Anda di halaman 1dari 12

48

BAB III

SUBJEK DAN METODE PENELITIAN

3.1 Subjek Penelitian

Populasi penelitian yang digunakan adalah hewan tikus (Rattus norvegicus

Berkenhout) Wistar yang memenuhi kriteria inklusi dan tidak memenuhi kriteria

eksklusi.

3.1.1 Kriteria Inklusi

Keseluruhan populasi Rattus norvegicus Berkenhout Wistar, kelompok yang

dapat dimasukkan ke dalam sampel adalah yang memenuhi kriteria inklusi berikut:

 Tikus jantan, Pertimbangan pemilihan tikus jantan pada penelitian diharapkan

mewakili kondisi tambang pasir timah (di dalamnya terdapat kandungan

timbal) yang pekerjanya adalah pria.


 Aktivitas fisik baik: gerak aktif, lincah, tanpa kelainan fisik, dan sehat.
 Usia dewasa yaitu 3 bulan; karena pekerja di tambang berusia 21 tahun ke atas

( 1 bulan usia tikus setara dengan 7 tahun usia manusia).


 Berat 230 gram.

3.1.2 Kriteria Eksklusi

- Hewan sakit yang didiagnosa pra perlakuan, ditandai oleh perilaku tidak aktif,

tidak mau makan atau minum, atau munculnya gejala fisik.

3.1.3 Kriteria Drop Out

- Hewan mati sebelum penelitian selesai


49

Hewan tersebut kemudian dikelompokkan ke dalam kelompok penelitian sebagai

berikut:

Untuk paparan subkronik (1 bulan)

a. Kelompok hewan yang tidak diberi paparan inhalasi timbal. Selanjutnya

disebut sebagai kelompok hewan Kontrol (SK0)


b. Kelompok hewan yang diberi paparan inhalasi timbal dengan dosis 6,25

mg/m3 1 jam per hari selama 1 bulan (paparan subkronik). Selanjutnya

disebut sebagai kelompok hewan Perlakuan SK1


c. Kelompok hewan yang diberi paparan inhalasi timbal dengan dosis 12,5

mg/m3 1 jam per hari selama 1 bulan (paparan subkronik). Selanjutnya disebut

sebagai kelompok hewan Perlakuan SK2


d. Kelompok hewan yang diberi paparan inhalasi timbal dengan dosis 25 mg/m3

1 jam per hari selama 1 bulan (paparan subkronik). Selanjutnya disebut

sebagai kelompok hewan Perlakuan SK3

Untuk paparan kronik (6 bulan)

a. Kelompok hewan yang tidak diberi paparan inhalasi timbal. Selanjutnya

disebut sebagai kelompok hewan Kontrol (K0)


b. Kelompok hewan yang diberi paparan inhalasi timbal dengan dosis 6,25

mg/m3 1 jam per hari selama 6 bulan (paparan kronik). Selanjutnya disebut

sebagai kelompok hewan Perlakuan K1


c. Kelompok hewan yang diberi paparan inhalasi timbal dengan dosis 12,5

mg/m3 1 jam per hari selama 6 bulan (paparan kronik). Selanjutnya disebut

sebagai kelompok hewan Perlakuan K2


50

d. Kelompok hewan yang diberi paparan inhalasi timbal dengan dosis 25 mg/m3

1 jam per hari selama 6 bulan (paparan kronik). Selanjutnya disebut sebagai

kelompok hewan Perlakuan K3

3.1.4 Ukuran Sampel

Sampel yang dipergunakan untuk penelitian ini sesuai dengan hasil

penghitungan berdasarkan rumus Federer berikut ini:66

t (r – 1) ≥ 15
4(r – 1) ≥ 15
4r – 4 ≥ 15
r ≥5

t = jumlah perlakuan
r= banyaknya ulangan

Penelitian ini terdiri atas 8 kelompok penelitian sehingga diperlukan paling

sedikit 5 ekor tikus untuk tiap kelompok penelitian. Total dibutuhkan 40 ekor tikus.

Untuk mengkompensasi drop out, jumlah sampel ditingkatkan 20%. Maka jumlah

sampel sebanyak total 48 ekor tikus, dengan distribusi masing-masing 24 ekor tikus

pada kelompok subkronik dan kelompok kronik.

