TEMA 1: METODOLOGÍA DEL CULTIVO IN VITRO

Un cultivo in vitro es un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de células o
tejidos de plantas (explanto) en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas y de esterilidad.
Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular: La teoría de la totipotencialidad, enunciada por Haberlandt a principios del S. XX,
postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in
vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado (excepto para células del xilema, ya que éstas ya están
muertas). Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales,
temperatura, fotoperiodo, etc.

-Desdiferenciación: Consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo

celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una
planta es la rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas.

-Balance de reguladores del crecimiento vegetal: El proceso de regeneración de una planta entera es un
proceso largo y no puede llevarse a cabo en un cultivo estanco. Todo proceso de diferenciación está regulado
por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento (hormonas), fundamentalmente de
auxinas (raíces) y citoquininas (vástagos).

El crecimiento y desarrollo in vitro de una planta está determinada por diversos factores:

 Naturaleza del explanto: Algunos explantos son mejores que otros. Dependiendo del explanto, el
desarrollo del cultivo será de una manera u otra (no es lo mismo utilizar meristemos - no diferenciados
- que un trozo de hoja). Recordemos que un explanto es una célula, tejido u órgano de una planta
usado para comenzar el cultivo in vitro. Estos pueden variar desde los meristemos apicales del tallo y
raíz hasta hojas, yemas axilares, zonas internodales o raíces.
 Medio de cultivo: Contiene el agua, la fuente de energía y las sales inorgánicas necesarias para el
crecimiento celular. El uso de más o menos sales u hormonas determinará la vía de desarrollo que
seguirá el cultivo.
 Reguladores de crecimiento: Hormonas, principalmente auxinas y citoquininas.
 Factores físicos: Luz (uso de oscuridad, luz continua o fotoperiodo), temperatura, pH, oxígeno, CO2

1. MEDIO DE CULTIVO

1. 1 COMPOSICIÓN QUÍMICA

Factores que influyen en la elección del tipo de medio de cultivo

 Especie cultivada: algunas especies son más sensibles a altas concentraciones de sales o tienen altos
requerimientos fitohormonas.
 Edad del explanto: los tejidos juveniles, generalmente, regeneran las raíces más rápidamente que los
tejidos adultos y además no precisan de un aporte exógeno de auxinas, tienen concentración de
hormonas óptima.
  Tipo de órgano o estructura a cultivar: Tienen diferentes requerimientos. Por ejemplo: las raíces
requieres tiamina (vitamina) mientras que las hojas no.

Componentes del medio de cultivo

 Agua Destilada: Representa el 95% del medio nutriente. Debe ser lo más pura posible, destilada 
(por evaporación y condensación) o filtrada (por cartuchos que retienen iones o usando carbón activo
que retiene materia orgánica). El agua de grifo NO sirve ya que contiene sales incorporadas.

 Compuestos orgánicos:
-Fuente de carbono: La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente
autótrofos, y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro, por
tanto, es necesario el aporte de C en forma de sacarosa (fructosa y glucosa) normalmente. La
concentración óptima es de 20 a 40 g/L. Otras fuentes incluyen fructosa, glucosa, maltosa o rafinosa.

-Vitaminas: Sólo son necesarias en algunos medios. Normalmente en concentración de 0.2-1.0 mg/L.
Las más usadas son vitamina B1 o tiamina (metabolismo de carbohidratos y biosíntesis aas). Necesaria
con explantos de raíces. Vitamina C (antioxidante). Inositol o mio-inositol (se considera una vitamina
B. En su forma fosforilada forma parte de las membranas). Ácido nicotínico (B3) y piridoxina (B6).

- Aminoácidos: Tirosina, glicina, serina. Son importantes en la morfogénesis, necesarios sólo en

algunos tipos de cultivo.

-Poliaminas, carbón activo: El C activo actúa como antioxidante captando los fenoles oxidados
producidos por el estrés al que está sometido el cultivo in vitro. También filtra iones y materia
orgánica.
-Antibióticos, fungicidas: Para combatir infecciones o contaminación en el interior del tejido del
cultivo. Afectan al desarrollo y crecimiento de las células negativamente, por tanto, su uso debe
limitarse y en cantidades que no dañen la esterilidad del cultivo.

