Elektroforesis PDF
Elektroforesis PDF
Suatu elektroforegram
Suatu elektroforegram
Elektroforesis
• Electro – phoresis = “being carried”
• “Electrically induced movement of
particles” : gerakan partikel yang
bermuatan di dalam suatu media yang
diberi arus listrik
• Digunakan untuk pemisahan suatu
campuran senyawa yang bermuatan :
protein atau DNA
Protein
• Proteins adalah “building blocks of life”. Secara
kimiawi, protein adalah molekul yang terbentuk
dari suatu urutan asam amino yang
dihubungkan dengan ikatan peptida .
• Susunan dari beberapa amino acids sepanjang
rantai peptida tersebut disebut struktur primer
(primary structure) protein, secara experimen
dapat dibuktikan melalui teknik sequencing atau
dengan analisis DNA yang meng-encoding
specific proteins.
Struktur Protein
Struktur primer, sekunder, tersier dan kuartener
Struktur protein
Analisis protein
Penggunaan elektroforesis
dalam analisis
• Analisis kualitatif Untuk Protein
• Analisis kualitatif DNA
Penggunaan dalam biologi melekul
• Proteomic studies : untuk menentukan gen
yang bertanggung jawab dalam
menghasilkan suatu protein dan
menentukan fungsi protein tersebut
• “proteomic” : studi tentang struktur, fungsi
dan regulasi protein suatu organisme
Prinsip dasar elektroforesis
• Elektroforesis adalah suatu proses migrasi
molekul bermuatan di dalam suatu media yang
bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya
tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk
setiap molekul yang terlibat.
• Pada saat arus listrik diberikan, molekul
bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel),
molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat
daripada yang besar, sehingga akan terjadi
pemisahan
Elektroforesis vertikal untuk
analisis protein
Elektroforesis horizontal untuk
analisis DNA
Elektroforesis DNA
• Pada gel electrophoresis untuk DNA, enzim restriksi
memotong DNA menjadi beberapa fragmen dengan
panjang bervariasi. Larutan yang mengandung fragmen2
ini ditempatkan di dalam suatu gel tebal. Bila arus listrik
diberikan pada gel tersebut, maka satu sisi gel
akanbermuatan positif sedangkan sisi lainnya akan
bermuatan negatif.
• Semua fragmen tadi akan bergerak dari sisi gel yang
bermuatan negatif ke arah ujung yang bermuatan positif.
Fragmen yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat
dibandingkan yang berukuran lebih besar.
• Apabila arus listrik dihentikan , fragmen DNA tadi telah
terpisah-pisah di dalam gel tersebut dan yang berukuran
lebih kecil akan berada lebih dekat pada ujung postif.
Fragmen tersebut akan terlihat seperti bentuk barcode.
• setiap bar dlm pola tersebut mengandung DNA
fragments dgn ukuran tertentu . Scientists dpt
mengidentifikasi specific restriction fragments dengan
melihat posisinya pada gel.
• Urutan DNA complement dpt digunakan sbg probe
untuk menentukan restriction fragment pada gel yang
memiliki urutan nukleotida tertentu.
• Contoh : Scientists dpt menggunakan DNA darah
dilokasi kriminal untuk mengungkap pelaku kejahatan.
Jika contoh darah sesuai dengan yg terdapat pada gel
elektroforesis , maka proses pairing akan terjadi
Elektroforesis Protein
• Metode yang paling umum untuk memisahkan
protein adalah dengan cara electrophoresis
menggunakan discontinuous polyacrylamide gel
sebagai medium penyangga dan sodium
dodecyl sulfate (SDS) untuk men-denaturasi
protein.
• Metode ini disebut Sodium Dodecyl Sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-
PAGE).
• Metode ini disebut juga “Laemmli method”
karena penemunya U.K. Laemmli, adalah yang
pertama kali menggunakan metode SDS-PAGE
ini
Apa gunanya SDS?
• SDS (juga disebut Lauril sulfat) adalah suatu
deterjen anionik, yang apabila dilarutkan
molekulnya memiliki muatan negatif dalam
range pH yg luas.
• Suatu rantai polipeptida dpt berikatan dgn
sejumlah tertentu SDS sesuai ukuran molekul
(Molecular mass). Muatan negatif SDS akan
menghancurkan sebagian besar struktur
kompleks protein, dan secara kuat tertarik ke
arah anoda (positively-charged electrode) bila
ditempatkan pada suatu medan elektrik.
