Anda di halaman 1dari 17

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

“ISOLASI DNA DAN AMPLIFIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION”

Diajukan untuk memenuhi tugas akhir Praktikum Biologi Molekuler yang diampu

oleh :

Aprilia Indra K S.Pd M.Biotech

Ragil Saptaningtyas, S.Tr.AK

Oleh :

Yasin Saqfana (G1C016054)

PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

2018
Kata Pengantar

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya
yang telah diberikan, sehingga penyusun bisa menyelesaikan Laporan Praktikum
Biologi Molekuler ini. Adapun tujuan disusunnya laporan ini adalah sebagai syarat
untuk memenuhi tugas akhir Praktikum Biologi Molekuler.

Tersusunnya laporan ini tentu bukan karena buah kerja keras kami semata, melainkan
juga atas bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, kami ucapkan terima kasih sebesar-
besarnya kepada semua pihak yang membantu terselesaikannya laporan ini,
diantaranya:

1. Ibu Aprilia Indra K S.Pd M.Biotech dan Ibu Ragil Saptaningtyas, S.Tr.AK selaku
dosen pengampu mata kuliah Biologi.
2. Para petugas laboratorium Biologi Molekuler Universitas Muhammadiyah Semarang.
3. Orang tua, kerabat, sahabat, dan pihak-pihak lainnya yang tidak bisa kami sebutkan
satu persatu.

Kami sangat menyadari bahwa laporan ini masihlah jauh dari sempurna. Untuk itu,
kami selaku tim penyusun menerima dengan terbuka semua kritik dan saran yang
membangun agar laporan ini bisa tersusun lebih baik lagi. Kami berharap semoga
laporan ini bermanfaat untuk kita semua.

Semarang, November 2018


I. Judul : Isolasi DNA
II. Hari/Tanggal : Sabtu, Oktober 2018
III. Tujuan Praktikum :
1. Mengetahui tahapan-tahapan dalam isolasi DNA.
2. Mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA bufficoat.
IV. Dasar Teori :

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molekul


(molekul utama) yang mengkode semua informasi yang
dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme.
DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu deoksiribosa, basa
nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.
Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemuan
dinukleus, mitpkondria dan kloroplas. DNA yang menyusun
kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun
double helix, dimana basa nitrogen dan kedua “benang”
polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap
melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan
nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA
terdapat didalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai
“cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting
sebagai pembawa informasi yang menentukan struktur protein
dan proses metabolisme lain.

DNA merupakan sebuah polimer yang terdiri dari satuan-


satuan berulang yang disebut nukleotida. Tiap-tiap nukleotida
terdiri dari tiga komponen utama, yakni gugus fosfat, gula
deoksiribosa, dan basa nitrogen (nukleobasa). Pada DNA,
nukleobasa yang ditemukan
adalah Adenina (A), Guanina (G), Sitosina (C) dan Timina (T).
Nukleobasa yang terhubung dengan sebuah gugus gula disebut
sebagai nukleosida, dan nukleosida yang terhubung dengan satu
atau lebih gugus fosfat disebut sebagai nukleotida. Polimer
yang terdiri dari nukleotida yang saling terhubung menjadi satu
rantai disebut sebagai polinukleotida. Sehingga DNA termasuk
pula ke dalam polinukleotida.

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu


prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Isolasi
DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau
dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni
kandungannya.

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu


DNA juga bisa diisolasi. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui
tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian
DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA.

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal


ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain
yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-
hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk
mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti
baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara
mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus
menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi
dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan
membran inti, salah satunya adalah deterjen.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan


karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya mebran sel,
melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen
dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa
”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat
terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik
dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat
membentuk suatu ikatan kimia.

V. Alat dan Bahan :


1. Alat
a. Rak tabung
b. Tabung reaksi
c. Centrifuge
d. Mikropipet
e. Tabung conical
f. Pipet pasteur
g. Kapas alcohol 70%
h. Spuit
i. Vortex mixer
j. Microtube
k. Tip
l. Tube
m. Tissue
n. Hepafix
2. Bahan
a. Isolasi DNA Bufficoat
1. Darah 12 Ml, kemudian diambil seluruh buffy coat
yang ada.
2. Proteinase K 20 µL
3. Buffer lysis yang terdiri dari :
a. 10 mM tris HCl pH 8
b. 100 mM NaCl
c. 1 mM EDTA
d. 0,5 % SDS
e. 0,4 mg/ml Proteinase K
4. Phenol / CIAA
5. Ethanol absolute dingin
6. Ethanol 70%
7. TE Buffer 100 µL
b. Isolasi DNA Whole Blood

