tersebut sebagai
berikut.
a. Cara Dingin

Maserasi, adalah ekstraksi menggunakan pelarut dengan


beberapa kali pengadukan pada suhu kamar. Secara teknologi
termasuk ekstraksi dengan prinsip metoda pencapaian
konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetic berarti
dilakuakn pengadukan kontinyu. Remaserasi berarti dilakukan
pengulangan penambahan pelarutsetelah dilakukan ekstraksi
maserat pertama dan seterusnya.
Perkolasi, adalah ekstraksi pelarut yang selalu baru
sampai sempurna yang umumnya pada suhu ruang.
Prosesnya didahului dengan pengembangan bahan, tahap
maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penampungan
ekstrak) secara terus menerus samapai diperoleh ekstrak
perkolat yang jumlahnya 1- 5 kali bahan
b. Cara Panas
Reflux, adalah ekstraksi pelarut pada temperature
didihnya selamawaktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas
yang relative konstan dengan adanya pendingin balik
Soxhlet, adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang
selalu baru menggunakan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi
kontinyu dengan jumlah pelarut relative konstan dengan
adanya pendingin balik.
Digesi, adalah maserasi kinetik pada temperature lebih
tinggi dari temperature kamar sekitar 40-50 C.
Distilasi uap, adalah ekstraksi zat kandungan menguap
dari bahan dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan
parsial zat kandungan menguap dengan fase uap air dari ketel
secara kontinyu sampai sempurna dan diakhiri dengan
kondensasi fse uap campuran menjadi distilat air bersama
kandungan yang memisah sempurna atau sebagian.
Infuse, adalah ekstraksi pelarut air pada temperature
penangas air 96-98 C selama 15-20 menit.
Pelarut yang baik untuk ekstraksi adalah pelarut yang
mempunyai daya melarutkan yang tinggi terhadap zat yang
diekstraksi. Daya melarutkan yang tinggi ini berhubungan
dengan kepolaran pelarut dan kepolaran senyawa yang
diekstraksi. Terdapat kecenderungan kuat bagi senyawa polar
larut dalam pelarut polar dan sebaliknya.
Pemilihan pelarut pada umumnya dipengaruhi oleh:
1. Selektivitas, pelarut hanya boleh melarutkan ekstrak yang
diinginkan.
2. Kelarutan, pelarut sedapat mungkin memiliki kemampuan
melarutkan ekstrak yang besar.
3. Kemampuan tidak saling bercampur, pada ekstraksi cair,
pelarut tidak boleh larut dalam bahan ekstraksi.
4. Kerapatan, sedapat mungkin terdapat perbedaan kerapatan
yang besar antara pelarut dengan bahan ekstraksi.
5. Reaktivitas, pelarut tidak boleh menyebabkan perubahan
secara kimia pada komponen bahan ekstraksi.
6. Titik didih, titik didh kedua bahan tidak boleh terlalu dekat
karena ekstrak dan pelarut dipisahkan dengan cara
penguapan, distilasi dan rektifikasi.
7. Kriteria lain, sedapat mungkin murah, tersedia dalam
jumlah besar, tidak beracun, tidak mudah terbakar, tidak
eksplosif bila bercampur udara, tidak korosif, buaka
emulsifier, viskositas rendah dan stabil secara kimia dan
fisik.
Karena tidak ada pelarut yang sesuai dengan semua
persyaratan tersebut, maka untuk setiap proses ekstraksi harus
dicari jenis pelarut yang paling sesuai dengan kebutuhan.
E. Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis

Spekra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif


dan sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
1. Aspek Kualitatif ;
Data spektra UV-Vis bila digunakan secara tersendiri,
tidak dapat digunakan unutk identifikasi kualitatif obat atau
metabolitnya. Akan tetapi, bila digabung dengan cara lain seperti
spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti, dan
spektroskoppi massa, maka dapat digunakan untuk maksud
analisis kualitatif suatu senyawa tersebut.
Data yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah
panjang gelombang maksimal, intensitas, efek, pH, dan pelarut
yang kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah
dipublikasikan.
Dari spektra yang diperoleh dapat dilihat, misalnya :
a. Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan
pH. Jika berubah bagaimana perubahannya apakah
batokromik ke hipsokromik dan sebaliknya atau dari
hipokromik ke hiperkromik, dsb.
b. Obat-obat yang netral misalnya kafein, kloramfenikol atau
obat-obat yang berisi auxokrom yang tidak terkonjugasi
seperti amfetamin, siklizin, dan pensiklidin.

