Analisis Vitamin A, D, E, K, B1, B2, B3, B5, B6, B9, DAN B12

Dengan Menggunakan Metode Dalam AOAC

Paper
Untuk memenuhi tugas matakuliah
Analisa Makanan dan Minuman yang dibina oleh Ibu Riska Yudhistia Asworo, S.Si., M.Si.

Disusun Oleh:
Muthia Rizqy Fadhilah
P17120174027

POLITEKNIK KESEHATAN MALANG

JURUSAN GIZI
D3 ANALISIS FARMASI DAN MAKANAN
2019
 VITAMIN A (RETINOL)

Vitamin A sensitif terhadap cahaya (UV), udara (beberapa prooksidan), suhu tinggi dan
kelembaban. Perlu tahap-tahap untuk menghindari perubahan yang merugikan seperti
pengaruh dari penggunaan barang pecah belah, nitrogen dan vakum sebagaimana pengaruh
dari suhu tinggi. Direkomendasikan untuk menambahkan antioksidan di awal prosedur.
Menggunakan metode HPLC dikarenakan keakuratan dalam proses analisis.

a. Prinsip:

Sampel disaponofikasi, vitamin A akan terekstrak ke dalam larutan organik dan

terkonsentrasi. Semua trans-retinol dan 13-cis-retinol ditentukan dengan HPLC dengan kolom
silika.

b. Yang perlu diperhatikan:

1. Semua pekerjaan harus dilakukan dalam cahaya dengan intesitas rendah
2. Harus menjaga terjadinya oksidasi retinol selama analisa
3. Evaporasi larutan harus menyeluruh di bawah aliran nitrogen dan heksadekan
ditambahkan untuk mencegah destruksi selama evaporasi.
Prosedur:
 Preparasi Sampel
 Transfer sampel (makanan formula atau susu cair) ke dalam tabung digesti 100 ml,
tambahkan 10 ml etanolik pirogallol (2% pirogallol dalam 95% etanol) dan
sabunkan dengan etanolik KOH (10% KOH dalam 90% etanol) pada suhu ruang
selama 18 jam atau pada suhu 70 C dengan menggunakan reflux vessel.
 Ekstraksi
 Pipet 3 ml sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung sentrifus 15 ml dan
tambahkan 2 ml air. Ekstrak dengan 7 ml heksan-dietileter (85:15). Ulangi
ekstraksi sebanyak 2 x. Masukkan sampel terekstrak ke dalam tabung volumetrik
25 ml. Tambahkan 1 ml heksadekan (heksadekan (1) + hexan (100)) dan encerkan
sampai 25 ml dengan heksan. Pipet 15 ml ekstrak yang sudah diencerkan ke dalam
tabung sentrifus dan uapkan dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 ml heptan.
c. Parameter Kromatografi
1. Kolom berukuran 15 cm x 4.5 mm yang dipadati dengan 3 mm silika (Apex m silika)
2. Fase mobil berupa Isokratik, heptane dan isopropanol (1-5%)
3. Fokus deteksi pada gelombang UV dengan panjang 340 nm
4. Flow rate 1-2 ml/menit

d. Perhitungan:
Semua trans retinol (mg/ml) =
(At/Ast x Wt x DF)/V
Ket :
At = area puncak sampel
Ast= area puncak standar
Wt = berat sampel
V = volume sampel
DF = faktor pengenceran
 VITAMIN B1 (TIASIN)

a. Prinsip

Ekstraksi dan hidrolisis enzimatis dari ester-ester tiamin fosfat dan pembersihan.
Metode ini didasarkan pada pengukuran fluoresensi dari bentuk oksidasi tiamin (tiokrom).

b. Yang Perlu diperhatikan

1. Tiokrom sensitif pada cahaya sehingga harus mengurangi cahaya pada semua prosedur.

2. Tiamin sensitif panas terutama pada suasana basa sehingga tahap analisa dengan cara
oksidasi tiamin harus dilakukan dengan cepat dan teliti berdasarkan prosedur yang ada.

c. Prosedur

 Preparasi Sampel

 Timbang sampel yang mengandung 10-20g tiamin, tambahkan HCl, campur,

autoklaf selama 15 menit pada 121 C, atur pH sampai 4,5-5,0 dengan HCl,

 Hidrolisis Enzim

 Tambahkan larutan enzim dan inkubasi selama 3 hari pada suhu 45-50 C, dinginkan
sampel atur pH sampai 3,5, encerkan sampai volume dengan air, campur dan
saring. Larutan standard diperlakukan dengan enzim yang sama.

 Pembersihan Ekstrak sampel

 Masukkan ekstrak sampel ke dalam kolom ion-exchange, cuci kolom dengan air
panas kemudian larutkan tiamin dengan larutan asam KCl panas, diinginkan.
Encerkan sampai volume dengan larutan asam-KCl, lakukan juga pada standard.

 Pembentukan Tiokrom

 Konversi tiamin ke tiokrom menggunakan K2Fe(CN)6, tambahkan isobutil alkohol,

kocok, dan sentrifus.Tuangkan fraksi isobutil alkohol ke dalam tabung baca
fluoresen dan baca pada 365 nm/435nm. Begitu juga standard dan buat kurva
standard untuk menghitung tiamin sampel
 VITAMIN B2 (RIBOFLAVIN)

Vitamin B2 memiliki struktur yang mirip gula ribose. Larut air dan memberi warna
fluoresens kuning kehijauan. Mudah rusak oleh cahaya dan sinar UV. Tahan panas, oksidator,
asam namun sensitif pada suasana basa.

a. Prinsip

 Ektraksi, pembersihan dan kompensasi adanya substansi pengganggu

 Ditentukan dengan fluorometer

b. Titik Kritis

 Karena sensitif pada UV maka semua prosedur dilakukan pada ruang minim cahaya.