1. Darah 6 mL
2. Proteinase K 20 µL
3. Buffer lysis, terdiri dari :
a. 10 mM tris HCl pH 8
b. 100 mM NaCl
c. 1 mM EDTA
d. 0,5 % SDS
e. 0,4 mg/ml Proteinase K
4. Phenol
5. Ethanol 70%
6. TE Buffer 100 µL
7. Loading buffer
8. Cyber safe
9. Gel agarose 1%
c. Isolasi DNA Bakteri Salmonella typhi
1. Proteinase K 20 µL
2. Ethanol 70%
3. TE Buffer 100 µL
4. Buffer lysis, terdiri dari :
a. 100 mM Tris HCl pH 8
b. 100 mM NaCl
c. 50 Mm EDTA
d. 2% SDS
5. Phenol
6. Koloni bakteri Salmonella typhi
7. Media BHI
d. Isolasi DNA Jaringan
1. Daging sapi 3 gr
2. Proteinase K 20 µL
3. Buffer lysis, terdiri dari :
a. 50 mM Tris HCl pH 8
b. 100 mM EDTA
c. 100 Mm NaCl
d. 1% SDS
4. Phenol
5. Ethanol 70%
6. TE Buffer 100 µL

VI. Prosedur Kerja :


A. Cara kerja membuat gel agarose
1. Siapkan buffer TAE 1x
2. 1 gram agarose dilarutkan dalam
3. Dimicrowave sampai mendidih sehingga larutan jernih
4. Tambahkan pewarna
5. Tuang kedalam cetakan
6. Dimasukkan sisiran
7. Ambil sisiran setelah gel sudah mengeras
B. Cara kerja membuat buffer lisis pada jaringan
1. 50 mM Tris HCl pH8
2. 100 mM EDTA
3. 100 mM NaCl
4. 1% SPS
C. Cara kerja isolasi DNA
1. Isolasi DNA Bufficoat
a. Diambil 6 mL darah EDTA
b. Dicentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000
rpm
c. Diambil bufficoat dan pindahkan ke tabung conical
d. Ditambah buffer lisis sebanyak 5 mL, kemudoan gojok
kuat-kuat selama 15 menit
e. Setelah digojok ditambah ss phenol CIAA dengan
perbandingan 1:1 lalu gojok kuat selama 10 menit
f. Dipindah lapisan paling atas (aquoeus)
g. Ditambah etanol 96% dingin dengan perbandingan 1:1
h. Digojok pelan sampai terbentuk benang DNA
i. Dipindahkan DNA ke microtube berisi 350 ul ethanol 70
%
j. Dicentifuge selama 10 menit dengan kecepatan 12.000
rpm, lakukan pencucian sebanyak 2x
k. Buang dan sisahkan endapan lalun keringkan pelet
l. Setelah kering ditambah 100 ul TE buffer
2. Isolasi DNA Whole Blood
a. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b. Diambil sampel darah sebanyak 6 ml.
c. Sampel darah kemudian dimasukkan kedalam tabun
conical.
d. Ditambahkan buffer lysis ke dalam darah dengan
perbandingan 1 : 1 sebanyak 6 ml.
e. Kemudian ditambahkan 20 µL proteinase K.
f. Divortex hingga homogen, kemudian ditambahkan
phenol perbandingan 1 : 1.
g. Dikocok dengan kuat selama 1 jam menggunakan
rotator.
h. Dilakukan centrifugasi selama 20 menit dengan
kecepatan 2800 rpm.
i. Lapisan supernatan (aquos) diambil untuk kemudian
dipindahkan ke tabung conical.
j. Ditambahkan ethanol 70% dengan perbandingan 1 :
1.
k. Lakukan homogenisasi, kemudian dipindahkan ke
dalam mikrotube.
l. Ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µL,
kemudian dilakukan centrifugsi selama 10 menit
dengan kecepatan 12000 rpm.
m. Lakukan pencucian dengan ethanol sebanyak 2 kali.
n. Setelah itu cairan dalam mikrotube dibuang, DNA
dalam mikrotube dikeringkan.
o. Setelah benar benar kering ditambahkan TE Buffrer
sebanyak 100 µL.
p. Kemudian disimpan dalam kulkas.

