BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Newcastle Disease (ND) atau dikenal dengan nama lain penyakit
tetelo, pseudovogolpest, sampar ayam, Rhaniket, Pneumoencephalitis dan
Tontaor furrens merupakan penyakit yang disebabkan oleh virus dari
famili Paramyxoviridae, genus Avulavirus, spesies Avian Paramixovirus
serogrup Avian Paramyxovirus tipe 1 ( APMV – 1), merupakan virus
Ribonucelic Acid (RNA), genom serat tunggal (single stranded/ss) dan
berpolaritas negatif. Famili Paramyxoviridae berbentuk pleomorfik,
biasanya berbentuk bulat dengan diameter 100-500 nm, namun ada pula
yang berbentuk filamen, dan beramplop. (Miller et al.,2010 ;OIE,2002).
Induk semang (jenis unggas) dan strain virus ND merupakan tolak ukur
dari tinggat keparahan penyakit ini, penelitian menunjukan bahwa virus
ND paling pathogen pada ayam baik ras mau pun bukan ras terutama ayam
muda(Hewajuli dan Dharmayanti, 2011; Direktorat Kesehatan Hewan,
2014).
New castle disease merupakan penyakit dalam daftar A dari Office
Internasional der Epizootika, dijelaskan sebagai penyakit yang
penyebarannya berlangsung dengan cepat, menembus batas Negara,
menyebabkan konsekuensi sosio-ekonomi dan implikasi perdagangan
global (AIO, 2009). Fakta mengatakan New castle disease menyebabkan
kematian bagi unggas penderita, menurunkan produksi telur, menurunkan
daya tetas, serta menurukan memperlambat pertumbuhan unggas
(Pudjiatmoko et al.,2012). New castle disease merupakan penyakit yang
endemik di Indonesia, pertama kali ditemukan di Jakarta pada tahun 1926
oleh seseorang bernama Kraneveld, sejak saat itu penyakit ini dilaporkan
terjadi diberbagai negara diseluruh dunia (Darmintoet al.,1996).
Penyakit ini menimbulkan gejala pada sistem pernafasan, sistem
pencernaan dan sistem saraf pada unggas penderita, bersifat akut dan
menular. Berdasarkan gejala klinis yang ditimbulkan pada ayam, ND dapat

1
 dikelompokkan menjadi 3 patotipe, yang pertama velogenik, penyakit ini
menimbulkan gejala pada bagian respirasi, digesti, dan saraf, mortalitas
dari patotipe ini mencapai 100% pada ayam muda. Yang kedua mesogenik
menimbulkan gejala pada respirasi diikuti oleh penurunan produksi telur
pada ayam dan hambatan pertumbuhan pada ayam dewasa . Yang terakhir
adalah bentuk lentogenik, biasanya tidak disertai gejala klinis dan tanda
yang tidak spesifik pada ayam dewasa (Alexander,1983; Alexander and
Senne, 2008; Quin et al.,2011).
Virus ND galur virulen mempunyai kemampuan untuk
menghambat pertumbuhan sampai menimbulkan kematian embrio ayam,
hal ini dapat digunakan sebagai penilaian karakter virulensi virus ND.
Pada bentuk valogenik, menyebabkan kematian embrio ayam kurang dari
60 jam, contoh kasus adalah isolat Salatiga. Virus bentuk mesogenik
menyebabkan kematian embrio ayam antara 60-90 jam, sedangkan bentuk
lentogenik menyebabkan kematian embrio ayam lebih dari 90 jam pasca
inokulasi, seperti pada virus ND La Sota (Putra et al.,2012; Alexander and
Senne, 2008; NRC, 1997). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui lesi
yang ditimbulkan akibat infeksi virus strain virulen baik gangguan
pertumbuhan (berat badan) dan histopatologi organ otak, paru-paru, usus
dan bursa fabrisius pada embrio ayam.

1.2. Rumusan Masalah

2
 Dari latar belakang diatas, dapat dirumuskaan masalah penelitan
yaitu :
1.2.1. Apakah terjadi penurunan berat badan embrio pasca inokulasi virus
Newcastle Disease?
1.2.2. Bagaimanakah gambaran histopatologi otak, paru – paru, usus , dan bursa
fabrisius embrio yang diinokulasi virus ND?