 Sustancias inorgánicas: Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, B, Mn, etc)
Ni, Al, I  no esenciales.
 Mezclas de sustancias orgánicas poco definidas: Complementos orgánicos cuya composición química
se desconoce. Se utilizan si el medio estándar no produce el crecimiento deseado.
- Leche de coco (fuente de hormonas como la kinetina).
- Zumo de tomate (antioxidante).
- Hidrolisado de caseína, peptona y triptona (fuente de vitaminas y aminoácidos).
- Extracto de levaduras (alto contenido en vitaminas B)
 Reguladores de crecimiento - hormonas:
- Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
Auxinas, citoquininas, giberelinas. En menor proporción etileno y ácido abscísico (mirar diapo 7)
- Generalidades:
-Actúan a bajas concentraciones
-Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones
relativas entre las diferentes fitohormonas).
 -Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo
de vida, pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado
fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.
-Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.
-Se usan a concentraciones de 0.001 – 10 μM
-Algunas pueden ser autoclavadas (especialmente las sintéticas como 2,4-D, BA), pero la
mayoría se degradan con el calor y, por tanto, tienen que ser esterilizadas con filtros (IAA,
kinetina, zeatina, etc).
-Se pueden preparar disueltas en agua (GA), NaOH (IAA), etanol (CK), DMSO.

Una mayor ratio de auxina/citoquinina favorece el crecimiento de las raíces en favor de los vástagos.

- Sistemas de soporte: Dependiendo de la naturaleza del cultivo (líquido, sólido, en suspensión)

- AGENTES SOLIDIFICANTES: Se usan en medios sólidos o semi sólidos.

1. Agar: polisacárido de alto peso molecular obtenido de algas. Solidifica a una temperatura entorno a los 45ºC
y se funde entorno a los 65 ºC. Alto contenido de impurezas inorgánicas y orgánicas. Por lo que cultivos
sensibles a la contaminación no se pueden llevar a cabo.

2. Agarosa: es una fracción purificada del agar con menos impurezas. Tiene un menor punto de fusión y
gelificación que el agar. Es más cara que el agar y se suele utilizar en cultivo de protoplastos (los protoplastos
con mas sensibles ya que no poseen pared celular).

3. Gellan Gum: (Gelrite y Phytagel) polisacárido obtenido de bacterias. Alta pureza (muy caro). Se debe
controlar muy bien la concentración de cationes divalentes (Ca) para su solidificación.

Nota: si un medio es muy sólido, tiene la limitación en el crecimiento, ya que éste retiene mucho la solución
nutritiva, por lo que si hay mucho agar, habrá mucha cantidad de solución nutritiva retenida por el agar al
explanto le cuesta más obtener los nutrientes.

-SOPORTES MECÁNICOS: Mantienen el explanto sobre la superficie del medio líquido. Papel de filtro,
lana de vidrio, planchas de poliuretano…(ej: medio hidropónico lo necesita)

Existen también medios de cultivo ya preparados y comercializados. Los más usados son el MS (Murashige
y Skoog), que contiene una concentración de sales muy alta (para callos de hojas de tabaco, por ejemplo); el
White (para raíces) o el B5 (Gamborg) para protoplastos por su baja concentración de sales. SH (para callos).

Ejemplo de cómo afectan la composición del medio, genotipo y agente solidificante a la regeneración de tallos:

1. 2 PROPIEDADES FÍSICAS

- Consistencia: (semisólido o líquido)

El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo
(líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener
importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.) Hiperhidricidad es un
trastorno metabólico/fisiológico por exceso de absorción de agua que puede llevar a la muerte celular. A
simple vista el cultivo se ve "empapuchado".

El cultivo en medio líquido resulta imprescindible en el cultivo de protoplastos (células sin pared) o en
suspensiones celulares.

- Intercambio gaseoso:

Los recipientes de cultivo deben ser estériles (tubos de ensayo, vidrio) y se tapan con un film o tapón de
polietileno para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio
de gases se ve dificultado. Por ejemplo, la inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay
suficiente oxígeno. La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes.

- pH:

Es el factor más importante. El pH óptimo del medio oscila entre 5,5- 6,0 (ligeramente ácido para favorecer la
absorción de sales). El pH del medio afecta:

- Solidificación de agentes gelificantes: A pH bajo no solidifican.

- Reguladores del crecimiento y vitaminas: pHs excesivamente altos o bajas degradan vitaminas por
ejemplo.
- Solubilidad de algunos componentes del medio: pHs ácidos o alcalinos precipitan sales. Por
ejemplo, los fosfatos a pH básico precipitan y desencadenan una deficiencia mineral.
- Absorción de determinados nutrientes: Absorción mediante simporte de nitrato (2H+) o sulfato
(3H+)
- pH del citoplasma

El pH se ajusta con HCl o sosa (K/NaOH). Una vez ajustado es necesario la utilización de tampones como el
tampón fosfato o Mes/Tris. No se usa el tampón de bicarbonato porque la célula puede absorber la amilasa
carbónica y metabolizarla.