3. Isolasi DNA Bakteri Salmonella typhi


a. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b. 1 koloni bakteri Salmonella typhy ditumbuhkan ke
dalam media BHI sebanyak 15 mL kemudian
diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
c. Kultur bakteri dilakukan sentrifugasi selama 15
menit pada kecepatan 3000 rpm
d. Supernatan dibuang, kemudian ambil pelletnya
e. Ditambahkan buffer lysis ke dalam darah dengan
perbandingan 1 : 1 sebanyak 6 ml.
f. Kemudian ditambahkan 20 µL proteinase K.
g. Divortex hingga homogen, kemudian ditambahkan
phenol perbandingan 1 : 1.
h. Dikocok dengan kuat selama 1 jam menggunakan
rotator.
i. Lakukan inkubasi selama 30 menit pada suhu 550C.
j. Dilakukan centrifugasi selama 15 menit dengan
kecepatan 3000 rpm.
k. Lapisan supernatan (aquos) diambil untuk kemudian
dipindahkan ke tabung conical.
l. Ditambahkan phenol sebanyak 100 µL, kemudian
dikocok perlahan selama 30 menit
m. Dilakukan centrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 12000 rpm.
n. Supernatan kemudian dipindahkan ke tabung
conical.
o. Ditambahkan ethanol 96% dengan perbandingan 1 :
1.
p. Lakukan homogenisasi hingga terbentuk benang
benang DNA, kemudian dipindahkan ke dalam
mikrotube.
q. Lakukan pencucian dengan ethanol sebanyak 2 kali.
r. Setelah itu cairan dalam mikrotube dibuang, DNA
dalam mikrotube dikeringkan.
s. Setelah benar benar kering ditambahkan TE Buffrer
sebanyak 100 µL.
t. Kemudian disimpan dalam kulkas.
4. Isolasi DNA Jaringan
a. Dipersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b. Timbang sampel daging sapi sebanyak 3 gr.
c. Sampel daging kemudian dimasukkan kedalam
tabun conical.
d. Ditambahkan buffer lysis ke dalam darah dengan
perbandingan 1 : 1 sebanyak 6 Ml.
e. Kemudian ditambahkan 20 µL proteinase K.
f. Divortex hingga homogen, kemudian ditambahkan
phenol perbandingan 1 : 1.
g. Inkubasi pada suhu 550C selama 60 menit.
h. Ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1 : 1.
i. Dikocok dengan kuat selama 30 menit
menggunakan rotator.
j. Dilakukan centrifugasi selama 20 menit dengan
kecepatan 3000 rpm.
k. Lapisan supernatan (aquos) diambil untuk kemudian
dipindahkan ke tabung conical.
l. Ditambahkan ethanol absolute dingin dengan
perbandingan 1 : 1.
m. Lakukan homogenisasi sampai terbentuk benang
benang DNA, kemudian benang benang DNA
dipindahkan ke dalam mikrotube.
n. Ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µL,
kemudian dilakukan centrifugsi selama 10 menit
dengan kecepatan 12000 rpm.
o. Lakukan pencucian dengan ethanol sebanyak 2 kali.
p. Setelah itu cairan dalam mikrotube dibuang, DNA
dalam mikrotube dikeringkan.
q. Setelah benar benar kering ditambahkan TE Buffrer
sebanyak 100 µL.
r. Kemudian disimpan dalam kulkas.

VII. Hasil :

Sumuran 1 = bakteri = ada : smear


Sumuran 2 = darah A = ada : murni
Sumuran 3 =darah F = ada : murni
Sumuran 4 =bakteri = ada : smear
Sumuran 5 = bufficoat = ada : smear/murni
Sumuran 6 = jaringan = tidak ada
Sumuran 7 = darah F = ada : murni
Sumuran 8 = bufficoat Y = tidak ada
Sumuran 9 = bakteri = ada : smear
Sumuran 10 = bufficoat y = ada : murni
Sumuran 11 = jaringan = tidak ada
Sumuran 12 = bakteri = ada : smear
Sumuran 13 = darah A = ada : murni
VIII. Pembahasan :
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA
melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari bahan lan seperti protein, lemak, dan
karbohidrat. Prinsip utama dalan isolasi DNA ada 3 yakni
penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein serta pemurnian DNA. Ada
beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA
antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminasi
seperti protein dan RNA.
Isolasi DNA bergantung pada :
1. Banyaknya DNA yang ingin didapatkan dalam isolasi.
2. Jenis organisme yang akan diisolasi DNAnya.
IX. Kesimpulan :
Pada praktikum isolasi DNA menggunakan sampel Bufficoat
didapatkan hasil yang mengandung DNA murni dan smear pada
sumuran ke 5, dan pada sumuran 8 tidak ada, kemudian sumuran ke
10 mengandung DNA murni.
Dari hasil tersebut disimpulkan bahwa setiap sumuran
memiliki/didapatkan hasil yang berbeda. Hasil sampel yang smear
kemungkinan terjadi kontaminasi oleh protein /RNA dan pada
sumuran 8 dan 10 dari sampel yang sama tetapi didapatkan hasil
yang berbeda, kemungkinan dikarenakan oleh faktor pemipetan
atau pemasukan sampel tidak dikocok terlebih dahulu.
X. Daftar Pustaka :
http://www.generasibiologi.com/2012/08/isolasi-dna.html