1.3. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dilakakukannnya penelitian ini adalah sebagai
berikut :
1.3.1. Untuk mengetahui penurunan berat badan embrio yang diinokulasi
Newcastle Disease dan yang tidak diinokulasi New Castle Disease.
1.3.2. Untuk mengetahui gambaran histopatologi organ otak, paru-paru, usus dan
bursa fabrisius pada embrio yang diinokulasi Newcastle Disease dan yang
tidak diinokulasi Newcastle Disease.

1.4. Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah:
1.4.1. Mengetahui efek virus Newcastle Disease terhadap perkembangan embrio
(berat badan).
1.4.2. Mengetahui gambaran histopatologi virus Newcastle Disease dari organ
otak, paru-paru, usus, dan bursa fabrisius pasca inokulasi.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Telur Ayam Berembrio (TAB)

3
 Banyak teknik yang dapat digunakan dalam inokulasi pada media isolasi,
antara lain inokulasi pada hewan percobaan, biakan jaringan dan inokulasi pada
telur ayam berembrio (TAB). Dari sekian teknik yang digunakan tenik inokulasi
pada TAB sangat luas digunakan untuk pengujian virus dan pembuatan antigen.
Telur ayam berembrio dinilai lebih ekonomis, mudah diperoleh, mudah ditangani,
relatif bebas dari mikroorganisme pathogen tertentu, selain itu telur ayam juga
peka terhadap infeksi beberapa virus dan menghasilkan titer yang tinggi dan juga
mudah diberikan label dengan data yang lengkap (Astawa et al.,2013).
Menurut Astawa et al.,(2013) teknik inokulasi telur ayam berembrio
memiliki beberapa jalur inokulasi yaitu :
1. Membran Korioalantois (Chorioallantoic Membrane/CAM), jalur ini
digunakan untuk menginokulasi virus Pox, Variola, Marek, Distemper dan
lain – lain. TAB yang dipergunakan untuk tujuan inokulasi adalalah yang
berumur antara 10-13 hari.
2. Ruang Alantois (Allantoic Cavity), jalur ini biasa dipergunakan untuk
isolasi virus ND (New Castle Disease), H5N1, Infectious Bronchitis dan
lain – lain. Telur yang digunakan untuk tujuan inokulasi berumur antara 8-
12 hari.
3. Kantong Kuning Telur ( Yolk Sac), prosedur pada yolk sac dari telur ayam
berembrio sering digunakan untuk menginokulasi Chlamydia, Rickettsia
dan Avian Encephalomyelitis. Untuk inokulasi pada bagian yolks sac
adalah pada saat kantong kuning telur relative besar yaitu pada umur 5-7
hari.
4. Ruang Amnion (Amnionic Cavity), jalur ini digunakan untuk mengisolasi
virus influenza, pada jalur ini diperlukan ayam bertunas yang berumur 9-
13 hari.

2.2. Otak, Paru – paru, Usus, dan Bursa Fabrisius

2.2.1. Otak
Otak pada burung meliputi, medulla, lobus optok dan cerebellum dan
cerebrum.Medulla adalah bagian dari otak termasuk sistem saraf yang berfungsi
membantu mengontrol detak jantung, pernapasan, dan tekanan darah pada burung.

4
Lobus optic merupakan bagian dari otak tengah, ukurannya relatif besar pada
burung dibandingkan dengan vertebrata lain. Cerebellum berfungsi membantu
koordinasi aktivitas otot skeletal, ukuran cerebellum juga relative besar
dibandingkan bagian otak yang lain.Bagian yang berikutnya adalah cerebrum
yang terdiri dari 2 bagian yaitu, lobus hemisfer cerebri dan lobus olfaktori cerebri
(Anonim, tahun tidak diketahui).
2.2.2. Paru – Paru
Paru – paru atau pulmo pada unggas berukuran kecil dan tidak
dapat mengembang dikarenakan paru – paru menempel pada tulang
rusuk (McLelland, 1990). Pulmo pada unggas sama jumlahnya dengan
pada mamalia yaitu sepasang dan terletak pada region thoraks.
Selain sebagai alat respirasi, paru- paru juga berfungsi
mengeluarkan zat sisa dari aktivitas metabolisme sel, yaitu CO2 dan
air. Keberadaan CO2 dapat menimbulkan gangguan fisiologis yang
penting. CO sangat mudah berikatan dengan air membentuk asam
karbonat yang dapat menciptakan suasana asam. Oleh karena itu, CO
yang terbentuk harus segera diangkut dan dikeluarkan dari tubuh
(Isnaeni, 2006).
2.2.3. Usus
Usus pada ayam terdiri dari usus halus (intestinum tenue) dan usus kasar
(intestinum crassum). Usus halus terdiri atas duodenum, jejenum dan ileum, yang
dilapisi oleh epitel kolumner simplex yang mengandung banyak Goblet Cells.
Goblet Cells pada mukosa usus halus mensekresi mukus, yang bada bagian
duodenum berfungsi sebagai pelindung permukaan mokosa dari bahan asam dari
empedal (Siswanto, 2011).Usus halus ayam memiliki memiliki lendir berbentuk
villi hampir disepanjang ususnya, pada bagian duodenum villi tersembut
mencapai 1 – 1,5 mm. semakin kebelakang villinya semakin rendah dan tebal.
Pada tunika propria tersebar jaringan jaringan limfoid ditambah sel eosinophil,
kelenjar lieberkuhn relative pendek. Muskularis mukosa terdiri atas otot polos

