Avaliação da Produção de Amilase por Fungos

Endofíticos Isolados de Euterpe precatoria Mart.

Bárbara Nunes Batista 1,2, Rosiane Rodrigues Matias1,2, Rafael Lopes e
Oliveira1,2 e Patrícia Melchionna Albuquerque1,2
1
Universidade do Estado do Amazonas (ESA/UEA) – Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia – Escola Superior de Ciências da Saúde - CEP
69065-001 - Manaus - Amazonas - E-mail: barbara_sing@hotmail.com
2
Universidade do Estado do Amazonas (EST/UEA) – Laboratório de Química aplicada à
Tecnologia - Escola Superior de Tecnologia CEP 69050-020 Manaus – Amazonas

RESUMO
De grande potencial econômico local, a Euterpe precatoria (açaizeiro), apresenta
compostos de interessante atividade biológica (antimalárica, antidiarreica e
antioxidante). No entanto, sabe-se muito pouco sobre o potencial de seus fungos
endofíticos, capazes de produzir uma variedade de enzimas extracelulares, como as
amilases, amplamente utilizadas na indústria. Assim, este estudo teve por objetivo
avaliar a produção de amilase por fungos isolados de açaizeiro. Os fungos foram
reativados em ágar batata dextrose, incubados à 28°C por 7 dias. Posteriormente,
foram avaliados quanto a síntese de amilase em meio sólido. Dos 15 fungos
avaliados, dois foram selecionados para produção de amilase em meio líquido.
Observou-se o potencial do isolado de folha F3 (Penicillium) ao produzir mais
amilase em menor tempo (2 dias), quando comparado ao fungo isolado de caule
C22 (Guignardia), que produziu a enzima somente após 6 dias de cultivo.

Palavras-chave: açaizeiro, endófitos, atividade amilolítica.

INTRODUÇÃO
Típica no estuário amazônico, o açaizeiro (Euterpe Precatoria Mart.) apresenta
importância econômica e é pouco descrito na literatura, principalmente quando os
estudos são relacionados aos seus fungos endofíticos (ANDRADE; OLIVEIRA, 2013;
AGUIAR; MENDONÇA, 2003). Colonizadores do interior das plantas sem causar danos
aparentes, os endófitos auxiliam na síntese de metabólitos de interesse
biotecnológico, como as enzimas hidrolíticas, entre as quais encontram-se as
amilases.
Degradadoras de amido, as amilases são classificadas em: endoamilases
(catalisam hidrólise aleatória das moléculas de amido) e exoamilases (hidrolisam
ligações glicosídicas -1,4 ou -1,6) e apresentam vasta aplicabilidade industrial,
especialmente na indústria de alimentos e de bebidas (AZEVEDO,; OLIVEIRA ; NETO ;
PENA, 2007; STOIAN, 2004; MORAES, 2004; BON et al., 2008). Portanto, este estudo
teve por objetivo avaliar o potencial dos fungos endofíticos isolados de E. precatoria
Mart. quanto à síntese de amilase.