3.2 Metode Penelitian


3.2.1 Klasifikasi Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan suatu uji eksperimental yang dilakukan di
66,67
laboratorium dengan sampel berupa hewan coba.
51

3.2.2 Rancangan Penelitian


Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental Rancangan Acak

Lengkap (RAL). Penggunaan kelompok pembanding bertujuan untuk mengetahui

hubungan antara dosis dan lamanya paparan timbal dengan efek yang ditemukan pada

tulang dan serum. 67,68,69

3.3 Definisi Variabel dan Operasional Penelitian

3.3.1 Definisi Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

a. Timbal

b. Durasi : 28 hari subkronik dan 180 hari kronis

c. Dosis : 6,25, 12,5, 25 mg/m3

2. Variabel tergantung

a. Mikrostruktur tulang trabekular

b. Kristal hidroksiapatit tulang

d. Ekspresi calcium sensing receptor tulang (CaSR)

e. Aktivitas OPG/RANK/RANKL

f. Kekuatan Tulang berdasarkan Bone-J

3.3.2 Definisi Operasional Penelitian

No. Variabel Definisi Variabel Metode Satuan Pengukuran Skala


52

Penelitian Penelitian Pengukuran Ukur


1 Kadar timbal Senyawa logam  mg/m3
berat toksik  nano partikel
konsentrasi  subkronik (1 bulan)
tertentu yang -  kronik
dipaparkan (3 bulan)
dengan secara
inhalasi.

2 mikrostruktur mikrostruktur 1. SEM 1. Pesentasi mineral


tulang tulang trabekular, (Scannnig 2. nm, lapisparameter
trabekular kristal elektro
Kristal hidroksiapatit mikrosko
hidroksiapatit,yang mengalami p)
perubahan setelah 2. XRD
dipaparkan (Kristal)
dengan senyawa
timbal
3 (Ekspresi (Ekspresi AU
CaSR) CaSR)diaktivasi CLSM
dengan senyawa
timbal.
4 Kadar OPG/ Mekanisme ELISA- Miksroskopik 400x
RANKL aktivasi OPG CLSM AU
RANK/ /RANK/RANKL
ketika diaktivasi
dengan senyawa
timbal.
5 Kekuatan Mekanisme Software Bone-J SMI Histomorfometri
Tulang Kekuatan Tulang

3.4 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakologi, Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya, Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya,


53

Laboratorium Fisika Fakultas Sains Universitas Brawijaya Malang, dan Laboratorium

Sentral Fisika Universitas Negeri Malang. Waktu penelitian dilakukan selama ± 9

bulan.

3.5 Tata Kerja

3.5.1 Persiapan Penelitian

Penelitian diawali dengan mempersiapkan hewan uji, protokol, persiapan kit

untuk pemeriksaan laboratorium, serta menginformasikan teknik pelaksanaan kepada

pelaksana harian tempat pemeriksaan.

3.5.2 Persiapan Hewan Uji

Hewan uji yang dipergunakan dalam penelitian ini tikus (Rattus norvegicus

Berkenhout) Wistar jantan dewasa berumur 3 bulan dengan berat badan ± 230 g

sebanyak total 48 ekor dengan keadaan baik. Pemeliharaan tikus dilakukan di dalam

ruangan yang tenang dengan pencahayaan cukup dengan durasi 2 mg. Suhu ruang

dijaga sekitar 20- 250 C dengan kelembaban 70-80%. Hewan diberi pakan (pelet)

secara ad libitum dan dipelihara di dalam kandang pemeliharaan beralas sekam yang

dilengkapi dengan tempat pakan dan botol air minum (diganti setiap hari). Pakan

yang diberikan mengandung protein, lemak, serat, kalsium, dan fosfor.

Pengandangan dan pemberian nutrisi diberikan sama pada semua kelompok

perlakuan. Kandang tersebut dibersihkan dan diganti alasnya dua kali seminggu.

Pemeliharaan dan penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas


54

Kedokteran Universitas Brawijaya Malang (ISO 9001:2008). Secara keseluruhan

animal house tergolong memadai, layak dan sesuai untuk dilakukan penelitian.

Hewan uji dibagi menjadi delapan kelompok yaitu kelompok paparan

subkronik meliputi kontrol (SK0), kelompok perlakuan dosis I (SK1), kelompok

perlakuan dosis II (SK2) dan kelompok perlakuan dosis II (SK3). Masing-masing

kelompok terdiri dari 6 ekor tikus. Selain itu juga dibandingkan dengan kelompok

paparan kronik, yakni kelompok paparan akut meliputi kontrol (K0), kelompok

perlakuan dosis I (K1), kelompok perlakuan dosis II (K2) dan kelompok perlakuan

dosis II (K3). Masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor tikus.