 Adanya proses oksidasi permanganat perlu diperhatikan untuk hasil yang reliable

c. Prosedur

 Preparasi Sampel

 Timbang sampel homogen, tambahkan 0,1N HCl campur kemudian autoklaf

selama 30 menit pada suhu 121 C dan dinginkan. Endapkan substansi pengganggu
dengan mengatur pH 6 dan segera diikuti pengaturan pH 4,5, encerkan sampai
volume dengan air dan saring.

 Oksidasi Materi pengganggu

 Tempatkan filtrat ke dalam 4 tabung, 2 tabung tambahkan 1 ml air dan tambahkan

1 ml larutan standard (0,5g/ml riboflavin) ke dalam 2 tabung lainnya. Untuk tiap
tabung (satu persatu) Tambahkan 1 ml asam asetat glasial, diikuti 0,5 ml KMnO4
3 % biarkan selama 2 menit kemudian tambahkan 0,5 ml H2O2 3%, kocok.
 Pengukuran Fluoresen

 Panjang gelombang 440 nm/565 nm

 Pertama baca ekstrak sampel yang mengandung air kemudian tambahkan 20 mg

Na2S2O4 campur dan baca ulang, setelah itu baca standard.
 VITAMIN B3 (NIASIN)

Untuk menganalisis vitamin B3, digunakan metode Microbiological assay.

Microbiological assay berguna untuk menguji pertumbuhan mikroba dalam ekstrak sampel
yang mengandung vitamin dibandingkan dengan pertumbuhan mikroba dalam vitamin dengan
jumlah yang diketahui. Bakteri, yeast dan jamur digunakan sebagai organisme uji.
Pertumbuhan diukur dengan turbiditas (kekeruhan), produksi asam, gravimetri dan respirasi

a. Prinsip

Vitamin B3 menggunakan bakteri L.plantarum sebagai organisme ujinya. Preparasi

stok kultur dilakukan dengan inokulasi freeze dried culture pada agar bacto-lactobacili dan
diinkubasi pada 37 oC selama 24 jam. Secara umum pertumbuhan diukur dengan turbiditas,
namun jika menggunakan laktobacillus maka dapat diukur dengan asidimeter

b. Tahap analisa
 Preparasi sampel
 Timbang sampel (kira-kira mengandung 0,1 mg niasin) dan tambahkan
NH2SO4, autoklaf selama 1 jam dan dinginkan. Atur pH sampai 6,8 dan
encerkan sampai volume (konsetrasi 0,1 g niasin/ml), campur dan saring
 Preparasi tabung pengujian
 Pengulangan sedikitnya menggunakan 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 dan 5.0 ml
sampel kemudian tambahkan air sampai mencapai 5 ml. Tambahkan 5 ml
Difco Basal Medium untuk niasin ke dalam masing-masing tabung,
autoklaf selama 10 menit pada suhu 121 C dan dinginkan
 Preparasi standar
 Sama dengan cara preparasi tabung pengujian.
 Standar merupakan larutan yang mengandung 0,1 µl/ml Niasin.
 Inokulasi dan inkubasi (37 C, 16-18 jam)
 Tambahkan 1 tetes inokulum ke masing-masing tabung, tutup tabung dan
inkubasi pada suhu 37 C selama 16-18 jam sampai kekeruhan maksimum
pada tabung dengan konsentrasi niasin paling tinggi.
 Pengukuran
 Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540-660 nm.
 VITAMIN B5

Prinsip
Ekstraksi PA menggunakan larutan buffer amonium asetat 0,4 M. Setelah filtrasi, solusi akhir
dikenakan UPLC-MS / MS.

E. Persiapan Sampel dan Ekstraksi

(a) Persiapan sampel makanan. — Timbang porsi sampel 25,0 g sampel padat homogen (mis.,
susu formula bayi atau nutrisi). Tambahkan 200 mL air pada suhu 40 ° C sebelum dicampur
sampai suspensi homogen diperoleh. Homogenizer dapat digunakan bila perlu.

Catatan: Jika produk mengandung pati, tambahkan 50 mg α-amilase dan inkubasi selama 15
menit pada suhu 40 ° C untuk mengurangi viskositas dan memudahkan penanganan.
Campurkan sampel cairan dengan baik untuk memastikan homogenitas dan melanjutkan
langsung ke ekstraksi.

(b) Ekstraksi. — Timbang 15,0 g alikuot suspensi sampel yang dihomogenisasi (sesuai
dengan porsi sampel 5,0 g) atau sampel cairan 20,0 g ke dalam labu ukur 50 mL. Tambahkan
25 mL volume larutan amonium asetat 0,4 M, pH 3,8. Encerkan ekstrak sampel ke volume
dengan air. Tambahkan bar aduk dan aduk selama 10 menit. Saring 20 mL porsi melalui
kertas lipat (grade 597½). Jalankan analisis kromatografi.

F. Analisis

(a) Analisis kromatografi. — Transfer 1 mL alikuot filtrat yang diperoleh dalam Preparasi
Sampel dan Ekstraksi (b) ke dalam tabung polipropilen 15 mL (mis., tabung Falcon) yang
mengandung 500 μL larutan stok IS. Encerkan larutan hingga 10,0 ± 1,0 mL dengan tutup
dan campuran air. Saring melalui filter jarum suntik 0,22 μm. Menyuntikkan ke sistem
UHPLC-MS / MS.

