LaboratoriumTeknik Lingkungan 16(3).

1-7 Desember 2018

ISOLASI DAN PEMURNIAN MIKROBA

Mulyani1, Emeryani2, dan Ika Oksi Susilawati3

1
Teknik Lingkungan, FT, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jend A. Yani Km 36,
Banjarbaru, 70713, Indonesia
2,
Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jend A. Yani Km
36, Banjarbaru, 70713, Indonesia
1
E-mail: mulyani.apps27@gmail.com

Abstrak
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya,
sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya
berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam
mikrobiologi, yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri
cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu
macam mikroorganisme saja. Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan
habitatnya menentukan sampel dan media apa yang akan digunakan. Pemilihan mikroba sebagai sumber
enzim mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan yang diisolasi dari tanaman ataupun hewan.
Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih mudah ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih
cepat, skala produksi sel lebih mudah ditingkatkan bila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya
produksinya relatif rendah, kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan
waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan
untuk mengisolasi mikroba antara lain dengan cara goresan (streak plate), cara tuang atau taburan (pour
plate), cara pengenceran (dilution method), serta micromanipulator. Praktikum kali ini yang digunakan
adalah metode pour plate (cawan tuang) untuk sampel air sungai dan Metode spread plate (cawan
sebar) untuk sampel tanah TPA.

Kata kunci: Isolasi, Biakan Murni, pour plate, dan spread plate

I. Pendahuluan Isolasi merupakan cara untuk

Populasi mikroba di alam sekitar kita
sangat besar dan komplek. Beratus-ratus
spesies berbagai mikroba biasanya
menghuni bermacam-macam bagian tubuh
kita, termasuk mulut, saluran pencernaan,
dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin
dapat menyebarkan beribu-ribu
mikroorganisme. Satu tinja dapat
mengandung jutaan bakteri (Pelczar, 1986).
Fungi lebih mudah dibedakan dari
organisme lainnya kerena umumnya
tumbuh berupa benang-benang halus
sedangkan bakteri tampak berupa bulatan
kental dengan permukaan yang umumnya
tampak licin atau redup. Fungi dapat
tumbuh baik pada medium Malt Extract
Agar ataupun Potatoes Dextrose Agar,
koloni-koloninya memiliki struktur yang khas
dan terkadang memiliki warna yang menarik
(Gandjar, 2006).
memisahkan atau memindahkan mikroba
tertentu dari lingkungannya, sehingga
diperoleh kultur murni atau biakan murni.
Kultur murni ialah kultur yang sel-sel
mikrobanya berasal dari pembelahan dari
satu sel tunggal (Pelczar, 1986).
Pekerjaan memindahkan bakteri dari
medium yang lama ke medium yang baru
harus dilakukan secara teliti. Terlebih
dahulu harus diusahakan agar semua alat-
alat yang ada sangkut pautnya dengan
medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-
benar steril. Hal ini untuk menghindari
kontaminasi, yaitu masuknya
mikroorganisme yang tidak diinginkan
(Budiarti, 2009).
Kultur murni atau biakan murni sangat
berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk
menelaah dan mengidentifikasi
mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-
ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun

1
LaboratoriumTeknik Lingkungan 16(3). 1-7 Desember 2018

serologis, memerlukan suatu popolasi yang
terdiri dari satu macam mikroorganisme
saja (Hadioetomo, 1993). Sifat organisme
dalam suatu biakan murni dapat dipelajari
dengan metode yang amat keras dengan
hasil yang sangat akurat karena pengaruh
sel hidup yang lain dapat ditiadakan (Volk,
1993).
Cara yang dapat dilakukan untuk
mendapatkan biakan murni terdapat
beberapa, yaitu :
1. Pengenceran
2. Penuangan
3. Penggesekan
4. Single cell isolatiom
5. Inokulasi hewan (Budiarti, 2009)
Adapun tujuan dari praktikum ini
adalah untuk memberikan pengetahuan
kepada mahasiswa tentang teknik-teknik
isolasi dan pemurnian mikroba. Untuk
mendapatkan biakan yang murni.
dituang ke dalam 5 buah tabung reaksi,
masing-masing tabung reaksi sebanyak 1
ml.
Selanjutnya diambil sampel
menggunakan eppendorf pipet, dilakukan
pengenceran pada sampel dengan mulut
tabung reaksi dipanaskan terlebih dahulu
dengan api bunsen, pengenceran dilakukan
dari 10-1 hingga 10-5, lalu dihomogenkan
menggunakan vortex mixer. Pada
pengenceran 10-4 dan 10-5 sampel, diambil
sebanyak 1 ml, kemudian dituang ke dalam
cawan petri yang sudah dipanaskan
sekelilingnya. Sampel dituang hingga
memenuhi dasar cawan dan digoyangkan
searah dengan angka delapan. Cawan petri
direkatkan dengan kertas pembungkus,
kemudian diinkubasi selama 2 x 24 jam
pada suhu 28oC. Setelah selesai, dilakukan
pengamatan.