2. Aspek Kuantitatif ;
Suatu berkas radiasi dikenakan pada larutan sampel
(cuplikan) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur
besarnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding
dengan jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang
per detik.
3. Serapan dapat terjadi jika foton/radiasi yang mengenai cuplikan
memiliki energi yang sama dengan energi yang dibutuhkan
untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Jika sinar
monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan
ketebalan db, maka penurunan intesitas sinar (dl) karena
melewati lapisan larutan tersebut berbanding langsung dengan
intensitas radiasi (I), konsentrasi spesies yang menyerap (c), dan
dengan ketebalan lapisan larutan (db). Secara matematis,
pernyataan ini dapat dituliskan :
-dI = kIcdb
bila diintergralkan maka diperoleh persamaan ini :
I = I0 e-kbc

dan bila persamaan di atas diubah menjadi logaritma


basis 10, maka akan diperoleh persamaan :
I = I0 10-kbc

dimana : k/2,303 = a , maka persamaan di atas dapa diubah


menjadi persamaan :
Log Io/I
= abc
atau A =
abc
dimana : A=
Absorban,
a=absorptivit
a
b = tebal
kuvet (cm),

c=konsentra
si
Bila Absorbansi (A) dihubungkan dengan Transmittan
(T) = I/Io maka dapat diperoleh

A=log 1/T .

Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak


tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi
yang mengenai larutan sampel. Tetapi tergantung pada suhu,
pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi.

Pada Hukum Lambert-Beer, terdapat beberapa batasan, antara


lain :
1) Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
2) Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang
mempunyai penampang luas yang sama
3) Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak
tergantung terhadap yang lain dalam larutan
4) Tidak terjadi peristiwa flouresensi atau fosforisensi
5) Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan.

Salah satu hal yang penting juga diingat adalah untuk


menganalisis secara spektrofotometri UV-Vis diperlukan panjang
gelombang maksimal. Adapun beberapa alasan mengapa harus
menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu :

a. Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga


maksimal karena pada panjang gelombang maksimal
tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap
konsentrasi adalah yang paling besar.
b. Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva
absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum
Lambert-Berr akan terpenuhi.
c. Jika dilakukan pengukuran ulang, maka kesalahan
yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang
gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang
gelombang maksimal.
F. Penyimpangan Hukum Beer