(b) Kondisi UPLC. — Volume injeksi, 2 μL; suhu kolom, 30 ° C; laju aliran, 0,45 mL / menit;
fase gerak A, 0,1% (v / v) asam format dalam air; dan fase seluler B, asetonitril.
 Komposisi fase gerak awal adalah 92% A dan 8% B. Program gradien adalah 0 hingga 2,2
menit ramp dari 92 hingga 80% fase A; 2,2 hingga 2,4 menit dari 80 hingga 50% fase A; 50%
Penangguhan dari 2,4 hingga 4,0 menit; kembali ke komposisi fase gerak awal pada 4,1
menit, dan tahan hingga 7,0 menit. Aliran HPLC diarahkan ke detektor MS hanya antara 0
dan 2 menit untuk mencegah sumber busuk sebanyak mungkin.

(c) Kondisi MS / MS. — ESI positif; tegangan kapiler, 2,2 kV; kerucut, 25 V; extractor, 3,0
V; suhu sumber, 140 ° C; suhu desolvasi, 350 ° C; dan aliran gas kerucut, 700 L / jam.

MS dijalankan dalam mode pemantauan reaksi tunggal. Transisi yang dipantau antara 0
hingga 2.1 menit adalah m / z 220.2 → 90.1 untuk PA, dan m / z 224.2 → 94.1 untuk IS
berlabel isotop. Energi tumbukan ditetapkan pada 14 V. Waktu tunggu untuk setiap transisi
yang dipantau adalah 0,1 detik.
 VITAMIN B6

Metode Titrasi Bebas Air

Bahan yang digunakan 300 mg piridoksin hidroklorida yang ditimbang, dilarutkan dalam 40
mL asam asetat glacial lalu dititrasi dengan asam perklorat 0,1 N menggunakan indicator 3
tetes Kristal violet samapai biru hijau. Tiam mL asam perklorat 0,1 N setara dengan 20,56 mg
piridoksin hidroklorida. Alat yang digunakan, bulk, buret, corong, erlenmeyer, gelas kimia,
gelas ukur, pipet tetes, pipet volum, statif dan klem.Bahan yang digunakan yaitu, Aluminium
foil, Asam asetat P, Asam perklorat (HClO4) 0,5177 N baku, Benzena P, etiket, kofein
(C8H10N4O2), indicator Kristal violet, , kertas timbang dan tissue.

Cara kerja metode ini yaitu, Keringkan alat yang akan digunakan dengan cara dibersihkan
dengan alkohol lalu dimasukkan ke dalam oven pengering. Timbang piridoksin hidroklorida 2
kali, yang pertama sebanyak 300 mg, masukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan
asam asetat sebanyak 40 ml, dipanaskan lalu didinginkan kembali, setelah itu ditambahkan
benzene sebanyak 100 ml, tambahkan indicator Kristal violet sebanyak 4 tetes hingga larutan
berwarna ungu kemudian dititrasi dengan asam perklorat sampai warna larutan menjadi biru
hingga hijau lalu catat volume titran. Lakukan hal yang sama dengan mengunakan kofein
sebanyak 501,8 mg.

Rumus perhitungan titrasi bebas air :

% kadar = V x N x berat setara x 100 %

Berat sampel x faktor koreksi

Keuntungan TBA yaitu, Asam dan basa organik yang larut dalam air yang larut dalam pelarut
bebas air, Titrasi yang dilakukan sederhana dan akurat, Pelarut bebas air dapat membantu dua
yang lebih banyak asam dalam campuran, Organik asam merupakan kekuatan sebanding
dengan air, tidak dapat dititrasi dengan mudah oleh pelarut bebas air. Kerugian TBA yaitu
titrasi bebas air dilakukan dengan menggunakan berbagai indikator yang cukup terbatas dan
kelembaban dari air harus dijaga setiap waktu, agar kadar air tidak lebih dari yang ditetapkan.
 VITAMIN B9 (ASAM FOLAT)

Saat ini, metode kromatografi cair sangat penting untuk memastikan jumlah asam folat
dan bentuk ragam folat dalam makanan. Baru-baru ini, kolaborasi prosedur mikrobiologi yang
berdasarkan ektraksi trienzim dapat menghitung hanya total folat dan tidak dapat membedakan
antara folat fortifikasi dan folat makanan.

a. Prinsip :

Folat dalam sampel diekstraksi dalam buffer pada suhu 100 C (air mendidih). Hasil
esktraksi didigesti dengan -amilase dan protease (untuk membebaskan ikatan folat dengan
makromolekul) dan konjugase (untuk memecahkan poly--glutamyl folat menjadi PteGln3 atau
yang lebih kecil). Pertumbuhan mikroba uji diukur dengan % transmitan. Transmitan
berpengaruh pada konsentrasi folat.

b. Yang perlu diperhatikan

1. Harus dilakukan upaya untuk melindungi folat yang labil dari oksidasi dan degradasi
fotokimia.
2. Pengurangan senyawa-senyawa termasuk asam askorbat, -mercaptoetanol dan
ditiotreitol adalah cara efektif dalam mencegah oksidasi.
3. Patuh pada prosedur analisa adalah penting untuk menguji folat dengan tepat.

