Hasil dan pembahasan

Selama beberapa tahun terakhir, ada peningkatan minat untuk menggunakan kromatografi cair
(LC-MS) untuk menentukan kadar vitamin D3, 25-hydroxyvitamin D3 dan metabolit lainnya
dalam plasma manusia (Aronov et al., 2008; Capote et al., Hidayat et al., 2008; , Karma et al.,
2007; Chen et al., 2007; Dimartino, 2009; Heudi et al., 2004; Jakobsen et al., 2007; Kamao et al.,
2007a; Kamao et al., 2007b; Lu et al. , 2007; Phillips et al., 2008) karena peningkatan sensitivitas
dan selektivitas instrumen ini terhadap HPLC tradisional dengan deteksi UV.

LC-MS memungkinkan prosedur pembersihan sampel yang lebih sederhana untuk digunakan ,
mengurangi tidak hanya waktu analisis sampel, namun yang lebih penting, metode waktu
pengembangan. Kromatografi cair-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) diterima secara
luas sebagai tolok ukur untuk kuantifikasi berbagai senyawa non-volatil polar pada bagian-per-
miliar (mg / kg) dan bagian-per-triliun (lg / kg) tingkat (Zhang, Rose, & Trenerry, 2009) dan
menjadi lebih banyak digunakan untuk menentukan vitamin D3 dan metabolitnya dalam plasma .
susu manusia (Kamao et al., 2007b) dan makanan (Byrdwell, 2009; Chen et al., 2007; Phillips et
al., 2008). Spektrometer massa perangkap Ion (LC-MSn) mencakup rentang m / z yang serupa
dengan spektrometer massa tandem dan juga dapat beroperasi dalam mode pemindaian penuh
pada resolusi tinggi dan rendah. Keuntungan utama dari instrumen LC-MSn adalah kemampuan
untuk melakukan tahap langkah pemecahan yang memberikan informasi lebih struktural
daripada penganalisis massa lainnya. Namun, sensitivitas spektrometer massa perangkap ion 3D
tradisional adalah urutan besarnya kurang dari pektrometer massa tandem. Spektrometer massa
perangkap ion linier baru menunjukkan sensitivitas mendekati spektrometer massa tandem yang
rutin digunakan dalam pengujian laboratorium dan Dimartino (2009) menggunakan teknik ini
untuk mengukur kadar vitamin D3 dalam berbagai makanan. Batas kuantifikasi (LOQ) sebesar
0,125 lg / 100 g (1,25 ppt) untuk vitamin D3 dilaporkan dalam penelitian ini.

Kami menentukan kadar vitamin D3 dalam pemilihan susu formula dan susu formula yang
tersedia secara komersial tanpa memerlukan pembersihan lebih lanjut dari ekstrak heksan kasar
(Bagian 2.3.2.1.1) dengan menggunakan LC-MSn dan LC-MS / MS. Kromatogram LC-MSn dan
LC-MS / MS ditampilkan pada Gambar. 1 dan 2 masing-masing. Instrumen LC-MSn
dioperasikan dalam mode ion positif APCI karena ini memberikan peningkatan kepekaan 20 kali
lipat terhadap ESI. Tingkat vitamin D3 ditentukan dari kromatogram ion [M + H] + orang tua (m
/ z 385.5) serta dua kromatogram fragmen ion (m / z 367,4 dan m / z 259).

Spektrometer massa tanduk mini Micromass Quattro dioperasikan dalam mode ion ESI positif,
karena ini memberikan kepekaan sedikit lebih baik daripada APCI. Untuk LC-MS / MS, kadar
vitamin D3 ditentukan dengan menjumlahkan area dari transisi MRM (m / z 385,2 107, 159,2,
259,4). Tingkat vitamin D3 ditentukan oleh LC-MSn (m / z 385.5, 367,4 dan 259) dan LC-MS /
MS hampir identik dan sebanding dengan tingkat yang tercantum pada label (lihat Tabel 1).
Pemulihan vitamin D3 yang ditambahkan ke sampel sebelum saponifikasi dapat diterima
(kisaran spiking 0,1-2 lg / 100 ml, pemulihan rata-rata 78% n = 19). Metode ini selanjutnya
divalidasi melalui partisipasi dalam penelitian Proficiency Testing Australia untuk penentuan
vitamin D dalam formula bayi yang diperkaya, di mana dua sampel identik (S1 dan S2) diuji
dalam rangkap dua (S1, hasil kami 7,8 + 0,2 lg / 100 g , hasil analisis kemakmuran 8,7 + 2 lg /
100 g dan S2, hasil penelitian kami 7.5 + 0,2 lg / 100 g, hasil penelitian kemahasiswaan 9,6 + 2,4
lg / 100 g, n = 7) (Bunt, 2010). Kromatogram LC-MSn dan LC- MS / MS dari sampel susu
komersial yang diperkaya mengandung 0,5 lg / 100 ml ditunjukkan pada Gambar. 1 dan 2.
Metodologi ini kemudian diterapkan pada pemilihan sampel susu komersial yang tidak
difortifikasi dengan kandungan lemak yang berbeda serta contoh susu sapi segar.