5
yang tersusun memanjang dan dibawahnya terdapat sub mukosa, tunika
muskularis interna tersusun melingkar dan lebih tebal dari tunika muskularis
eksterna (Suwiti,2008).
Pada bagian usus kasar atau Itestinum crassum yang tersusun atas kolon,
caeca, dan rectum yang tidak dapat dibedakan dan bermuara bersama ureter dalam
kloaka. Kolon memiliki villi yang pendek dan lebar, juga berotot. Kolon mampu
mengadakan gerakan antiperistaltis yang membawa kembali isinya ke caeca.
Caeca sendiri memiliki 2 kantong buntu, villinya kecil pada spesies unggas
tertentu bisa rudimeter atau bahkan tidak ada, caeca berfungsi sebagai tempat
fermentasi, pengisian dan pengosongannya diatur oleh otot – otot sphincter
(Suwiti, 2008). Kloaka terbagi atas 3 bagian, yaitu kaprodeum, urodeum, dan
prokodeum. Kaprodeum merupakan ruang yang besar untuk urin dan feces.
Urodeum berfungsi sebagai penerima oviduct atau jendolan genetalia jantan dan
ureter, sedangkan protodeum fungsinya belum diketahui dengan jelas (Suwiti,
2008; Siswanto,2011).
2.2.4. Bursa Fabrisius
sistem kekebalan tubuh pada ayam seperti halnya pada hewan lainnya
merupakan sistem yang sangat komplek. Pada tubuh unggas umunya terdiri atas
kekebalan humoral dan seluler. Kekebalan humoral melibatkan antibody spesifik
terhadap antigen yang masuk. Pada ayam ada dua organ yang yang berhubungan
dengan sistem kebal, yaitu Bursa Fabrisius dan timus. Bursa fabrisius sebagian
besar berisi sel B yang memiliki fungsi memproduksi antibodi humoral atau yang
bersirkulasi. Sedangkan timus sebagian besar berisi sel T bertugas mengenal dan
dan menghancurkan sel yang terinfeksi bakteri dan virus, mengaktifkan makrofag
dalam fagositosis dan membantu sel B dalam produksi antibody. Pada masa
embrio kedua system ini di programkan untuk menghasilkan kekebalan aktif
terhadap penyakit, artinya kekebalan yang didapat sebagai akibat pernah terinfeksi
atau karena inokulasi dengan bahan – bahan penyebab penyakit yang telah diubah
bentuknya ( Junaidi, 2007). Sel B yang dihasilkan oleh bursa fabrisius akan
menghasilkan antibodi dan sel memori. Dalam menanggapi adanya antigen, sel –
sel plasma menghasilkan antibody. Antibodi adalah suatu protein yang besar