1-D Electrophoresis
• Ketika protein dan macromolecules lain di
treatment dengan SDS suatu strong detergent,
maka mereka akan ter denaturasi dan akan
bermuatan negatif.
• Jumlah yang terikat akan proposional dengan
massa.
• Jumlah yang tertarik per unit massa di electric field
adalah sama dan seluruh molekul akan bergerak
dengan kecepatan yang sama bila tidak ada friksi.
• Pada proses electrophoresis dengan SDS
dilakukan di dalam suatu gel yang akan melewati
pori-pori gel., sehingga kemudahan pergerakan
melalui pori tergantung pada diameter molekul.
• Molekul yg lebih besar akan tertahan dan akibatnya
bergerak lebih lambat .
• Karena molekul terdenaturasi, diameter nya tergantung
dari berat molekulnya. Makin besar diameter
molekulnya, semakin lambat gerakannya.
• Dengan demikian electrophoresis + SDS akan
memisahkan molekul berdasarkan molecular weight,
tidak hanya native charge.
• Catatan : Protein dgn panjang yang sama biasanya tidak
dapat dipisahkan dengan by gel electrophoresis + SDS.
Perbedaan MW yg disebabkan oleh perbedaan R groups
tidak cukup untuk terjadinya pemisahan. Jika dua protein
bermigrasi bersamaan maka diasumsikan bahwa mereka
memiliki BM yang sama karena panjangnya kurang lebih
sama. (walaupun jenis aa berbeda tapi jumlahnya mgk
sama).
2-Dimensional Electrophoresis
• Umum digunakan : 2-D polyacrylamide gel
electrophoresis
• Memisahkan, identifikasi, dan mengukur seluruh
protein yang terdapat dalam suatu sample sel
• Pada dimensi pertama, Protein dipisahkan pada
titik isoelektriknya yaitu pada pH dimana muatan
tiap protein sama dengan 0. Pada dimensi
kedua, protein lalu didenaturasi sedemikian
sehingga setiap residu asam amino mempunyai
muatan tertentu. Selanjutnya protein dipisahkan
berdasarkan ukurannya.
Bahan penyangga
• Berupa gel (sediaan semisolid transparan)
• Utk pemisahan protein : digunakan gel
polyacrylamide
• Utk pemisahan DNA : digunakan gel
agarose
Komposisi gel untuk
pemisahan protein
• Gel dengan komposisi 7 sampai 15%
acrylamide, tergantung pada rentang
protein yang akan
• Separating gel buffer stock (4x conc)
terdiri dari 0.4% SDS, 1.5 M Tris-Cl, pH
8.8.
Denaturasi sampel protein
• Berbagai larutan dapar (buffer) digunakan dalam
SDS-PAGE , namun untuk proses denaturasi
sample dapat digunakan prinsip yg sama :
• Denaturasi : campuran protein sample 1:1
dengan 2x kons buffer yg mengandung 2%
SDS, 20% glycerol, 20 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2
mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA),
plus suatu reducing agent spt dithiothreitol
(DTT) atau 2-mercaptoethanol, dan sejumlah
kecil bromophenol blue t, dye utk tracking (0.1
mg/ml)
Proses pembuatan gel
• Acrylamide akan berpolimerasi secara spontan
bila tidak ada oxygen, jadi sangat penting
membuang oxygen dari larutan
• Polimerasi akan lebh sempurna bila larutan
dilakukan de-gassing dibawah vacuum selama
5 min
• Awali polimerisasi dengan menambahkan
freshly prepared10% ammonium persulfate (AP)
ke dalam campuran lalu diikuti dengan
menambahkan N, N, N', N'-
tetramethylethylenediamine (TEMED).
• Umumnya : 100 µl AP dan 10 µl TEMED per 10
ml gel mix
Hal penting yang harus diperhatikan dalam
pembuatan gel
DNA
marker Produk PCR
PCR Fingerprints of Replicates of an isolate
of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of
Preservation with Mr Primer
Membrane 7
1,20
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Distance, cm
Normalisasi pola elektroforesis
H37Rv Pattern
6,00
5,00
4,00
MW(kb)
3,00
2,00
1,00
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8