Manual BQ 3 2018

Manual de Laboratorio de
Bioquímica III
Recopilado y adaptado por:

Coordinación de Biotecnología del I2QB3, 2008
Modificaciones y revisiones:
Facultad de Medicina de la UMG en 2010, 2012 y 2014
Coordinación de Química del I2QB3, Septiembre 2014
INDICE
No. de Nombre de la práctica No. de

práctica página
0 Normativa de laboratorio 3
1 Capacidad buffer 12
2 Separación e identificación de proteínas en suero y 23

plasma
3 Coagulación sanguínea 30
4 Función renal: determinación de creatinina 37
5 Función renal: determinación de urea 45
6 Determinación enzimática de ácido úrico 50
7 El Elisa como un análisis cualitativo y cuantitativo 55
8 Determinación cualitativa de tiroxina y 68

triiodotironina total
9 Determinación de cortisol 75
10 Determinación FSH y LH 82
11 Determinación del límite de detección de una 88

prueba cualitativa prueba HCG de embarazo
Manual de Bioquímica III Página 2

PRÁCTICA No. 0
INTRODUCCIÓN AL TRABAJO DENTRO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
NORMATIVA DE COMPORTAMIENTO Y DE TRABAJO
Introducción
Trabajar dentro de un laboratorio de cualquier índole supone un grado de

responsabilidad del cual muchos estudiantes no están conscientes. Es necesario que cualquier persona que se
encuentre dentro de las instalaciones del laboratorio sepa comportarse de forma adecuada. Un mal
comportamiento no solamente tendrá implicaciones disciplinarias, sino podría también tener serias implicaciones
de salud y seguridad. Es absolutamente necesario que tanto el instructor como el estudiante que trabaja dentro
del laboratorio sepan que una acción fuera del comportamiento adecuado puede desencadenar un serio
accidente que puede afectar tanto la salud y seguridad propia como la de los demás. Para evitar este tipo de
situaciones, se ha diseñado una práctica de introducción para dar a conocer al estudiante lo que se espera de
él o ella durante el transcurso de los laboratorios.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Conozca la responsabilidad que adquiere al trabajar dentro del laboratorio de Bioquímica.
2. Conozca el trabajo que se espera de él o ella antes, durante y después de realizarse un laboratorio de
Bioquímica
3. Se comprometa con los Laboratorios del Instituto a guardar compostura tanto en su rendimiento académico
como en su comportamiento personal, de manera que pueda obtener el mayor provecho de su experiencia en
el laboratorio.
Alcance
Que el estudiante:
1. Conozca la forma de evaluación dentro del laboratorio
2. Esté consciente de las consecuencias de su calidad de trabajo en el laboratorio
3. Conozca a cabalidad los aspectos que se tomarán en cuenta en la evaluación del laboratorio como parte
del curso de Bioquímica.

Reglamento para el estudiante
Para que un estudiante tenga derecho a participar en las sesiones del Laboratorio de Bioquímica, debecumplir con
las siguientes reglas:
1. Estar inscrito en el curso teórico de Bioquímica III.
2. Guardar un comportamiento adecuado en las actividades del laboratorio, adhiriéndose completamente al

REGLAMENTO DEL LABORATORIO establecido. Puede encontrar una copia del REGLAMENTO DEL LABORATORIO
en el apéndice al final de este manual. El faltar al reglamento tiene consecuencias que pueden llegar hasta el
retiro definitivo del laboratorio.
3. Asistir al laboratorio de manera PUNTUAL. El alumno que no se presente puntualmente a la puerta

del laboratorio, perderá el derecho de presentar examen corto. El alumno que se presente después de
haberse presentado las instrucciones para el laboratorio, perderá el derecho de ingresar a la práctica.
4. De no asistir a una práctica, el alumno pierde automáticamente el derecho a presentar todos los
componentes de la nota de esa práctica, teniendo un cero inmediato. Sin embargo, si el alumno justifica su
ausencia (razones médicas o por luto), la nota de ese laboratorio será eliminada del promedio para obtener la
nota final. Independientemente que su ausencia sea justificada o no, es responsabilidad del alumno
ponerse al día con el contenido de la práctica perdida. Existe la opción de reponer prácticas si el
alumno lo tramita con su instructor anticipadamente y si existe espacio disponible para hacerlo.
5. Haber cumplido con las tareas preparativas de cada práctica, las cuales incluyen,
pero no se limitan a, la información solicitada en el cuaderno, una lectura a conciencia de la práctica y
cualquier investigación previa que se haya solicitado (ya sea escrita o no). Se practicará un examen corto al
inicio de la práctica para asegurar que el alumno conoce el tema a tratar y el procedimiento a seguir.
Queda a discreción del instructor permitir la entrada de un alumno que evidentemente no maneja el
conocimiento previo requerido.
6. Utilizar su equipo de protección personal todo el tiempo que se encuentre dentro de las instalaciones del
laboratorio. Como equipo de protección personal se incluye: bata larga (siempre cerrada), de manga larga,

sin bolsas en los costados y deberá contar con su respectivo nombre y logo de la Universidad, anteojos
de seguridad y zapatos cerrados. El no cumplir con esta regla es causa justificada para retirar a un alumno
del laboratorio del día, perdiendo el derecho a presentar examen, cuaderno, práctica y reporte. De reincidir,
el alumno incluso puede ser retirado definitivamente de laboratorio.
7. No llevar consigo bolsas, mochilas ni artículos de uso personal (celulares, localizadores, joyas, etc.). De
descubrirse que un alumno porta consigo una de estas pertenencias, ésta se confiscará y se devolverá al
final de la práctica. No utilice su teléfono móvil como calculadora; lleve la propia. El laboratorio no se
hace responsable de guardar ninguna pertenencia personal de los alumnos durante la práctica. Es
responsabilidad del estudiante asegurar sus pertenencias personales ANTES de llegar al laboratorio.
Trabajo antes de llegar al laboratorio: El Pre-Lab

El laboratorio es un lugar donde nunca debe llegarse a improvisar. Es necesario asegurar que el estudiante esté
familiarizado con el tema a tratarse en el laboratorio, así como con el procedimiento que se seguirá. Como ayuda
al estudiante, se ha diseñado un cuestionario que llamaremos Pre-lab. Responder el Pre-lab a conciencia tiene la
ventaja de ayudar a un mejor rendimiento para el examen corto que se realizará en cada práctica al inicio de la
misma.
El Pre-lab es un cuestionario que queda bajo la responsabilidad del estudiante el resolver a conciencia para
asegurarse que se comprenderá el trabajo que se va a realizar durante el laboratorio. La resolución escrita del
Pre-Lab deberá entregarse al Instructor antes de empezar la práctica del día.
Para la presentación del Pre-Lab se deberá incluir:
- Revisión Bibliográfica acerca de la práctica (No más de una página)
- La importancia Clínica-medica que tiene la práctica
- Cuestionario
- Referencias Bibliográficas
Trabajo dentro del Laboratorio

Como se indicó anteriormente, se espera que el estudiante haga su mejor esfuerzo para aprovechar al
máximo el recurso que se tiene en el laboratorio. El trabajo que se realice dentro del laboratorio deberá ser
registrado por cada estudiante a manera de poder comprobar qué se hizo, cómo se hizo y cuándo se hizo.
Para este propósito, es necesario la realización de un examen corto y que cada uno lleve un cuaderno de
laboratorio.

Examen Corto
Al inicio de cada laboratorio se realizará un examen corto que evidenciará el conocimiento con el que se preparó
el estudiante para la práctica. El alumno pierde el derecho a esta prueba si llega después de iniciado el laboratorio.
Cuaderno de Laboratorio
El cuaderno de laboratorio está diseñado para cumplir como evidencia del trabajo que se ha realizado
durante cada práctica de laboratorio. Lo más valioso de su cuaderno de laboratorio es el contenido. Aunque su
presentación es importante, no es lo principal en un cuaderno de laboratorio, por lo que el estudiante no debe temer
a hacer cualquier anotación dentro de su cuaderno en cualquier momento.
Cada estudiante debe poseer un cuaderno de laboratorio que cumpla con ciertas especificaciones establecidas.
Si alguna persona desea usar el cuaderno de laboratorio de otro curso que haya llevado previamente, puede
hacerlo siempre y cuando se identifique claramente el cuaderno (vuelto a forrar si hay cambio en el color a usarse) y
la sección que se utiliza. No puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultáneos en un
mismo ciclo.
Un trabajo que no puede leerse simplemente no tiene validez alguna, por lo que se espera que el estudiante tenga
un cuaderno tan ordenado como sea posible, y sobre todo, legible. No se permitirá el uso de lápiz o de corrector en el
mismo.
El cuaderno de laboratorio deberá contener las siguientes secciones:

Trabajo posterior al laboratorio
La principal forma de evaluación del trabajo hecho durante el laboratorio, así como la comprensión obtenida
después de realizado el laboratorio, es el reporte del mismo. En él de evidencia el nivel de comprensión y la
calidad del trabajo realizado por el estudiante.
Reporte del Laboratorio

El reporte de laboratorio tiene doble función: permite al estudiante entrenarse en el arte de la escritura
científica y le brinda la oportunidad de demostrar qué tanto aprendió durante la realización de la práctica.
Para presentar un buen reporte de laboratorio, el estudiante debe esforzarse en varios aspectos. Primero, debe
asegurarse que el contenido del reporte sea acorde al tema que se trató en el laboratorio. Segundo, es
necesario que muestre tanto una buena redacción como una buena ortografía. Como futuros médicos, es
importante que los estudiantes ejerciten su habilidad de escribir bien, ya que forma parte de la buena
formación de todo profesional.
El reporte debe contener las siguientes secciones:

El reporte de laboratorio debe ser entregado durante el período de laboratorio siguiente de realizada la
práctica. Todo reporte debe presentarse escrito con máquina de escribir o impreso. No se recibirán reportes parcial
o totalmente escritos a MANO (salvo excepciones precisas indicadas por su instructor), ni en formato
electrónico. Estos deberán entregarse debidamente engrapados. Se entregará una hoja de control de entrega de
reporte, donde se anotará semanalmente la fecha en que se entregó el informe.
Toda aquella persona que se haya ausentado por cualquier motivo de una práctica, NO TIENE DERECHO a
entregar un reporte, sin importar si la falta ha sido justificada o no. De ser justificada, la nota de dicho laboratorio
se eliminará, a manera de no ser tomada en cuenta en el cálculo de la nota final. Sin embargo, esto no quiere
decir que el estudiante se libere de la evaluación del tema de la práctica durante las pruebas finales del
laboratorio del curso. ES RESPONSABILIDAD DEL ALUMNO investigar el tema tratado durante la práctica que
faltara, independientemente si la falta ha sido justificada o no.
IMPORTANTE: NO se tolerará ningún tipo de copia en los reportes de laboratorio. Cualquier indicio de plagio
(reproducción no autorizada de una publicación, palabra por palabra, incluyendo Internet) será castigado con
una nota de cero en el reporte. Cualquier indicio de copia (entrega de reportes idénticos por parte de dos
o más alumnos) será evaluado como un cero para todos aquellos estudiantes que tengan el reporte igual, sin
importar quién lo generó ni quién lo copió. Todo caso quedará documentado, y una reincidencia puede
significar el retiro definitivo del o los alumnos involucrados del laboratorio del curso.
Los reportes se corregirán durante la semana y se devolverán en la siguiente semana. Si algún
alumno tiene cualquier reclamo sobre la forma en que se ha calificado su reporte, debe hablar con el
catedrático DENTRO DE LA PRIMERA SEMANA después de haberlo recibido corregido. No se aceptarán
reclamos posteriormente.
Las actividades que se entreguen impresas deberán de ir debidamente identificadas de la siguiente manera:

Evaluación de todo el trabajo del laboratorio
Cada práctica realizada en el laboratorio (una vez por semana) se evaluará de la siguiente manera:
Rubro a evaluar Puntaje

Examen corto de laboratorio 15
Pre-laboratorio 20
Cuaderno de laboratorio 10
Trabajo dentro del laboratorio (apreciación por el 5
instructor)
Reporte de laboratorio 50
Total Práctica Individual 100
Al final del curso, la nota final de laboratorio se compondrá de la siguiente forma

Rubro a evaluar Puntaje
Prácticas de laboratorio (10 prácticas) 16
Examen parcial de laboratorio (Incluye los temas vistos 2
hasta la fecha de realización)
Examen final de laboratorio (Incluye los temas vistos en 2
todas las prácticas del laboratorio)
Total Nota de Laboratorio 20
Bibliografía de referencia:
1. Mazariegos, D. & Molina S. 2008 Manual de Prácticas de Bioquímica 3, Universidad Mariano Gálvez de
Guatemala y El I2QB3. Modificado en 2012 por Del Cid, N.

PRÁCTICA NO. 1
CAPACIDAD BUFFER
Introducción
El papel de las soluciones buffer es de gran importancia no solamente para el organismo sino para el
trabajo dentro del laboratorio. El pH de los diferentes fluidos orgánicos varía grandemente. Por ejemplo, el jugo
gástrico se encuentra en el rango de pH 1 y no se regula en gran manera, mientras que el pH de la sangre ronda
los 7.40 y es uno de los parámetros más regulados del organismo. Para cumplir esta regulación, el organismo
se vale de las propiedades de algunos compuestos químicos que tienen capacidad de “resistir” cambios de pH
drásticos por la adición o remoción de iones H+. Estos compuestos forman las conocidas soluciones buffer,
de gran importancia dentro del organismo.
Esta práctica ayuda al estudiante a darle un significado más allá que el puramente teórico a la existencia y
comportamiento de las soluciones buffer, así como a sus propiedades. El significado del pK de disociación pasa
de ser un valor numérico a un valor práctico que el cuerpo usa en la regulación del pH. El principal propósito de
esta práctica es ilustrar al estudiante a visualizar algunos procesos, en su versión simplificada, que se llevan a
cabo dentro del organismo.
Objetivos
Que el estudiante
1. Conozca las propiedades de las soluciones buffer y la importancia de su rol dentro del organismo y
dentro de las actividades del laboratorio de Bioquímica.
2. Determine el valor de pK de disociación de un ácido débil (KH2PO4).
3. Identifique una solución con mejor comportamiento de buffer.

Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparación de soluciones.
2. Conozca la forma correcta de utilizar un potenciómetro.
3. Aprenda la aplicación de curvas de calibración de un aparato simple.
4. Aplique su conocimiento matemático en la obtención e interpretación de gráficos en el laboratorio.
Antecedentes
El agua tiene diversas propiedades que le ha convertido en el solvente universal adecuado para la vida tal
y como la conocemos. Es una molécula tetraédrica con extremos ligeramente cargados, dándole carácter de
molécula polar. Esta característica le permite interaccionar con la gran cantidad de moléculas de diferente
naturaleza que nos conforman.
Es capaz de formar puentes de hidrógeno, lo cual estabiliza su relación con otras moléculas de agua así
como otras moléculas polares (hidrofílicas). Esta propiedad ayuda a que la estructura tridimensional de las
grandes moléculas orgánicas, como proteínas y ácidos nucleicos, pueda ser estable.
Una de sus propiedades más importantes fisiológicamente es la tendencia que muestran las moléculas
de agua a que una pequeña porción de ellas se disocien. El agua tiene capacidad para funcionar como ácido
o como base, por lo cual su disociación puede escribirse como una transferencia de protones entre ácido y
base, de la siguiente forma:
Se ha observado que la tendencia del agua a disociarse se comporta de manera tal que mantiene una
constante de disociación, K, la cual se define de la siguiente manera:

Sin embargo, la disociación del agua se da en un grado tan pequeño que no afecta la concentración total del
agua, así que puede incorporarse a la constante (ya que siempre permanece constante) para dar la siguiente
ecuación:
Esta nueva constante, KW, se conoce como producto iónico del agua, y tiene un valor de 1 x 10-14, y es
válida para todas las ecuaciones acuosas. Esto quiere decir que en un vaso de agua pura, por ejemplo, donde
no hay influencias de ácidos o bases, se encontrará una concentración de protones (H+) equivalente a 1 x 10-7.
Este número varía y ya no se hace tan sencillo cuando ya se consideran soluciones con la influencia de ácidos y
bases. Para facilitar el manejo de estas concentraciones, se recurre a una escala logarítmica mucho más fácil de
utilizar: el pH.
El pH se define clara y llanamente como el logaritmo negativo de la concentración de protones de una solución,
o escrito matemáticamente:
Esta ecuación permite que lo que sería una escala complicada se convierta en una simple escala lineal que va
desde valor 1 a 14, donde el 7 indica neutralidad (es decir, igual número de protones y grupos OH-), un valor
menor a siete indica acidez y uno mayor, basicidad. (Para ejemplos vea Figura No. 1.1)

Figura No. 1.1
Concentración de [H+] vrs pH y ejemplos
http://www.investigacion.frc.utn.edu.ar/sensores/PH/pH.htm
El valor del pH del organismo no permite fluctuaciones muy amplias dentro de la escala. En el caso
específico de la sangre, el pH se encuentra alrededor del 7.40, pero no puede ir más allá de 7.0 ni de 7.7, ya
que ambos casos son generalmente fatales. Por tanto, la regulación debe hacerse de forma muy cercana.
Para lograr esto, el organismo recurre a las llamadas soluciones buffer. El sistema buffer de más importancia en
el organismo es el de CO2 / bicarbonato.
Las soluciones buffer son soluciones que se resisten a cambiar de pH por adición de protones (H+) o
grupos hidroxilo (OH-). Estas soluciones generalmente están formadas por ácidos o bases débiles
(parcialmente ionizados) con la presencia de una sal del mismo anión que el ácido o base fuerte. La capacidad
de resistir a estos cambios, o capacidad buffer, depende de la concentración del ácido conjugado y de la base
conjugada. Una característica única para cada sistema buffer es su valor de pK, que no es más que el logaritmo

negativo de su constante de disociación. Cuando el pH del medio es igual al pK del buffer estudiado, se dice que
el buffer se encuentra en su capacidad máxima.
Buffer en sangre y orina : Los sistemas buffers que hay en la sangre y en el sistema extracelular son:
 Bicarbonato: Está constituido por H2CO3 y HCO3. Aunque su valor de pK (6,1) está algo alejado
del pH fisiológico de la sangre (7,4), es un sistema muy eficaz debido a que:
o La relación HCO3/ H2CO3 es muy alta (20/1), lo que le proporciona una alta capacidad tampón frente
a los ácidos;
o Es un sistema abierto, con lo que el exceso de CO2 puede ser eliminado por ventilación pulmonar de
manera rápida;
o el HCO3 puede ser eliminado por los riñones mediante un sistema de intercambio con solutos.
 Hemoglobina: Es un tampón fisiológico muy eficiente debido tanto al cambio de pK que experimenta al pasar
de la forma oxidada a la reducida, como a la gran abundancia de esta proteína en la sangre (15 % del volumen
total sanguíneo). La oxihemoglobina (pK= 7,16) es un ácido más fuerte que la desoxihemoglobina (pK= 7,71).
Los valores de pK son tales que determinan que en la disociación siguiente, el valor x sea, aproximadamente,
0,7.
Esta propiedad de la hemoglobina, de cambiar su valor de pK, demuestra el efecto tampón, permite el
transporte de una determinada cantidad de CO2 liberada en los tejidos. La hemoglobina oxigenada que llega a
los tejidos se disocia liberando O2, un proceso que está favorecido por el estado de los tejidos (baja pO2,
menor pH y alta pCO2).
 Proteínas: Los aminoácidos y proteínas son electrolitos anfóteros, es decir, pueden tanto ceder protones
(ácidos) como captarlos (bases) y, a un determinado pH (en su pI), tener ambos comportamientos al mismo
tiempo. La carga depende del pH del medio. En un medio muy básico se cargan negativamente, mientras que
en el fuertemente ácido lo hacen positivamente. Desde el punto de vista fisiológico este tipo de amortiguador
es resulta de especial interés a nivel tisular.
 Fosfato: A pH fisiológico, las especies del fosfato con capacidad de tamponar son H2PO4- y HPO42- ya que su
valor de pK es de 6,8. Así pues, para el tampón fosfato:

A pH fisiológico de 7,4, la concentración de HPO42- (un 80%) es 4 veces superior a la de H2PO4 - (un 20%). Así
pues, el tampón fosfato es un sistema muy eficaz para amortiguar ácidos. La concentración de fosfato en la
sangre es baja (2 mEq/L) por lo que tiene escasa capacidad de tamponar si lo comparamos con otros
tampones (ej el bicarbonato). En cambio, a nivel intracelular, las concentraciones de fosfato son elevadas lo
que le convierte en un tampón eficiente. Las grandes cantidades de fosfato dentro de las células corporales y
en el hueso hacen que el fosfato sea un depósito grande y eficaz para amortiguar el pH.
Buffer en la saliva: Entre las funciones protectoras de la saliva, se puede citar el mantenimiento del balance ecológico
en la cavidad bucal, mediante la interferencia con la adherencia bacteriana, a través de efectos mecánicos,
inmunológicos y no inmunológicos. Su efecto antibacteriano mediante la acción de un grupo de proteínas salivales
como lactoferrina, lizosima y lactoperoxidasa 6 y el mantenimiento del pH bucal. Estas funciones en conjunto
contribuyen al mantenimiento de la integridad del diente en condiciones fisiológicas en la cavidad bucal.
Pre— Laboratorio
En su trabajo de Pre-Laboratorio, conteste claramente las siguientes preguntas:
1. Soluciones buffer o amortiguadoras:
a. ¿Cómo se definen?
b. ¿Cuáles son sus principales características?
c. ¿Cuál es su papel dentro del organismo?
d. ¿Cuáles son los principales sistemas buffer que se encuentran en el

organismo?
e. ¿Qué significa la pK de una solución buffer?
2. Investigue sobre el potenciómetro:
a. ¿Qué es y para qué se usa?
b. ¿Cómo se encuentra diseñado?
c. ¿Cómo se calibra?
d. ¿Cómo se maneja y qué cuidados debe tenerse al manejarlo?

Materiales
1. Reactivos
a. Hidróxido de sodio, NaOH, solución 1M
b. Fosfato diácido de potasio, KH2PO4, solución 0.05M
c. Fosfato ácido de potasio, K2HPO4, solución 0.05M
d. HCl 0.0033 M
e. 2-octanol
2. Cristalería
a. Balón aforado de 50 mL
b. Pipeta volumétrica de 1 mL
c. Pipeta volumétrica de 5 mL
d. Pipeta volumétrica de 10 mL
e. Beaker de 100 mL
f. Beaker de 50 mL
3. Instrumental
a. Medidor de pH, o potenciómetro
b. Bulbo de lapicero
c. Estufa con agitador
d. Agitador magnético
Procedimiento
1. Capacidad buffer de la saliva

a. Colecte saliva en un beaker de 50 mL.
b. Mida el pH de la saliva y anote en su cuaderno.
c. Mida 2.0 ml de la saliva en un beaker de 10 mL .

d. Agregar 6.0 ml HCl 0.0033 mol/l
e. Para prevenir el espumando, agregue una gota de 2-octanol

f. Mezclar durante 20 minutos para eliminar el CO2
g. Mida el pH final de la saliva y anote en su cuaderno como se encuentra su saliva comparando con el
cuadro No. 1.1
Cuadro No. 1.1
Evaluación de la capacidad buffer de la saliva
2. Preparación de las muestras.

a. Usando las soluciones que se le facilitan en el laboratorio, prepare las muestras siguiendo las
indicaciones del cuadro siguiente. Para mayor facilidad, utilice balones de 50 mL, transfiera el
volumen menor usando pipeta volumétrica y afore con el volumen mayor. Rotule claramente cada
muestra para evitar confusiones.
Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8
K2HPO4 0.05M (mL) 0 1 5 20 30 45 49 50
KH2PO4 0.05M (mL) 50 49 45 30 20 5 1 0
3. Lectura.
a. Obtenga el valor del pH para cada una de las muestras. Siga claramente las instrucciones del
docente de laboratorio y asegúrese de ser supervisado al momento de tomar las lecturas
de su muestra. Procese la información que obtuvo como se indica en la sección de Observaciones
importantes.
b. Calibración del potenciómetro:

i. Retirar la tapa del potenciómetro.
ii. Retirar el tapón de plástico que está en el sensor.

iii. Introducir el sensor del potenciómetro en el buffer pH 7.
iv. Presionar la tecla ON/OFF.
v. Seguidamente presionar la tecla CAL y se escuchara un Beep, esperar a que en la

pantalla indique 7.0 y sonara Beep
vi. Retirarlo del Buffer pH 7.
vii. Lavar el sensor con agua destilada y eliminar el exceso de agua sin tocar al sensor.
viii. Introducir el sensor del potenciómetro en el buffer pH 4.
ix. Presionar la tecla CAL y se escuchará un Beep, esperar a que en la pantalla se

indique 4.00 y sonara Beep.
x. Retirarlo del buffer pH 4.
xi. Lavar el sensor con agua destilada y eliminar el exceso de agua sin tocarel sensor.
xii. El potenciómetro está listo para leer su muestra. No lo apague.

xiii. Obtenga el valor de pH para cada una de las muestras.
xiv. Introducir el potenciómetro en el beacker con la muestra y presionar la tecla READ y espere
el sonido Beep y en la pantalla se le indicara el pH de la muestra.
4. Comparación.
a. Coloque en un beacker 50 mL de muestra (un beacker por muestra) y 50 mL de agua en otro beaker
b. Mida el pH de cada solución.

c. Luego de haber medido el pH de cada solución, añadir 5 gotas de NaOH al 2.5% Vuelva a
medir el valor de Ph de cada solución.
Observaciones importantes
Asegúrese de anotar claramente dentro del cuadro que preparó para datos, en su cuaderno los valores de
pH para todas sus muestras.
Para cada muestra, calcule los siguientes parámetros:

1. [HPO42-] usando la información del volumen de K2HPO4 que agregó en la muestra, utilizando la
siguiente formula
2. [H2PO -] usando la información del volumen de KH2 PO4 que agregó en la muestra:
3. El logaritmo de la relación de las dos concentraciones usando la siguiente ecuación
Haga una gráfica en donde se muestre en el eje x el valor de la relación de concentraciones obtenidas en
el inciso anterior, en el eje y el valor obtenido para cada muestra. Obtenga una regresión lineal entre estos datos y el
valor que obtenga para el intercepto será su valor del pK.
Busque en la literatura el valor teórico para el pK de disociación de la siguiente ecuación y calcule el
porcentaje de error de su experimento.
Anexo
Investigue lo siguiente
1. Capacidad buffer o de amortiguación:
a. ¿Qué significa?
b. ¿Qué sucede cuando se excede?
c. ¿Qué significa rango buffer o de amortiguación y cuál es su relación con el pK?
d. ¿Por qué una solución buffer no puede actuar de la misma manera en todas

las situaciones (a varios valores de pH?
2. Dé un ejemplo de un buffer o amortiguador médico y describa su función.
3. El pH de la sangre humana debe mantenerse alrededor de 7.4; sin embargo, condiciones fisiológicas varias
pueden alterar el pH sanguíneo, entre ellos la actividad física intensa y de corta duración, que genera
cantidades importantes de ácido láctico. El lactato se acumula en tejido muscular y sangre y los protones
liberados bajan el pH sanguíneo, condición conocida como acidosis. La sensación de fatiga muscular y el
eventual bloqueo del sistema contráctil actina/miosina sobreviene rápidamente ante la acidosis. Se ha
observado en algunos deportistas la práctica de consumir una solución de bicarbonato sódico (NaHCO 3,
carbonato ácido de sodio) poco antes de una competencia intensa de corta duración (ej. 100 m planos). De
manera clara y concisa, explique con base en los fundamentos teóricos y las observaciones de este
laboratorio, cuál sería la justificación bioquímica de este consumo. Discuta y argumente la efectividad de tal
práctica.
Bibliografía de referencia
1. Arronte, C. 2010 “ Manual de Prácticas de Bioquímica” Facultad de Odontología, Universidad