II. Materi & Metode

Alat
Alat-alat yang digunakan dalam
praktikum ini adalah tabung reaksi steril,
cawan petri, vortex mixer, eppendorf pipet,
pipet volumetri, lampu spiritus, alkohol 70%,
spiritus, alumunium foil (kertas
pembungkus), kapas dan karet.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam
praktikum ini adalah media Nutrient Agar
(NA), aquades, sumber bakteri (tanah TPA
dan air sungai).
Metode yang digunakan dalam
praktikum ini adalah isolasi dan pemurnian
mikroba. Bahan yang digunakan yaitu
media Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose
Agar (PDA), aquades, 5 gram sampel tanah
TPA dan 5 ml sampel air sungai. Cara kerja
pada isolasi dan pemurnian mikroba yaitu
diambil sampel tanah TPA sebanyak 5 gram
menggunakan neraca analitik, dimasukkan
5 gram sampel tanah TPA dan 5 ml sampel
air sungai ke erlenmeyer yang berbeda,
masing-masing erlenmeyer sudah berisi 45
mL NaCl fisiologis. Kemudian masing-
masing sampel dihomogenkan
menggunakan orbital shaker, ditunggu
selama 15 menit. Setelah itu sampel

2
III. Hasil dan Pembahasan
A. Hasil
Tabel 1. Morfologi koloni mikrob asal tanah TPA dan Air Sungai

Bakteri Jamur Yeast

No Nama sampel Pengamatan
-4 -5 -4 -5 -4
10 10 10 10 10 10-5
1. Tanah TPA Bentuk koloni Circular - - Filamentous Circular Circular
Moserate
Ukuran koloni - - Large Small Small
(sedang)
Pigmentasi koloni Putih - - Putih kekuningan Putih Putih
Karakteristik optic Transparan - - Transparan Transparan Transparan
Permukaan koloni Mengkilap - - Seperti kapas Mengkilap Mengkilap
Margin Entire - - Entire Entire Entire

Elevasi koloni Raised - - Raised Raised Raised

2. Air Sungai Bentuk koloni - circular - - - -
Ukuran koloni - kecil - - - -
Pigmentasi koloni - putih - - - -
Karakteristik optic - - - - - -