Berbeda dengan pekerjaan yang dijelaskan di atas untuk LC-MSn, hanya ion m / z 259 yang
dapat digunakan untuk kuantifikasi, karena senyawa co-eluting mengganggu m / z 385,5 dan m /
z 367,4 ion. Data kuantitatif dari instrumen LC-MS / MS juga tidak konsisten. Ekstrak
pembersih dicapai dengan menggunakan tahap pembersihan silika SPE, dan ini sesuai untuk
analisis LC-MS / MS. Kromatogram LC-MSn m / z 259 juga lebih bersih setelah perlakuan SPE,
namun pembersihan SPE gagal untuk sepenuhnya menghilangkan senyawa yang mengganggu
dalam kromatogram LC-MSn untuk m / z 385,5 dan m / z 367,4 ion. Tingkat vitamin D3 pada
sampel yang ditentukan oleh LC-MSn (m / z 259) dan dengan instrumen LC-MS / MS (jumlah
MRM m / z 385,2 107, 159,2, 259,4) setelah SPE serupa dan ditampilkan dalam Tabel 2. Tingkat
juga serupa dengan yang dilaporkan dalam literatur (Jakobsen & Saxholt, 2009; Kurmann &
Indyk, 1994). Pemulihan vitamin D3 yang ditambahkan sebelum saponifikasi berkisar antara
61% (tingkat spiking 0,01 lg / 100 ml) sampai 86% (tingkat lonjakan 0,1 lg / 100 ml) - lihat
Tabel 2. Tujuh aliquot dari sampel susu sapi segar diuji menunjukkan kemampuan
reproduktibilitas metode (0,02 lg / 100 ml, CV = 4,4%). Batas kuantifikasi (LOQ) untuk vitamin
D3, berdasarkan rasio S / N 10: 1, adalah 0,01 lg / 100 g untuk LC-MSn dan 0,02 lg / 100 g
untuk LC-MS / MS. 25-Hydroxyvitamin D3 juga dapat ditentukan oleh LC-MSn dengan
menggunakan pembersihan SPE terpisah dari ekstrak kasar. Sebuah LOQ 0,01 lg / 100 ml untuk
25-hydroxyvitamin D3 dalam sampel susu sapi segar dicapai meskipun secara keseluruhan
sembuh antara 30% dan 40%. 25-Hydroxyvitamin D3 tidak hadir pada level> LOQ pada sampel
yang dianalisis.

Metode ini kemudian digunakan untuk mengukur kadar vitamin D3 dan 25-hydroxyvitamin D3
pada susu sapi yang dikumpulkan dari uji coba makanan yang dilakukan oleh Department of
Primary Industries, Victoria. Hasil uji coba ini akan dilaporkan di tempat lain.

Kesimpulan

Metode mudah dan kuat untuk menentukan kadar vitamin D3 dalam kisaran susu sapi, susu
formula dan susu sapi segar menggunakan LC-MSn telah dikembangkan. Metode ini divalidasi
dengan prosedur LC-MS / MS yang terpisah. Hasil vitamin D3 yang ditambahkan ke sampel
sebelum saponifikasi cukup memuaskan (60-90%). LOQ masing-masing 0,01 lg / 100 g dan 0,02
lg / 100 g untuk LC-MSn dan LC-MS / MS. 25-hydroxyvitamin D3 juga dapat ditentukan pada
sampel susu segar dengan menggunakan prosedur ini, walaupun kondisi ekstraksi tidak
sepenuhnya dioptimalkan untuk senyawa ini.