Veracruzana, México pág. 15-18
2. Department of Biochemistry, University of Minnesota. Labotatory Manual for Biochemistry 5025. 1998.
Consultado el 23 de junio, 2005. Modificado el 23 de diciembre, 2003.
http://www.natureandscience.net/labmanual.htm
3. Kaplan, L. A. y A. J. Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry. Theory, Analysis, Correlation. 4ª.
Edición. Mosby, Inc. pág. 38-39
4. Devlin, T. (ed) 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. 5ª Edición. Estados Unidos.
Wiley-Liss. Páginas 12-13.
5. Mazariegos, D. & S. Molina, 2008 “Manual de Prácticas de Bioquímica 3” I2QB3.
6. http://www.fundabiomed.fcs.uc.edu.ve/cap81.pdf
7. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/06%20pH%20AMORTIGUADORES.pdf
8. http://www.fundabiomed.fcs.uc.edu.ve/cap82.pdf
9. http://www.investigacion.frc.utn.edu.ar/sensores/PH/pH.htm

PRÁCTICA No. 2
SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN SUERO Y PLASMA
Introducción
Las proteínas están compuestas por carbono, oxigeno, hidrogeno y nitrógeno. La mayoría de ellas contienen
además azufre y algunas fósforo.
Las proteínas proporcionan estructuras, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo multitud de tareas. Su
papel central en la célula queda reflejado en el hecho que la información genética se expresa en forma de
proteínas. Existe para cada proteína un segmento de ADN que codifica la información que especifica su
secuencia de aminoácidos.
Para el estudio de las proteínas es necesario que estas se encuentren en estado puro, existen
varias técnicas para poder separarlas como la precipitación por adición de sales y precipitación por adición de
aniones y cationes. Luego de la separación por medio de la precipitación es necesaria una purificación más
profunda a través de la cromatografía.
Durante esta práctica el estudiante podrá poner en práctica la precipitación de proteínas plasmáticas y
de huevo; así mismo podrá identificar la presencia de proteínas en soluciones de varios alimentos a través del
reactivo de Biuret.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Describa que es la sangre y sus constituyentes.
2. Describa cada una de las fracciones que constituyen a las proteínas del plasma con base a su origen,
concentración y función
3. Conozca e interprete la diferencia entre suero y plasma.
4. Explique cómo se encuentran constituidas las inmunoglobulinas, y las diferentes características de cada
una de ellas.

Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparación de soluciones.
2. Conozca la forma correcta de utilizar un potenciómetro.
3. Aprenda la aplicación de curvas de calibración de un aparato simple.
4. Aplique su conocimiento matemático en la obtención e interpretación de gráficos en el laboratorio.
Antecedentes
La sangre es considerada como un tejido que circula por un espacio virtualmente cerrado, que son los vasos
sanguíneos. Está constituida por una fracción celular (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y un líquido llamado plasma,
en el que se encuentran suspendidos los constituyentes de la fracción celular además de nutrientes, metabolitos,
hormonas, células, electrolitos, proteínas, factores de la coagulación, sistema del complemento, entre otros.
El volumen de la sangre es de aproximadamente el 8% del peso corporal total, del cual el 55% está constituido por
el plasma y el 45% por células sanguíneas.
El plasma es una solución constituida por un 90% de agua y un 10% de solutos. Entre los solutos se halla un
inmenso número de iones, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas en tránsito hacia diversas partes del cuerpo o
que ayudan en el transporte de otras sustancias. Las proteínas plasmáticas constituyen la mayor parte de los sólidos
del plasma. Estas son un grupo de más de 100 moléculas distintas con características y funciones muy diversas. No
son sustancias en tránsito, sino que funcionan dentro del torrente circulatorio
Proteínas del plasma
La sangre normal circulante contiene en su plasma alrededor de 7 a 7.5 g/100mL de proteínas
totales siendo su fraccionamiento el siguiente:
Albúmina 4.3 g/100 mL (3.5 – 5.5)

Globulina 2.4 g/100 mL (2.0 – 3.6)
Fibrinógeno 0.3 g/100 mL (0.2 – 0.6)
7.0 g/100 mL (5.7 – 9.7)

Además el plasma contiene otras proteínas plasmáticas en menor cantidad como se puede observar en la
figura No. 2.1
Figura No. 2.1
Proteínas plasmáticas
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_06.htm
o Albúmina
Esta fracción de las proteínas del plasma es la más abundante, es sintetizada en el
hígado. Tiene un peso molecular aproximado de 69,000. La estructura primaria de la albúmina está
constituida por 610 aminoácidos dispuestos en una sola cadena peptídica. La estructura
secundaria parece ser solo una, la cual esta plegada sobre si misma, formando capas que se
pueden desplegar bajando el pH y volverse a plegar cuando se sube el pH. La albumina en el
organismo cumple con varias funciones como por ejemplo: transporte de compuestos
orgánicos y recambio de nutrientes y metabolitos.
o Globulina
Es una mezcla de varias proteínas las cuales se han podido separar por métodos especiales de
laboratorio, uno de ellos es la electroforesis son la cual se obtienen fracciones de globulinas

conocidas como α1, α2 y β. Las globulinas α1, α2, al asociarse a carbohidratos forman gluco
y mucoproteínas. Todas las globulinas al asociarse a fracciones de lípidos (TAG, colesterol libre
y esterificado, fosfolípidos), forman las llamadas lipoproteínas.
Algunas globulinas se unen a metales para transportarlos por el plasma, como la Siderofilina o
Transferrina para el hierro, la Ceruloplastina para el cobre. Los pesos moleculares de las
globulinas cubren una gama muy amplia, desde cerca de 40,000 hasta algo más de 1
millón. El sitio principal de su síntesis es el hígado, con excepción de las gamma
globulinas que se sintetizan en el sistema retículo endotelial.
Gamma Globulinas: también llamadas Inmunoglobulinas (Ig), tienen actividad de defensa actuando
como anticuerpos. Cada molécula de Ig está formada por 4 cadenas polipeptídicas (2 pesadas
llamadas H y 2 livianas llamadas
L) las que están unidas por puentes disulfuro. Se conocen 5 clases de inmunoglobulinas: IgA,
IgG, IgD, IgM e IgE.
o Fibrinógeno
Es una proteína que está presente en el plasma humano a una concentración de ± 0.3g por 100
mL. La molécula de fibrinógeno es un dímero que consta de 2 mónomeros constituidos de 3
cadenas polipeptídicas cada uno enlazados por puentes disulfuro. La presencia de hidratos de
carbono en la molécula tiene algún significado en el mecanismo de la coagulación.
Técnicas para obtención del plasma y del suero

El plasma se obtiene cuando, inmediatamente después de extraer la sangre, se le agregan anticoagulantes como
oxalato, citrato, EDTA, o heparina y se centrifuga. Si se recoge sangre sin anticoagulante y se deja que está coagule, el
líquido que se separa se llama suero. El suero carece de células y de factores de la coagulación
incluyendo la proteína fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada en fibrina insoluble en el proceso de la
coagulación.
Una de las técnicas de precipitación se basa en la baja solubilidad que tienen las proteínas en disoluciones
salinas concentradas, la sal que más se ha utilizado es el Sulfato de Amonio, (NH4)2SO4. El hecho de que
una proteína se disuelva en un medio acuoso se debe a su capacidad de formar puentes de hidrógeno. Con el
agua a mayor cantidad de puentes de hidrógeno mayor solubilidad. La acción de la sal es liberar el agua unida a
la proteína por puentes de hidrógeno, lo cual provoca su precipitación.

El reactivo de Biuret se utiliza para la determinación de proteínas, peptidos cortos y otros compuestos con dos
o más en laces peptídicos. La prueba se basa en la reacción del sulfato de cobre con compuestos que
tengan dos o más enlaces peptídicos, en un medio alcalino. La reacción final produce un complejo color violeta,
cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos presentes.
Materiales
1. Reactivos
a. Solución de hidróxido de sodio al 10%
b. Solución saturada y semisaturada de sulfato de amonio
c. Cristales de sulfato de amonio
d. Reactivo de Biuret
e. Suero y Plasma oxalatado
f. Agua destilada
2. Cristalería
a. Tubos de ensayo
b. Tubos de centrifuga
c. Pipeta volumétrica de 5 mL
3. Equipo
a. Gradillas para tubos de ensayo
b. Pipetas pasteur
c. Pipetas de 1 mL y de 5 mL
d. Espátula
e. Centrífuga
Procedimiento
I. Presencia de Fibrinógeno
- Colocar 1 mL de plasma oxalatado en un tubo de centrifuga, agregarle 1 mL de una solución
semisaturada de sulfato de amonio y mezclarlos.

- Observe el fibrinógeno que se precipitó.
- Centrifugue el tubo con su contenido durante 5 minutos, descartar todo el sobrenadante.
- Al sedimento agréguele 1 mL de agua destilada, mézclelo completamente.
- Agréguele 1 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 1 mL de reactivo de Biuret.
- Observe el color que se desarrolla.
II. Separación de Globulinas

- Tomar 1 mL de suero y colocarlo en un tubo de centrifuga, agregarle 1 mL de una solución saturada de
sulfato de amonio y mezclarlos.
- Observe el precipitado.
- Centrifugar durante 10 minutos.
- Pasar el sobrenadante a otro tubo de centrifuga limpio (este se utilizara en el apartado III).
- Al sedimento agregue 1 mL de agua destilada y mézclelo.
- Agréguele 1 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 1 mL de reactivo de Biuret.
III. Separación de Albúmina

- Al sobrenadante del inciso anterior, agréguele unos cristales de sulfato de amonio y agítelo suavemente
hasta que se disuelva (si es necesario agregue un poco más).
- Observar el precipitado que se forma.
- Agréguele 2.5 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 1 mL de reactivo de Biuret.
Anexo
Investigue lo siguiente:
1. Describir la función de por lo menos tres proteínas plasmáticas que se incluyen dentro de las globulinas.
Bibliografía
1. Del Cid , N. y Ochaeta F. 2012, “Práctica No. 3 del Manual de Bioquímica 3” Facultad de Medicina,
Universidad Mariano Galvez. 98pp
2. Quesada Mora, Silvia. Manual de experimentos para Bioquímica. San José Costa Rica. EUNED. 2007.
148 p.

3. Departamento de Bioquímica, Universidad Autónoma de México. Programa académico, objetivos del
curso, contenido temático y manual de prácticas de Laboratorio, Biología y Biología Molecular. 2004.
Consultado en enero 2010. Reimpreso 2006.
4. http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_06.htm

PRÁCTICA No. 3
COAGULACIÓN SANGUÍNEA
Introducción
El organismo dispone de un sistema de seguridad que le permite detener una hemorragia o pérdida de
sangre debido a la rotura de la pared vascular, a este mecanismo se le conoce como hemostasia o
coagulación sanguínea.
Existen diferentes pruebas para poder evaluar este proceso como el tiempo de sangría, tiempo de
coagulación, tempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial, entre otras. En esta práctica conocerá
algunas técnicas para verificar los tiempos de coagulación en el humano.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Conozca las pruebas de coagulación y la importancia de cada una de ellas.
2. Conozca que se evalúa en cada prueba.
3. Conozca la forma adecuada de realizar cada una de las pruebas.
Antecedentes
Se denomina coagulación al proceso por el cual la sangre pierde su liquidez, tornándose similar a un gel en
primera instancia y luego sólida, sin experimentar un verdadero cambio de estado. Cuando una lesión afecta la
integridad de las paredes de los vasos sanguíneos, se ponen en marcha una serie de mecanismos que tienden a limitar
la pérdida de sangre llamados hemostasia.
La hemostasia consiste en una serie de mecanismos destinados a detener la pérdida de sangre de los vasos
sanguíneos dañados. Se divide en tres fases:
1. Vasoconstricción: es la disminución de la luz del vaso sanguíneo, como un mecanismo de defensa, llevado a
cabo por el estímulo directo del sistema nervioso simpático sobre el músculo liso de la pared del vaso
sanguíneo.
2. Adherencia o activación paquetería: es el proceso que se desencadena cuando una plaqueta se adhiere al
factor de Von, Willebrand unido a la colágena del vaso sanguíneo, está plaqueta libera tromboxano A2, lo cual

atrae a otras plaquetas. Las plaquetas que se van agregando emiten pseudópodos y sustancias que activan a
otras plaquetas para que sigan uniéndose hasta formar el coágulo plaquetario
3. Formación de fibrina o coagulación.

