FIKSASI (FIXATION)
Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang benar.
Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada
tahapan selanjutnya. Jadi hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara
melakukan fiksasi dengan baik.
3. Pengerasan
Efek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak
4. Pemadatan koloid
Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (Sol) menjadi lebih padat (Gel)
5. Differensiasi optik
Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga unsur-
unsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah dibandingkan dengan
jaringan yang belum difiksasi.
6. Pengaruh terhadap pewarnaan
Sebagian besar cairan fiksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat
bagian reaktif jaringan.
dengan mikrotom dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi
menjadi 2 kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan
fiksasi yang tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnov)
dan fiksasi sitoplasma (larutan Muller, formol saline, formol calcium, Zenker
formol).
C. Histochemical fixatives
Fiksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan
histokimia Cairan fiksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau
sedapatnya mengubah seminim mungkin unsur-unsur yang akan
didemonstrasikan. Fiksasi histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat
sebagai berikut:
1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan
2. Mengikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus, tanpa
mempengaruhi gugus reaktif yang digunakan pada visualisasi.
3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi,
misalnya fiksatif glutaraldehida memfiksasi protein jaringan sedemikian
rupa dengan suatu coating terdiri atas gugus aldehida reaktif sehingga
menghasilkan reaksi PAS atau Schiff positif.
A. LARUTAN FORMALIN
Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Laurtan formalin yang
digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah
Formalin (40% Formaldehida) ........................................................ 10 ml
Air .................................................................................................. 90 ml
Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat
larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai Formalin atau 40%
Formaldehida. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan formaldehida 40% =
larutan jenuh gas formaldehida.
Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat
digunakan untuk fiksasi. Yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk
menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan netral
atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekali-kali
menggunakan formalin 10% yang baru dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum
terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat
4
oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit
alkalis dengan menggunakan larutan buffer phosphate dengan pH 7.2 sebagai pelarut, atau
dengan menambahkan kalsium asetat. Yang paling mudah dan murah adalah Formol Saline
dengan formulanya
Formalin (formaldehida 40%) .............................................................. 100ml
Sodium klorida (NaCl) .............................................................. 9gram
Air kran ............................................................ 900ml
Larutan formalin 10% dengan phosphate buffer yang sering digunakan adalah
1. Formol Calcium (Lillie 1965)
Formalin (40% formaldehida) ....................................................... 10 ml
Kalsium asetat ................................................................................. 2 gr
Akuades ................................................................................... ad 100 ml
2. Formol Calcium (Baker, 1944)
Formalin ............................................................................................. 10 ml
Calcium chlorida .................................................................................. 2 gr
Akuades ....................................... ................................................ad 100 ml
3. Buffer formalin
Formalin ............................................................................................ 10 ml
Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0.40 gr
Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0.65 gr
Akuades ...........................................................................................ad 100 ml
4. Buffered formalin sukrosa (Holt dan Hicks, 1961)
Formalin ............................................................................................. 10 ml
Sukrosa ................................................................................................ 7.5 gr
M/15 Phosphate buffer (pH 7.4) .......................................................ad 100 ml
Cairan fiksatif formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik,
phospholipid dan beberapa ensim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian
gabungan secara sitokimia dan mikroskop elektron. Untuk mendapatkan hasil yang terbaik
jaringan harus di dinginkan sampai 4 derajat Celsius dalam refrigerator.
c. Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk karena pembentukannya baru
terjadi bila ada interaksi antara larutan formalin pada pH asam dengan hemoglobin atau
produknya (sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hepar, lien,
sumsum tulang dan sebagainya). Bila pigmen ini terbentuk dapat dihilangkan dengan
perlakuan pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam sodium hidroksida (NaOH)
d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formol salin untuk jangka waktu lama
(dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti
e. Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat di ambil dan
dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lainnya bila diperlukan
B. LARUTAN MULLER
Cairan fiksasi ini merupakan fiksatif sitologi yang dapat digunakan untuk memfiksasi inti
dan sitoplasma sel. Potassium dikromat yang terdapat di dalam larutan Muller akan
memfiksasi protein tanpa mempresipitasikannya. Diduga hal ini terjadi karena ion krom
membentuk kompleks-kompleks dengan air yang mengikat bagian reaktif rantai protein di
dekatnya. Kalium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga
fiksatif yang mengandung ion krom tidak dapat di pakai untuk histokimia. Kalium dikromat dapat
digunakan untuk reaksi kromaffin.
