DASAR BIOLOGI MOLEKULER

Biologi Molekuler merupakan cabang ilmu pengetahuan yang mempelajari

hubungan antara struktur dan fungsi molekul-molekul hayati serta kontribusi
hubungan tersebut terhadap pelaksanaan dan pengendalian berbagai proses biokimia.
Dengan kata lain ilmu ini adalah studi biologi pada tingkat molekuler. Oleh karena itu,
materi kajian utama di dalam ilmu ini adalah makromolekul hayati, seperti
karbohidrat, lemak, protein, dan asam nukleat.
Biologi Molekuler sebagai cabang ilmu pengetahuan tergolong relatif masih
baru dan merupakan ilmu multidisiplin yang melintasi sejumlah disiplin ilmu
terutama Biokimia, Biologi Sel, dan Genetika. Akibatnya, seringkali terjadi tumpang
tindih di antara materi-materi yang dibahas meskipun seharusnya ada batas-batas yang
memisahkannya. Sebagai contoh, reaksi metabolisme yang diatur oleh pengaruh
konsentrasi reaktan dan produk adalah materi kajian Biokimia. Namun, apabila reaksi
ini dikatalisis oleh sistem enzim yang mengalami perubahan struktur, maka kajiannya
termasuk dalam lingkup Biologi Molekuler. Demikian juga, struktur komponen
intrasel dipelajari di dalam Biologi Sel, tetapi keterkaitannya dengan struktur dan
fungsi molekul kimia di dalam sel merupakan cakupan studi Biologi Molekuler.
Komponen dan proses replikasi DNA dipelajari di dalam Genetika, tetapi
macam-macam enzim DNA polimerase beserta fungsinya masing-masing dipelajari di
dalam Biologi Molekuler.
Prinsip dasar biomolekul adalah peran dan interaksi molekul-molekul hayati
dalam mengontrol reaksi-reaksi biologis. Interaksi tersebut berlangsung di dalam sel
(intrasel) maupun di luar sel (ekstasel) makhluk hidup. Inti reaksi biologis tersebut
adalah berupa reaksi metabolisme pembentuk senyawa (anabolisme) atau penguraian
senyawa (katabolisme) dengan bantuan enzim-enzim tertentu. Bahan dasar
metabolisme tersebut diperoleh dari makromolekul yang tekandung dalam makanan
yaitu karbohidrat, lemak, dan protein. Asam nukleat berperan dalam meregulasi reaksi
metabolisme tubuh seperti proses pemeliharaan, transmisi, dan ekspresi informasi
hayati yang meliputi replikasi, transkripsi, dan translasi.
Karbohidrat merupakan komponen pangan yang menjadi sumber energi utama
dan sumber serat makanan. Komponen ini disusun oleh 3 unsur utama, yaitu karbon
(C), hidrogen (H) dan oksigen (O). Jenis-jenis karbohidrat sangat beragam dan
mereka dibedakan satu dengan yang lain berdasarkan susunan atom-atomnya,
panjang/pendeknya rantai serta jenis ikatan akan membedakan karbohidrat yang satu
dengan lain. Dari kompleksitas strukturnya dikenal kelompok karbohidrat sederhana
(seperti monosakarida dan disakarida) dan karbohidrat dengan struktur yang
kompleks atau polisakarida (seperti pati, glikogen, selulosa dan hemiselulosa).
Lemak adalah salah satu kelompok yang termasuk pada golongan lipid, yaitu
senyawa organik yang terdapat di alam serta tidak larut dalam air, tetapi larut dalam
pelarut organik non-polar, misalnya dietil eter, kloroform, benzena dan hidrokarbon
lainnya. Lemak disusun oleh 2 jenis molekul yaitu gliserol dan asam lemak. Gliserol
adalah alkohol yang terdiri dari 3 stom karbon dengan setiap atom karbon mengikat
satu gugus hidroksil. Asam lemak memiliki rangka karbon panjang, biasanya 16 atau
18 karbon, dengan gugus karboksil pada bagian ujungnya. Lemak terbentuk bila asam
lemak berikatan dengan setiap gugus karboksil pada gliserol dan menghasilkan ikatan
ester. Hasil dari reaksi ini adalah triasilgliserol. Seringkali dalam pembahasan nutrisi
kita mengenal istilah lemak jenuh dan lemak tak jenuh. Kondisi tersebut dibentuk
oleh jumlah ikatan rangkap yang terdapat pada asam lemak. Lemak tak jenuh
memiliki satu atau lebih ikatan rangkap pada asan lemaknya.