La activación plaquetaria y la formación de fibrina dan lugar a la formación del tapón hemostático que bloque la
salida de sangre y detiene la hemorragia.
Coagulación sanguínea: La sangre coagula por la transformación del fibrinógeno soluble en fibrina insoluble. Más de
una docena de proteínas plasmáticas interactúan en cascada. La cascada de la coagulación es una cascada
enzimática proteolítica, que consta de XIII componentes (los factores I-XIII)
 Los precursores inactivos son activados en serie, cada uno da lugar al factor siguiente.
 La última enzima, la trombina, derivada de la protombina (II), convierte el fibrinógeno soluble (I) en una red
insoluble de fibrina donde quedan atrapadas las células de la sangre formando el coágulo.
Tradicionalmente se divide en 3 fases:
 Vía intrínseca: Todos los elementos están presentes en la sangre. Esta comprende los factores XII, XI, IX Y
VIII, además de la calicreina (inicialmente precalicreina) y el cininógeno de alto peso molecular. Esta se inicia
con el contacto con una superficie patológica como la exposición de las cargas negativas en el endotelio
lesionado.
 Vía extrínseca: Algunos elementos no se encuentran en la sangre. Esta se inica con la activación del factor VII
y el factor tisular (Factor III).
 Vía común: Tanto la vía intrínseca como la extrínseca convergen en la activación del factor X que es el que
inicia la vía común, la cual comprende la conversión de la protombina en trombina y la conversión del
fibrinógeno en el coágulo de fibrina como se observa en la figura No. 3.1

Figura No. 3.1
Cascada de Coagulación
Pruebas para medir el tiempo de coagulación:
Tiempo de sangría:
El tiempo de sangrado mide la fase primaria de la hemostasia: la interacción de las plaquetas con la
pared del vaso sanguíneo y la formación del tapón hemostático. El tiempo de sangrado constituye la mejor
prueba para detectar alteraciones de la función plaquetaria y es uno de los principales estudios en los
trastornos de la coagulación. Se hace una pequeña herida en el lóbulo auricular o en el antebrazo y se anota el
tiempo de sangrado y la velocidad con al que se forma el coágulo plaquetario. La duración del sangrado de
un capilar depende de la calidad y cantidad de plaquetas y de la vasoconstricción. Valor de referencia: 2 – 5 minutos
Tiempo de coagulación:
Es el intervalo requerido para que la sangre venosa se coagule en condición controlada; es una
medición del tiempo requerido para la formación de las primeras trazas de trombina que bastan para formar un

coagulo visible. Valor de referencia: 5 a 8 minutos.
PTT, TPT o TTP
Otra prueba de la coagulación de la sangre, llamada tiempo de tromboplastina parcial (PTT, por sus siglas en
inglés), mide el tiempo en que se forma en coágulo en una muestra de sangre. El tiempo de tromboplastina parcial y
el tiempo de protrombina suelen realizarse al mismo tiempo para controlar problemas de hemorragia o la posibilidad
de demasiada hemorragia en la cirugía. Prueba que se realiza para evaluar la vía intrínseca de la coagulación.
Valor de referencia: 25 a 40 segundos
PT:
El tiempo de protrombina (PT, por sus siglas en inglés) es un análisis de sangre que mide cuánto tarda la
sangre en coagular. Se puede utilizar para verificar problemas de hemorragia. También se utiliza para comprobar si está
funcionando un medicamento para prevenir coágulos de sangre.
Esta prueba también se conoce como prueba de INR. El INR “Razón Normalizada Internacional” (en inglés,
“International Normalized Ratio”) es un modo de estandarizar los resultados de pruebas de tiempo de protrombina, sin
importar el método usado. De esta forma, el médico puede entender los resultados del mismo modo aun cuando
provengan de laboratorios y métodos de prueba diferentes. En algunos laboratorios, solo se reporta el INR; no se
reporta el PT.
Los factores de coagulación de la sangre son necesarios para la coagulación. La protrombina, o factor II, es
uno de los factores de coagulación producidos por el hígado. La vitamina K es necesaria para producir protrombina y
otros factores de coagulación. El tiempo de protrombina es una prueba importante porque verifica si cinco diferentes
factores de coagulación de la sangre (factores I, II, V, VII y X) están presentes. El tiempo de protrombina se prolonga
por:
 Los anticoagulantes, como warfarina.
 Niveles bajos de factores de coagulación de la sangre.
 Un cambio en la actividad de cualquiera de los factores de coagulación.
 La ausencia de cualquiera de los factores de coagulación.
 Otras sustancias, llamadas inhibidores, que afectan a los factores de coagulación.
 Un aumento en el uso de los factores de coagulación.
Un tiempo de protrombina anormal suele ser causado por una enfermedad o una lesión del hígado, o por el
tratamiento con anticoagulantes. El tiempo de protrombina se utiliza como prueba discriminativa y como

prueba cuantitativa para determinar los factores de coagulación en las vías extrínseca y común. Esta
prueba también se utiliza para controlar los tratamientos con anticoagulante por vía oral.
Para calcular el I.N.R se utiliza la siguiente fórmula:
.
Donde el I.S.I. es el índice de Sensibilidad internacional. Para facilidad de los cálculos internacionalmente se ha colocado el
exponente I.S.I = 1 y la formula quedaría entonces:
Se considera un I.N.R. normal entre 0.8 – 1.2 . Los pacientes que estan con tratamiento de anticoagulantes o
aquellos pacientes que tienen problemas de coagulación tendrán un I.N.R. más alto.
Pre-laboratorio
De la coagulación investigue lo siguiente:
1. ¿Qué es la fibrina?
2. ¿Qué son las plaquetas?
3. A que se refiere cuando se habla de la vía intrínseca y extrínseca de la coagulación
4. ¿Qué tipo de anticoagulante debe de usarse en pruebas de coagulación?
Materiales
1. Reactivos
a. Reactivo para Tiempo de Protrombina (TP)
b. Agua Destilada
c. Control Normal para TP
d. Control Patológico para TP

2. Cristalería
a. Tubos de ensayo
b. Laminas porta-objeto

3. Equipo
a. Gradillas para tubos de ensayo
b. Micro pipeteador automático 200µL
c. Micro pipeteador automático 50 µL
d. Baño de María a 37ºC
4. Otros
a. Papel mayordomo
b. Cronometro
c. Lancetas
Procedimiento
1. Tiempo de Protrombina (TP)

a. Recolectar y separar la sangre
b. Calentar el reactivo de TP a 37ºC
c. Colocar 50 µL del control normal de TP en un tubo e incubarlo a 37ºC en el baño de Maria durante 2
minutos.
d. Añadir con fuerza 100 µL del Reactivo de TP al tubo del inciso 3) y cronometrar hasta la formación de hilos
de fibrina.
e. Repetir procedimiento para el control patológico y la muestra.
MUESTRA TIEMPO EN INR
SEGUNDOS
Control Normal --
Control Patológico --
Muestra No. 1
Muestra No. 2
2. Tiempo de Sangría
a. Se utiliza la zona que esta 15 a 20 mm por encima de la porción grasa redonda del lóbulo de la oreja.
b. Calentar la oreja.

c. Desinfectar el área a puncionar.
d. Colocar una lámina portaobjetos detrás del pabellón de la oreja (esto con la finalidad de darle
firmeza a la punción que se ejecutará).
e. Usando una lanceta, se perfora el lóbulo de la oreja mediante un golpe firme. La herida deberá ser lo
suficientemente posible profunda para que fluya libremente la sangre sin apretar con el dedo.
f. Activar el cronómetro inmediatamente
g. A intervalos de medio minuto, recoger la cota de sangre que se forma en la oreja con un pedazo de
papel mayordomo
h. Cuando el papel ya no absorba nada, detener el cronometro.
i. Reportar el tiempo transcurrido en minutos y segundos.
Anexo
Investigue lo siguiente
1. Clínicamente cual es el comportamiento del TP, cuando hay administración de anticoagulantes en un

paciente, explique el por qué.
2. Cuantos factores de la coagulación existen, mencione cada uno de ellos
Bibliografía
1. Del Cid, N. 2012. “Práctica No. 4 del Manual de Bioquímica 3” Facultad de Medicina de la Universidad
Mariano Gálvez de Guatemala. 98 pp.
2. Pérez Folgar, JR, Fernández Ch., JG. Manual de Prácticas de Laboratorio de Hematología Básica.
Guatemala. USAC. 2002. 102 p.
3. Ficha técnica NEOPLASTINE® CI PLUS. Diagnostica Stago, Francia.
4. http://med.unne.edu.ar/sitio/multimedia/imagenes/ckfinder/files/files/cap22_trombolit.pdf
5. http://www.uwhealth.org/spanishhealth/topic/medicaltest/an%C3%A1lisis-de-sangre/hw203083.htm

PRÁCTICA No. 4
FUNCIÓN RENAL:DETERMINACIÓN DE CREATININA
Introducción
La prueba que se usará en el laboratorio es un método colorimétrico de punto final para la detección de
creatinina en suero u orina. El principio del método se basa en que la creatinina reacciona con el picrato alcalino
formando un complejo de color rojo. La intensidad de color es proporcional a la concentración de creatinina en la
muestra, lo cual permite su cuantificación con el uso de estándares de creatinina de concentración
conocida.
Objetivos
Que el estudiante
1. Realice un método espectrofotométrico para determinación de analitos en

muestras biológicas.
2. Practique la preparación de curvas de calibración con estándares de

concentración conocida.
Alcance
Que el estudiante
1. Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones.
2. Aprenda a realizar cálculos de concentración por interpolación usando curvas de calibración
3. Interprete resultados clínicos.
Antecedentes
La creatinina es el producto de degradación de la creatina. La creatina es un derivado de los aminoácidos
arginina, glicina y metionina, el cuerpo la fabrica básicamente en el hígado, los riñones y el páncreas, y también puede
obtenerse a través de una dieta rica en carne o pescado (podemos encontrar unos 5 gr., de creatina por cada kilo de
carne). Se acumula básicamente en los músculos esqueléticos (aproximadamente un 98 %) en forma de creatina libre
unida a una molécula de fosfato (PCr o fosfocreatina). La PCr sirve como fuente inmediata de energía para la

contracción muscular para lo que se degrada produciendo creatinina.
Esta es llevada a la sangre a través riñones los cuales la filtran del cuerpo en la orina (puede también ser
medida en la orina) La cantidad de creatinina que aparece en la sangre de un individuo depende de su masa
muscular, por tanto, esta concentración será constante para cada individuo si no varía su masa muscular. (Ver figura
No. 4.1)
Figura No. 4.1
Los niveles de creatinina sérica y la excreción urinaria son una función de la masa muscular en personas
normales, y muestran muy poca respuesta a cambios en la dieta. La creatinina deriva de la deshidratación no
enzimática de la creatina en músculo esquelético. La cantidad de creatina por unidad de masa muscular es
constante, y por lo tanto la tasa de deshidratación de creatina es constante también. Por lo tanto la concentración
de creatinina sérica es muy estable, con variaciones diarias de menos del 10%.
La creatinina es un compuesto sumamente difusible y se elimina del organismo casi exclusivamente por
filtración renal: Es filtrada libremente en el glomérulo y no es reabsorbida en los túbulos. La razón más importante
del aumento de este metabolito en sangre es la mala filtración glomerular Por estas propiedades, la tasa de

depuración de creatinina puede ser usada como estimación de la función glomerular. Su determinación en
suero y la tasa de depuración de creatinina endógena constituyen parámetros importantes para el
diagnóstico de diversas afecciones renales. Una de las aplicaciones clínicas de emergencia más importantes de la
determinación de creatinina en sangre es la detección de la Insuficiencia renal aguda, que es la disminución rápida
en horas o días de la función renal con caída de la filtración glomerular y en algunos casos disminución en la
producción de orina acompañada de retenciones nitrogenadas y alteraciones hidroeléctricas y acido básicas.
Durante el curso de esta enfermedad los valores de creatinina sufren un gran aumento en un periodo corto
mostrando valores que superan los 1.5 mg/dl.
Fundamento del análisis de creatinina:
La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el picrato alcalino para formar un complejo de
color rojo. La intensidad del color se cuantifica con un espectrofotómetro, a una longitud de onda de 510 nm, y
por interpolación (comparación) con la absorbancia de un estándar o curva estándar se obtiene la
concentración de la muestra que se analiza. Como otros compuestos de la muestra también reaccionan con la
muestra, para eliminar la interferencia se agrega ácido, el cual destruye el complejo picrato-creatinina pero
no los otros complejos. La concentración de creatinina se calcula por diferencia entre la absorbancia
(intensidad de color) antes y después de agregar el ácido.
Pre-laboratorio
1. ¿Qué es la creatinina?
2. Investigue las patologías que presentan alteraciones de los valores de creatinina sérica y urinaria.
3. Haga los cálculos necesarios para obtener 1 mL de una muestra de orina diluida para cada una de las
siguientes diluciones: 1:2, 1:50, 1:100 y 1:200 de la muestra de orina.

Materiales
1. Reactivos
a. Muestras de suero y orina de 24 horas diluida 1:50
b. Solución salina, NaCl al 0.9%
c. Kit de análisis de Creatinina directa (Wiener lab) conteniendo el siguiente material

• Estándar de creatinina, 2.0 mg/dL
• Solución de ácido pícrico 41 mmol/L
• Solución de buffer alcalino, pH 12.4
• Reactivo de trabajo: Prepare en frasco de plástico mezcla a partes iguales de ácido pícrico y
buffer alcalino.
• Solución stop, ácido acético al 20%
2. Instrumentación
a. Espectrofotómetro, lectura a 510 nm
b. Celdas para espectrofotómetro
c. Baño de agua a 37°C
d. Reloj o timer
e. Micropipetas de 2 a 20 μL, 10-100 µL, 200-1000 µL
f. Puntas para micropipeta
3. Cristalería
a. Tubos Eppendorf de 1.5 mL
b. Tubos de vidrio

Precauciones
Los reactivos utilizados son tóxicos y corrosivos. Maneje todas las soluciones con cuidado. Evite derrames
y el contacto directo con la piel y mucosas.
Toda muestra biológica debe tratarse como potencialmente infecciosa, por lo cual debe cumplirse con las
normas de bioseguridad adecuadas. Debe usarse guantes en todo momento, así como ser cauteloso durante la
manipulación.
Procedimiento
1. Identifique las siguientes muestras en la gradilla que se encuentra en el área de trabajo:
a. Estándar
b. Muestra de suero
c. Muestra de orina
d. Reactivo de creatinina
2. Rotule los tubos eppendorf de 1500µL como se indica en la siguiente figura:
3. Con la ayuda de una pipeta automática agregue las siguientes cantidades de soluciones en cada uno de
los tubos Eppendorf que se rotularon anteriormente. (Estas cantidades dependerán de la marca del kit que
está utilizando. Antes de servir sus muestras verifique con su profesor las cantidades a agregar)

4. Cierre los tubos Eppendorf, agite e incube a 37°C por 10 minutos
5. Dentro de los 15 minutos después de retirarlo del baño, leer el tubo No. 2 (Estándar), No. 3 (Muestra de
suero) y No. 4 (Muestra de orina) en el espectrofotómetro a 510nm, llevando el equipo a 0 con el tubo No.
1 (Blanco).
6. Agregar la solución stop como indica el siguiente cuadro:
7. Cierre los tubos y mezclar.
8. Reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
9. Lea nuevamente los tubos No. 2 y 3, utilizando como blanco el tubo No. 1