Setelah fiksasi dengan larutan Muller jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir
selama 24 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi, karena memindahkan jaringan secara
langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat
disingkirkan lagi dari jaringan.
C. LARUTAN BOUIN
Larutan fiksatif ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat
berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit dan mudah meledak dalam keadaan kering,
sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara
melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar
larutan.
Asam pikrat mempresipitasikan protein dengan cara membentuk ikatan pikrat-protein.
Asam pikrat menyebabkan sel darah merah menjadi rusak, seringkali menghilangkan Fe+3,
terutama bila berada dalam jumlah sedikit dan dapat melindungi RNA dari proses perusakan oleh
ensim ribonuklease.
dan berfungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya.
Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada zat wara
hematoksilin agar inti tampak jelas dan tajam.
2. Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome.
3. Sangat baik untuk memperlihatkan inti sel seperti pada sel benih di testis dan ovum.
Kekurangan dari larutan Bouin adalah
1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi
setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan
kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom
secara baik.
2. Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna
kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran
semalam. Oleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan
harus segera dipindahkan ke dalam alkohol
3. Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih
cemerlang.
ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar inti tampak lebih jelas dan tajam, mitokondria dan
aparatus Golgi dihancurkannya atau menjadi rusak
F. LARUTAN CARNOY
Larutan ini merupakan larutan fiksatif inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat.
Di samping itu larutan fiksatif ini juga akan mengawetkan substansia Nissl dan glikogen.
Keuntungan dari larutan Carnoy adalah sangat cepat . Fiksasi ini sering digunakan
apabila suatu diagnostik perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya pada bagian bedah untuk
diagnostik sel kanker. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2jam,sedangkan potongan kecil selesai
difiksasi dalam 15 menit.
Kekurangan fiksasi ini adalah efek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian
besar unsur sitoplasma lainnya. Efek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan fiksasi pada
suhu nol derajat Celsius selama 18 jam
10
TEHNIK LENDRUM
Tehnik Lendrum digunakan untuk melunakkan jaringan kulit setelah difiksasi. Hal ini
terjadi karena kulit merupakan jaringan yang keras. Setelah potongan kulit dikeluarkan dari
larutan fiksatif, kulit dicuci sebentar dengan air kran mengalir atau dengan alkohol 90%,
kemudian direndam dalam larutan phenol 4% dalam akwades selama 1-3 hari. Dengan perlakuan
khusus ini diharapkan kulit menjadi mudah diiris dengan pisau mikrotom tajam tanpa merobek .
Sebelum memotong pisau mikrotom sebaiknya direndam dalam es sehingga memudahkan
pemotongan. Setelah dibuat blok, blok preparat sebaiknya disimpan dalam air es.
DEHIDRASI
Dehidrasi merupakan langkah ke dua dalam pemerosesan jaringan. Proses ini (Gb-2)
bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang telah difiksasi
sehingga jaringan nantinya dapat diisi dengan parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk
membuat blok preparat. Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur dengan cairan
parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.
Ada beberapa macam cairan yang dapat dipakai untuk proses dehidrasi yaitu
1. Alkohol
2. sukrosa 20%
3. metil alkohol atau spiritus
Setelah jaringan selesai difiksasi jaringan dipindahkan ke dalam alkohol dan diproses
sebagai berikut
1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari
2. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari
3. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari
4. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
5. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
6. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
11
PEMBENINGAN (CLEARING)
Pembeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan
menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan parafin. Jaringan tidak dapat
langsung dimasukkan ke dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling melarutkan.