Protein merupakan suatu zat makanan yang penting bagi tubuh, karena zat ini
disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat
pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung
unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak dan karbohidrat. Protein disusun
oleh 20 asam amino essensial membentuk ikatan peptida.
Asam nukleat adalah
makromolekul terbesar dalam sel,
berupa polimer linier sangat
panjang disebut juga polinukletida
yang terdiri dari 106 atau lebih
nukleotida. Nukleotida terdiri dari
molekul gula dengan 5 atom C
(pentosa), satu atau lebih gugus
fosfat, dan basa nitrogen. Asam
nukleat yang paling umum
adalah Asam
deoksiribonukleat (DNA) dan
Asam ribonukleat (RNA). Asam
Deoksiribonukleat (DNA)
merupakan asam nukleat yang
mengandung informasi genetik
dan biasanya dalam bentuk kompleks nukleoprotein (DNA-protein) yang disebut
kromosom. Tiap kromosom membawa informasi genetik yang dibutuhkan pada sintesis
senyawa yang diperlukan untuk pemeliharaan, pertumbuhan dan replikasi sel. DNA
merupakan molekul yang sangat besar dengan struktur sederhana, berupa 4 subunit
nukleotida yang terikat dalam suatu rantai dengan urutan tertentu. Urutan nukleotida
dalam DNA berfungsi sebagai sandi untuk menyampaikan semua informasi kepada sel
guna membuat segala sesuatu untuk kebutuhan kehidupannya. Asam ribonukleat
(RNA) berperan sebagai pembawa bahan genetik dan memainkan peran
METODE BIOLOGI MOLEKULER
Ada beberapa metode yang digunakan dalam dunia biologi molekuler:
1. Radioisotop
Yang pertama adalah radioisotop. Isotop itu sendiri merupakan elemen – elemen
kimia yang mempunyai jumlah proton yan sama di dalam inti atomnya, namun meski
demikan massa atomnya ( jumlah proton dan neuron ) berbeda. Beberapa isotop
bersifat lebih dan mengalami peluruhan secara spontan yang kadang – kadang diikuti
oleh penyebaran radiasi elektromagnetik. Atom – atom yang memiliki sifat demikian,
dinamakan sebagai radioisotop. Adapun penggunaan radioisotop ini digunakan
untuk mendeteksi hasil suatu reaksi kimia yang terdiri dari autoradiografi.
2. Sentrifugasi
Yang kedua adalah sentrifugasi. Adapun sentrifugasi ini digunakan untuk
fraksionasi sel atau pemisahan bagian – bagian sel atau organel dan juga pemisahan
molekuler. Prinsip senrtifugasi ini senidiri berdasarakna atas fenomena yang
mengatakan bahwa partikel yang tersuspensi di daam suatu wadah ( tabung ) akan
mengedap kedasar wadah karena pe ngaruh gravitasi. Laju pengendakan akan
dipercepat dengan alat sentrifuge dengan cara diputar pada kecepatan tinggi.
3. Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan molekul selular berdasarkan
ukurannya dengan mneggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium
dengan suatu sampel yang akan dipisahkan tersebut. Teknik seperti ini dapat
digunakan untuk menganalisisi DNA, RNA maupun protein. Sehingga fungsi dna dan
rna bisa diketahui dengan jelas.
Berikut ini adalah salah satu contoh proses biologi molekuler yang seirng
digunakapan dalam dunia kedoteran. Adapun salah satu contih tersebut adalah seperti
“ Kloning Ekspersi “. Salah satu teknik dasar biologi molekuler adalah pada
“ Kloning Ekspersi “ yang digunakan untuk mempelajari protein seperti halnya proses
kloning pada manusia atau pun hewan. Berikut ini adalah proses atau cara kerjanya.
 Potogan DNA pnyandi protein yang diinginkan digtranspalantasikan ke suatau
plasmid ( DNA sirkuler yang pada umumnya ditemukan pada bakteri .
 Plasmid yang telah mengadung potongan DNA yang diinginakn tersebut
kemudian dapat disisipkan kedalam sel bakteri atau sel hewan.
 Penyisipan DNA kedalam sel bakteri disebut dengan trasformasi yang dapat
dilakukan denagn berbagai metode.
 Setelah penyisipan kedalam sel, protein yang disandi oleh potongan DNA
yang tadi kini sdah dapt diekspresikan oleh sel yang bersangkutan.
 Setelah itu, berbagai cara akan dilakukan untuk membuat penyisipan tersebut
agar protein yang bersangkutan didapatkan dalam jumlah besar, misalnay
seperti inducible promoter dan juga specific cell – signaling factor. Protein
dalam jumlah besar tertentu tersebut kemudian dapt diekstrak dari sel bakteri
atau eukaryote.
TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