Prosedur Analisis

 Preparasi sampel

 1,2-2 g sampel ditambahkan 50 ml buffer, dihomogenkan, dan didigesti (sampel

tinggi lemak harus diekstrak dengan heksan dan semua sampel harus dihindarkan
dari cahaya dan udara)

 Pemecahan trienzim

 Panaskan sampel selama 5 menit, dinginkan pada suhu ruang, digesti sampel
dengan -amilase, protease dan cojugase. Inaktifasi enzim dengan pemanasan
 selama 5 menit, dinginkan, filter dan encerkan dengan aquades sampai konsentrasi
0,15 ng/ml

 Preparasi kurva standar dan tabung blanko

 Buat 8 titik kurva standard dengan menggunakan larutan folat. Tambahkan 5 ml

L.casei ke dalam masing-masing tabung. Siapkan blanko tanpa inokulasi dan blanko
inokulasi dan dinolkan (spektrofotometer) dan enzim blanko untuk mengetahui
kontribusi enzim dalam pertumbuhan mikroba

 Pengujian

Asam folat diuji berdasarkan pertumbuhan L.rhamnosus (AOAC). Tabung sampel,

kurva standard, blanko inokulasi, blanko uninokulasi dan blangko enzim diautoklaf pada suhu
121 C selama 5 menit, kemudian diinokulasi dengan 1 tetes inokulum L.rhamnosus per tabung.
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37 C selama 20-24 jam, pertumbuhan mikroba dinyatakan
dalam % transmitan pada 550 nm.
 VITAMIN B12

a. Prinsip
Vitamin B12 diekstraksi dari sampel menggunakan buffer natrium asetat di hadapan
natrium sianida pada 100 ° C selama 30 menit. Ekstrak dimurnikan dan dipekatkan dengan
kolom immunoaffinity. Vitamin B12 ditentukan oleh kromatografi cair berkinerja sangat tinggi
dengan deteksi UV pada 361 nm.

b. Prosedur
(a) Pengambilan sampel sampel untuk sampel serbuk. — Timbang 25,0 g sampel ke dalam
gelas kimia 250 mL. Tambahkan 200 g air pada suhu 40 ± 5 ° C. Campur dengan batang kaca
sampai suspensi homogen, atau dihomogenisasi dengan Polytron®. Lanjutkan seperti yang
dijelaskan dalam Ekstraksi E (d).
(b) Pengambilan sampel sampel untuk produk berbasis asam amino. — Timbang sampel bubuk
25,0 g ke dalam gelas kimia 250 mL. Tambahkan 190 g air pada 40 ± 5 ° C dan 10 g susu
bubuk skim. Campur dengan batang kaca sampai suspensi homogen, atau dihomogenisasi
dengan Polytron. Secara paralel, kosongkan dengan mengganti sampel dengan air. Encerkan,
sampel dilarutkan dan kosong, dua kali dalam air (mis., 50 g sampel dilarutkan atau kosong +
50 g air). Lanjutkan seperti yang dijelaskan dalam Ekstraksi E (d).
c) Persiapan sampel untuk sampel cair. — Aduk rata untuk memastikan homogenitas porsi
sampel. Lanjutkan seperti yang dijelaskan dalam Ekstraksi E (d).
(d) Ekstraksi. — Timbang 60,0 g sampel suspensi E (a) dan (b), blank E (b), atau sampel cair
E (c), ke dalam labu gelas amber 250 ml datar-datar atau Erlenmeyer dengan leher kaca tanah
. Tambahkan 1 mL larutan natrium sianida 1%, D (b). Jika sampel mengandung pati,
tambahkan sekitar 0,05 g α-amilase, aduk rata, tutup labu, dan inkubasi 15 menit pada suhu 40
± 5 ° C. Tambahkan 25 mL larutan natrium asetat D (a). Campur dengan baik. Tempatkan labu
dalam penangas air mendidih selama 30 menit (atau autoklaf 30 menit pada 100 ° C).
Dinginkan labu dalam penangas es. Secara kuantitatif mentransfer isi labu ke labu volumetrik
gelas 100 mL. Encerkan ke volume dengan air. Saring larutan melalui filter kertas terlipat.
Dalam hal produk-produk tinggi lemak, dan jika pemulihan rendah, encerkan filtrat 1: 5 dalam
air sebelum ekstraksi untuk meningkatkan pemulihan atau ulangi ekstraksi dengan
menggunakan porsi sampel yang lebih kecil.
(e) Pembersihan immunoaffinity. — Biarkan kolom immunoaffinity menghangat pada suhu
kamar dengan mengeluarkannya dari pendingin setidaknya 30 menit sebelum digunakan.
Tempatkan setiap kolom immunoaffinity di rak. Buka tutupnya dan biarkan penyangga
penyimpanan mengering dengan gravitasi. Tutup penutup bawah. Isi kolom dengan 9 mL filtrat
bening dan tutup penutup atas. Tempatkan kolom dalam pengocok rotari, dan aduk perlahan
selama 10-15 menit. Kembalikan kolom ke dukungan dan diamkan selama beberapa menit.
Buka tutupnya agar cairan mengalir dengan gravitasi. Cuci kolom dengan 10 mL air. Dengan
jarum suntik, masukkan sekitar 40 mL udara untuk mengeringkan kolom. Elusi dengan 3 mL
metanol, dan kumpulkan eluat dalam botol reaksi gelas 4 atau 7 mL. Bilas kolom dengan 0,5
mL metanol, dan dengan jarum suntik, masukkan sekitar 20 mL udara untuk mengumpulkan
semua metanol dalam botol yang sama. Evaporasi eluat pada 50 ° C di bawah aliran nitrogen.
Rekonstitusi sampel dalam pelarut sampel 0,3 mL D (e). Campurkan pada mixer Vortex.
Transfer ke botol amber mikro.

