UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL

DE HUAMANGA
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGÍA

ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE

INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENIERÍA QUÍMICA

Y METALURGÍA

INGENIERIA DE BIOPROCESOS

Práctica Nº 04

“CINÉTICA ENZIMÁTICA DE INVERSIÓN DE LA SACAROSA”

Profesor :Ing. TRANSMONTE PINDAY,Wilfredo

Alumnos :
 ÁVILA HURTADO, Yanet
 CÉPIDA PORRAS, David.

Día de práctica : Lunes 2:00 – 5:00 p.m.

Semestre académico : 2007 – II

Ayacucho – Perú

2008
 I. OBJETIVOS:
 Estudiar la cinética de la reacción de la inversión de la sacarosa
catalizada por enzima invertasa.
 Determinar la constante de Michaeles – Menten (km) para el sustrato.
 Aplicar la ecuación Linear – Burk para determinar los parámetros.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

2.1.CINETICA ENZIMÁTICA
La cinética enzimática es la rama de la enzimología que trata de los
factores que afectan a la velocidad de las reacciones catalizadas
enzimáticamente. Los factores más importantes son la concentración de esas
enzimas, la concentración de los ligandos (sustratos, productos, inhibidores y
activadores), pH, fuerza iónica y T° cuando todos esos factores se analizan
adecuadamente, es posible averiguar muchos datos acerca de la naturaleza de la
reacción catalizada enzimáticamente. Por ejemplo, mediante la variación de la
concentración del sustrato y del producto, es posible deducir el mecanismo
cinético de la reacción, o sea el orden en el que los sustratos se le adicionan al
azar, tales enzimas - producto que pueden formarse y en algunos casos
proporcionarse pruebas concluyentes para conocer los intermedios enlazados
covalentemente que sean indefectibles mediante los análisis químicos ordinarios.
Determinadas constantes cinéticas pueden ser calculadas y de ellas
podemos deducir las concentraciones intracelulares normales de los sustratos y
los de productos y la dirección fisiológica de la reacción. La cinética de una
reacción puede indicar la forma en la que la actividad de la enzima se regula en
vivo. Un estudio del efecto de variación del pH y de la T° en las constantes
cinéticas puede proporcionar información concerniente a las identidades de los
grupos R de los aminoácidos de sitio activo. (Doran, 2001)

2.2. ECUACION DE HENRI - MICHAELIS – MENTEN

Generalmente se acepta que la catálisis de la reacción enzimática
requiere la formación de un complejo entre la enzima E y el substrato S; éste
complejo ES puede disociarse para formar E y P o bien para sufrir alguna
reorganización y formar E; éstas pueden representarse como:
E + S ES EP P + E
Donde:
E = Enzima. P = Producto
S = sustrato ES = Complejo enzimatico
Por tanto, según la ley de la acción de masas por estado de equilibrio tenemos:
K1 (E) (S) + K4 (E) (P) = K2 (ES) + K3 (ES)

Considerando P = 0, se tiene lo siguiente:

K1 (E) (S) = (ES) + (K2 + K3)
(𝐸) ∗ (𝑆) 𝐾2 + 𝐾3
= = 𝐾𝑚
(𝐸𝑆) 𝐾1
 La velocidad máxima Vmax, se considera cuando toda enzima presente esté en
el complejo (ES), de modo siguiente
Vmax = K3 (S)
En cualquier otro estado de saturación de la enzima, la velocidad inicial V1,
para la formación de P será:
V = K3 (ES) Como: (Et) = (E) + (ES)
Se obtiene lo siguiente:
𝑉𝑚𝑎𝑥 ∗ (𝑆)
𝑉=
𝐾𝑚 + (𝑆)
2.3. REPRESENTACION INVERSA DE LINEWEAVER - BURK
Cuya ecuación es:
1 𝐾𝑚 1
= +
𝑉 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∗ (𝑆) 𝑉𝑚𝑎𝑥

La grafica se realiza con 1/V frente a 1/[s]

Esta reacción se basa en la reestructuración de la ecuación de HENRI -
MICHAELIS - MENTEN en una forma lineal ( y = mx +b)