Jika dalam analisis suatu unsur tidak memenuhi Hukum


Beer, maka absorbansi tidak setara dengan konsentrasi. Jika ingin
mengetahui apakah suatu unsur memenuhi Hukum Beer atau
tidak maka perlu ditentukan grafik kalibrasi absorbansi vs
konsentrasi. Hukum Beer hanya dapat dipenuhi jika dalam range
(cakupan) konsentrasi hasil kalibrasi berupa garis lurus, jadi kita
hanya bekerja pada linear range. Seringkali sampel yang dianalisa
akan memiliki absorbansi yang lebih tinggi dari pada larutan
standar. Jika kita berasumsi bahwa kalibrasi tetap linier pada
konsentrasi yang lebih tinggi
Dengan cara ramalan kalibrasi yang linier [itu]. Hal ini
tidak boleh diilakukan karena bagaimanapun, ketika kita tidak bisa
mengetahui apakah hukum Beer masih terpenuhi pada konsentrasi
yang lebih tinggi. Jika Hukum Beer tidaklah terpenuhi pada
konsentrasi yang lebih tinggi, hasil dari pengukuran akan
merupakan suatu kesalahan besar ( ketelitian sangat kecil).
Sekalipun standar lebih lanjut disiapkan dan kurva dicoba
ke data, ketepatan dari hasil akan sangat lemah dalam kaitan
dengan ketidak-pastian di (dalam) membaca konsentrasi dari
kurva.
Oleh karena itu, larutan yang memiliki absorbansi lebih
tinggi dari larutan standar harus diencerkan sampai memenuhi
konsentarasi larutan standar yang telah ada.
IV. Prosedur Kerja
1. Penyediaan Tempe Bebas Lemak
a. Tempe digerus dengan lumpang sampai cukup halus,
lalu ditimbang sebanyak 15 g ke dalam erlemeyer
tutup asah.
b. Tambahkan n-heksan sebanyak 150 mL, kocok
selama 5 menit baru disimpan pada suhu kamar
selam 90 menit, tetapi setiap selang waktu 15 menit
dikocok lagi selama 5 menit.
c. Campuran dipisahkan dengan cara dekantasi
(diendap-tuangkan), residu tempe tetap dalam
Erlenmeyer, pelarut ditampung dalam wadah bersih.
d. Residu tempe ditambah lagi n-heksan 100 mL,
dikocok lagi selama 5 menit baru disaring, filtrat
(pelarut) dicampur dengan pelarut pada prosedur no.
3.
e. Residu tempe dikeluarkan dari Erlenmeyer,
ditempatkan pada selembar kertas atau wadah
kering, baru dikering-anginkan pada suhu kamar.
f. Tempe kering yang diperoleh di sini adalah tempe
bebas lemak, lemak sudah terlarut ke dalam n-
heksan.
2. Ekstraksi Flafonoid dari Tempe Bebas Lemak
a. Tempe bebas lemak yang diperoleh pada prosedur
sebelumnya dimasukkan ke dalam Erlenmeyer tutup
asah yang bersih dan ditambah dengan etanol 95%
sebanyak 200 mL, dikocok selama 5 menit baru
disimpan sampai pertemuan minggu berikutnya.
b. Campuran disaring, filtrate ditampung secara kuatitatif
dalam Erlenmeyer bersih.
c. Residu tempe ditambah lagi dengan 100 mL etanol
95%, dikocok selama 5 menit baru disaring, filtrat
dicampur dengan filtrat etanol sebelumnya (dianggap
sebagai ekstrak etanol).
d. Ekstrak etanol dipindahkan secara kuantitatif ke dalam
labu Rotavapor vakum, lalu dipekatkan sampai
tersisah 50 mL.
3. Penentuan Kadar Flavonoid
a. Ekstrak etanol dari tempe yang telah dipekatkan
melalui rotavapor diencerkan menjadi 50—100 mL
(volume ekstrak etanol, V) dengan etanol;
b. Dipipet 0,1 mL larutan ekstrak tersebut (1) ke dalam
labu takar 50 mL dan ditambah dengan 25 mL air
suling dan 3 mL FeNH4(SO4)2 0,10 M;
c. Campuran no.2 disimpan selama 20 menit pada suhu
kamar kemudian ditambahkan dengan K3Fe(CN)6
0,008 M sebanyak 0,5 mL, kemudian diimpitkan
sampai tanda batas dengan air suling dan setelah itu
dikocoki dan simpan pada suhu kamar selama 20
menit;
d. Setelah tepat 20 menit segera ukur serapannya pada
panjang gelombang 720 nm, catat serapan (As).
e. Konsentrasi polifenol dalam larutan ekstrak etanol (Cs)
ditentukan dengan metode kurva standar secara
ekstrapolasi atau menggunakan persamaan garis
lurus yang diperoleh dari kurva standar.
4. Prosedur pembuatan larutan standar
a. Disediakan larutan asam tannat dengan konsentrasi 1
g dalam 100 mL larutan (1%);
b. Larutan no. 1 dipipet 1 mL ke dalam labu takar 100
mL dan encerkan sampai tyanda batas dengan air
suling;
c. Disedian 5 buah labu takar 100 mL yang bersih, dan
ke dalamnya dipipet beruturut-turut 0,1; 0,2; 0,3;
0,4; dan 0,5 mL larutan no.2 dan masing-masing
ditambah dengan 50 mL air suling, dikocok dengan
baik;
d. Ke dalam masing-masing larutan no.3 ditambahkan 3
mL FeNH4(SO4)2 0,10 M lalu dikocong dan
didiamkan selama 20 menit;
e. Kemudian ditambahkan 0,5 mL larutan K3Fe(CN)6
0,008 M dan setelah itu diimpitkan sampai tanda
batas dengan air suling, didiamkan selama 20 menit
baru diukur serapannya pada panjang gelombang
720 nm;
f. Catat serapannya dan buat kurva standar antara
konsentrasi asam tannat dalam larutan dengan
serapannya masing-masing.

Anda mungkin juga menyukai