MATERIAL E MÉTODOS

Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário
Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br
Micro-organismos
Os fungos endofíticos utilizados neste estudo são provenientes do estudo
realizado por Batista, Silva e Rapôso (2016), isolados de diferentes tecidos de E.
precatoria em Manaus-AM. Foram reativados 15 fungos em meio ágar batata
dextrose (BDA) e incubados em B.O.D a 28 °C durante 7 dias.
Ensaio da Produção de Amilase em Meio Sólido
Para o inóculo, 5 mm de material micelial crescido em meio BDA foram
transferidos para o centro de uma placa de Petri com meio específico (ágar amido),
composto por ágar, amido e tampão citrato fosfato 0,1 M, pH 5,0, para detecção de
amilase (SOUZA; OLIVEIRA; ANDRADE, 2008). Após o período de incubação, as
placas foram coradas com iodo 0,1 M, revelando a formação de halos de degradação
do amido, que por sua vez foram medidos, assim como as colônias, para o cálculo
do Índice enzimático (IE), que expressa a atividade enzimática extracelular
mediante a relação entre o diâmetro do halo de degradação e o diâmetro médio da
colônia (OLIVEIRA; FLOR; OLIVEIRA, 2010). Foram selecionados os fungos que
apresentaram IE≥2 para o cultivo em meio líquido e determinação da atividade
enzimática.
Cultivo em Meio Líquido e Dosagem da Atividade Enzimática
Após a seleção dos isolados, foram inoculados 10 6 esporos/mL em 50 mL de meio
líquido, pH 7 , composto por NaNO 3 (3 g/L), MgSO4.7H2O (0,5 g/L), KCl (5 g/L), KH 2PO4
(1 g/L), FeSO4.7H2O (0,01 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) e amido (15 g/L) (HEGDE, RAMESHA E
SRINVAS, 2011). Os frascos foram incubados em shaker a 30ºC e 120 rpm. Alíquotas
de 1 mL foram retiradas a cada 24 h, filtradas, e o extrato enzimático foi utilizado na
dosagem da atividade de amilase.
Foi preparada uma curva padrão de glicose e a atividade amilolítica foi
determinada conforme descrito por Miller (1959), que consiste na determinação de
açúcares redutores utilizando ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Incubou-se o extrato
enzimático com amido e após a reação foi lida a absorbância em espectrofotômetro
a 540 nm. Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade
de enzima necessária para produzir 1μmol de açúcar redutor por minuto de reação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 15 isolados avaliados em meio sólido, 13 apresentaram atividade amilolítica.
Dois isolados que apresentaram os maiores índices enzimáticos foram selecionados
para a produção da enzima em meio líquido: o isolado de folha F3 (IE = 3,36 ± 0,2)
e de caule C22 (IE = 3,5 ± 0,14), pertencentes aos gêneros Penicillium e
Guignardia, respectivamente.
Há diversos trabalhos que descrevem as diferenças moleculares e morfológicas
das espécies de Guignardia isoladas de plantas cítricas, porém não há relatos que
indiquem características da produção enzimática (EVERETT, REES-GEORGE, 2006;
VAN GENT-PELZER et al., 2007; SPOSITO et al., 2011). Assim, ao observar a
atividade enzimática para a Guignardia sp. isolada do açaizeiro, tornam-se
necessários mais estudos para estabelecer os papeis que tais compostos exercem
na relação endófito-hospedeiro.
No cultivo em meio líquido, o fungo F3 (Penicillium) apresentou produção
enzimática em menor tempo (2 dias), quando comparado ao isolado C22. Além

Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário
Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br
disso, a atividade enzimática do isolado da folha foi maior (250 ± 0,05 U/mL) (Figura
1).
Em um estudo recente, Pathak, Devkatte e Rathod (2016) estudaram a síntese de
amilase por Penicillium sp. em meio sólido, observando uma produção de 81,80
U/mL aos 4 dias sob incubação de 30°C, enquanto que sob as mesmas condições
experimentais, o fungo C22 já havia alcançado um pico máximo (218,03 ± 0,01
U/mL).

Figura 1. Atividade enzimática de amilase dos fungos endofíticos do açaizeiro, F3

(a) e C22 (b).

CONCLUSÕES
Os isolados do açaizeiro se mostraram promissores como possíveis fontes de
amilase, sendo capazes de produzir significativos níveis desta enzima em um curto
espaço de tempo. Além disso, ao que se sabe, este é o primeiro trabalho que
estudou a atividade amilolitica de fungos endofíticos de E. precatoria Mart. na região
amazônica. Desta maneira, espera-se que os dados obtidos por este estudo sirvam
de estímulo para o desenvolvimento de novos estudos a cerca do potencial
enzimático de fungos endofíticos do açaizeiro.

Agências de Fomento: Capes e CNPq.

REFERÊNCIAS
AGUIAR, M. O.; MENDONÇA, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart. (Palmae).
Revista
Brasileira de Sementes, v. 25, n°1, p 37-42, 2003.
ANDRADE, P. C.; OLIVEIRA, M. S. P. Viabilidade de pólen em germoplasma de Euterpe precatoria Mart.
In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE RECURSOS GENÉTICOS, N° 2, 2013. Belém, PA. Anais... Brasília, DF dos
resumos:
Sociedade Brasileira de Recursos Genéticos, 2012. 4 p.
AZEVEDO, J. L. Microrganismos Endofíticos. In: MELOI. S. Ecologia Microbiana, Jaguariúna-SP:
EMBRAPA, 1998.
p.117-137.

Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário
Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br
BATISTA, B. N.; SILVA, I. R.; RAPÔSO, N. V. M. Isolamento e avaliação da atividade antimicrobiana de
fungos
endofíticos de Euterpe precatoria Mart. In: Congresso sobre Diversidade Microbiana da Amazônia, 6,
2016,
Manaus. Resumos. Manaus: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. p. 1-10, 2016.
BON, E. P. S.; FERRARA, M. A.; CORVO, M. L.; VERMELHO, A. B.; PAIVA, C. L. A; ALENCASTRO, R. B.;
COELHO, R. R.
R. Enzimas em Biotecnologia: Produção, Aplicações e Mercado. 1 ed. Rio de Janeiro:
Interciência Ltda,
2008. 506 p.
EVERETT KR; REES-GEORGE J. Reclassification of an isolate of Guignardia citricarpa from New Zealand
as Guignardia
mangiferae by sequence analysis. Plant Pathology. 55: 194-199, 2006.
HEGDE S. V.; RAMESHA, A.; SRINVAS, C. Optimization of amylase production from an endophytic fungi
Discosia sp.
isolated from Calophyllum inophyllum. Journal of Agricultural Tecnology, v. 7, n. 3, p. 805-813,
2011.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicyllicacid for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v.
11, p. 426-
428, 1959.
MORAES, L.M.P. Amilases. In: SAID, S.; PIETRO, R. Enzimas como agentes Biotecnológicos. Ribeirão
Preto: Legis
Summa, 2004
OLIVEIRA, A. N.; FLOR, N. S.; OLIVEIRA, L. A. Influência do pH e temperatura sobre a atividade
amilolítica de
rizóbios isolados de solos da Amazônia. Acta amazonica, v. 40, n. 2, p. 401-404, 2010.
OLIVEIRA, M. DO S. P. DE; NETO, J. T. DE F.; PENA, R. DA S. Açaí: técnicas de cultivo e processamento.,
In:
SEMANA DA FRUTICULTURA, FLORICULTURA E AGROINDUSTRIA, VII, 2007, Pará. Anais. Pará: Instituto
Frutal,
p. 104, 2007.
PATHAK, A. P.; DEVKATTE, S. B.; RATHOD, M. G. Production of amylase by Penicillium sp. using solid
state
fermentation method and inexpensive agricultural residues. International Journal for research
in Biology &
Pharmacy, v. 2, n°4, p 32-42, 2016.
SPOSITO, M. B.; ANDREOTE, F. D.; AZEVEDO, J. L.; ARAUJO, W. L. Enzymatic differences between the
endophyte
Guignardia mangiferae (botryosphaeriacceae) and the citrus pathogen Guignargdia citricarpa.
Genetics and
Molecular Research evolution and tecnology 10: 243-252, 2011.
SOUZA, H. Q.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S. Seleção de Basidiomycetes da Amazônia para produção
de enzimas
de interesse biotecnológico. Ciência e tecnologia de alimentos, v. 28, p. 116-124, 2008.
STOIAN, D. Todo lo que sube tiene que bajar : la economía del palmito (Euterpe precatoria Mart .) en el
norte
amazónico de Bolivia. In: ALEXIADES, M. N.; SHALEY, P. (Eds.). Productos Forestales, Medios de
Subsistencia y
Conservación- Estudios de Caso sobre Sistemas de Manejo de Productos Forestales No Maderables.
Indinesia:
CIFOR, p. 119-125, 2004.
VAN GENT-PELZER, MPE; VAN BROUWERSBAVEN, IR; KOX, LFF; BONANTS, PJM. A tacman PCR method
for routine
diagnosis of the quarantine fungus Guignardia citricarpa on citrus fruit. J. Phytopathol. 155: 357-363,
2007.

Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário
Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br