1/V

𝐾𝑀
𝑚=
𝑉𝑚𝑎𝑥

1/ Vmax

1/S
2.4.CONSTANTS DE MICHAELES PARA:
Enzima Fuente Sustrato Km (mM)
Invertasa Sacharomices serviceae Sacarosa 9,1
Neurospora crassa Sacarosa 6,1
α - amilasa Bacillus stearothermophilus Almidón 1,0
Pancreas porcino Almidón 0.4
β - amilasa batata amilosa 0.07
Fuente: Doran, 2001

III. MATERIALES Y EQUIPOS

3.1. MATERIALES
 6 matraces de 250ml.
 2 pipetas de 10ml
 2 vasos de 250ml
 1 bureta de 250ml
 2 soportes universales
 Termómetro.
 3.2. EQUIPOS
 Baño maría
 Equipo para calentar.
 pHmetro.

3.3. REACTIVOS
 Acido Cítrico.
 Licor de Fheling A y B.
 Diastasa
 Agua destilada
 Azul de metileno 1%
 Sacarosa.
3.4.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
 Preparar 100ml de solución de sacarosa de las siguientes concentraciones
1M, 0.8M, 0.6M, 0.4M, 0.2M y 0,1M ajuste el pH de toda estas
soluciones a 4.5 con solución de ácido cítrico al 1%,, luego coloque toda
estas soluciones a baño maría la temperatura de 45°C pero antes añada
10mL de invertasa previamente preparada, a cada matraz, deje que
transcurra el tiempo de 45 minutos, luego saque todas las soluciones y
enfríe para luego titular vada solución con licor de Fheling, colocando en
la bureta la solución del matraz y en el vaso el licor de Fheling A y B 5
mL de cada uno, y proceda a titular cuando está en ebullición, luego
anote el volumen gastado para calcular el % de conversión haciendo uso
de la tabla de PEARSON.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. RESULTADOS

 Datos obtenidos en la práctica.

Tabla Nº 1: Características de la solución

A B C D E F
Concentración (M) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1
Vol. Solución (mL) 100 100 100 100 100 100
Masa de azúcar (g) 34.4 27.52 20.64 13.76 6.88 3.44
pH 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5

Titulando con la solución de FHELING A (5 mL) + FHELING B (5 mL) +

AGUA (90 mL) y se obtienen el volumen gastado de la solución de azúcar.

Tabla Nº 2: Volumen gastado de solución de azúcar.

Número de soluciones Concentración (Mol) Gasto solución (ml)
A 1,0 21.6
B 0.8 16.6
C 0.6 15.6
D 0.4 15.4
E 0.2 11.2
F 0.1 9.20
 Tabla Nº 3: Factor para cada concentración y gasto de NaOH.
MOLARIDAD GASTO (ml) FACTOR (Tablas de Pearson)
1,00 21,60 51,00
0,80 16,60 50,70
0,60 15,60 50,60
0,40 15,40 50,50
0,20 11,20 48,40
0,10 9,20 47,40

 Calculando azúcar invertido para 1M

factor
Azucarinvetida = ∗ 100
volumen gasto

51.00
Azucarinvetida = ∗ 100 = 236.11 mg
21.60

Se calcula igual para las siguientes concentraciones

Tabla Nº 4: Cantidad de azúcar invertido para cada concentración
Molaridad Gasto (ml) Factor Tablas de Pearson Azúcar invertido (mg)
1,00 21,60 51,00 236,11
0,80 16,60 50,70 305,42
0,60 15,60 50,60 324,36
0,40 15,40 50,50 327,92
0,20 11,20 48,40 432,14
0,10 9,20 47,40 515,22