Sejak akhir 1950-an dan awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk
mengkarakterisasi, mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan
organisme. Komponen-komponen ini mencakup DNA, informasi-informasi genetik
seperti; RNA, kerabat dekat DNA yang berfungsi dalam sintesis protein, sementara
DNA berfungsi dalam struktural dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan
pada struktural saat translasi, juga protein, jenis struktural serta enzimatik utama dari
molekul dalam sel.

Ekspresi kloning

Salah satu teknik yang paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi
protein adalah kloning ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk suatu protein
dari kloning (menggunakan PCR dan / atau enzim restriksi) ke dalam sebuah plasmid
(dikenal sebagai vektor ekspresi). Plasmid ini mungkin memiliki elemen promotor
khusus untuk mendorong produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki
penanda resistensi antibiotik untuk membantu mengikuti plasmid.

Plasmid ini dapat dimasukkan ke dalam sel-sel bakteri baik atau hewan.
Memperkenalkan DNA ke dalam sel bakteri yang dapat dilakukan dengan
transformasi (melalui penyerapan DNA telanjang), konjugasi (melalui kontak sel-sel)
atau dengan transduksi (melalui vektor virus). Memperkenalkan DNA ke dalam sel
eukariotik, seperti sel hewan, dengan cara fisik atau kimia yang disebut transfeksi.
Beberapa teknik transfeksi yang berbeda tersedia, seperti transfeksi kalsium fosfat,
elektroporasi, injeksi dan transfeksi liposom. DNA juga dapat diperkenalkan ke dalam
sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang terakhir ini
kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium
tumefaciens. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi
stabil, atau mungkin tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi sementara.

Dalam kedua kasus, DNA coding untuk suatu protein yang menarik sekarang di
dalam sel, dan protein sekarang dapat dinyatakan. Berbagai sistem, seperti promotor
diinduksi dan spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia untuk membantu
mengekspresikan protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar protein
kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk
aktivitas enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga
struktur tersier yang dapat dipelajari, atau dalam industri farmasi, aktivitas obat baru
terhadap protein dapat dipelajari.

Polymerase chain reaction (PCR)

 Reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin
DNA. Secara singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan
kali), atau diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat
digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi
(mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai
“perubahan cepat”. PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu
fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan cDNA. PCR memiliki banyak
variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan,
baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran
kuantitatif molekul DNA atau RNA.

Gel elektroforesis

Elektroforesis gel adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip
dasarnya adalah bahwa DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui
medan listrik. Dalam elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan
berdasarkan ukuran dengan menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat
dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan gel SDS-PAGE, atau
berdasarkan ukuran dan muatan listrik mereka dengan menggunakan apa yang dikenal
sebagai elektroforesis gel 2D.

Makromolekul blotting

Istilah “utara”, ”barat” dan “timur” blotting berasal dari apa yang awalnya adalah
lelucon biologi molekuler yang dimainkan dijangka blotting selatan, setelah teknik
yang dijelaskan oleh Edwin Selatan untuk dengan hibridisasi DNA dari dihapuskan.
Patricia Thomas, pengembang dari noda RNA yang kemudian menjadi dikenal
sebagai “noda utara” sebenarnya tidak menggunakan istilah itu. Kombinasi lebih
lanjut dari teknik ini menghasilkan istilah-istilah seperti “southwesterns”
(protein-DNA hybridizations), “northwesterns” (untuk mendeteksi protein-RNA
interaksi) dan “farwesterns” (interaksi protein-protein), yang semuanya saat ini
ditemukan dalam literatur.