c. Proses Analisis
(a) Kondisi kromatografi. — Laju aliran, 0,4 mL / mnt; volume injeksi, 50 μL; deteksi, UV pada
361 nm; elusi gradien.
(b) Uji kesesuaian sistem. — Menyeimbangkan sistem kromatografi selama setidaknya 15
menit. Suntikkan solusi standar kerja 3–6 kali, dan periksa waktu retensi puncak dan respons.
Suntikkan solusi standar kerja secara teratur dalam serangkaian analisis.
(c) Analisis. — Lakukan suntikan tunggal untuk solusi standar dan uji. Ukur respons puncak
kromatografi (tinggi).
(d) Identifikasi. — Identifikasi puncak vitamin B12 dalam kromatogram larutan uji dengan
membandingkan dengan waktu retensi dan spektrum UV dari puncak terkait yang diperoleh
untuk larutan standar.
(e) Kalibrasi. — Plot respons puncak terhadap konsentrasi (dalam ng / mL). Lakukan analisis
regresi. Hitung kemiringan dan intersep. (AU: Nilai minimum untuk R (atau R2) harus
ditentukan di sini. Juga, beberapa kriteria penerimaan untuk standar yang disuntikkan ulang
(F.f.) harus ditentukan.
(f) Kuantisasi. — Hitung konsentrasi vitamin B12, dalam μg / 100 g produk yang dilarutkan,
sebagai berikut:
di mana A = respons (tinggi) dari puncak yang diperoleh untuk larutan sampel, I =
memotong kurva kalibrasi, S = kemiringan kurva kalibrasi, V1 = volume larutan uji
(volume yang digunakan untuk melarutkan bagian uji) dalam mL (100 mL), V3 = volume
di mana alikuot larutan sampel dilarutkan setelah pembersihan immunoaffinity (0,3
mL), m = berat bagian uji, seperti dilarutkan, dalam g (60 g), dan V2 = volume alikuot
larutan sampel dimuat ke kolom afinitas (9 mL). (AU: Kuantifikasi tidak menunjukkan
bagaimana menangani susu bubuk skim kosong E.b. disiapkan bersama dengan formula
asam amino.)
(g) Pelaporan. — Laporkan hasil dengan dua titik desimal sebagai cyanocobalamin,
dalam μg / 100 g produk yang dilarutkan. Tingkat rekonstitusi adalah 25 g / 225 g untuk
produk serbuk, 50 g / 100 g untuk konsentrat, dan 1 g / 1 g untuk formula siap makan.
 VITAMIN C

Vitamin C berbentuk asam L-askorbat dan asam L-dehidroaskorbat. Mudah teroksidasi

terutama oleh tingginya pH dan adanya katalisator seperti Fe dan ion Cu. Sehingga perlu
prosedur yang didisain rendah pH dan adanya chelating agent. Oksidasi ringan asam askorbat
menghasilkan asam dehidroaskorbat dan bersifat reversibel dengan adanya perlakuan dengan
reducing agents (-mercaptoetanol dan ditioreitol). Metode yang digunakan adalah metode
titrasi 2,6 dicloroindophenol.

a. Prinsip
 L-asam askorbat dioksidasi menjadi L-asam dehidroaskorbat. Pada akhir titrasi
akan menunjukkan warna merah muda.
 Perhitungan :
 mg asam askorbat/ml sampel = Standard (mg/ml) x volume titrasi
sampel x (FP/berat sampel)

b. Prosedur
 Preparasi sampel
 Timbang dan ekstrak sampel dalam asam metafosforat-asam asetat (15 g HPO4
dan 40 ml HOAc dalam 500 ml air), filter dengan sentrifus dan encerkan sampai
konsentrasi 10-100 mg asam askorbat/100 ml.
 Preparasi standard
 Timbang 50 mg asam askorbat dan encerkan sampai 100 ml dengan asam
metafosforat-asam asetat
 Titrasi
 Titrasi sampel dan standard (3 ulangan) dengan dikloroindophenol sampai
berwarna merah muda sedikitnya 10 detik
 VITAMIN D

a. Prinsip

Sampel padat yang dihomogenisasi dicampur dengan larutan standar internal yang
mengandung vitamin D2 dan D3 berlabel isotop, dengan etanol, dan dengan kalium hidroksida.
Itu campuran dipanaskan hingga ~ 95 ° C dan direfluks dengan nitrogen. Setelah penyabunan
dan pencampuran, sampel diencerkan dengan air dan didinginkan hingga suhu kamar. Sampel
secara kuantitatif dipindahkan ke corong pemisah menggunakan 40% etanol dalam air, diikuti
oleh cairan-cair ekstraksi menjadi n-heptana. Bahan asing yang ada dalam fraksi n-heptana
dihilangkan oleh melakukan ekstraksi cair-cair berurutan dengan kalium hidroksida encer
dalam air, 40% etanol dalam air, dan air, masing-masing. Fraksi n-heptana disaring melalui
natrium sulfat untuk menghilangkan sisa air dan diuapkan sampai kering menggunakan sistem
vakum putar. Itu sampel dilarutkan dalam metil etil keton dan isopropil alkohol dan gangguan
dihilangkan dengan elusi melalui kolom gel silika ekstraksi padat fase pakai (SPE). Eluant dari
kolom SPE diuapkan sampai kering dan dilarutkan dalam metanol dan sampel diuji
menggunakan gradien format metanol dan amonium pada sistem UPLC-MS / MS dilengkapi
dengan kolom C18. Vitamin D dilaporkan sebagai jumlah vitamin D2 dan D3 menyajikan.