Proses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam jaringan masih
tertinggal sedikit alkohol maka parafin tidak bisa masuk kedalam jaringan sehingga jaringan
12
menjadi “ matang diluar, mentah di dalam” dan akan menyebabkan jaringan menjadi sulit untuk
dipotong dengan mikrotom.
Bahan atau reagen pembening yang paling sering dipakai adalah sebagai berikut
1. chloroform
2. benzene/benzol
3. xylene/xylol
4. cedar wood oil
5. benzil benzoat
6. methyl benzoat
Chloroform
Chloroform merupakan clearing agent yang paling sering dipakai, karena sifatnya
yang “toleran” artinya jaringan tidak menjadi keras dan rapuh. Sifat ini tak dipunyai oleh
benzene dan xylene. Jaringan biasanya dibeningkan dalam waktu semalam
Kekurangan chloroform adalah titik akhirnya yaitu saat jaringan telah menjadi bening
dan transparan yang tak dapat terlihat dengan jelas oleh mata. Untuk mengatasi hal ini
jaringan sebaiknya direndam dalam chloroform untuk jangka waktu yang lebih panjang
dari yang sebenarnya, sehingga seluruh alkohol diyakini telah keluar dari jaringan dan
jaringan telah sempurna diresapi oleh chloroform. Kekurangan lainnya adalah chloroform
harganya ebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedarwood oil
Benzyl benzoat
Benzyl benzoat merupakan clearing agent yang lambat penetrasinya sehingga
dibutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama Metoda pembeningan adalah sebagai berikut
1. Benzyl benzoat I
Jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi dan direndam dalam benzyl benzoat
selama semalam (24 jam) sampai seluruh jaringan tenggelam. Benzyl benzoat
mempunyai penetrasi yang lambat sehingga tidak perlu kuatir jaringan menjadi
terlalu keras dan rapuh.. Setelah inkubasi selama semalam, jaringan akan tampak
menjadi bening dan transparan.
2. Benzyl benzoat II
Jaringan lalu dipindahkan ke dalam benzyl benzoat II selama kira-kira 2-3 jam.
3. Benzol parafin
Jaringan lalu dipindahkan ke dalam campuran benzol dan parafin cair dengan
perbandingan yang sama, misalnya benzol/benzene sebanyak 25 ml di campur
dengan parafin cair sebanyak 25 ml juga. Jaringan direndam dalam benzol parafin
selama ½-1 jam.
4. Parafin cair
Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair selam kira-kira ½ jam.
Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.
5. Bisa juga setelah dari benzyl benzoat II jaringan direndam dalam xylol/xylene
selama ½-1jam, baru kemudian dimasukkan kedalam parafin cair di oven selama
½ jam.
14
Cedarwood oil
Cedarwood oil merupakan zat pembening termahal dari semua clearing agent tetapi
merupakan clearing agent terbaik, karena sifatnya yang tidak mengeraskan jaringan,
sehingga nantinya jaringan sangat mudah untuk diiris tipis dengan mikrotom. Jaringan
dapat direndam dalam clearing agent ini untuk waktu yang lama bahkan hingga berbulan-
bulan tanpa menjadi keras dan rusak. Pembeningan oleh cedarwood oil ini sangat baik
tidak hanya untuk jaringan yang halus tetapi juga untuk jaringan yang keras seperti kulit
dan jaringan ikat padat.
Methyl benzoate
Methyl benzoat merupakan clearing agent yang mempunyai dayapenetrasi lebih
cepat dari benzyl benzoat. Kekurangan dari zat clearing ini adalah mudah menjadi
rapuh/keras sehingga menyulitkan pengirisan dengan mikrotom. Prosedur
pembeningannya adalah sebagai berikut
1. Methyl benzoat I
Setelah dikeluarkan dari cairan dehidrasi jaringan dimasukkan kedalam larutan
methylbenzoat sampai tenggelam, dengan waktu kira-kira 2-3 jam.
