Generasi Biologi

logo

MENU

SEARCH...

Home » Biologi Molekular » Pengertian dan Prinsip Kerja Real Time PCR

Pengertian dan Prinsip Kerja Real Time PCR

Biologi Molekular

Real Time PCR adalah teknik yang digunakan untuk memonitor progress reaksi PCR pada waktu yang
sama (Biosoft, 2007). RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA,
cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat dihitung secara kuantitatif.

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang
meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada
tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada
double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green atau EvaGreen®Reagents ) atau menggunakan probe
spesifik sekuens/sequence specific probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes).

Gambar 1. Contoh Mesin Real Time PCR

Analisis menggunakan Real time PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR
tertentu. Real time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara Real Time
menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung pada waktu yang bersamaan. Real Time-RT
PCR memiliki tambahan siklus Reverse Transcription yang memacu perubahan molekul DNA dari molekul
RNA. Real Time-RT PCR diperlukan karena RNA kurang stabil dibandingkan dengan DNA.

Gambar 2. Proses Real Time PCR pada deteksi target non-spesifik (Fraga et al., 2008).

Pada prosedur Real Time PCR, molekul reporter dengan fluoresensi (pada Gambar 2 ditunjukkan dengan
bagian berwarna hijau) digunakan untuk memonitor proses PCR. Fluoresensi akan dipendarkan oleh
molekul sebagaimana terakumulasinya produk PCR pada tiap siklus proses amplifikasi. Berdasar pada
molekul yang digunakan untuk deteksi, teknik Real Time PCR dapat dibedakan sebagai berikut:

1. Deteksi target non-spesifik menggunakan pewarnaan DNA

Pada Real Time PCR, pewarna DNA digunakan sebagai reporter fluoresensi untuk memonitor reaksi Real
Time PCR. Fluoresensi pada reporter akan terakumulasi seiring dengan proses amplifikasi yang
berlangsung. Pencatatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung pancaran fluresensi tiap siklus
PCR. Hal tersebut mungkin untuk dilakukan guna memonitor reaksi PCR selama fase eksponensial. Jika
grafik digambarkan antara log jumlah awal template dan hubungan peningkatan fluoresensi reporter
selama proses Real Time PCR, maka akan didapatkan suatu garis hubungan yang menunjukkan kuantitas
gen yang diekspresikan.

2. Deteksi target spesifik

Deteksi target spesifik Real Time PCR dilakukan menggunakan beberapa probe oligonucleotide yang
dilabeli pada dua bagian reporter dengan label (pewarna) fluoresensi/fluorescent dye dan pewarna
quencher/ quencher dye.

Kuantitas mRNA dalam sel merupakan parameter jumlah gen yang terekspresi. Untuk menganalisa
tingkat ekspresi gen, cDNA yang telah disintesis dari mRNA diuji secara kuantitatif menggunakan real
time PCR. Analisis hasil real time PCR dapat dilakukan secara absolute quantification dan relative
quantitation. Metode relative quantitation atau yang dikenal juga dengan comparative threshold method
menghilangkan kebutuhan akan kurva standar yang digunakan dalam perhitungan absolute
quantification dan menggunakan perhitungan secara matematika untuk mengukur tingkat kuantitatif
relatif ekspresi dari gen target dengan menggunakan gen referensi dan kalibrator dari jaringan (Arya et
al., 2005).

Untuk mengetahui ekspresi suatu gen maka dibutuhkan gen referensi sebagai pembanding internal
(endogenous control) jumlah DNA agar tidak terjadi kesalahan interpretasi akibat jumlah DNA yang
berbeda. Gen referensi yang digunakan adalah gen yang tidak terpengaruhi oleh lingkungan. Gen yang
paling banyak digunakan adalah housekeeping gene seperti actin dan gliseraldehida-3-fosfat-
dehidrogenase (GAPDH) (Bustin, 2000).

Hasil real time PCR dengan metode comparative threshold meliputi nilai Cq dan relative quantitation. Cq
merupakan hasil fraksi jumlah siklus PCR dimana nilai reporter fluoresensi lebih besar dari tingkat deteksi
minimal mesin real time PCR sehingga amplicon meningkat secara signifikan. Nilai Cq didapat dari jumlah
siklus pada proses PCR yang berpotongan dengan garis threshold. Threshold adalah garis yang menandai
peningkatan sinyal fluoresensi secara signifikan berdasarkan variabilitas baseline, namum posisi
threshold dapat diatur bebas pada setiap titik di fase eksponensial (Life TechnologiesTM, 2012).

Nilai relative quantitation dihitung berdasarkan satuan massa dengan rasio nilai Cq kalibrator dengan Cq
sampel dengan bentuk rumus:

Rasio(sampel/kalibrator) = ECq (kalibrator)-Cq (sampel)

E adalah nilai efisiensi amplifikasi yang menjelaskan berapa banyaknya target yang diproduksi dalam
setiap siklus PCR. Jika proses PCR efisien 100%, maka setiap siklus akan memproduksi dua kali lipat hasil
dari template semula. E bernilai 2 jika amplifikasi PCR 100% efisien (Bio-Rad, 2006). Jika E bernilai 2,
maka perhitungannya menjadi sebagai berikut:

Rasio(sampel/kalibrator) = 2Cq (kalibrator)-Cq (sampel) ;atau

Rasio(sampel/kalibrator) = 2DCq ; dimana DCq = Cq(kalibrator) – Cq(sampel)

Analisis relative quantitation menggunakan gen referensi yang umum digunakan adalah Livak Method
atau yang dikenal juga dengan metode 2-DDCq dan metode Pfaffl. Pada metode ini diperlukan formula
rumus alternatif untuk menentukan ekspresi relatif gen target pada sampel yang berbeda-beda (Pfaffl,
2001).