Southern blotting

Dinamai setelah penemunya, biologi Edwin Selatan, Selatan Blot adalah metode
untuk menyelidiki keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA
sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan
elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi
kapiler. Membran tersebut kemudian terkena probe DNA berlabel yang memiliki
urutan basa pelengkap untuk urutan DNA pada bunga. Kebanyakan protokol asli yang
digunakan label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia.
Southern blotting kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena kapasitas
teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA.
Bercak ini masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun, seperti
mengukur jumlah salinan transgen pada tikus transgenik, atau rekayasa gen sel induk
garis KO embrio.

Northern blotting

Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul
RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada
dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah noda.
Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke
membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan.
Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang
digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran
RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah
RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk
mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur
berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu
alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa,
gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam jaringan hidup.

Western blotting

Antibodi terhadap protein yang paling dapat dibuat dengan menyuntikkan

sejumlah kecil protein menjadi binatang seperti mouse, kelinci, domba, atau
keledainya (antibodi poliklonal) atau diproduksi dalam kultur sel (antibodi
monoklonal). Antibodi ini dapat digunakan untuk berbagai teknik analisis dan
preparatif.

Di barat blotting, protein yang pertama dipisahkan oleh ukuran, dalam gel tipis
terjepit di antara dua pelat kaca dalam teknik yang dikenal sebagai SDS-PAGE
(natrium sulfat dodesil poliakrilamida elektroforesis gel). Protein dalam gel kemudian
ditransfer ke PVDF, nitroselulosa, membran nilon atau dukungan lainnya. Membran
ini kemudian bisa dideteksi dengan solusi antibodi. Antibodi yang secara khusus
mengikat protein yang menarik kemudian dapat divisualisasikan oleh berbagai teknik,
termasuk produk berwarna, chemiluminescence, atau autoradiografi. Seringkali,
antibodi diberi label dengan enzim. Ketika substrat chemiluminescent terkena enzim
itu memungkinkan deteksi. Menggunakan teknik western blotting memungkinkan
deteksi tidak hanya tetapi juga analisis kuantitatif.

Metode analog dengan Barat blotting dapat digunakan untuk langsung noda
protein tertentu dalam sel hidup atau bagian jaringan. Namun, metode
“immunostaining”, seperti pada IKAN, lebih sering digunakan dalam penelitian
biologi sel.

Timur blotting

Teknik blotting Timur adalah untuk mendeteksi modifikasi pasca-translasi

protein. Protein mengeringkan ke nitroselulosa membran PVDF atau yang diperiksa
untuk modifikasi menggunakan substrat tertentu.

Array

Sebuah array DNA adalah kumpulan bintik-bintik melekat pada dukungan solid
seperti slide mikroskop dimana spot masing-masing berisi satu atau lebih beruntai
tunggal oligonukleotida fragmen DNA. Array memungkinkan untuk meletakkan
jumlah besar bintik-bintik yang sangat kecil (100 diameter micrometre) pada slide
tunggal. Setiap tempat memiliki molekul DNA fragmen yang melengkapi urutan
DNA tunggal (mirip dengan blotting Selatan). Sebuah variasi dari teknik ini
memungkinkan ekspresi gen dari suatu organisme pada tahap tertentu dalam
pembangunan yang berkualitas (profiling ekspresi). Dalam teknik ini RNA dalam
jaringan adalah terisolasi dan diubah menjadi cDNA berlabel. Ini cDNA ini kemudian
hibridisasi dengan fragmen di array dan visualisasi hibridisasi dapat dilakukan. Sejak
beberapa array dapat dilakukan dengan posisi yang sama persis fragmen mereka
sangat berguna untuk membandingkan ekspresi gen dari dua jaringan yang berbeda,
seperti jaringan sehat dan kanker. Juga, kita dapat mengukur apa gen disajikan dan
bagaimana perubahan ekspresi yang dengan waktu atau dengan faktor lain. Sebagai
contoh, ragi roti yang umum itu, ”Saccharomyces cerevisiae”, mengandung sekitar
7000 gen, dengan microarray, orang dapat mengukur secara kualitatif bagaimana gen
masing-masing dinyatakan, dan bagaimana bahwa perubahan ekspresi, misalnya,
dengan perubahan suhu.