Permukaan koloni - mengkil - - - -

ap
Margin - entire - - - -

Elevasi koloni - Flat - - - -

Gambar 5. Koloni Yeast Pp 10-4 ST Gambar 6. Koloni Yeast Pp 10-5 ST


Gambar 1. Koloni bakteri Pp 10-5 Air
Gambar 2. Koloni bakteri Sp 10-5 Air
Gambar 3. Koloni bakteri Pp 10-4 ST
Gambar 5. Koloni yeast Pp 10-4 ST
Gambar 4. Koloni jamur Sp 10-5 ST
Gambar 6. Koloni yeast Pp 10-5 ST
B. Pembahasan
Praktikum kali ini yang dilakukan
adalah teknik isolasi dan pemurnian
mikroba dengan media Nutrient Agar (NA)
dan media Potato Dextrose Agar (PDA). NA
dan PDA memiliki fungsi masing-masing
dalam menumbuhkan mikroorganisme.
Media NA memiliki fungsi untuk
mengembangbiakan bakteri secara umum.
Sedangkan media PDA berfungsi untuk
menumbuhkan fungi atau jamur.
Pertama-tama yang dilakukan adalah
memasukkan sebanyak 5 ml masing-
masing ke dalam 5 tabung reaksi yang
berbeda selanjutnya disterilkan dengan
otoklaf. Kemudian 1 ml sampel air
dimasukkan ke dalam tabung reaksi 1, 1 ml
sampel dari tabung reaksi 1 dimasukkan ke
dalam tabung reaksi 2, begitu seterusnya
sampai 5 kali pengenceran. Hal ini
bertujuan dilakukan agar memudahkan
dalam isolasi pada saat perhitungan jumlah
koloni, dan agar koloni yang di dapat benar-
benar murni.
Kultur murni ialah kultur yang sel-sel
mikrobanya berasal dari pembelahan dari
satu sel tunggal. Kultur murni atau biakan
murni sangat berguna didalam mikrobiologi,
yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi
mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-
ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun
serologis, memerlukan suatu popolasi yang
terdiri dari satu macam mikroorganisme
saja. Sebelum mengisolasi, harus diketahui
mikroba apa yang akan diisolasi dan
habitatnya menentukan sampel dan media
apa yang akan digunakan. Pemilihan
mikroba sebagai sumber enzim mempunyai
beberapa keuntungan bila dibandingkan
yang diisolasi dari tanaman ataupun hewan.
Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih
mudah ditumbuhkan, kecepatan
LaboratoriumTeknik Lingkungan 16(3). 1-7
pertumbuhan relatif lebih cepat, skala
produksi sel lebih mudah ditingkatkan bila
dikehendaki produksi yang lebih besar,
biaya produksinya relatif rendah, kondisi
selama produksi tidak tergantung oleh
adanya pergantian musim dan waktu yang
dibutuhkan dalam proses produksi lebih
pendek (Gandjar, 2006).
Pemurnian (purification) bertujuan
agar diperoleh biakan murni yang
diinginkan tanpa ada kontaminan dari
mikroba lain. Pemilihan koloni mikroba
yang dimurnikan berdasarkan perbedaan
kenampakan morfologi koloni, baik dari
segi warna, elevasi, tekstur permukaan,
garis- garis radial, lingkaran konsentris
maupun tetes eksudat sehingga diperoleh
isolat murni. Pemurnian isolat bakteri
dilakukan dengan cara memindahkan
bakteri menggunakan metode garis yang
kemudian ditumbuhkan pada media NA,
sedangkan pada pemurnian isolat fungi
menggunakan metode titik dalam proses
pemindahan ke dalam media PDA (Ed-har
dkk., 2017).
Pengisolasian merupakan suatu cara
untuk memisahkan atau memindahkan
mikroba tertentu dari lingkungannya,
sehingga diperoleh kultur murni atau biakan
murni. Ada beberapa cara yang dapat
dilakukan untuk mengisolasi mikroba antara
lain dengan cara goresan (streak plate),
cara tuang atau taburan (pour plate), cara
pengenceran (dilution method), serta
micromanipulator. Pada praktikum kali ini
yang digunakan adalah metode pour plate
(cawan tuang) untuk sampel air dan Metode
spread plate (cawan sebar) untuk sampel
tanah. Sampel yang digunakan adalah air
sungai dan tanah TPA.
Tanah TPA diduga mengandung
bakteri karena merupakan tempat
penimbunan bermacam-macam sampah,
seperti makanan yang membusuk dan
limbah rumah tangga yang mengandung
minyak. Sampah-sampah tersebut
kemungkinan juga telah membentuk
kompos. Oleh karena itu tanah TPA
berpotensi mengandung bakteri Akhir (TPA)
Desember 2018
limbah rumah tangga dan industri kecil
diduga mengandung bakteri penghasil
lipase, karena merupakan tempat
penimbunan bermacam-macam sampah,
seperti makanan yang membusuk dan
limbah rumah tangga yang mengandung
minyak. Sampah-sampah tersebut
kemungkinan juga telah membentuk
kompos. Oleh karena itu tanah TPA
berpotensi mengandung bakteri (zusfahair
dkk., 2010).
Metode pour plate (cawan tuang)
adalah suatu teknik untuk menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar
dengan cara mencampurkan media agar
yang masih cair dengan stok kultur bakteri
(agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar
merata dan diam baik di permukaan agar
atau di dalam agar (Harley & Presscot,
2002).
Metode ini diperlukan pengenceran
sebelum ditumbuhkan pada medium agar di
dalam cawan petri. Setelah diinkubasi akan
terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam
jumlah yang dapat dihitung. Metode pour
plate sangat mudah dilakukan karena tidak
membutuhkan keterampilan khusus dengan
hasil biakan yang cukup baik. Metode ini
dilakukan dengan mengencerkan sumber
isolat yang telah diketahui beratnya ke
dalam 45 mL garam fisiologis (NaCl) atau
larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan
sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak
rusak akibat menurunnya pH lingkungan.
Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali
agar biakan yang didapatkan tidak terlalu
padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu
padat akan mengganggu pengamatan).
Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam
cawan petri steril, dilanjutkan dengan
menuangkan media penyubur (nutrien agar)
steril hangat (40-50 ⁰C) kemudian ditutup
rapat dan diinkubasi selama 1-2 hari pada
suhu 37 ⁰C. Penuangan dilakukan secara
aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak
terjadi kontaminasi atau tumbuh atau
masuknya organisme yang tidak diinginkan
(di laboratorium, kontaminasi biasanya
terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti
5
LaboratoriumTeknik Lingkungan 16(3). 1-7 Desember 2018

Penicilium dalam biakan). Pada metode menyebabkan perhitungan yang salah.