Calculo de resultados
Valores de referencia
Hombres Mujeres
Suero 0.64 - 1.04 mg/dL 0.57 - 0.92 mg/dL
Orina 1.0 – 2.0 g /24 hrs. 0.8 – 1.8 g /24 hrs.
Depuración de creatinina: 80-140 mL/min

1. Ficha técnica Creatinina Di recta .864101004. Wiener Lab, Rosario, Argentina
Edición.Mosby, Inc.
4. http://sipla.com.ar/download/Creatinina%20trabajo%20final.pdf

PRÁCTICA NO. 5
FUNCIÓN RENAL:DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO DE UREA
Introducción
La Urea es una sustancia de las llamadas “Nitrogenadas No Proteícas” (NNP). Es el principal producto
nitrogenado del catabolismo de las proteínas y sólo se sintetiza en hígado. Junto con la prueba de Creatinina, son las
más utilizadas para verificar la función renal. La concentración de urea será cuantificada espectrofotométricamente,
y al igual que con las pruebas de Creatinina, una elevación de la concentración serica, se interpreta como una posible
disfunción real, con la diferencia que las concentraciones de urea están íntimamente ligados con la dieta y el
metabolismo proteico, por lo que cualquier cambio en alguno de estos dos dará como consecuencia un cambio en la
concentración de la urea.
Objetivos
Que el estudiante
1. Realice la prueba de determinación de nitrógeno de urea.
2. Use los valores obtenidos para evaluar la condición del paciente.
Alcance
Que el estudiante
1. Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones.
Antecedentes
La urea solo se sintetiza en el hígado como un producto de la desaminación de los aminoácidos. (Ver Figura
No.5.1). Su eliminación en la orina representa la principal vía de excreción del nitrógeno. La elevación de sus valores
se utiliza como indicador de disfunción de la filtración renal y es utilizado como para establecer la necesidad de
diálisis en pacientes con insuficiencia renal crónica. Es considerada una prueba de función renal. La concentración
sanguínea y urinaria se pueden incrementar por: la actividad muscular, traumas, infecciones, ayuno, etc). Se
encuentran concentraciones elevadas de urea en plasma como consecuencia de una dieta hiperproteíca, o
tratamiento con glucocorticoides (uremia prerrenal).

Figura No. 5.1
Biosintesis de Urea
http://www.guiametabolica.org/noticia-articulo/novedades-y-avances-en-el-ciclo-de-la-urea
En condiciones patológicas las concentraciones séricas de urea aumentan en: insuficiencia renal, deshidratación,
inanición, úlcera péptica sangrante, insuficiencia cardiaca congestiva, choque (hipovolémico, cardiogénico, séptico,
etc), tirotoxicosis, etc. El incremento en la mayoría de los casos se explica por una disminución en el índice de
filtración glomerular. La uremia postrenal está causada por condiciones que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis,
tumor o hipertrofia prostática. La utilidad de la urea como indicador de la función renal está limitada por la
variabilidad de su concentración plasmática como consecuencia de factores no renales.
La disminución de la urea sérica se observa, entre otras condiciones, en insuficiencia hepática, pues es en el
hígado donde se sintetiza la urea. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un
único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
Fundamento del método:
El test de Nitrógeno de Urea mide la porción de nitrógeno de la urea, y es usado como índice de función
glomerular.
La técnica esta basada en una serie de reacciones en donde la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en
la muestra, en amoníaco (NH3) y anhídrido carbónico (CO2). El amoníaco formado se incorpora al α-cetoglutarato
por acción de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH a NAD+.

Pre-laboratorio
1. Mencione 3 patologías que se asocien a la alteración del nitrógeno de urea y mencione los síntomas de
cada una de ellas.
Materiales
1. Reactivos
a. Muestra de suero
b. Kit para medir Urea Cinética AA de Wierner lab. Conteniendo los siguientes reactivos:
i. Estándar, solución de urea 0.6 g/L
ii. Buffer, solución buffer Goods pH 7.9
iii. Enzimas, 2 oxoglutarato, NADH, ureasa y glutamato deshidrogenasa (GIDH)
iv. Reactivo de trabajo, el cual consta de una mezcla de buffer y enzimas (2- oxoglutarato,
NADH, ureasa y glutamato deshidrogenasa)
2. Instrumentación
c. Cronometro
d. Micropipetas de 2 a 20 μL, 10- -
e. Puntas para micropipeta
f. Gradilla
3. Cristalería
a. Tubos de vidrio

Procedimiento

a. Estándar
b. Muestra Suero No. 1
c. Muestra Suero No. 2

d. Reactivo de trabajo
4. Mezclar sin invertir y comenzar a tomar el tiempo inmediatamente.

5. Después de 60 segundos medir la absorbancia y continuar la incubación. (S1)
6. Esperar 120 segundos y medir nuevamente la absorbancia. (S2) (60 segundos después de la primera
lectura)
7. Determine la diferencia de absorbancias (A)
Para la determinación del Nitrógeno de Urea: divida el resultado de la Urea / 2.14
Nota: para el reporte de sus resultados, deberá de calcular la concentración de Nitrógeno de Urea en
mg/dL.
Urea = 15 – 39 mg/dL
Nitrógeno de Urea = 7 – 20 mg/dL
Anexo:
Investigue sobre la reacción de Berthelot modificada
Bibliografía
1. Ángel, Gilberto y Ángel, Mauricio. Interpretación Clínica del Laboratorio. 7ª. Edición. Editorial Médica
Panamericana. 2006. Bogotá.
2. Cifuentes, G. y N. Del Cid 2011” Práctica No. 5 del Manual de Bioquímica III”, Facultad de Medicina de la
Universidad Mariano Gálvez, 5 páginas.
3. Ficha técnica Urea Cinética. 861237005. Wiener Lab. Rosario, Argentina
4. http://www.guiametabolica.org/noticia-articulo/novedades-y-avances-en-el-ciclo-de-la-urea
5. http://www.geocities.ws/jorgecon/UREA-guia.pdf

PRÁCTICA NO. 6
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE ÁCIDO ÚRICO
Introducción
El ácido úrico se produce por la descomposición de las purinas, sustancias químicas que entran al torrente
sanguíneo durante la digestión de los alimentos o debido a la descomposición normal de algunas células del cuerpo.
Los riñones filtran la mayor parte del ácido úrico presente en la sangre y lo eliminan del organismo a través de la orina.
Parte del ácido úrico también se expulsa del organismo en las heces. Si el cuerpo produce demasiado ácido úrico o si
no logra eliminar cantidades suficientes, es posible que se acumule en el organismo. En esta práctica se harán las
mediciones del ácido úrico en la orina por medio de un examen rápido y sencillo.
Objetivos
Que el estudiante
1. Se introduzca a los métodos enzimáticos para determinaciones clínicas.
2. Estudie las patologías asociadas con ácido úrico elevado.

Alcance
Que el estudiante
1. Continúe familiarizándose con la aplicación de métodos espectrofotométricos para determinación de analitos

en muestras biológicas.
Antecedentes
El ácido úrico es el mayor producto del catabolismo de los nucleósidos de purina. Las purinas
provenientes de la dieta se convierten a ácido úrico directamente. Sin embargo la mayor parte de las purinas que
se excretan como ácido úrico en la orina proviene de la degradación de ácidos nucleicos endógenos. Un 75% del
acido úrico excretado por los seres humanos es excretado por la orina, el resto es secretado al tracto
gastrointestinal, donde se degrada a alantoína y otros compuestos por las enzimas bacterianas.
El manejo renal es complejo y ocurre en 4 pasos: (1) filtración glomerular; (2) reabsorción de 98-100%
en el túbulo proximal convolucionado; (3) secreción hacia el lumen en la porción distal del túbulo proximal; y (4)

nueva reabsorción en el túbulo distal. La filtración neta de ácido úrico es de 6 a 12% de la cantidad filtrada.
La hiperuricemia se define como concentraciones de ácido úrico en sangre mayor a 6.0 (mujeres)
o 7.0 mg/dL (hombres). La manifestación clínica extrema de hiperuricemia ocurre en forma de gota, cuando el
urato monosódico precipita de los fluidos sobresaturados. Los depósitos de urato son los responsables de los
síntomas La artritis gotosa puede asociarse con cristales en fluido articular, y depósitos de cristales en los
tejidos que rodean la articulación. Cuando los depósitos ocurren en tejido blando, producen una respuesta
inflamatoria intensa mediada por leucocitos polimorfonucleares y macrófagos.
La gota primaria se asocia con hiperuricemia esencial debido a la sobreproducción metabólica de

purinas o excreción disminuida de ácido úrico. La gota secundaria es resultado de hiperuricemia asociada a
causas identificables. La falla renal aguda o crónica puede producir retención renal de ácido úrico.
Algunos medicamentos, en particular diuréticos pueden ser la causa de la falla. La acidemia orgánica por
aumento del ácido acetoacético en diabéticos, o la acidosis láctica pueden interferir con la secreción
tubular del urato. En células tumorales, el rápido recambio de ácidos nucleicos puede también inducir
hiperuricemia.
El nivel de ácido úrico en la sangre se incrementa gradualmente con la edad, aumentando un 10%
entre los 20 y 60 años de edad. Las mujeres muestran un aumento considerable después del inicio de
la menopausia, alcanzando niveles similares a los reportados en hombres.
Un acercamiento a la interpretación de valores de ácido úrico sérico es
considerar el grado de hiperuricemia en relación con el riesgo de desarrollo de gota. Hombres con valores de
ácido úrico por encima de 9.0 mg/dL tienen alrededor de 150 veces más riesgo de tener artritis gotosa que el
grupo de hombres con valores menores a 6.0 mg/dL. La excreción de ácido úrico
Los métodos que involucran reacciones enzimáticas tienen mayor especificidad que otros métodos
colorimétricos debido a que el sustrato reacciona específicamente con la enzima utilizada. La uricasa cataliza la
oxidación del ácido úrico a alantoína, con producción de H2O2. En este procedimiento se utiliza un sistema de
peroxidasa acoplado con moléculas aceptoras de electrones que producen un cromógeno, o molécula
coloreada. Se reducen la interferencias con metabolitos como bilirrubina o ácido ascórbico usando moléculas
complejas, como el fenol substituido de la aminofenazona.
Fundamento del método:

La concentración de ácido úrico será cuantificada espectrofotométricamente a través de la reacción de
ácido úrico catalizada por uricasa, acoplada a la formación de un complejo de color. La uricasa cataliza la reacción
del ácido úrico presente en la muestra, para formar alantoína y peróxido de hidrógeno (H2O2). El H2O2

formado reacciona por la actividad catalítica de la peroxidasa con ácido 3,5-dicloro-2- hidroxibencensulfónico
(DCHBS) y 4-aminofenazona (PAP) para producir un complejo rojo-violeta de quinoneimina que se
cuantifica en el espectrofotómetro con una longitud de onda de 520 nm.
Pre-laboratorio
1. Investigue en que situaciones se pide análisis de ácido úrico.
2. Haga un cuadro de causas de hiperuricemia.
3. ¿Cuáles son los diferentes métodos para la identificación de ácido úrico?
4. Investigue cuales son los valores normales de ácido úrico en sangre y en orina de 24 horas
Materiales
1. Reactivos
a. Kit de Ácido Urico Liquicolor conteniendo los siguiente reactivos:
i. Estándar de ácido úrico, 8 mg/dL
ii. Reactivo enzimático
2. Cristalería
a. Tubos de vidrio de 10 Ml
3. Instrumentación
c. Baño de agua a 37°C
d. Micropipetas de de 2 a 20 µL, 20-200 µL, 200-1000 µL
e. Puntas para micropipeta azules y amarillas

Procedimiento
 Estándar
 Muestra Suero
 Muestra de orina diluida 1:10
 Reactivo de trabajo

4. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos o 5 minutos en baño María a 37°C
5. Medir la absorbancias de las muestras a 520 nm llevando el equipo a 0 con el tubo No. 1 (Blanco), debe
leer en el siguiente orden: Estándar, muestra de suero, muestra de orina, antes de transcurridos 15
minutos.
Suero:
 Hombres: 3.4 a 7.0 mg/dL
 Mujeres: 2.4 a 5.7 mg/dL
Orina: 250 a 750 mg/24 horas
1. Burtis, C. y E. Ashwood. 2001. Fundamentals of Clinical Chemistry. 5ª. Edición. W.B. Saunders Company,
Filadelfia, USA. p 422-426.
2. Ficha técnica URIC ACID Liquicolor. 106901E Human, Wiesbaden, Alemania.