2. ESTERILIZACIÓN

Proceso por el cual se destruye o elimina la contaminación en un cultivo in vitro. La contaminación puede
provenir desde el propio material vegetal (puede venir contaminado por esporas y que hongos y bacterias
acaben creciendo), medio de cultivo (el agua debe ser filtrada y puede contener microorganismos que
proliferen por los nutrientes del medio), el aire (cabina de flujo laminar) o del propio investigador (toser,
higiene de guantes, etc). Las técnicas de esterilización más habituales son tres: destrucción física, química y
eliminación física.

2. 1. DESTRUCCIÓN FÍSICA

 Calor húmedo - Autoclave: Consiste en una resistencia que calienta agua en la base, que cuando
hierve y genera vapor dentro del recipiente, alcanza una presión muy alta que es capaz de destruir
bacterias, esporas, hongos, etc. Posee una válvula de escape como medida de seguridad para reducir
la presión. Condiciones de 120 ºC durante 20 minutos a una presión de 1 atm.
VENTAJAS

- Se utiliza para esterilizar el medio e instrumentos de cultivo (pinzas, escarpelos, recipientes, etc).
- Velocidad y simplicidad.
- Destrucción de microorganismos y sus esporas
- No adsorción de líquidos (no existe filtro que adsorba parte del medio)

DESVENTAJAS

- Cambios de pH
- Precipitación de sales (provocaría una deficiencia mineral al no estar éstas disponibles para la
absorción por la célula)
- Despolimerización del agar (incapaz de solidificar otra vez)
- Descomposición de sustancias termolábiles (ejemplo vitaminas u hormonas)

 Calor seco - Hornos o estufas: Condiciones de 160 ºC durante 2 o 3 horas.

VENTAJAS

- Se utiliza para esterilizar instrumentos de cultivo (pinzas, escarpelos, etc)

- Destrucción de microorganismos y sus esporas

DESVENTAJAS

- Tiempos largos (2-3 h)

- No esteriliza plásticos que resista a esas temperaturas
- No se puede utilizar para materiales vegetales (deshidratación) ni medios de cultivo ya que la sacarosa
a esa temperatura se desnaturalizaría y no habría fuente de C disponible.

 Irradiación - Luz UV o gamma: Se trata de radiaciones altamente energéticas. Las cabinas de flujo
laminar están dotadas con lámparas UV que no se pueden encender a la vez que las bombillas
normales ya que si no, no se notaría que la UV está encendida, siendo muy dañina.

VENTAJAS

- Esterilización de material de plástico que no resiste altas temperaturas

- Destrucción de microorganismos y sus esporas

DESVENTAJAS

- Tiempos muy largos

- Muy caro. No se suele utilizar a menos que sea muy necesario ya que su vida útil es limitada y las
lámparas deben ser muy grandes.

2. 2 ELIMINACIÓN FÍSICA

 Filtración: Consiste en pasar la sustancia a esterilizar disuelta en un medio acuoso a través de un filtro
cuyo poro es de 0,22 micras.
VENTAJAS

- Esterilización de sustancias termolábiles

DESVENTAJAS

- Adsorción de sustancias al filtro. No es una desventaja especialmente importante ya que normalmente

se filtran volúmenes grandes de los cuales la pérdida es insignificante.
- Algunas partículas víricas pueden pasar a través de los poros del filtro, pero esto es poco importante
para cultivos vegetales.

2.3 DESTRUCCIÓN QUÍMICA

Se utiliza fundamentalmente para esterilizar el material vegetal. Eliminación de microorganismos en la
superficie externa del explanto, cuesta trabajo eliminar los que están en el interior. Los agentes químicos
destruyen los microorganismos y sus esporas.

 Etanol: para material vegetal (al 70%) e instrumentos (puro y después flamear o diluido al 70%). Es
importante utilizar etanol diluido para el material vegetal ya que el alcohol puro desnaturaliza las
glicoproteínas que se encuentran en gran concentración en las capas externas de las paredes de las
bacterias. Al desnaturalizar estas proteínas, las deshidrata formándose una capa compacta que impide
el paso de más etanol al interior, y así la bacteria no muere.
 Hipoclorito sódico (lejía): sería como una segunda fase del proceso, al 1% durante varios min (si se
utiliza más concentrada se baja el tiempo de exposición)
 Hipoclorito cálcico: penetra lentamente en tejidos
 Peróxido de hidrogeno: 3-10% durante varios min
 Cloruro de mercurio: muy tóxico (0,01-0,05%)

Los tres últimos son muy agresivos y no se suelen utilizar tanto. El tipo de agente químico usado va a depender
del tipo de material vegetal a esterilizar, del tamaño y de qué parte de la planta proviene el explanto. (peróxido
más hipoclorito no se suelen usar nunca juntos  reaccionan y es tóxico para la planta)

Nota:
-El cultivo de meristemos sí es posible porque estos son zonas de la planta donde no existe contaminación
interna, ya que son células tan primarias que no tienen microorganismos en su interior. A los meristemos no
llegan los haces vasculares, ya que el transporte se hace célula a célula, por tanto los microorganismos no
acceden a ellos. También una hipótesis es que son tejidos con alta división celular y gran concentración de
auxinas, que aparentemente desfavorecen la presencia de microorganismos, aunque esto aún está por probar.
-La adición de antibióticos a los medios de cultivo, aunque se debe adicionar una cantidad que no comprometa
la viabilidad de las células vegetales, ya que estas sustancias son tóxicas también para la planta. Se generan
plantas resistentes a estos antibióticos que sólo destruirían a los microorganismos, esto podría ser una ventaja
a la hora de seleccionar plantas transformantes.

