fabricación, proceso y
análisis
Jorge Ramírez Salcedo1, Lorena Chávez González2, José Luis
Santillán Torres3 y Simón Guzmán León4
Introducción
203
En este capítulo explicaremos la técnica conocida como microarreglos de ADN
de dos canales, cómo se fabrican, cómo se procesan en el laboratorio, cómo se
obtienen los resultados, cómo se analizan, algunas consideraciones para un buen
diseño experimental y finalmente los usos y aplicaciones de esta tecnología.
a) Bibliotecas genómicas
Protocolo
Proceso de microarreglos
a) Extracción de ARN
c) Hibridación
d) Lectura y cuantificación
e) Análisis
• Termociclador
• Centrífuga para micro-placas
• Vórtex
• Entrecruzador de luz UV
• Incubadora con agitación
• Centrífuga con vacío
• Microfuga
• Incubadora sin agitación
• Lector de microarreglos
• Espectrofotómetro
• Termoblock
• Equipo de cómputo con conexión a internet
Material
Reactivos
• Deoxinucleótido poli T
• Hexámeros al azar
• Transcriptasa inversa (Invitrogen)
• 5-(3-aminoalil-2´deoxiuridín 5´ trifosfato) Aminoalil-dUTP (CAS N° 936327-
10-5)
• 5-(3-alexa555-2´deoxiuridín 5´ trifosfato) dUTP-Alexa555
• 5-(3-alexa647-2´deoxiuridín 5´ trifosfato) dUTP-Alexa647
• Hidróxido de sodio (NaOH) 1N (CAS N° 1310-73-2)
• Ácido etilen diamino tetracético (EDTA) 0.5M, pH 8.0 (CAS N° 139-33-3)
Figura 3. Imagen digital de muestras de ARN total aislado a partir de células de le-
vadura del experimento de la represión catabólica por la fuente de carbono, corrido
en un gel desnaturalizante de agarosa 1% y teñido con bromuro de etidio. Es impor-
tante resaltar que la banda ribosomal 28S (grande) es al menos dos o más veces
más intensa que la 18S (indicativo de la integridad del ARN mensajero presente en
la muestra).
DNA Genómico
RNA Transferencia
1. Extracción de ARN. Existe una gran variedad de métodos para aislar ARN y su
elección depende del origen de la muestra. Lo más importante es obtener un
material de la más alta calidad, para esto se deben considerar los siguientes
aspectos: obtenerlo lo más concentrado posible, se requiere al menos 10 µg
de ARN total para un experimento; en un gel de agarosa, la banda ribosomal
grande debe ser al menos dos veces más intensa que la pequeña (esto nos
permite tener una idea de la integridad del ARN mensajero (ARNm) contenido
en la muestra), no es necesario aislar ARNm para realizar el experimento; la
contaminación con fenol u otro reactivo proveniente del proceso de extrac-
ción puede inhibir la síntesis de ADNc; es recomendable la degradación del
ADN genómico contaminante (Eisen y Brown 1999, Gasch et al. 2000). En la
Figura 3 se muestra el ARN total con las características descritas, obtenido de
las levaduras del experimento antes mencionado.
2. Síntesis y marcaje de ADNc. Para marcar el ARN se utiliza una reacción de
síntesis enzimática de ADNc de cadena sencilla. El proceso más utilizado
considera que el ARN total se mezcle con un deoxinucleótido poli T y un
conjunto de hexámeros al azar, permitiendo que reconozcan sus sitios en
el ARN mensajero. Posteriormente, se agregan los deoxinucleótidos A, C,
G, T y una porción de deoxinucleótido U, este último marcado con una mo-
lécula fluorescente (dUTP-Cy3, dUTP-Cy5, dUTP-alexa 555 y dUTP-alexa
647) y se espera que la transcriptasa inversa incorpore los deoxinucleóti-
dos marcados a la cadena naciente de ADNc. Finalmente, se purifica para
eliminar los deoxinucleótidos fluorescentes no incorporados. Este procedi-
miento se conoce como incorporación directa de la molécula fluorescente
(Ramírez et al. 2003, http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/
superscript_onestepRTPCR_man.pdf, consultado en junio de 2010, http://
www.promega.com/tbs/tm287/tm287.pdf, consultado en junio de 2010).