3.5.3 Pelaksanaan

a. Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus jantan dewasa,

berusia 3 bulan yang telah memenuhi kriteria inklusi dan tidak memenuhi

kriteria eksklusi.

b. Pemberian timbal dilakukan dengan cara inhalasi dengan alat paparan debu

yang dibuat dan tersedia di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya Malang.

c. Dosis timbal yang diberikan pada tikus adalah tiga dosis, yakni 6,25 mg/m 3,

12,5 mg/m3, dan 25 mg/m3.

d. Paparan inhalasi timbal diberikan satu kali setiap hari (1 jam per hari) selama

satu bulan (paparan inhalasi subkronik) dan tiga bulan (paparan inhalasi

kronik).
55

e. Setelah satu bulan dan tiga bulan, tikus dilakukan eutanasia dengan anestesi

eter secara inhalasi. Tikus yang teranesteasi dilakukan pembedahan dengan

menggunting abdomen dan memotong costa kemudian menemukan jantung

untuk mengambil darah (serum). Darah diambil denga spuit sebanyak 8-10 ml

kemudian dilakukan isolasi serumnya. Serum yang diperoleh akan disimpan

dalam kulkas bersuhu -40oC. Selain itu, tulang femur kanan dan kiri juga akan

diambil. Femur kanan akan disimpan di tabung berisi paraformaldehid dan

disimpan di suhu ruang. Untuk femur kiri akan disimpan di kulkas pada

bersuhu -40oC. Selanjutnya, tikus akan dikuburkan dengan layak.

f. Pemeriksaan kadar mineral atom dengan X-Ray Fluorescence (XRF)

dilakukan pada femur kiri. Pemeriksaan kristal hidroksiapatit menggunakan

X-Ray Diffraction dilakukan pada femur kiri. Pemeriksaan kadar

mikroarsitektur dan distribusi mineral mempergunakan Scanning Electron

Microscope Energy Dispersive X-ray (SEM-EDX) juga dilakukan pada femur

kiri. Keseluruhan alat tersedia di Laboratorium Sentral Fisika.

g. Pengujian kekuatan tulang dilakukan pada femur kanan, mempergunakan

micro heavy test yang tersedia di Laboratorium Fisika, Fakultas Sains,

Universitas Brawijaya Malang..

h. Analisa CasR dan RANK tulang femur kanan dilakukan dengan alat confocal

laser scanning microscope yang tersedia di Laboratorium Sentral Ilmu Hayati

Universitas Brawijaya Malang.


56

i. Analisa OPG dan RANKL dilakukan di serum dengan teknik ELISA yang

tersedia di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya, Malang.

3.5.4 Aspek Etik

Aspek etik dalam penelitian ini diharapkan tercapai dengan rincian sebagai

berikut: 65,66

– Replacement

Untuk menilai patogenesis timbal di tulang trabecular, dipilih tikus sebagai

hewan vertebrae dengan anatomi dan fisiologi terdekat dengan manusia sehingga

diharapkan akan menjadi refleksi jika perlakuan yang sama dilakukan pada

manusia.

– Reduction

Berdasarkan perhitungan jumlah sampel, dibutuhkan paling tidak 5 ekor tikus

pada tiap kelompok penelitian. Peneliti mengambil jumlah terbawah untuk

meminimalisasi pemakaian jumlah hewan uji yang terlalu banyak Total

dibutuhkan 40 ekor tikus. Namun tetap harus ditambah 20% sebagai kompensasi

jika terdapat sample yang drop out. Sehingga pada akhir penghitungan

didapatkan jumlah sampel sebanyak total 48 ekor tikus, dengan distribusi

masing-masing 24 ekor tikus pada kelompok subkronik dan kelompok kronik.

– Refinement

Dalam rangka meminimalisasi rasa nyeri, penelitian ini tergolong dalam

penelitian dengan pemanfaatan hewan vertebrata sedikit sekali atau sama sekali
57

tidak menimbulkan rasa tidak nyaman. Proses euthanasia sampel dilakukan

dengan inhalasi ether sehingga meminimalisasi rasa tidak nyaman pada hewan

uji.

3.6 Alur Penelitian POPULASI Inklusi

SAMPEL Eksklusi

Drop Out

Inhalasi Pb (mg/m3) Inhalasi Pb (mg/m3)


28 hari 6 bulan
1 jam / hari 1 jam / hari
58

Subkronik Kronik

SK0 SK1 SK2 SK3 K0 K1 K2 K3

6,25 12,5 25 6,25 12,5 25

Euthanasia (inhalasi ketamin 0,02 mg/kgbb)

Pembedahan

8-10 cc darah Femur dextra Femur sinistra


↓ ↓ ↓
Serum disimpan Disimpan dalam suhu normal Disimpan dalam
dalam suhu -40 0C dengan paraformaldehid suhu -40 0C

ELISA CLSM  SEM – edx :


 OPG -Ekspresi calcium sensing mikroarsitektur dan
distribusi mineral
 RANKL receptor tulang (CaSR
 XRD :Hidroksiapatit
-RANK  Sofware Bone-J
3.7 Teknik Analisis Data 

Analisis Data
59

Analisis data dilakukan dengan menggunakan program SPSS for windows

versi 18.0 pada derajat kepercayaan 95% dengan nilai P ≤ 0,05. Analisis statistik

dilakukan dengan ANOVA dan uji lanjutan. 63,64