b. Persiapan sampel:
1. Menghomogenkan sampel dalam kedap udara, wadah gelap disimpan pada atau di
bawah 8 ° C.
2. Penanganan dan penyimpanan sampel harus sesuai dengan praktik laboratorium yang
baik. Biarkan sampel yang didinginkan atau dibekukan datang ke suhu kamar sebelum
ditimbang.
3. Semua pekerjaan laboratorium harus dilakukan di bawah lampu neon kuning atau emas
kondisi untuk analisis vitamin menggunakan aktinik rendah atau gelas yang jelas
tertutup.
4. Semua pekerjaan laboratorium akan dilakukan di tenda dengan pengecualian Genevac
Sistem penguapan roket, pemulihan sampel dengan metanol, dan analisis sampel pada
LC / MS / MS.
c. Prosedur
1. Nyalakan mantel pemanas 6 x 500 mL ke pengaturan 1 pada kenop kontrol panas (~ 95
° C) 10 menit sebelum penggunaan yang dimaksudkan untuk memungkinkannya
mencapai keseimbangan suhu.
2. Labeli dengan jumlah yang sesuai dari labu alas bulat 500 mL untuk digunakan dalam
pengujian. Disebabkan oleh pembatasan jumlah stasiun pada mantel pemanas,
lanjutkan dalam set enam atau kurang.
3. Tempatkan labu alas bulat 500 mL pada keseimbangan dan taruhkan ke nol.
4. Keluarkan jumlah sampel yang sesuai ke dalam labu alas bulat 500 mL berdasarkan
tabel di bawah ini sebagai panduan. Catat berat hingga 0,001 g untuk makanan dan
0,0001 g untuk sampel vitamin d premix.
5. Tambahkan bilah aduk dan beberapa keripik mendidih ke setiap labu.
6. Buang sekitar 0,5 g asam askorbat dan 0,5 g asam pirogalik untuk masing-masing labu
didih.
7. Keluarkan 200 μL larutan Vitamin D yang dicampur Campuran Standar Stok Kerja
Internal (1000 ng / mL) ke setiap labu didih.
8. Keluarkan 80 mL etanol bukti 200 ke setiap labu mendidih menggunakan dispenser
botol. Bilas sisi labu bila perlu untuk memastikan sampel berkumpul di bagian bawah
labu.
9. Don pelindung wajah dan berikan 20 mL KOH 50% ke set pertama enam (atau kurang)
sampel dalam labu mendidih.
10. Pasang adaptor penghubung ke leher setiap labu mendidih dan hubungkan labu ke
refluks kondensor pada Manifold Saponifikasi. Putar pengaduk magnetik dan
pendinginan air di. Nyalakan gas nitrogen pada laju aliran sedemikian rupa sehingga
aliran gelembung tetap akan keluar tabung terendam air.
11. Refluks setiap sampel selama 15 menit pada ~ 95 ° C.
12. Setelah saponifikasi, lepaskan setiap labu mendidih dari unit dan tambahkan 50 mL
Nanopure air. Campur isinya dengan mengaduk labu mendidih dengan lembut. Biarkan
sampel menyeimbangkan suhu kamar (tempatkan dalam bak air dingin jika perlu untuk
mempercepat pendinginan).
13. Lepaskan adaptor kaca dan batang pengaduk magnet dari setiap labu mendidih.
Gunakan 200 bukti etanol dalam botol semprot untuk membilas sambungan kaca tanah
dari adaptor kaca dan aduk batasi ke dalam labu mendidih untuk mencegah hilangnya
bahan.
14. Untuk setiap sampel, siapkan corong pemisah bernomor yang sesuai untuk memegang
rak (500 mL di rak atas, 250 mL di rak bawah). Penutupan asuransikan ditutup untuk
masing-masing corong pemisah dan tutup sekrup yang sesuai tersedia.
15. Pindahkan isi labu mendidih ke pemisah 500 mL berlabel yang sesuai corong. Buang
50 mL 40% v / v larutan etanol ke dalam labu didih dan aduk hingga rata putar labu.
Pindahkan ini ke dalam corong pemisah 500 mL. Ulangi langkah ini.
16. Keluarkan 75 mL heptana ke setiap labu mendidih, aduk dan transfer ke masing-masing
500 mL corong pemisah. Segel corong dengan tutup pelintir, kocok perlahan beberapa
kali, balikkan, dan melampiaskan dengan penyesuaian stopcock. Kocok selama satu
menit tambahan dengan tangan atau pada separator platform shaker (gunakan karet
gelang untuk mengamankan funnels ke shaker).
17. Pasang kembali corong pemisah ke rak penahan, kendurkan dan / atau lepaskan tutup
pelintir, dan biarkan fase terpisah. Kuras fasa air (lapisan bawah) ke dalam yang sesuai
labu alas bulat berlabel.
18. Pindahkan sisa fase heptana (lapisan atas) ke dalam corong pemisah 500 mL corong
pemisah 250 mL yang sesuai di baris bawah penahan putih rak.
19. Tutup sumbat corong pemisah 500 mL. Transfer isi babak labu didih bawah kembali
ke masing-masing corong pemisah 500 mL.
20. Tambahkan 75 mL heptana lagi ke labu mendidih, aduk dan transfer ke masing-masing
500 mL corong pemisah. Goyang dan corong saluran dengan lembut, lalu goyang
dengan kuat menit.
21. Kuras fasa air (lapisan bawah) ke dalam labu mendidih atau wadah limbah sekunder
dan buang fasa air ke dalam drum limbah berbahaya yang sesuai. Labu mendidih tidak
lagi dibutuhkan.
22. Keluarkan fase heptana dari corong pemisah 500 mL ke dalam masing-masing 250 mL
corong pemisah. Bilas dinding bagian dalam corong pemisah 500 mL dengan
semprotan botol berisi 200 etanol bukti dan tiriskan isinya ke dalam pemisahan 250 mL
corong. Corong dan tutup pemisah 500 mL tidak lagi diperlukan.
23. Keluarkan 50 mL 1 M KOH ke dalam masing-masing corong pemisah 250 mL. Tutup
dan kocok perlahan corong selama sekitar 30 detik. Buang fase air (lapisan bawah)
ketika fase telah terpisah.
24. Keluarkan 50 mL etanol 40% v / v untuk setiap corong pemisah 250 mL. Tutup dan
dengan lembut goyang corong selama sekitar 30 detik. Buang fase air (bawah layer)
hingga ke lapisan emulsi ketika fase telah terpisah.
25. Keluarkan lagi 50 mL etanol 40% v / v untuk setiap corong pemisah 250 mL. Tutup
dan goyangkan corong dengan lembut selama sekitar 30 detik. Buang fase air (lapisan