volume kultur sebanyak 0,1-1,0 mL diambil Jumlah koloni yang sangat sedikit juga tidak
dan dimasukkan ke dalam cawan petri diharapkan karena secara statistik
steril. Kemudian ditambahkan media agar keakuratan hasil perhitungan jumlah koloni
cair dan dilakukan pencampuran antara ini sangat rendah. Dalam penerapannya,
kultur dan media dengan memutar cawan secara statistik yang paling baik adalah
petri secara pelan pada permukaan yang menghitung jumlah koloni hanya jika pada
rata. Karena sampel dicampur dengan media agar terdapat koloni antara 30- 300
media agar cair, maka volume kultur yang koloni.
digunakan dapat lebih tinggi dibanding Koloni bakteri di temukan pada
kultur/sampel mikroba yang digunakan tanah TPA dengan konsentrasi 10-4, Koloni
harus dapat bertahan hidup pada saat jamur ditemukan pada tanah TPA dengan
media agar dengan suhu sekitar 45 ºC konsentrasi 10-5 dan yeast pada konsentrasi
ditambahkan. 10-4 dan 10-5. tanah yang berada di dekat
Metode spread plate (cawan sebar) sampah atau tanah yang berada di TPA
adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan umumnya lembab sehingga mudah
mikroorganisme di dalam media agar ditumbuhi oleh jamur.
dengan cara menuangkan stok kultur
bakteri di atas media agar yang telah IV. Simpulan
memadat. Kelebihan teknik ini adalah Berdasarkan hasil praktikum yang
mikroorganisme yang tumbuh dapat telah dilakukan dapat diambil kesimpulan
tersebar merata pada bagian permukaan sebagai berikut :
media agar. Pada metode cawan sebar
sebanyak 0,1 mL suspensi bakteri yang 1. Isolasi adalah cara untuk
telah diencerkan (disebar pada media memisahkan atau memindahkan
penyubur steril yang telah disiapkan. mikroba tertentu dari lingkungannya,
Selanjutnya, suspensi dalam cawan sehingga diperoleh kultur murni atau
diratakan dengan batang drugal agar koloni biakan murni.
tumbuh merata pada media dalam cawan 2. Teknik isolasi yang digunakan dalam
tersebut, kemudian diletakkan dalam percobaan ini adalah teknik sebar untuk
inkubator (37⁰C) selama 1-3 hari (Pradika, isolasi sampel air sungai dan tuang
2008). untuk isolasi sampel tanah TPA.
Pada saat meratakan batang 3. Media yang digunakan dalam
drugal harus benar-benar steril, yaitu percobaan ini adalah media Nutrient
dengan mensemprotkannya terlebih oleh agar (NA) untuk sampel air dan media
alkohol kemudian dipanaskan dengan api Potato Dextrose Agar (PDA) untuk
bunsen. Perlu diingat, batang drugal, yang sampel tanah.
masih panas akibat pemanasan dengan api 4. Koloni bakteri di temukan pada
bunsen, dapat merusak media agar, tanah TPA dengan konsentrasi 10-4,
sehingga harus didinginkan terlebih dahulu Koloni jamur ditemukan pada tanah
dengan meletakkannya di atas api bunsen TPA dengan konsentrasi 10-5 dan yeast
dengan jarak sekitar 15 cm. pada konsentrasi 10-4 dan 10-5.
Penggunaan metode spread plate
dan pour plate sangat penting agar jumlah V. Daftar Pustaka
koloni yang tumbuh pada media tidak terlalu
banyak. Hal ini dikarenakan apabila pada Budiarti.B., & Yulia.L. 2009. Penuntun Praktikum
Mikrobiologi Terintegrasi. Penerbit
cawan petri ditumbuhi koloni yang banyak,
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
beberapa sel tidak dalam bentuk koloni Kedokteran Universitas Lambung
yang tunggal, sehingga dapat Mangkurat, Banjarbaru.
6
LaboratoriumTeknik Lingkungan 16(3). 1-7 Desember 2018

Ed-har. A. A,. Widyastuti. R,. & Djajakirana.G.

2017. Isolasi Dan Identifikasi Mikroba
Tanah Pendegradasi Selulosa dan Pektin
Dari Rhizosfer. Buletin Tanah dan Lahan.
1 (1), 58-64.

Gandjar.I., & Sjamsuridzal.W. 2006. Mikrologi

Dasar dan Terapan. Jakarta

Hadietomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar

Dalam Praktek. PT Gramedia, Jakarta.

Harley, J.P., and Prescott, L.M. 2002. Laboratory

Exercises in Microbiology. 5th Edition, The
McGraw-Hill Companies.

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 2006. Dasar-

Dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta.

Pradika, E.I. 2008. Isolasi Mikroorganisme.

Volk.V., & Wheeler. W 1993. Mikrobiologi Dasar.

Penerbit Erlangga, Jakarta.

Zusfahair. Z., Setyaningtyas.T., & Fatoni.A.

2010. Isolasi, Pemurnian dan
Karakterisasi Lipase Bakteri Hasil
Skrining dari Tanah Tempat Pembuangan
Akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas.
Jurnal Natur Indonesia. 12(2): 124-129.