Actualmente, es más utilizada la incorporación indirecta que difiere de la
anterior en que el deoxinucleótido U está modificado con un grupo aminoalil
(dUTP-NH3), que se incorpora a la cadena de ADNc y posteriormente por
reacción química la molécula fluorescente se acopla a éste.
2.1 Síntesis enzimática de ADNc. Preparar una mezcla con 10 µg de ARN
total, deoxinucleótido poli T (2µg), hexámeros al azar (3 µg), ajustar a
un volumen de 19 µL con agua desionizada en tubos para microcentrífuga
Métodos de análisis
Figura 5. Esquema del funcionamiento del lector de microarreglos con óptica confo-
cal. En el recuadro se observa la imagen exterior de un lector, la inserción del chip en
el CPU y la imagen digital obtenida de la lectura.
Análisis estadístico
218
genes correspondientes en el arreglo.
Núm. ORF Gen Descripción del Gen D-Cy3 D-Cy5 F-Cy3 F-Cy5 S-Cy3 S-Cy5
1 ybr012c Proteína hipotética 620 484 227 196 393 288
2 ybr006w UGA2 Similar a la succinato semialdehído deshi- 4517 3118 250 212 4267 2906
drogenasa de E. coli
3 ybr002c RER2 cis-preniltransferasa, enzima llave en la 513 473 231 196 282 277
síntesis de dolicol
4 ybl107c Proteína hipotética 4041 2296 236 210 3805 2086
5 ybl040c ERD2 Proteína receptor del lumen del RE 654 515 230 198 424 317
6 ybl034c STU1 Proteína mitótica 579 453 237 189 342 264
7 ybl028c Involucrado en el apareamiento en 878 1088 238 191 640 897
levaduras
8 ybl022c PIM1 Proteasa dependiente de ATP de 862 749 230 197 632 552
Núm. ORF Gen Descripción del Gen D-Cy3 D-Cy5 F-Cy3 F-Cy5 S-Cy3 S-Cy5
15 ybr280c Proteína hipotética 1218 608 235 204 983 404
16 ybr274w CHK1 Regulador negativo de la fosforilación de 635 475 246 203 389 272
Cdk por PDS1
17 ybr197c Similar a la proteína hipotética YPL077c 4399 2745 226 193 4173 2552
18 ybr191w RPL21A Proteína ribosomal L21.e 1972 10413 243 208 1729 10205
19 ybr185c MBA1 Proteína de ensamble de la cadena 1082 862 240 201 842 661
respiratoria
20 ybr179c FZO1 Proteína requerida para la biogénesis 542 428 235 191 307 237
mitocondrial
21 ybr102c EXO84 Proteína esencial para la secreción 4954 5381 233 219 4721 5162
22 ybr005w Similar a la proteína hipotética YDR003w 2208 3298 231 199 1977 3099
23 ybr090c Cuestionable ORF 2201 1188 245 193 1956 995
24 ybr085w AAC3 Intercambiador ADP/ATP 1225 685 229 197 996 488
25 ydl104c QRI7 Similar a la sialoglicoproteasa (gcp) de H. 397 340 212 197 185 143
influenzae
Análisis bioinformático
Diseño experimental
Como hemos visto, los resultados obtenidos con esta tecnología nos permi-
ten observar un panorama general de lo que está sucediendo con la célula en
a) El origen de la muestra
Aplicaciones
Por lo general, esta herramienta se utiliza para observar los cambios en la expre-
sión de los genes ocurridos en las células en una condición determinada en un
Bibliografía