bawah) hingga lapisan emulsi ketika fase telah terpisah.
26. Buang 100 mL air ke setiap corong pemisah 250 mL. Tutup dan kocok perlahan corong
selama sekitar 30 detik. Buang fase air (lapisan bawah) saat fase telah terpisah.
27. Dapatkan labu evaporator dengan jumlah yang sesuai dan tambahkan sekitar 5 mg BHT
(beberapa butir kristal) ke dalam masing-masing labu.
28. Pasang filter natrium sulfat untuk memerangkap air dan residu padatan untuk setiap
sampel menempatkan kapas kaca ke bagian bawah corong sekali pakai dan
menambahkan lapisan natrium sulfat anhidrat di atas.
29. Saring fase heptana dari masing-masing corong pemisah 250 mL melalui masing-
masing filter natrium sulfat ke dalam labu evaporator yang ditandai.
30. Secara kuantitatif mentransfer konten residu yang mungkin melekat pada interior 250
mL corong pemisah dengan heptana menggunakan botol semprot ke dalam masing-
masing natrium filter sulfat dan labu evaporator.
31. Tempatkan labu evaporator ke dalam Evaporator Genevac Rocket (maksimum
kapasitas adalah enam labu), dengan labu diposisikan sejajar satu sama lain untuk
keseimbangan. Posisi yang tidak dihuni diisi dengan colokan kosong atau labu kosong.
Pasang tutup rotor bagian dalam, tutup tutup utama luar dan mulai penguapan dengan
menggunakan Metode 02: BP rendah, yang membutuhkan waktu sekitar 50 menit untuk
selesai.
32. Keluarkan labu dari evaporator dan susun kembali sampel dengan 1 mL dari 99,8: 0,2
metil etil keton: larutan isopropil alkohol. Vortex tercampur rata.
33. Siapkan kartrid ekstraksi fase padat silika gel dengan menempatkan jumlah yang sesuai
ke manifold vakum dengan sumbat tertutup dan bersihkan tabung reaksi sekali pakai
kapal pengumpul.
34. Isi wadah kartrid (~ 5,5 mL) dengan 80:20 metil etil keton: isopropil alcohol larutan.
Buka stopcocks dan oleskan vakum untuk menarik solusi melalui tingkat lambat dan
konsisten, mengumpulkan eluant ke tabung reaksi di dalam ruang hampa manifold dan
berhenti ketika level tepat di atas frit teratas dengan menggunakan stopcock dan
penyesuaian vakum. Jangan mengeringkan kemasan.
35. Isi reservoir kartrij (~ 5,5 mL) dengan 99,8: 0,2 metil etil keton: larutan isopropil
alcohol. Buka stopcocks dan berikan vakum untuk menarik solusi secara lambat dan
tingkat yang konsisten, mengumpulkan eluant ke dalam tabung reaksi di dalam
 manifold vakum dan berhenti ketika level tepat di atas frit atas dengan menggunakan
stopcock dan vakum pengaturan. Jangan mengeringkan kemasan.
36. Buka manifold vakum, buang larutan cuci dan kembalikan gelas sekali pakai tabung
reaksi ke unit.
37. Transfer sampel dalam labu penguapan yang dilarutkan dengan 1 mL metil 99,8: 0,2
etil keton: larutan isopropil alkohol di bagian atas kartrid SPE dengan memanfaatkan
ekstra pipet transfer panjang sekali pakai. Buka sumbat dan beri ruang hampa udara
untuk menarik solusi melalui pada kecepatan lambat dan konsisten, mengumpulkan
eluant ke dalam tabung reaksi di dalam manifold vakum dan berhenti pada tingkat tepat
di atas frit atas dengan menggunakan stopcock dan penyesuaian vakum. Jangan
mengeringkan kemasan.
38. Tambahkan 1 mL 99,8: 0,2 metil etil keton: larutan isopropil alkohol ke setiap
evaporator labu. Vortex mencampur dan mentransfer konten ke bagian atas masing-
masing kartrid SPE menggunakan pipet transfer sekali pakai yang ekstra panjang. Labu
penguapan tidak lagi dibutuhkan.
39. Buka sumbat dan gunakan vakum untuk menarik solusi secara lambat dan konsisten
tingkat, mengumpulkan eluant ke dalam tabung reaksi di dalam manifold vakum dan
berhenti pada tingkat tepat di atas frit atas dengan menggunakan stopcock dan
penyesuaian vakum (~ 2 mL eluent dikumpulkan). Jangan mengeringkan kemasan.
40. Ketika tabung reaksi menerima penuh, pindahkan eluant yang terkumpul ke dalam
tabung dengan benar labu evaporator bersih berlabel yang mengandung ~ 5 mg BHT
(beberapa butiran kristal). Gunakan botol semprot yang mengandung metil etil keton
(rapi) untuk memastikan transfer kuantitatif dari tabung reaksi ke dalam labu evaporator
putar.
41. Isi wadah kartrij (5 mL) dengan 99,8: 0,2 metil etil keton: larutan isopropil alcohol.
Buka stopcocks dan berikan vakum untuk menarik solusi secara lambat dan tingkat
yang konsisten, mengumpulkan eluant ke dalam tabung reaksi di dalam manifold
vakum dan berhenti pada tingkat tepat di atas frit atas tanpa pengeringan dengan
menggunakan stopcock dan tekanan vakum. Jangan mengeringkan kemasan. Ulangi
langkah ini dengan cara yang sama dengan total lima iterasi, sehingga total ~ 27 mL
eluant dikumpulkan. Harap dicatat, 16 x 125 mm tabung reaksi borosilikat sekali pakai
memiliki volume maksimum ~ 17 mL, mis. 5 mL kedua elusi akan membutuhkan
transfer sampel dari tabung reaksi ke tabung evaporator putar (~ 12 mL).
42. Setelah semua eluant telah dikumpulkan (~ 27 mL), tabung reaksi dan kartrid fase padat
dapat dibuang.
43. Transfer labu ke Genevac Rocket Evaporator dengan menggunakan Metode 02: BP
Rendah, yang membutuhkan waktu sekitar 50 menit untuk selesai.
44. Pasang kembali sampel dengan 1 mL metanol, aduk dengan baik. Transfer alikuot
dengan pipet transfer 9” sekali pakai ke dalam jarum suntik sekali pakai 3 mL yang
dilengkapi dengan 13 mm filter jarum suntik. Saring sampel ke dalam botol HPLC yang
berisi sisipan. Uji oleh LC / MS / MS.
 VITAMIN E

