Procesamiento en bajada

Ohmura et al. describieron la aplicación de la adsorción en lecho empacado (PBA) para la

purificación de rHSA que requiere etapas de filtración y cromatografía. Alternativamente,
utilizando la adsorción en lecho expandido (EBA), el producto puede capturarse directamente de
la célula que contiene el caldo de fermentación. Sumi et al. reportaron mejoras significativas en
una reducción del 50% del tiempo corriente abajo y un aumento del 45% en el rendimiento
general en comparación con los resultados utilizando el método de purificación convencional. Se
han publicado algunas comparaciones de costos de los procesos de EBA y PBA, por ejemplo, por
Curbelo et al. para la albúmina de suero bovino del caldo de P. pastoris y de Amersham
Biosciences para el anticuerpo monoclonal.

En este estudio de caso, comparamos el uso de EBA y PBA como rutas alternativas en la
producción de rHSA (proceso EBA, proceso PBA). La Figura 11.2 muestra los diagramas de flujo de
la sección de recuperación para el proceso de EBA y PBA. La aplicación del proceso EBA permite la
eliminación de al menos tres pasos de procesamiento descendente (microfiltración y dos
ultrafiltraciones) que se espera que conduzcan a un mejor rendimiento de purificación y una
reducción en el tiempo de purificación. Los diagramas de flujo de proceso de la sección de
biorreacción y la sección descendente después del paso EBA y el paso PBA, respectivamente, son
idénticos en ambos casos (como se muestra en la Figura 11.1).

Proceso EBA. Bajo las condiciones ácidas necesarias para la EBA que usa partículas adsorbentes
fuertemente catiónicas, la rHSA se degradaría rápidamente por las proteasas contenidas en el
medio de cultivo. Por lo tanto, las proteasas se inactivan calentando el caldo de fermentación a 68
° C durante 30 minutos en presencia de caprilato de sodio 10 mM como estabilizador y cisteína 10
mM y clorhidrato de aminoguanidina 100 mM para suprimir la coloración causada por el
calentamiento. El tratamiento térmico se realiza en el biorreactor (P-3), ahorrando un tanque
adicional. Para representar la desnaturalización de la rHSA debido al tratamiento térmico, se
utiliza una operación de reacción con una extensión de reacción del 4% que convierte la rHSA en
proteínas de desecho.

La solución calentada tiene una conductividad eléctrica de aproximadamente 20 mS / cm. Una

unión óptima de rHSA a las partículas adsorbentes fuertemente catiónicas es a una conductividad
eléctrica de 8–12 mS / cm. Para una mejor adsorción, la solución se diluye (1: 1) en el recipiente P-
8 utilizando un tampón de acetato (50 mM) y agua destilada. El valor del pH se ajusta a 4,5 usando
ácido acético.

La solución diluida que contiene las células se carga hacia arriba en la columna EBA (P-9), que se
ha equilibrado con un tampón de acetato. La rHSA objetivo se une a las partículas adsorbentes,
mientras que las impurezas se descartan. El tampón de equilibrado se utiliza para el lavado. La
rHSA se recupera alimentando hacia abajo un tampón fosfato (100 mM, pH 9).

Para la decoloración, la solución de rHSA se trata luego con calor nuevamente en P-10 a 60 ° C
durante 1 hora en presencia de cisteína 10 mM, caprilato de sodio 5 mM y clorhidrato de
aminoguanidina 100 mM a pH 7.5. La solución luego se ajusta a pH 6.8 usando ácido fosfórico y la
concentración de sal se reduce a 200 mM agregando agua. La solución ajustada se carga en la
columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) (P-11), donde se retienen las impurezas.
En el siguiente paso, la concentración de sal de la solución se reduce de nuevo a
aproximadamente 100 mM (P-12) y se carga en el intercambiador de aniones (P-13). La rHSA fluye
a través de la columna, mientras que las materias colorantes y las impurezas se eliminan. En la
etapa de diafiltración (P-14), el tampón de fosfato (pH 6.8) se reemplaza por un tampón de
acetato (pH 4.5), que se requiere para el tratamiento con resina de quelato (P-16). El tratamiento
con resina de quelato retiene de nuevo la materia colorante. Los pirógenos se eliminan mediante
ultrafiltración (P-17, corte de peso molecular: 100 kDa). En otra etapa de ultrafiltración (P-18), la
solución se concentra y luego se liofiliza (P-21).

Proceso de PBA. En el proceso de PBA, la biomasa celular se separa del caldo de fermentación
mediante microfiltración (P-23). La solución se concentra adicionalmente por ultrafiltración (P-24).
Las proteasas en la solución se inactivan por calor en P-9 a 60 ° C durante 1 hora (también para
decoloración). La solución tratada térmicamente se ajusta a pH 4.5 usando ácido acético. Los
contaminantes polimerizados de alto peso molecular se eliminan mediante ultrafiltración (P-25).
La solución rHSA luego se carga en la columna PBA (P-26), donde se retiene el producto. El tampón
de acetato se utiliza para el lavado y para el equilibrio de la columna. Al igual que en el proceso de
EBA, la rHSA se recupera mediante la alimentación en un tampón de fosfato. Los pasos de
purificación adicionales (P-10 y unidades posteriores) son idénticos al proceso de EBA.