2. 4 CABINAS DE FLUJO LAMINAR: "ESTERILIZACIÓN DEL AIRE"

En estas cabinas ya se trabaja en condiciones de esterilidad. Existe una turbina que succiona el aire exterior,
lo pasa por filtros especiales o HEPAs que adhieren las partículas que contiene el aire y lo expulsa al interior
de la cabina esterilizado. La presión positiva en el interior y negativa en el exterior favorece que el aire
esterilizado salga a la cabina.

Presión interior > presión exterior

3. CONDICIONES FÍSICAS

3. 1 LUZ
Es la energía necesaria para realizar la fotosíntesis y actúa como estímulo del crecimiento y desarrollo
(fotomorfogénesis, gracias a los fotorreceptores).

Hay tres aspectos de la luz que son importantes para llevar a cabo los cultivos in vitro:
- La cantidad de luz o la irradiancia: Cantidad de luz que incide sobre la superficie (Wm-2 o μmol m-2 s-
1
). Las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las irradiancias que necesitan los
cultivos in vivo debido a:
o Presencia de carbohidratos en medios de cultivo
o Cultivos in vitro se comportan sólo parcialmente de forma autótrofa

- La calidad de la luz/espectro: Es la longitud de onda. Los cultivos se pueden desarrollar con una sola
lámpara, aunque se pueden usar dos tipos diferentes. El tipo de luz puede influir en la regeneración
de la planta, en el cultivo in vitro. Qué tipo de luz es mejor, depende del tipo de planta, explanto, otras
condiciones, etc. Se averigua a partir de ensayo/error.

- El fotoperiodo: Es la alternancia de los ciclos de luz-oscuridad. Influye de cierta manera, pero al igual
que el espectro, está sujeto a otros factores.

3. 2 TEMPERATURA
Es un factor fundamental. La temperatura de incubación suele oscilar entre los 15-30 º C. La media es de 22-
23ºC. Hay que determinar empíricamente cuál es la temperatura óptima para tu cultivo.

3. 3 HUMEDAD RELATIVA Cantidad de vapor de agua contenido en la atmósfera. No es problema en cultivos

in vitro ya que los cultivos in vitro siempre se encuentran dentro de recipientes.
3. 4 OXÍGENO
Necesidad de una buena aireación para la respiración mitocondrial. Los cultivos líquidos deben agitarse
adecuadamente para una buena difusión del oxígeno. Se debe permitir el intercambio gaseoso.

3.5 DIÓXIDO DE CARBONO

No es limitante ya que los medios contienen carbohidratos debido a la casi nula fotosíntesis de los cultivos in
vitro. Fuente de carbono asegurada, pero no suele ser problema de cultivos in vitro.

4. CÁMARAS DE CULTIVO
Son espacios donde se controlan las condiciones ambientales.
•Control del ambiente físico: Tª, iluminación, fotoperiodo y HR
•Tª: sistema refrigeración-calefacción por medio de aire acondicionado y una sonda.
•Iluminación: fluorescentes y bombillas conectados a un reloj para el fotoperiodo. Pueden ser horizontales o
verticales y eso puede tener diferentes efectos sobre los distintos cultivos.
•Fotoperiodo: programador conectado a circuito de iluminación. Puede estar conectado al de la Tº.
•HR: pulverizador de agua. Las bombillas secan y calientan el ambiente, por lo que el pulverizador es
importante para mantener la temperatura y humedad.

5. ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO

Área de preparación de medios provistos de agua de calidad, balanzas, frigoríficos, congeladores, pH-metros,
etc. Debe de haber autoclaves grandes, una habitación adecuada para almacenar medios. Esta habitación
debe ser frigorífica, debe estar entre 2 y 6 ºC. También debe existir una habitación de transferencia donde
debe haber cabinas de flujo laminar, salidas de gas, microscopios, pinzas, escarpelos. Esta debe estar aislada
y apartada ya que las condiciones de esterilidad deben ser máximas. Por último, debe haber una cámara de
cultivo que controla la luz, temperatura, humedad relativa, etc. Contiene incubadoras, agitadores orbitales.

Toda la información ha sido sacada de Bibliografía