Lampiran gambar
I. Judul : PCR (Polymerase Chain Reaction)
II. Hari/Tanggal : Sabtu, 3 November 2018
III. Tujuan Praktikum :
1. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan
mplifikasi DNA menggunakan PCR
2. Mengetahui perbandingan hasil data elektroforesis yang telah
diuji
IV. Dasar teori :
PCR adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang
dikembangkan oleh Karry Mullis. Dengan menggunakan teknik ini
dapat pula dilakukan amplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan
kali hanya dalam beberapa jam. Dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridasi pita yang berlawanan dan
mengapit dua target DNA. Kesedehanaan dan tingginya tingkat
kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan
teknik ini semakin luas penggunaannya. Perbanyakan DNA denagn
melalui siklus berulang secara berseri yang melibatkan tahap
denaturasi, annealing, dan extention sehingga dihasilkan fragmen
DNA yang diinginkan atau spesifik. Keuntungan yang terdapat dalam
jumlah yang sangat sedikit. Selain itu juga dapat memperbanyak
jumlah fragmen DNA yang digunakan untuk mendeteksi suatu gen.
V. Alat dan Bahan :
1. Alat
a. Thermocycler
b. Tabung PCR
c. Micropipet
d. Chamber Elektroforesis
e. UV transiluminator
f. Yellow tip dan blue tip
2. Bahan
a. DNA hasil isolasi
b. Nuclease free water
c. Master mix
d. Primer 1 forward
e. Primer 2 reverse
f. Polimerase
VI. Prosedur Kerja :
A. Tahap PCR
1. Tahap pemipetan
 Disiapkan 4 buah tabung PCR (tabung 1, 2, 3, dan 4)
 Dipipet 7,5 ul Nuclease Free Water pada masing masing
tabung
 Ditambah master mix, dipipet 12,5 ul pada masing
masing tabung
 Ditambah 1 ul sampel DNA
1. Tabung 1 sampel 1
2. Tabung 2 sampel 2
3. Tabung 3 sampel 3
4. Tabung 4 sampel 4
 Divortex sebentar agar tercampur
 Dispindown agar cairan pada dinding tabung turun ke
bawah
 Dimasukkan ke dalam PCR (Thermocycler)
2. Tahap Pensetingan Alat
 Suhu 95°C hot start 4 menit
 Suhu 95°C denaturasi 30 detik
 Suhu 48°C anealling 30 detik
 Suhu 72°C elongasi 2 menit
 Suhu 72°C extra extensi 10 menit
 Suhu 4°C cooling down 10 menit
 Pengulangan 34 kali selama 3 jam 9 menit pada tahap
denaturasi sampai elongasi
3. Tahap Elektroforesis
1. Pembuatan Gel Agarose
a. Ditimbang 1 gram serbuk agarose
b. Ditambah 50 mL TAE 1x
c. Di microwave 600°C
d. Setiap 20 detik dibuka dan digoyang-goyang sampai
dengan larutan bening dan tercampur, tunggu agak
dingin
e. Diletakkan pada elektroforesis dan ditambah TAE 1x
2. Elektroforesis
a. Dipipet marker bufficoat 5 ul
b. Dipipet sampel hasil PCR 7 ul (pada lubang/sumuran
2-8)
c. Dialiri listrik 100 volt sampai dengan aliran turun
kebawah
d. Dibaca dengan UV transiluminator
VII. Hasil :
Setelah dilakukan proses elektroforesis sampel DNA hasil PCR target
berada pada 1520 bp. Hasil elektroforesis yang dilihat menggunakan
UV transiluminator menunjukkan :
1. Sumuran 1 dan 16 merupakan marker.
2. Sampel bakteri pada sumuran 4,6,7,8, dan 9 berada pada
sequense 1500 bp (sesuai/mendekati target).
3. Sampel bakteri pada sumuran 1,2,3,5 tidak terdapat DNA.
4. Sampel whole blood pada sumuran 10 dan 13 tidak terdapat
DNA.
5. Sampel bufficoat pada sumuran 8 dan 15 tidak terdapat DNA.
6. Sampel sapi/jaringan pada sumuran 12 dan 14 tidak terdapat
DNA
VIII. Pembahasan :
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah
templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek
yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan
urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide
triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2 ) dan enzim
polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1)
pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3)
penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan
primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2)
sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana
pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.
Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan
optimasi proses PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat
dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada
proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-
faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini
berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR
dan waktu.
IX. Kesimpulan :
Berdasarkan hasil praktikum PCR yang dilakukan hasil sampel pada
bakteri diperoleh 1500 bp yang sesuai dengan acuan target pada
NCBI yaitu 1520 bp, namun pada sampel yang lain tidak diperoleh
hasil yang sesuai.
X. Daftar Pustaka :
https://core.ac.uk/download/pdf/11980242.pdf
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/
Lampiran gambar