PRÁCTICA No. 7
EL ELISA COMO UN ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO
Introducción
Las técnicas basadas en las reacciones antígeno-anticuerpo, conocidas como inmunoanálisis, permiten
el estudio, reconocimiento y cuantificación de una gran cantidad de moléculas. En esta práctica conocerá una
de las técnicas más comunes, el ELISA (por el término en inglés Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Está
práctica se realizará en su totalidad en tres sesiones de laboratorio. En la primera realizará una simulación del
análisis de ELISA, en la segunda y tercera parte realizará un análisis completo de ELISA.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Simule una prueba de ELISA para una especie específica, sea esta
patógena o no.
2. Diferencie entre ELISA directo, ELISA tipo sándwich y ELISA indirecto
Alcance
El estudiante
1. Reconocerá el esquema de cada uno de los tres tipos diferentes de ELISA que existen
2. Podrá describir la base inmunológica de una prueba de ELISA
3. Explicará el por qué la especificidad del análisis de ELISA
Antecedentes
Antes de profundizar en los inmunoensayos es importante que queden claros algunos conceptos que se
enumeran a continuación:
 Anticuerpo: es una proteína producida por el cuerpo en respuesta a una sustancia “invasora”. Los anticuerpos
se producen como parte de la respuesta inmunológica del cuerpo para protegerse. Los anticuerpos (Ab) son un

tipo de proteínas denominado inmunoglobulinas. La más común es la inmunoglobulina G (IgG). IgG es una
proteína compuesta por dos regiones principales, estructural y funcional (Ver Figura No. 7.1)
o Región Fab: Contiene el punto de unión del antígeno (Ag) que varía entre diferentes anticuerpos.
o Región Fc: Región de estructura constante dentro de una clase de anticuerpo.
Figura No. 7.1

Estructura de un Anticuerpo
http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-_inmunoensayos_1.pdf
 Antígeno: es la sustancia que el cuerpo está tratando de “combatir” (eliminar o reducir) preparando una
respuesta inmunológica. Algunos test de inmunoensayos determinan la presencia de antígenos directamente,
en vez de buscar anticuerpos.
 Analito: es todo lo que se mide en una prueba de laboratorio. En el inmunoensayo, el analito puede ser tanto un
anticuerpo como un antígeno.
Inmunoensayos:
Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son los que se basan en la especificidad de la
unión antígeno-anticuerpo. Los inmunoensayos utilizan un anticuerpo selecto o más para detectar analitos de interés.
Los analitos que se miden pueden ser aquellos que están presentes en el cuerpo naturalmente (como por ejemplo una
hormona tiroidea), aquellos que el cuerpo produce, pero no están típicamente presentes (como por ejemplo un antígeno

de cáncer), o aquellos que naturalmente no existen en el cuerpo (como por ejemplo una droga de abuso).Los
anticuerpos poseen una alta especificidad y afinidad para un antígeno específico. Es la unión específica de un
anticuerpo a un antígeno lo que permite la detección de analitos por medio de una variedad de técnicas de
inmunoensayo.
Existen diferentes criterios de clasificación para estos ensayos: según la naturaleza del sistema pueden ser
competitivos o no, conforme a la naturaleza del conjugado se han identificado los ensayos con antígenos o anticuerpos
marcados. Sin embargo, la clasificación más usada se basa en si se requiere o no de procedimientos para separar las
fases del ensayo; de acuerdo con este criterio los inmunoensayos enzimáticos se clasifican respectivamente en
heterogéneos y homogéneos.
 Inmunoensayos homogéneos: Estos se ejecutan sin una fase sólida y no requieren la separación entre los
reactantes enlazados y libres. Su principio se basa en una inhibición o activación de la reacción enzimática por
el complejo antígeno-anticuerpo. En la reacción enzimática de comprobación, esta actividad catalítica se mide
en comparación con el conjugado libre, lo que hace superflua la separación de fases, razón por la cual se le
denomina ensayo homogéneo. Pueden dividirse en:
o Competitivos, el clásico conjugado antígeno-enzima es modulado por la reacción antígeno-anticuerpo,
o por impedimento estérico o cambio en la configuración de la enzima. En lugar de la enzima puede
conjugarse el substrato; en este caso, el anticuerpo bloqueará su degradación. En ambos
procedimientos el antígeno libre disminuirá esta modulación.
o No competitivos, la distinción entre los elementos libres y enlazados se logra usando diferentes
conjugados, dirigidos contra distintos epítotos del antígeno, y el producto de una de las enzimas
seleccionadas es el substrato para la otra.
 Inmunoensayos heterogéneos: También conocido como ELISA, siempre se realiza una separación entre el
inmunocomplejo formado sobre la fase sólida y las biomoléculas no fijadas. Esta separación se realiza de
varias maneras:
o Aspiración y lavado
o Sedimentación
o Captura de inmunocomplejos
o Filtración
o Difusión radial
o Otras técnicas inmunocromatográficas.
Historia del ELISA

No se puede decir que los ELISAs fueran desarrollados en un solo trabajo, sino que fueron numerosos los
autores que contribuyeron, en mayor o menor medida, a su completo desarrollo:
 Avrameas y Uriel (1966) concibieron la idea de marcar antígenos y anticuerpos con enzimas.
 Nakane y Pierce (1966) y Wincker y Avrameas (1969) marcaron anticuerpos mediante enzimas con la
finalidad de localizar antígenos virales en cortes de tejidos animales.
 Engvall y Perlmann (1971, 1972) utilizando los métodos anteriormente mencionados, describieron el
primer método ELISA para titular inmunoglobulinas utilizando como inmunoadsorbente tubos de
poliestireno
 Voller (1974) puso a punto el método en microplaca de poliestireno y sugirió su uso para titular
anticuerpos inducidos por enfermedades infecciosas.
 En 1975 aparece el primer trabajo empleando el ELISA para la detección de anticuerpos anti-
Trichinella spiralis (Ruitenberg, Steerenberg y Brosi).
Desde el año 1977 hasta la actualidad se observa un gran auge en la aplicación de estas técnicas para el
diagnóstico de diferentes enfermedades animales, vegetales y humanas. Hoy en día la técnica de ELISA se aplica en la
mayoría de laboratorios, constituyendo uno de los métodos de diagnóstico más extensamente utilizados en análisis
rutinarios así como en investigación.
Fundamento del Elisa:

Para evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo se han usado diferentes métodos; de los basados en la
inmunoprecipitación y la aglutinación, que adolecen de insuficiente sensibilidad y detectabilidad, se pasó a los que
emplean marcadores para detectar dicha reacción. Se han usado isótopos radioactivos, compuestos fluorescentes y
quimioluminiscentes, marcadores electroactivos, lantánidos, radicales libres estables, partículas de látex, liposomas,
colorantes, coloides, bacteriófagos y enzimas, entre otros. Los ensayos que usan como marcador enzimas (técnicas
inmunoenzimáticas, inmunoensayos enzimáticos o ensayos inmunoenzimáticos) presentan extraordinarias ventajas
aún no superadas, tales como:
 Elevada sensibilidad, detectabilidad y especificidad.
 Equipamiento relativamente barato.
 Procedimientos técnicos rápidos y sencillos.
 Alta precisión y exactitud.
 Reactivos relativamente baratos y de larga vida.
 Gran variedad de substratos y cromógenos que incrementa su versatilidad.
Las técnicas inmunoenzimáticas constituyen el desarrollo ulterior del radioinmunoanálisis; en lugar de los peligrosos
radioisótopos de corta vida media, se emplean enzimas como sustancias marcadoras. Surgieron a mediados de la
década de los 60 para la identificación y localización intracelular de antígenos y han tenido un auge vertiginoso, su uso
se ha ampliado para la detección de un diverso número de antígenos y anticuerpos. Estos ensayos se apoyan en tres
características biológicas fundamentales: la extraordinaria especificidad de los anticuerpos, el elevado poder catalítico y
la alta especificidad de las enzimas. Mediante la combinación de la reacción inmunológica con un indicador altamente
sensible, el débil efecto inmunológico se ve reforzado por la amplificación enzimática, de forma que se consigue una
elevada sensibilidad y detectabilidad; si a esto le añadimos la especificidad de la reacción inmunológica, se podrá
comprender su aplicabilidad en el diagnóstico clínico. Gracias a ello se han podido estudiar: hormonas, fármacos,
péptidos y proteínas, vitaminas, agentes patógenos, otros analitos y, por supuesto, anticuerpos dirigidos contra los
propios constituyentes del organismo (autoanticuerpos), contra diversos microorganismos o contra inmunógenos
vacunales.
La reacción antígeno-anticuerpo se detecta generalmente mediante un cambio de color o la emisión de luz,
producidos por la interacción de la enzima y su substrato. Ambos efectos son cuantificables y proporcionales a la
intensidad de la interacción. Para comprender completamente lo que ocurre durante un ensayo ELISA puede revisar la
figura No. 7.2 o consultar el siguiente link:
http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html

Figura No. 7.2
Esquema de cómo ocurre un ELISA
http://www.reumatologiaclinica.org/es/tecnicas-inmunologicas-que-apoyan-el/articulo/13149602/
Clasificación de ELISA
 ELISA competitivo: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un
número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva
debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra.
 ELISA no competitivo: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la
fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el
conjudado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando un color determinado. Estos se sub-
clasifican en:
o Los directos que detectan antígenos
o Los indirectos que detectan anticuerpos.

o Tipo sándwich doble anticuerpo, el primer anticuerpo captura el antígeno de la muestra que

es detectado a través del conjugado anticuerpo-enzima o amplificado con un conjugado
dirigido contra el segundo anticuerpo (sándwich doble anticuerpo modificado) u otros
procedimientos. Este tipo de ELISA es una modificaicón del directo y mejora la sensibilidad
del análisis, cuando se requiere, usando un anticuerpo de captura para el antígeno que
se busca.
Pasos generales para realizar un ELISA
Como siempre, en la sección de procedimiento encontrará en forma detallada como debe trabajar en el
laboratorio, pero siendo esta práctica una introducción a los análisis ELISA se hace esta sección para que estudie y
comprenda como se realiza paso a paso y que resultados obtendrá de este análisis.
 Kit
Para realizar este tipo de análisis existen diferentes “Kits” que vienen provistos de los reactivos y materiales
necesarios para llevar a cabo este tipo de análisis. En la figura No.7.3 encontrara un ejemplo de estos kits.
Figura No. 7.3
Kit de ELISA
En la figura No. 7.3 se muestran las partes básicas que contiene un kit para trabajar en ELISA, estos son:
o Set de calibradores
o Pocillos preparados para agregar las muestras de trabajo.
o Soluciones de trabajo, estas pueden ser:
 Solución de parada
 Solución de lavado

 Soluciones buffer
 Conjugado enzimático-antígeno
 Sustrato
 Lector de ELISA
En el laboratorio se cuenta con un lector de ELISA similar al que se presenta en la figura No. 7.4, su instructor
le indicara sus partes y como funciona.
Figura No. 7.4
Lector de Elisa
http://www.cclab.pe/detalle-equipo.php?idEquipo=zbzxP
 Procedimiento general para realizar análisis de ELISA

o Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo, en el caso de los que utilizará en el laboratorio ya
vienen tapizados por el proveedor.
o Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos

o Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo.
o Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima (conjugado)
o Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
o Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

o Adición del sustrato
o Unión del sustrato a la enzima (obtención del producto)

o Agregar solución de parada
o Desarrollo del color y lectura en el espectrofotómetro
Pre— Laboratorio
Antes de llegar al laboratorio, investigue:
1. ¿Qué aplicaciones diagnósticas importantes tiene el ELISA?
2. ¿Qué significa un “análisis de tamizaje”?
3. Explique de qué depende la especificidad de un análisis de ELISA.

4. ¿En qué consiste el ELISA directo, indirecto y tipo sanwich?
Materiales
a. Reactivos
- Calibrador 1
- Calibrador 2
- Muestra1
- Muestra 2
- Enzima conjugada
- Sustrato
- Solución de lavado
- Solución STOP
b. Otros
- Placa para ELISA
Procedimiento
 Calibrador 1
 Calibrador 2
 Muestra 1
 Muestra 2
 Conjugado
 Reactivo de trabajo
 Solución de lavado´
 Substrato
 Stop

2. Se le dará una tira que simulara ser los pozos o pocillos para ELISA (Ver figura No.7.5) y siga el siga el
esquema de pipeteo para una prueba de ELISA que se describe en el cuadro No. 7.1
Figura No. 7.5
Posiciones de las muestras en los pocillos del Elisa
Cuadro No. 7.1
Esquema de pipeteo para práctica

Pozo A1 B1 C1 D1
Calibrador 1 20µL ------ ------ ------
Calibrador 2 ------ 20µL ------ ------
Muestra 1 ------ ------ 20µL ------
Muestra 2 ------ ------ ------ 20µL
Conjugado 200µL 200µL 200µL 200µL
3. Mezclar e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Lavar con 400µL cada pozo. Repetir 3 veces el lavado.
5. Agregar 100µL de substrato a cada pozo.
6. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.

7. Agregar 100 µL de solución Stop.
8. Mezclar cuidadosamente.
Anexo
Investigue qué pruebas clínicas se realizan con ELISA. Además, investigue qué otros tipos de ELISA
existen además de los tres ya mencionados.
1. Janeway, C. A. et al. 2001. Inmunobiology. 5a Edición. Garland

Science Publising, New York.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&dep th=10
2. Mazariegos D. & Molina S. 2008 Manual de Prácticas de Bioquímica 3, Universidad Mariano

Gálvez de Guatemala y El I2QB3. Modificado en 2012 por Del Cid, N.
3. Ochoa, R. 2012 “técnicas inmunoenzimáticas para ensayos clínicos de vacunas y estudios

inmunoepidemiológicos” Cuba. http://www.finlay.sld.cu/ediciones.htm
4. The Biology Project. ELISA Activity. 1998. Página consultada el 25 de febrero,

2007. http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&dep
6. th=10http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/soluciones-elisa-introduccion.pdf
7. http://www.reumatologiaclinica.org/es/tecnicas-inmunologicas-que-apoyan-el/articulo/13149602/
8. file:///C:/Documents%20and%20Settings/jgonzalez/Mis%20documentos/Downloads/C2++METOD
OLOGIA+Y+CLASIFICACION+DE+LOS+ELISAS++Ibeth+Neyra.pdf
9. Neyra I. 2012 “Metodología y clasificacion del Elisa en la determinacion de antigenos y de

anticuerpos”
file:///C:/Documents%20and%20Settings/jgonzalez/Mis%20documentos/Downloads/C2++METOD
OLOGIA+Y+CLASIFICACION+DE+LOS+ELISAS++Ibeth+Neyra.pdf
10. http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-_inmunoensayos_1.pdf
11. http://www.finlay.sld.cu/publicaciones/inyestrategias/Tecnicas%20inmunoenzimaticas%20para%2
0ensayos%20clinicos%20de%20vacunas%20y%20estudios%20inmunoepidemiologicos.pdf

PRÁCTICA No. 8
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE TIROXINA Y TRIIODOTIRONINA
Introducción
En la presente práctica se llevará a cabo una prueba de ELISA para determinar la presencia
de tiroxina total en muestras desconocidas. Esta práctica pretende ilustrar al estudiante sobre cómo se
lleva a cabo una determinación sencilla usando la técnica de ELISA, enfatizando los cuidados que debe
tenerse para asegurar el resultado obtenido.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de T4 total en muestras
desconocidas.
2. Reconozca los cuidados que debe tenerse durante todas las etapas de la realización de una
prueba de ELISA
Alcance
Que el estudiante:
1. Explique el esquema de la técnica de ELISA utilizado.
2. Indique la importancia de realizar correctamente los lavados durante una determinación por
técnica de ELISA
3. Conozca la forma correcta de manejar una muestra clínica para asegurar su integridad y la calidad de
los resultados obtenidos

4. Practique las precauciones indicadas durante el manejo de muestras
clínicas.
Antecedentes
 Tiroxina – T4 total – Tetraiodotironina
La Tiroxina es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Más del 99% de T4 en la

sangre está unida reversiblemente a las proteínas plasmáticas (principalmente a Globulina unida
a Tiroxina, TBG), quedando una parte muy pequeña libre, que es la porción que controla los
procesos metabólicos.
Es parte integrante del perfil tiroideo, el cual se emplea en el diagnostico de toda afección tiroidea
y su dosificación aislada, debe de interpretarse con reservas. Sin embargo, en el recién nacido,
su dosificación permite diagnosticar precozmente el hipotiroidismo congénito y evitar el
retraso mental.
Niveles elevados de T4 han sido encontrados en hipertiroidismo debido a enfermedad de Grave
y de Plummer así como en tiroiditis aguda y subaguda. Bajos niveles de T4 han sido
asociados con cretinismo, mixedema, enfermedad de Hashimoto y algunas anormalidades
genéticas.
 Tiriodotironina – T3 total
Es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Más del 99% de T4 en la sangre está
unida reversiblemente a las proteínas plasmáticas. La concentración de T3 es mucho más baja que
la de T4, pero su potencia metabólica es mucho más alta. Al igual que la T4, la T3 representa
una herramienta muy valiosa para el diagnostico de enfermedad tiroidea.
Pre— Laboratorio
Antes de llegar al laboratorio, investigue:
1. ¿Qué significa el término ELISA competitivo?
2. Para la realización de T3 y T4 se utilizará un ELISA de tipo

competitivo, hacer un esquema de este tipo de ELISA.