Vitamin E terdapat dalam bentuk 8 komponen yang berbeda dalam makanan dan
semuanya adalah 6-hidroksikroman. Famili vitamin E terdiri dari -,-,- dan -tokoferol.
Cirinya  sebuah rantai cabang jenuh dari 3 unit isopren dan berikatan dengan tokotrienol
tidak jenuh. Tahan panas dan asam, karena bersifat antioksidan maka Vitamin E akan mudah
teroksidasi terutama bila dalam minyak tengik, timah dan garam besi. Mudah rusak oleh sinar
UV

a. Prinsip
1. Untuk produk makanan umumnya  sampel disabunkan dengan reflux, diekstrak
dengan heksan dan diinjeksi ke dalam fase normal kolom HPLC yang disambungkan
pada detektor fluoresensi
2. Untuk Margarin dan Minyak nabati  sampel dilarutkan dalam heksan, MgSO4
ditambahkan untuk mengganti air kemudian difilter dan diuji dengan HPLC
3. Untuk minyak  dilarutkan dalam heksan dan diinjeksi secara langsung ke dalam
kolom HPLC

b. Yang perlu diperhatikan

1. Vitamin E adalah subyek oksidasi.
2. Penyabunan dilakukan dengan reflux yang sudah ditambah antioksidan pirogallol
dengan reaksi vessel yang terlindung dari cahaya.

c. Prosedur
 Produk makanan umum
 Tambahkan 10 ml dari 6 % (w/v) pirogallol dalam etanol ke sampel , campur dan
aliri dengan N2. Panaskan pada suhu 70 C selama 10 menit dengan sonikasi.
Tambahkan 2 ml 60 % KOH, campur dan aliri dengan N2. Hancurkan selama 30
menit pada suhu 70 C. Sonikasi selama 5 menit, dinginkan pada suhu ruang dan
tambahkan NaCl dan air. Ekstrak dengan heksan (0,1% BHT) 3 kali. Tambahkan 0,5
g MgSO4 dan campur. Filter dan encerkan sampai volume dengan heksan dan
injeksi 20 l.
 Margarin dan minyak nabati
 Tambahkan 40 ml heksan (0,1% BHT) ke dalam 10 g sampel dan campur.
Tambahkan 3 g MgSO4 dan campur, biarkan 2 jam. Filter dan encerkan
sampai volume dengan heksan. Injeksi 20 l.

d. Parameter Kromatografi
1. Kolom menggunakan jenis Hibar RT, Lichrosorb Si60 5m, 25 cm x 4.6 mm
2. Fase mobil menggunakan larutan 0,9% isopropanol dalam heksan
3. Flow  1 ml/menit
4. Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em = 330 nm
VITAMIN K