2. Methylbenzoat II
Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam methyl benzoat II selama 1-2 jam,
tergantung pada besar dan jumlah jaringan.
3. Benzol-Parafin
Jaringan kemudian dipindahkan dan direndam dalam cairan benzol-parafin dan
direndam selama 1/2 hingga 1 jam. Cairan benzol–parafin dibuat dengan
mencampurkan larutan benzol dengan parafin dengan perbandingan yang sama.
4. Jaringan kemudian dipindahkan kedalam cairan parafin selama beberapa menit
PEMBENAMAN (EMBEDDING/IMPREGNASI)
Pembenaman (impregnasi) adalah proses untuk mengeluarkan cairan pembening
(clearing agent) dari jaringan dan diganti dengan parafin. Pada tahap ini jaringan harus
benar-benar bebas dari cairan pembening karena sisa cairan pembening dapat mengkristal
15
dan sewaktu dipotong dengan mikrotom akan menyebabkan jaringan menjadi mudah
robek.
Zat pembenam (impregnasi agent) yang dipakai adalah
1. Pafin caira panas yang mempunyai temperatur lebur (Melting temperature) kira-
kira 56-59 C
2. Parafin histotek khusus (Tissue mat) dengan suhu 56C
3. Paraplast yaitu campuran parafin murni dengan beberapa polimer plastik.
PENGECORAN (BLOCKING)
Pengecoran (Blocking) adalah proses pembuatan blok preparat agar dapat
dipotong dengan mikrotom.
Untuk membuat blok preparat dapat digunakan 2 macam cara
1. Cara lama yaitu dengan menggunakan potongan besi berbentuk L (Leuckhart)
2 buah potongan besi disusun diatas lembaran logam hingga rapat dan
membentuk ruang seperti kubus. Tuangkan sedikit parafin cair di bagian pinggir
tempat pertemuan potongan besi agar tak bocor. Jaringan kemudian dimasukkan
ke dalam ruangan kubus. Selanjutnya parafin dituangkan kedalam ruangan kubus
tersebut. Hal yang harus dicegah adalah jangan sampai gelembung udara mengisi
kedalam blok parafin tersebut.
16
2. Cara baru yaitu dengan menggunakan cetakan dari plastik dan piringan logam
Dengan cara ini histoplate dari plastik diletakkan di atas piringan logam (seperti
cetakan membuat es batu). Tuangkan sedikit cairan parafin ke dalam cetakan
tersebut. Secepatnya masukkan jaringan dengan menggunakan pinset yang telah
dipanaskan (agar parafin tak beku) dan diatur posisinya di dalam cetakan. Parafin
cair kemudian dituangkan kembali hingga menutupi seluruh cetakan tersebut.
Selama tindakan ini cetakan (histoplate dari plastik) dan piringan logam harus
diletakkan diatas hot plate.
PEMOTONGAN (MOUNTING)
Pemotongan (mounting) adalah proses pemotongan blok preparat dengan
menggunakan mikrotom.
Sebelum melakukan pemotongan serangakaian persiapan yang harus dilakukan
adalah
1. Persiapan pisau mikrotom
Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong
dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau
mikrotom kemudian diletakan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu.
Rekatkan blok parafin pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel.
Letakkan tempat duduk blok parafin beserta blok preparat pada tempatnya pada
mikrotom.
2. Persiapan Kaca Objek
Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated (disalut) dengan
zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa
3. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C
4. Persiapan sengkelit atau kuas
Tehnik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut
1. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di
mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian
diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.
17
2. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya
sudut kemiringan berkisar 20-30 derajat.
3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7
mikrometer
4. gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok
preparat secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa
jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan
5. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati
menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur
37-40C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang.
6. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada
kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam
waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan
sengkelit atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat
kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin
tidak melipat.
7. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur
40-45C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan
kaca objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek.
8. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek
berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.
PEWARNAAN (STAINING)
Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong
sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati dengan mikroskop.
Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang
terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang
gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau
lampu mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi
18
(diserap) atau diteruskan. Zat warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar
dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan
adalah sebagai berikut
1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades
2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat
3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan
pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol
dulu sebelum ditambahkan bahan lain.
4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik
5. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan
dengan menyaringnya menggunakan kertas saring
6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan
tuangkan dalam wadah yang sesuai
7. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan
8. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol
yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna
Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat
keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya
seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada
keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsnetrasi
alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%.
Pulasan Hematoksilin-Eosin
Pulasan (pewarna) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat
digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu
pulasan hematoksilin-eosin (HE). Pada pulasan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu
hematoksilin yang berfungsi untuk memulas nti sel dan memberikan warna biru
(basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk
19
memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda
dengan nuansa yang berbeda.
Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863.
Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan
lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang
dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan
hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan
menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida,
hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel
akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk
memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan
disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan
diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yangsering dipakai adalah
mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai
adalah eosin, safranin, dan phloxine.
Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah
1. Hematoksilin Erlich
Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah
berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan
setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya
adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut
o Hematoksilin …………………….. 6 gram
o Alkohol absolut …………………. 300ml
o Akwades ………………………….. 300ml
o Glycerol ……………………………. 300 ml
o Glacial acetic acid ………………. 30 ml
o Potassium alum …………………. berlebihan
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
1. Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol
20
3. Hematoksilin Mayer
Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam
waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu
inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah
o Hematoksilin kristal ……………………….. 1gr
21
4. Hematoksilin Harris
Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining
dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya
adalah sebagai berikut
Kristal hematoksilin …………………………… 5.0 gr
Alkohol 100% ………………………………….. 50 ml
Ammonium/potassium alum ……………….. 100 gr
Distilled water …………………………………… 1000 ml
Merkuri oksida …………………………………… 2.5 gr
Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
1. Larutkan hematoksilin di dalam alkohol
2. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan
3. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut
4. Panaskan dengan cepat sambil di aduk
5. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-lahan
6. Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap
7. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah
berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin
8. Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan
22
9. Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk meningkankan
ketajaman warna inti
10. Saring sebelum digunakan
Larutan Counterstaining
Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah
eosin, safranin dan phloxine.
1. Larutan Eosin
Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan
kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut
1% Stock Alkohol-Eosin
Eosin Y, water soluble ………………………. 1.0 gr
Distilled water ………………………………….. 20 ml
Larutkan dan tambahkan
Alkohol 95% …………………………………….. 80 ml
Working Eosin Solution
Eosin stock solution …………………………… 1 bagian
Alkohol 80% …………………………………….. 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat
glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik
2. Larutan Phloxine
Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution
dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut
Stock Eosin
Eosin Y water soluble …………………………… 1 gram
Distilled water ……………………………………… 100ml
Stock Phloxine
Phloxine B …………………………………………….. 1.5 gr
Distilled water ………………………………………... 100ml
Working Solution
Stock Eosin …………………………………………….. 100ml
23
Pulasan ini menggunakan fiksasi buffer formalin, metoda blok parafin dengan ketebalan
potongan 4-7 mikron. Larutan yang dipakai adalah
Yenner stock solution
Yenner bubuk ………………………… 1 gram
Methyl alkohol ……………………….. 400ml
Yenner working solution
Yenner stok …………………………… 25ml
Air suling ………………………………. 25 ml
Giemsa solution (Stock Solution)
Giemsa bubuk ……………………………. 1 gram
Glyserin …………………………………….. 66 ml
Methyl alkohol …………………………… 66 ml
Campurkan glyserin dengan bubuk Giemsa, masukkan dalam oven 60
C selama 2 jam
Tambahkan 66 ml methyl alkohol
Giemsa working solution
Campurkan Giemsa stok 50 tetes dengan air suling 50ml
Setiap kali harus dengan larutan segar
Larutan Asam asetat glasial 1%
Asam asetat glasial (cuka) …………………… 1ml
Air suling …………………………………………… 100ml