Array juga dapat dibuat dengan molekul lain dari DNA. Sebagai contoh, sebuah
array antibodi dapat digunakan untuk menentukan apa yang protein atau bakteri yang
hadir dalam sampel darah.

Oligonukleotida spesifik alel

 Oligonukleotida alel spesifik (ASO) adalah teknik yang memungkinkan deteksi
mutasi basa tunggal tanpa memerlukan elektroforesis PCR atau gel. Pendek (20-25
nukleotida panjang), probe berlabel terkena DNA target non-terfragmentasi.
Hibridisasi terjadi dengan kekhususan tinggi karena panjang pendek dari probe dan
bahkan perubahan basa tunggal akan menghambat hibridisasi. DNA target kemudian
dicuci dan probe label yang tidak berhibridisasi dihapus. DNA target kemudian
dianalisa untuk kehadiran probe melalui radioaktivitas atau fluoresensi. Dalam
percobaan ini, seperti dalam kebanyakan teknik biologi molekular, kontrol harus
digunakan untuk memastikan percobaan berhasil. Illumina Metilasi Assay adalah
contoh dari sebuah metode yang mengambil keuntungan dari teknik ASO untuk
mengukur satu perbedaan pasangan basa secara berurutan.

Teknologi kuno

Dalam biologi molekular, prosedur dan teknologi yang terus-menerus

dikembangkan dan teknologi yang lebih tua ditinggalkan. Misalnya, sebelum
munculnya gel elektroforesis DNA (agarosa atau Polyacrylamide), ukuran molekul
DNA biasanya ditentukan oleh tingkat sedimentasi di gradien sukrosa, teknik lambat
dan padat karya yang membutuhkan instrumentasi mahal; sebelum gradien sukrosa,
viscometry digunakan .

Selain dari kepentingan sejarah mereka, sering perlu mengetahui tentang

teknologi yang lebih tua, karena kadang-kadang berguna untuk memecahkan masalah
lain yang baru untuk teknik yang lebih baru adalah tidak tepat
SEKUENSING DNA

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai
sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom
karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk
hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun
fungsi gen atau fragmen DNA lainnya. Hal ini dilakukan dengan cara
membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.
Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan
seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.

Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup

untuk melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan demikian, penentuan
sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan ‘murni’ mengenai mengapa dan
bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis.
Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA
dapat berguna dalam penelitian biologi manapun. Sebagai contoh, dalam ilmu
pengobatan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis,
dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian pula halnya, penelitian
pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi pengobatan
penyakit menular. Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA,
merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak
barang dan jasa berguna. Pengetahuan akan sekuens DNA berguna untuk mengetahui
sekuens asam amino yang disandikan oleh gen.

Karena RNA dibentuk dengan transkripsi dari DNA, informasi yang dikandung
RNA juga terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan
tersebut sudah cukup untuk membaca informasi pada RNA. Namun, sekuensing RNA
dibutuhkan khususnya pada eukariota. hal itu dikarenakan molekul RNA eukariota
tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena pemotongan intron setelah
proses transkripsi.

Macam Metode

Metode Maxam-Gilbert

Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA
hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan kloning untuk
membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi
rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan
teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up.

Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli
pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu
nukleotida pada ujung 3’. Metode maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA
untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik
yang dilakukan dalam dua tahap. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong
secara parsial menggunakan piperidin. pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi
piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam
ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu.

Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G,

hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi
reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat
macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T,
dan ujung C. Dari hasil dapat diketahui sekuens fragmen DNA yang dipelajari atas
dasar laju migrasi masing-masing pita.

Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G.
Untuk memastikannya harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua
terdapat pita-pita yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur
pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan fragmen yang
salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen
dengan basa A pada salah satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk
memastikan pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan
pita-pita pada lajur keempat.

Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa, laju migrasi pita

menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat
migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat
diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil
hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan ujung
TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen DNA yang dipelajari.

Metode Sanger

Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.

Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan

karena ada metode lain yang jauh lebih praktis. Metode tersebut yaitu metode
dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga.