 Calcular la concentración al final de la conversión para 1 M

Masa de azucar = 34.2g = 34200mg
Azúcar invertida = 236.11 mg
Azucarinv.
%Azucarinvetida = ∗ 100
masa de azucar
236.11
%Azucarinvetida = ∗ 100 = 0.690%
34200
La diferencia de porcentaje es
%Azucar = (100 − 0.690)% = 99,31%
Concentración de azúcar al final es:
[𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑎𝑙 𝑓𝑖𝑎𝑛𝑙] = 0.9931 ∗ 1 = [𝑆]
Se calcula igual para las siguientes concentraciones
Tabla Nº 5: Concentración al final de conversión
Masa de Azúcar %
Molaridad azúcar (mg) invertido (mg) %Azúcar inv azúcar [S]
1,00 34200,00 236,11 0,69 99,31 0,993
0,80 21360,00 305,42 1,43 98,57 0,789
0,60 20520,00 324,36 1,58 98,42 0,591
0,40 13680,00 327,92 2,40 97,60 0,390
0,20 6840,00 432,14 6,32 93,68 0,187
0,10 3420,00 515,22 15,06 84,94 0,085
  Calculando la velocidad de reacción (V = C/t)
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛
𝑉=
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
Reemplazando datos
1𝑀
𝑉= = 0.022 𝑀/𝑚𝑖𝑛
45 𝑚𝑖𝑛

Tabla Nº 5: Resultados
Tiempo Velocidad
MOLARIDAD (min) (M/min) 1/V 1/[S]
1,00 45,00 0,0222 45,00 1,007
0,80 45,00 0,0178 56,25 1,268
0,60 45,00 0,0133 75,00 1,693
0,40 45,00 0,0089 112,50 2,561
0,20 45,00 0,0044 225,00 5,337
0,10 45,00 0,0022 450,00 11,774

 La gráfica 1/v vs 1/[S]

1/V vs 1/S y = 37.596x + 12.493

R² = 0.9981
500.00
450.00
400.00
350.00
300.00
1/V
250.00
200.00
150.00
100.00
50.00
0.00
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000

1/S

 Hallar Km y Vmax
1/Vo = Km /Vmáx * 1/S + 1/Vmax
Km/Vmax = m = 37.59
1/Vmax = 12.49
Vmax = 0.080 M/min
Kmax = 3.009 M

4.2.DISCUSIONES
 La sacarosa al ser hidrolizada enzimáticamente por acción de la
invertasa por efecto de la temperatura se invierte, dando dos productos:
Glucosa y Fructosa, que son azúcares reductores e incristalizables, muy
higroscópicos y más dulces que la sacarosa. El grado de inversión,
depende del porcentaje de azúcar, ácido y tiempo de calentamiento.
  Se observó que él % de azúcar invertido varía de acuerdo a la
concentración de sacarosa, cuando desciende de 1M tal vez se debe a que
la cantidad de invertasa añadido a cada matraz no es lo suficiente para la
inversión ya que, la molaridad varía de 1M hasta 0.1M en forma
descendente.
 La Hidrólisis de la Sacarosa puede realizarse por la invertasa: por
ejemplo, la invertasa de las levaduras de panadería o vinificación. Está
favorecida por el pH ácido de un alimento y se produce espontáneamente
en los zumos de fruta durante su almacenamiento. El producto formado
se llama Azúcar Invertido y existe, en estado natural, en la miel.
 La Acción Enzimática de las enzimas, se produce con la unión de éstas
con una molécula de substrato, para luego formar el complejo enzima-
substrato y después del proceso se forma inmediatamente el producto
quedando libre la enzima, para unirse con el nuevo substrato.

V. CONCLUSIONES
 En la siguiente práctica se determinó la cinética enzimática empleando
una enzima invertasa para la inversión de una solución de sacarosa a
diferentes molaridades viendo que la sacarosa se convierte en glucosa y
fructuosa.
 Aplicamos la ecuación Linear – Burk para determinar los parámetros
 Determinamos el valor de la constante de Michaelis - Menten que es
3.009M para el sustrato por medio de la grafica.

VI. BIBLIOGRAFIA

 DORAN Pauline M.; 2001 “Principios de Ingeniería de los

Bioprocesos” Editorial Acribia S.A. Zaragoza - España.

 PEARSON, D; 1993 “Técnicas de laboratorio para el Análisis de

Alimentos” Editorial Acribia S.A. Zaragoza - España.