Materiales
1. Reactivos
a. Kit de Elisa para T3 y T4 conteniendo:
i. Calibradores
ii. Enzima Conjugado-antigénico
iii. Solución de lavado
iv. Reactivo Sustrato
v. Solución STOP
b. Muestra desconocida para T3 y T4
2. Instrumentación
a. Tiras de micropocillos (contenidas en los kits de T3 y T4)
b. Micropipetas de 10 a 100 μL, 100-1000 L
c. Puntas para micropipeta azules y amarillas
Procedimiento
1. Se le proporcionarán las muestras a utilizar para el análisis. En este caso, debe usarse muestras de
suero o plasma (¿Cuál es la diferencia?), que se haya obtenido usando EDTA o heparina como
anticoagulantes. No debe usarse muestras hiperlipidémicas o hemolizadas (¿Qué quiere decir esto y por
qué?).
2. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usarse. Para obtener resultados
reproducibles, es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con el mismo tiempo en todos los
pocillos.
3. Se le proporcionaran dos porta-tiras en los que ya se están incubando las muestras y los calibradores.
Estos fueron colocados como se indica la figura No. 8.1 y se siguió el esquema de pipeto que se indica en el
cuadro No. 8.1 y 8.2. Para que conozca el procedimiento se describe paso a paso que se realizó previo al
inicio de la práctica, pero usted lo iniciara en la Etapa de lavado.

Figura No. 8.1
Posiciones de las muestras de T3 y T4 en los pocillos del Elisa
Cuadro No. 8.1

Esquema de pipeteo para determinación de T3
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
Calibrador 1 50µL ----- ----- ----- -----
Calibrador 2 ----- 50µL ----- ----- -----
Calibrador 3 ----- ----- 50µL ----- -----
Muestra 1 ----- ----- ----- 50µL -----
Muestra 2 ----- ----- ----- ----- 50µL
Conjugado 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL

Cuadro No. 8.2
Esquema de pipeteo para determinación de T4
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
Calibrador 1 25µL ----- ----- ----- -----
Calibrador 2 ----- 25µL ----- ----- -----
Calibrador 3 ----- ----- 25µL ----- -----
Muestra 1 ----- ----- ----- 25µL -----
Muestra 2 ----- ----- ----- ----- 25µL
5. Etapa de lavado: Lavar cada pozo con la respectiva solución de lavado. Se debe lavar 3 veces con 300µL
cada vez.
6. Siga el siguiente sistema de pipeteo para cada análisis

Cuadro No. 8.3
Esquema de pipeteo del substrato para T3
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
Substrato 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL
Cuadro No. 8.4

Esquema de pipeteo del substrato para T4
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
7. Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
8. Agregar la respectiva solución Stop a los pocillos, siguiendo el siguiente esquema de pipeteo para cada
análisis:
Cuadro No. 8.5
Esquema de pipeteo de la Solución Stop para T3
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
Stop 50µL 50µL 50µL 50µL 50µL

Cuadro No. 8.6
Esquema de pipeteo de la Solución Stop para T4
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
9. Mezclar cuidadosamente e interpretar.

- Se le darán diferentes calibradores (por mesa se utilizarán 3), los cuales tienen una concentración
conocida de T3 o T4.
Calibradores T3 Calibradores T4
A = 0.00 ng/mL A = 0.00 µg/mL
B = 0.50 ng/mL B = 2.00 µg/mL
C = 1.00 ng/mL C = 5.00 µg/mL
D = 2.50 ng/mL D = 10.00 µg/mL
E = 5.00 ng/mL E = 15.00 µg/mL
F = 7.50 ng/mL F = 25.00 µg/mL
- Deberá de tener en cuenta que prueba está realizando su mesa, si T3 o T4.

- Deberá de conocer cuales calibradores está utilizando su grupo de trabajo.
Interpretación de resultados
Los resultados se interpretaran de la siguiente manera:

- Anotar la intensidad de color de sus calibradores y de sus muestras por medio de cruces, siendo
de menor (+) a mayor (+++) intensidad.
- Los calibradores le servirán para que pueda comparar estos contra su muestra y así saber la
concentración de las hormonas presentes en sus muestras.

Anexo
Investigue brevemente qué condiciones médicas pueden dar origen a niveles alterados (elevados o
disminuidos) de la hormona T4 y T3. ¿Existen otras pruebas que deben acompañar a éstas?
Edición. Mosby, Inc. pág. 827-848
2. Inserto del producto. T4 Prueba ELISA para la determinación cuantitativa de Tiroxina Total (T4) en
suero o plasma humanos.


PRÁCTICA No. 9
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE CORTISOL POR EL MÉTODO DE ELISA
Introducción
El cortisol es el principal glucococrticoide secretado por la corteza suprarrenal humana y el esteroide
más abundante en la sangre periférica. Estudios han demostrado que todo el cortisol secretado
deriva del colesterol circulante en condiciones basales y como resultado de la estimulación aguda
con adrenocorticotropina (ACTH).
Objetivos
Que el estudiante:
1. Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de cortisol en muestras
desconocidas.
2. Reconozca los puntos críticos en la realización de una prueba de ELISA.
Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparación de una placa de ELISA.
2. Explique el esquema de la técnica de ELISA competitivo y pueda reconocer las diferencias que existen
entre cada tipo de ELISA.
Antecedentes
El cortisol, también llamado hidrocortisona o componente F, es un esteroide de 21 carbonos y es
el glucocorticoide más importante en el humano. Es formado y secretado por la corteza suprarrenal. El
90% del cortisol está ligado a la proteína plasmática transcortina, mientras que alrededor del 7% está unida
a la albumina. El resto de forma libre (alrededor de un 3%) es la forma
biológicamente activa del cortisol, el cual puede determinarse en muestras de suero, plasma, saliva y
orina.

Regulación de la Secreción de Cortisol
La secreción del cortisol está determinada por el índice de secreción de ACTH por parte de la
adenohipófisis bajo la estimulación del factor de liberación de corticotropina (CRF) procedente del
hipotálamo. El índice de secreción de ACTH presenta el balance entre las influencias
estimuladoras del sistema nervioso central y las inhibidoras del cortisol circulantes sobre la hipófisis o
los centros hipotalámicos. El descenso del cortisol plasmático no unido a proteínas produce un aumento
en la secreción de ACTH y un ascenso inhibe dicha secreción. Sin embargo, pueden producirse
variaciones diarias de los niveles de ACTH en el plasma en ausencia de toda variación de los niveles
plásmaticos de cortisol (Enfermedad de Addison), por lo que la periodicidad circadiana parece ser secundaria
a la periodicidad en la secreción de ACTH. Esta secreción puede comenzar a concentración cero de
cortisol en plasma o a una alta concentración de cortisol o ACTH, por lo que es dudoso que el
concepto usual de un mecanismo cerrado de retroacción negativa cumpla alguna función en la regulación
minuto a minuto de la secreción de cortisol en el hombre.
En el hombre, el índice de secreción de ACTH se ha calculado en unos 10µg/día y la
concentración plasmática, entre las 6 y las 9 de la mañana, en 20- 100pg/ml. Las concentraciones
plasmáticas de ACTH y cortisol, muestran en individuos normales no sometidos a estrés, variaciones
cíclicas constantes en un periodo de 24 horas. En sujetos que tienen un ciclo sueño-vigilia normal, los
niveles plasmáticos son el resultado de una serie de episodios secretorios distintos y son más
elevados entre la 6 y las 9 de la mañana, para descender lentamente hasta alcanzar valores próximos a
cero cerca de medianoche. La secreción episódica de cortisol y ACTH representa una serie de
impulsos de amplitud y duración variable; durante estos episodios, el índice de secreción de cortisol
puede variar hasta 10 veces. Los impulsos de secreción guardan correlación generalmente con la
concentración plasmática de ACTH. No obstante, algunos individuos muestran escasa correlación entre
la ACTH detectable por inmunoensayo o bioensayo y el cortisol plasmático. El ritmo circadiano depende
del esquema sueño-vigilia, y es independiente de la ingestión de alimentos, del ejercicio o de la luz. El
acto inmediato de dormirse o despertarse no es el determinanate directo de la actividad suprarrenal, y el
aumento de ACTH que se produce a diario antes del despertar es probablemente una respuesta
condicionada debida a la anticipación subconsciente de dich despertar.
Pre-Laboratorio

1. ¿Qué significa la frase “proceso de retroacoplamiento negativo?
2. Que técnica analítica funciona mejor para la medición de hormonas y por qué?
3. ¿Cuál es la importancia de realizar una prueba de cortisol?
4. Haga un esquema para ejemplificar lo que sucede al realizar un ELISA COMPETITIVO
Materiales
1. Reactivos
a. Muestra desconocida
b. Kit de Elisa para Cortisol
i. Calibradores para cortisol
ii. Solución de conjugado
iii. Solución de lavado (diluida)
iv. Solución de sustrato
v. Solución STOP
c. Cloro 5%
d. Alcohol 70%
2. Equipo
a. Micropipetas de 2 a 20µL
b. Micropipetas de 10 a 100µL
c. Micropipetas de 100 a 1000µL
d. Puntas para micropipetas
e. Pocillos para ELISA (Kit de Elisa)
Procedimiento
suero o plasma

pocillos.
3. Se le proporcionaran un porta-tiras en el que ya se están incubando las muestras y los calibradores. Estos
fueron colocados como se indica la figura No 9.1 y se siguió el esquema de pipeto que se indica en el
cuadro No. 9.1. Para que conozca el procedimiento se describe paso a paso que se realizó previo al inicio
de la práctica, pero usted lo iniciara en la Etapa de lavado.
Figura No. 9.1
Posiciones de las muestras de Cortisol en los pocillos del Elisa
Cuadro No. 9.1

Esquema de pipeteo para determinación de Cortisol
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
Calibrador 1 20µL ----- ----- ----- -----
Calibrador 2 ----- 20µL ----- ----- -----
Calibrador 3 ----- ----- 20µL ----- -----
Muestra 1 ----- ----- ----- 20µL -----
Muestra 2 ----- ----- ----- ----- 20µL

cada vez.