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim
DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah
kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan
ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP
hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul
ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C
nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP
disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi
lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul
DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.
 Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi
dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga
polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga
ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di
tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap
reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung
3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang
mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran
yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya.

Pada Gambar 13.2 diberikan sebuah contoh sekuensing sebuah fragmen DNA.
Tabung ddATP menghasilkan dua fragmen dengan ukuran tiga dan tujuh basa; ddCTP
menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu, dua, dan empat basa; tabung ddGTP
menghasilkan dua fragmen dengan ukuran lima dan sembilan basa; ddTTP
menghasilkan dua fragmen dengan ukuran enam dan delapan basa. Di depan (arah 5’)
tiap fragmen ini sebenarnya terdapat primer, yang berfungsi sebagai prekursor reaksi
polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil sekuensing karena urutan basa primer telah
diketahui.

Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing tersebut dilakukan

elektroforesis. Cara itu menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi
perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya
diketahui, dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang
paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen dengan
ujung G (sembilan basa). Dengan demikian, hasil sekuensing yang diperoleh adalah
CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer
dengan hasil sekuensing ini, yaitu GGTGCATAC.

Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode

sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal
pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing.

Metode Sanger asli

Pada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan
dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah
satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi.
Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai
(labelling) primer yang digunakan dengan fosfor radioaktif sebelum reaksi sekuensing
dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada empat
lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.

Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam primer yang

ditandai dengan pewarna berpendar (fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan
karena tidak menggunakan bahan radioaktif; selain menambah keamanan dan
kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur
pada gel. Metode ini dikenal sebagai metode dye primer sequencing.
 Sekuensing dye terminator

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim
disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh
proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat
reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut,
masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna
fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Cara ini
lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaan primer berwarna. Namun
dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan
oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada
pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah
tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim
dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.

Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena
lebih sederhana dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel
secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali
pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal
primer.

Automatisasi dan penyiapan sampel

Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel

berlabel fluoresens sekaligus dalam sekali batch (elektroforesis) yang dapat dilakukan
sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses
pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan ulang dalam larutan
penyangga yang sesuai harus dilakukan secara terpisah.

Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan,
metode “sekuensing daur” (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode
ini dilakukan berturut-turut penempelan primer (primer annealing), ekstensi oleh
polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau melting) untai-untai DNA cetakan
secara berulang-ulang (25–40 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih
efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya
mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu seperti hairpin loop atau
daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah
temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal cycler) PCR.

Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer
akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah
(terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara
tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik
(organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai
pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95 °C).

Sekuensing generasi berikutnya

 Pyrosequencing

Pyrosequencing adalah teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi

terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini
memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase
untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.
 Sekuensing DNA skala besar

Dalam metode sekuensing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong
pendek DNA sekaligus. Contohnya, mesin sekuensing modern yang menggunakan
metode Sanger hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap
sekuensing. Keterbatasan ini disebabkan oleh probabilitas terminasi rantai yang
menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain
keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.

Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali dibutuhkan. Sebagai
contoh, genom bakteri sederhana dapat mengandung jutaan pasang basa, sedangkan
genom manusia terdiri atas lebih dari 3 milyar pasang basa. Berbagai strategi telah
dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk strategi primer walking
dan shotgun sequencing. Kedua strategi tersebut melibatkan pembacaan banyak
bagian DNA dengan metode Sanger. Selanjutnya menyusun hasil pembacaan tersebut
menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan sendiri
dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai contoh, metode shotgun sequencing
merupakan metode yang paling praktis untuk sekuensing genom ukuran besar, namun
proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan.

Data sekuens bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan
dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi. Hal
ini dapat dilakukan dengan metode reaksi berantai polimerase. Bila primer yang
dibutuhkan untuk mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat.
Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel. Cara ini menggunakan vektor
bakteri, yaitu memanfaatkan bakteri untuk “menumbuhkan” salinan DNA yang
diinginkan sebanyak beberapa ribu pasang basa sekaligus. Biasanya proyek-proyek
sekuensing DNA skala besar memiliki persediaan pustaka hasil kloning semacam itu.