Untuk menentukan rasio antara sampel dan kalibrator, digunakan rumus berikut ini:

Aplikasi dari Real Time PCR (Biosoft, 2007) antara lain digunakan sebagai studi expresi gen secara
kuantitatif, penghitungan jumlah copy DNA (cDNA) pada genom atau DNAs virus, analisis pembedaan
alel atau genotiping Single Nucleotide Polymorphism SNP, untuk verifikasi hasil microarray, keefektifan
obat terapi, penghitungan kerusakan DNA.

Perbedaan Real Time PCR dan PCR biasa yaitu, dengan Real Time PCR deteksi produk PCR dapat
dihasilkan pada fase awal reaksi. PCR biasa hanya menggunakan Electrophoresis gel untuk deteksi
produk amplifikasi PCR pada fase akhir, tanpa mengetahui jumlah produk PCR yang diekspresikan atau
dihasilkan.

inShare

Subscribe to receive free email updates:

Your email address...

Related Posts :

Pengertian dan Metode Biologi Molekuler

Pengertian biologi molekuler pertama kali dikemukakan oleh William Astbury pada tahun 1945.
Pengertian biologi molekular pada saat ini mer… Read More...

Manfaat dan Metode Marka (Penanda) Molekuler

Dalam dunia biologi molekular terdapat istilah “marka molekuler” (molecular marker) atau dapat juga
diartikan penanda molekuler. Pembah… Read More...

Database Biologi Molekular

Dalam perkembangan ilmu biologi molekular, database adalah kumpulan data yang terkomputerisasi dan
saling terkait satu sama lainnya. Da… Read More...

Pengertian dan Jenis Marka (Penanda) Molekuler

Menurut Semagn et al (2006), definisi marka (penanda) molekuler adalah sekuen DNA yang dapat
diidentifikasi, dan terdapat pada lokasi tert… Read More...

Sistematika dan Filogenetika Molekuler

Selama berabad-abad, para ilmuwan berusaha mendeteksi, mendeskripsikan, dan menjelskan

keanekaragaman hayati dengan pendekatan sistemat… Read More...

Posting Lebih BaruPosting LamaBeranda

POSTINGAN POPULER

RIBUAN Daftar Nama Latin (Ilmiah) Tumbuhan/Tanaman TERLENGKAP

Materi Archaebacteria dan Eubacteria LENGKAP

Macam-Macam Sendi Pada Manusia dan Gambar Letaknya

Struktur dan Fungsi Protein

Pengertian dan Struktur Tingkat Organisasi Kehidupan LENGKAP

Kultur Jaringan Tumbuhan

Prinsip, Metode, dan Teknik Isolasi DNA

Pertumbuhan dan Perkembangan Hewan, Materi Lengkap

Substansi Genetika LENGKAP

Pola-Pola Hereditas

Temukan Kami di Facebook

Blog Follower

TULISAN FAVORIT

RIBUAN Daftar Nama Latin (Ilmiah) Tumbuhan/Tanaman TERLENGKAP

Tahapan Pembelahan Meiosis Lengkap Beserta Gambar

Substansi Genetika LENGKAP

Pengertian dan Struktur Tingkat Organisasi Kehidupan LENGKAP

Macam-Macam Sendi Pada Manusia dan Gambar Letaknya

#HASTAG

ZOOLOGI BOTANI SPESIES BARU BIOLOGI SMA EKOSISTEM BIOLOGI MOLEKULAR MIKROBIOLOGI
FISIOLOGI TUMBUHAN ARTIKEL EKOLOGI FISIOLOGI HEWAN KESEHATAN BIOKIMIA GENETIKA
BIODIVERSITAS KLASIFIKASI LINGKUNGAN BIOTEKNOLOGI TAKSONOMI IMUNOLOGI ORNITOLOGI
ENTOMOLOGI ANATOMY BIOLOGI SEL HERBOLOGY LABORATORIUM NUTRISI MIKOLOGI MIKROTEKNIK
REKAYASA GENETIKA ENZIMOLOGY VIROLOGI EVOLUSI BIOINFORMATIKA EKSPEDISI BIOFISIKA E-BOOK
BIOLOGI FORENSIK HERPETOLOGI HISTOLOGI TERATOLOGI ASTROBIOLOGY BIOMATEMATIKA
BIOSPIRITUAL CONNECTOME METABOLISME NAMA LATIN/ILMIAH TOKSIKOLOGI ENDOKRIN GLOBAL
WARMING NEUROSAINS CHROMISTA EMBRIOLOGI FISIOLOGI MANUSIA HORMON KONSERVASI
MORFOLOGI HEWAN PALEONTOLOGI TEKNOBIOLOGI

Copyright 2016 Generasi Biologi

Powered by Blogger.com