Cuadro No. 9.2
Esquema de pipeteo del substrato para Cortisol
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
análisis:
Cuadro No. 9.3
Esquema de pipeteo de la Solución Stop para Cortisol
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
- Se le darán diferentes calibradores, los cuales tienen una concentración conocida de cortisol,
identificados de la siguiente manera:
Calibradores Cortisol
A = 0.00 ng/mL
B = 20.00 ng/mL
C = 50.00 ng/mL
D = 100.00 ng/mL
E = 200.00 ng/mL
F = 400.00 ng/mL
G = 800.00 ng/mL


- Los calibradores le servirán para que pueda comparar estos contra su muestra y así saber la
concentración de cortisol presente en sus muestras.
Anexo
1. Investigue brevemente qué condiciones médicas pueden dar origen a niveles alterados de cortisol
2. ¿Qué pruebas complementarias deben acompañar al cortisol para dar un

diagnostico más certero?
3. Menciones los efectos que tiene el cortisol sobre:
a. El metabolismo de los carbohidratos
b. El metabolismo de las proteínas
c. El metabolismo de las grasas

4. Investigue la función del cortisol en el estrés y la inflamación
Bibliografía
1. Ficha técnica CORTISOL. 55050 Human, Wiesbaden, Alemania
2. Kaplan, L.A. y Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry. Theory Analysis Correlation. 4ª.
Edición. Mosby, Inc. Pag 827-848.
3. Lehninger Albert L. Bioquimica; las bases moleculares de la estructura y función celular. 2ª.
Edición. Ediciones Omega, S.A. Pag. 832-834


PRÁCTICA NO. 10
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE FSH Y LH
Introducción
Entre las gonadotropinas hipofisiarias conocidas están la hormona folículo estimulante (FSH) y
la hormona luteinizante (LH), las cuales son hormonas glocoproteínicas encargadas de regular los ciclos
sexuales.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Realice una prueba de ELISA de tipo sandwich para detectar la presencia de FSH y LH en muestras
desconocidas.
2. Reconozca los puntos críticos en la realización de una prueba de ELISA.
Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparación de una placa de ELISA.
2. Explique el esquema de la técnica de ELISA de tipo sandwich y pueda reconocer las diferencias
que existen entre cada tipo de ELISA.
Antecedentes
 Hormona Foliculo Estimulante (FSH)

Es una hormona glicoproteica de aproximadamente 35.5 kD, secretada por la glándula pituitaria.
Fisiológicamente esta hormona actúa en los testículos y en los ovarios, donde induce la
espermatogénesis (en el hombre) y la esteroidogénesis (en la mujer) respectivamente. Todos
los ciclos menstruales tienen un patrón característico de secreción de FSH. Mientras la
concentración disminuye con el progreso de la fase folicular, el

valor más elevado se observa cerca del momento de la ovulación, es
decir, alrededor de la mitad del ciclo. La utilidad clínica y diagnostica de la medición de FSH para
la evaluación de la homeostasis que regula la fertilidad a través del eje hipotalámico-
hipófisiario-gonadal ha sido bien establecida.
 Hormona Luteinizante (LH)

Es una hormona glicoproteica de aproximadamente 30 kD, sintetizada en la hipófisis.
Fisiológicamente esta hormona actúa en las gonadas donde es esencial para su desarrollo y
función. Durante la primera fase del ciclo menstrual, la LH estimula el desarrollo del folículo de
Graaf. La ovulación se induce por los valores más altos de LH. La utilidad clínica y diagnostica de la
medición de LH para la para la evaluación de la homeostasis que regula la fertilidad a través del
eje hipotalámico-hipófisiario-gonadal ha sido bien establecida. La determinación de LH es
indispensable para monitorear pacientes sometidas a procedimientos de fertilización in vitro.
Pre-Laboratorio
1. ¿Cuál es el principio del ELISA tipo sandwich?
2. ¿Qué relación existe entre la hormona FSH y LH?
Materiales
1. Reactivos
a. Muestra desconocida
b. Kit de Elisa para FSH y LH conteniendo los siguientes reactivos:

• Calibradores para FSH y LH
• Solución de conjugado
• Solución de lavado (diluida)
• Solución de sustrato

• Solución STOP
c. Cloro 5%
d. Alcohol 70%
2. Equipo
a. Micropipetas de 2 a 20µL
b. Micropipetas de 10 a 100µL
c. Micropipetas de 100 a 1000µL
d. Puntas para micropipetas

e. Pocillos para ELISA (Kit de Elisa)
Procedimiento
Se le proporcionarán las muestras a utilizar para el análisis, que pueden ser suero o plasma
obtenido con EDTA. No debe usarse muestras hiperlipidémicas o hemolizadas, ni deben contener azida
de sodio. Para obtener resultados reproducibles, es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con
el mismo tiempo.
suero o plasma
pocillos.
3. Se le proporcionaran un porta-tiras en el que ya se están incubando las muestras y los calibradores. Estos
fueron colocados como se indica la figura No 10.1 y se siguió el esquema de pipeto que se indica en el
cuadro No. 10.1. Para que conozca el procedimiento se describe paso a paso que se realizó previo al inicio
de la práctica, pero usted lo iniciara en la Etapa de lavado.

Figura No. 10.1
Posiciones de las muestras de LSH o LH en los pocillos del Elisa
Cuadro No. 10.1

Esquema de pipeteo para determinación de LSH o LH
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
Calibrador 1 20µL ----- ----- ----- -----
Calibrador 2 ----- 20µL ----- ----- -----
Calibrador 3 ----- ----- 20µL ----- -----
Muestra 1 ----- ----- ----- 20µL -----
Muestra 2 ----- ----- ----- ----- 20µL
cada vez.

Cuadro No. 10.2
Esquema de pipeteo del substrato para LSH o LH
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
análisis:
Cuadro No.10.3
Esquema de pipeteo de la Solución Stop para LSH o LH
Pozo A1 B1 C1 D1 E1
- Se le darán diferentes calibradores (por mesa se utilizarán 3), los cuales tienen una
concentración conocida de FSH o LH.
Calibradores LSH Calibradores LH

A = 0 UI/L A = 0 UI/L
B = 5 UI/L B = 5 UI/L
C = 10 UI/L C = 25 UI/L
D = 25 UI/L D = 50 UI/L
E = 50 UI/L E = 100 UI/L
F = 100 UI/L F = 200 UI/L
- Deberá de tener en cuenta que prueba está realizando su mesa, si FSH o LH.


- Los calibradores le servirán para que pueda comparar estos contra su muestra y así saber
la concentración de FSH o LH presente en sus muestras.
Anexo
1. Investigue brevemente qué condiciones médicas pueden dar origen a niveles alterados de FSH y LH
2. ¿Qué pruebas complementarias deben acompañar a la FSH y LH para dar un diagnostico más
certero?
Bibliografía
1. Del Cid , N. 2012, “Práctica No. 10 del Manual de Bioquímica 3” Facultad de Medicina, Universidad Mariano
Galvez. 98pp
2. Kaplan, L.A. y Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry. Theory Analysis Correlation. 4ª.
Edición. Mosby, Inc. Pag 827-848.
3. Lehninger Albert L. Bioquimica; las bases moleculares de la estructura y función celular. 2ª.
Edición. Ediciones Omega, S.A. Pag. 832-834
4. Ficha técnica FSH 53020 Human, Wiesbaden, Alemania
5. Ficha técnica LH 53010 Human, Wiesbaden, Alemania

PRÁCTICA No. 11
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DE UNA PRUEBA CUALITATIVA
PRUEBA DE EMBARAZO
Introducción
La prueba que se usará en el laboratorio es una prueba rápida de detección de hCG en orina o en
sangre como indicador de embarazo. En esta práctica se determinará el límite de detección de la prueba, que
se utiliza como cualitativa.
Objetivos
Que el estudiante
1. Realice una cromatografía inmunológica para la detección de hCG
2. Determine el límite de detección de una prueba cualitativa de detección de hCG como prueba
temprana de embarazo.
Alcance
Que el estudiante
1. Se inicie en el manejo de muestras de suero, aplicando todo sus

conocimientos de bioseguridad
2. Relacione cada muestra con la realidad personal de un paciente
Antecedentes
La gonadotropina coriónica humana (hCG) es una hormona glucoproteica producida por la

placenta en desarrollo poco después de la fertilización. En el embarazo en un ser humano, la hCG puede
detectarse tanto en orina como en suero a partir de los 7-10 días de la concepción. Los niveles de hCG
continúan aumentando muy rápidamente superando las 100 mUI/mL tras la primera falta y alcanzando el
máximo en torno a 100,00 a 200,000 mUI/mL a las 10 a 12 semanas de embarazo. La aparición de
hCG en la orina y el suero poco después de la concepción y su rápido aumento posterior durante el

principio de la gestación hacen de esta hormona un marcador ideal para la indicación temprana del
embarazo
La prueba de embarazo en tarjeta es una prueba rápida que detecta cualitativamente la
presencia de hCG en una muestra de orina o suero con una sensibilidad de 25 mUI/mL. La prueba utiliza
una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales para detectar selectivamente los niveles
elevados de hCG en orina o suero. Con este nivel de sensibilidad, la prueba no muestra interferencias
cruzadas con otras hormonas glucoproteicas estructuralmente relacionadas, tales como la FSH, la LH y la
TSH a niveles fisiológicos altos.
Esta prueba se basa en un inmunoensayo de flujo cromatográfico en un solo paso que permite
detectar selectivamente los niveles elevados de hCG. El ensayo se realiza añadiendo la muestra al
pozo de la placa y observando la presencia o ausencia de bandas en la ventana de resultados. En el pozo
de la muestra se encuentra un conjugado de anticuerpo monoclonal de ratón contra hCG y partículas
coloidales de oro, que migra hacia las líneas de prueba y control. Si la muestra contiene hCG, el
complejo hCG-antihCG-oro se une al anticuerpo de captura en la línea de prueba y se desarrolla un color
rosado-vino tinto. La ausencia de esta línea sugiere un resultado negativo. Se incluye una línea de control,
que contiene anticuerpos policlonales de cabra contra ratón, y debe formarse siempre, independiente que
la muestra contenga hCG o no. La formación de color en la línea control asegura que la prueba ha sido
efectuada correctamente.
Materiales
1. Reactivos
a. Muestra de suero con contenido de hCG conocido
b. Prueba rápida de embarazo, placa de reacción y gotero incluido
c. Solución salina (NaCl 0.9%) para diluir
2. Cristalería
a. Tubo Eppendorf de 1.5 mL
b. Micropipetas de 2 a 20μL
c. Puntas para micropipeta

Procedimiento
1. Escuche atentamente a su instructor, quien le indicará como realizar las diluciones.
2. Tome la muestra que le corresponda a su mesa (de su compañero de la izquierda) y realice la

dilución que le corresponde. Anote en su registro la concentración de la muestra que le llegó y la
que usted produjo. Pase su muestra a su compañero de la derecha.
3. Obtenga una prueba para hCG y rompa la bolsa. No toque las membranas reactivas
con los dedos.
4. Coloque la placa en una superficie nivelada y limpia.
5. Manteniendo el gotero en posición vertical, agregue 4 gotas (unos 100 µL) de muestra al pozo de la placa
marcado como S (Sample: muestra en ingles) como lo indica la siguiente figura:
http://www.onlatexgroup.com/test-embarazo.ph
6. Programe el cronometro y revise la placa. Un resultado positivo es visible después de 1 minuto. (Después
de 10 minutos no se recomienda realizar la lectura.)
7. Los resultados pueden aparecer en la placa como se observa en la siguientes figura:

http://www.onlatexgroup.com/test-embarazo.ph
8. Compare resultados con sus compañeros de mesa. ¿Entre qué valores se encuentra el límite de
detección?
En esta práctica se estarán manejando muestras de suero humano que se sabe son positivas para
hCG. Toda muestra de esta naturaleza debe tratarse como potencialmente infecciosa, por lo cual debe
cumplirse con las normas de bioseguridad adecuadas. Debe usarse guantes en todo momento, así como
ser cauteloso durante la manipulación.
Anexo
1. Investigue qué otras pruebas existen con este tipo de principio.
2. Investigue en qué casos, fuera de embarazo normal se pueden observar valores elevado de hCG.
1. Ficha técnica Prueba de Embarazo Instant-View (Orina/Suero) Alfa Scientific Designs Inc., CA, USA
3. http://www.onlatexgroup.com/test-embarazo.ph

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Manual de Laboratorio de

Recopilado y adaptado por:

No. de Nombre de la práctica No. de

2 Separación e identificación de proteínas en suero y 23

4 Función renal: determinación de creatinina 37

5 Función renal: determinación de urea 45

6 Determinación enzimática de ácido úrico 50

7 El Elisa como un análisis cualitativo y cuantitativo 55

8 Determinación cualitativa de tiroxina y 68

11 Determinación del límite de detección de una 88

Manual de Bioquímica III Página 2

Trabajar dentro de un laboratorio de cualquier índole supone un grado de

1. Conozca la responsabilidad que adquiere al trabajar dentro del laboratorio de Bioquímica.

1. Conozca la forma de evaluación dentro del laboratorio

2. Esté consciente de las consecuencias de su calidad de trabajo en el laboratorio

Manual de Bioquímica III Página 3

1. Estar inscrito en el curso teórico de Bioquímica III.

2. Guardar un comportamiento adecuado en las actividades del laboratorio, adhiriéndose completamente al

3. Asistir al laboratorio de manera PUNTUAL. El alumno que no se presente puntualmente a la puerta

Manual de Bioquímica III Página 4

Trabajo antes de llegar al laboratorio: El Pre-Lab

Trabajo dentro del Laboratorio

Manual de Bioquímica III Página 5

Manual de Bioquímica III Página 6

Reporte del Laboratorio

Manual de Bioquímica III Página 8

Manual de Bioquímica III Página 10

Rubro a evaluar Puntaje

Al final del curso, la nota final de laboratorio se compondrá de la siguiente forma

Manual de Bioquímica III Página 11

2. Determine el valor de pK de disociación de un ácido débil (KH2PO4).

3. Identifique una solución con mejor comportamiento de buffer.

Manual de Bioquímica III Página 12

1. Adquiera destreza en el manejo y preparación de soluciones.

2. Conozca la forma correcta de utilizar un potenciómetro.

3. Aprenda la aplicación de curvas de calibración de un aparato simple.

4. Aplique su conocimiento matemático en la obtención e interpretación de gráficos en el laboratorio.

Manual de Bioquímica III Página 13

Manual de Bioquímica III Página 14

Concentración de [H+] vrs pH y ejemplos

Manual de Bioquímica III Página 15

Manual de Bioquímica III Página 16

En su trabajo de Pre-Laboratorio, conteste claramente las siguientes preguntas:

1. Soluciones buffer o amortiguadoras:

b. ¿Cuáles son sus principales características?

c. ¿Cuál es su papel dentro del organismo?

d. ¿Cuáles son los principales sistemas buffer que se encuentran en el

e. ¿Qué significa la pK de una solución buffer?

2. Investigue sobre el potenciómetro:

a. ¿Qué es y para qué se usa?

b. ¿Cómo se encuentra diseñado?

d. ¿Cómo se maneja y qué cuidados debe tenerse al manejarlo?

Manual de Bioquímica III Página 17

1. Capacidad buffer de la saliva

b. Mida el pH de la saliva y anote en su cuaderno.

c. Mida 2.0 ml de la saliva en un beaker de 10 mL .

Manual de Bioquímica III Página 18

e. Para prevenir el espumando, agregue una gota de 2-octanol

Evaluación de la capacidad buffer de la saliva

2. Preparación de las muestras.

K2HPO4 0.05M (mL) 0 1 5 20 30 45 49 50

KH2PO4 0.05M (mL) 50 49 45 30 20 5 1 0

b. Calibración del potenciómetro:

Manual de Bioquímica III Página 19

ii. Retirar el tapón de plástico que está en el sensor.

iv. Presionar la tecla ON/OFF.