6
molekulnya dapat membantu menghancurkan dan melumpuhkan pathogen dengan
jalan mengikat pathogen tersebut dengan protein yang bersifat antigenetik. Sel-sel
plasma yang menghasilkan antibodi berasal dari sel B. Sel-sel memori akan
mengingat antigen yang pernah masuk kedalam tubuh, sehingga sistem kekebalan
tubuh unggas dapat bertingdak cepat (Cheville, 1967).
Secara histologi bursa fabrisius terdiri dari lipatan longitudinal (plika)
besar dan kecil. Litapan yang besar mencapai keseluruhan dari panjang lumen
bursa sedangkan yang kecil lebih pendek lipatannya. Lipatan-lipatan ini terdiri
dari folikel bursa dan bagian bawahnya terdapat matriks jaringan ikat. Lipatan
epitel longitudinal dibentuk dalam permukaan kantung dan epitel korumnal
menutupi plika berpolifirasi dan membentuk pertumbuhan kearah luar dari pucuk
epitel ke dalam propria yang ada di bawahnya (Riddel, 1996).
Unit dasar bursa fabrisius adalah folikel, folikel berkembang dari interaksi
pertumbuhan epitel dan sel mesenkim. Setiap folikel matang terdiri dari medulla
dan korteks (Riddel 1996; Eerola et al., 1987)

2.6. Perubahan Gambaran Histopatologi

2.6.1. Kongesti
Kongesti merupakan penimbunan daerah pada vena akibat aliran darah
yang melambat atau bahkan berhenti. Kongesti dapat terjadi secara local atau pun
umum, kongesti lokal mengakibatkan jaringan mengalami anoksia sampai terjadi
nekrosis, sehingga dapat menimbulkan lesi kehitaman. Sedangkan kongesti umum
melibatkan sirkulasi pada jantung maupun paru – paru. Jantung menjadi lemah
(aneurisma) sehingga tidak bekerja secara optimal dalam fungsinya sebagai
pemompa darah. Kongesti umum dapat bersifat fatal dan menyebabkan kematian
(Barata et al.,2011).
Secara makroskopik pada kongesti terlihat adanya akumulasi darah pada
kapiler atau vena, beraspek biru karena darah kekurangan oksigen. Secara
mikroskopik kongesti mirip dengan hyperemia, namun yang membedakannya
dadlah pada hyperemia terdapat sel – sel radang. Sedangkan jika secara histologi
dinding vena lebih tipis dibandingkan dengan dinding arteri (Barata at al.,2011).
2.6.2. Hemorraghi

7
 Perdarahan atau hemorrahagi adalah peristiwa keluarnya darah dari
pembuluh darah yang secara patologis ditandai dengan adanya sel darah merah
diluar pembuluh darah atau jaringan. Berdasarkan ukurannya hemorraghi
dibedakan atas tiga, yaitu petechie, jika ukuran perdarahan yang terjadi antara 1-
2mm, kemudian perdarahan echymosae apabila ukuran perdarahan yang terjadi
antara 2-3mm, dan yang terakhir perdarahan paint- brush perdarahan ini bersifat
garis-garis. Ketiga bentuk hemorraghi ini biasanya terjadi pada permukaan serosa
atau mukosa yang dapat dilihat tetapi tidak dapat dipalpasi (Barata et al.,2011).
Secara makroskopik perdarahan dapat dilihat dengan adanya darah di luar
pembuluh darah, sedangkan secara mikroskopik dapat dilihat adanya darah diluar
pembuluh darah, ditandai dengan sel – sel berwarna merah terutama dengan
pewarnaan hematoksilin eosin (HE) (Berata et al., 2011).

2.7. New Castle Disease

2.7.1. Etiologi
Newcastel (ND) disease adalah salah satu penyakit yang menyerang ayam
yang disebabkan oleh virus, berikut adalah etiologi penyakit ND :
Menurut Miller at al (2010) :
Genus : Avulavirus
Famili : Paramyxoviridae
Spesies : Avian Paramyxovirus
Serogrup : Avian Paramyxovirus Tipe 1 - 9(APMV – 1 sampai APMV - 9)
Penyakit New Castle Disease (ND) atau bersinonim dengan penyakit
tetelo memiliki virus yang berbentuk plemorfik, sebagian besar berbentuk bulat
kasar dengan diameter 100 – 500nm, ditemukan juga dalam bentuk filamen
dengan diameter 100nm dan beramplop, virus ini juga merupakan virus
Ribonucleic Acid (RNA) dengan polaritas negative genom serat tunggal (single
stranded/ss). Panjang dari virus Paramyxovirus terlihat bervariasi (Yussof dan
Tan, 2001; OIE, 2002; Miller et al., 2010).
2.7.2. Model Transmisi
Penularan virus penyebab penyakit ND dapat melalui udara, kontak
dengan ayam penderita virus yang mencemari makanan, air minum, dan peralatan

8
kandang. Penyebaran virus ini sangat cepat, baik dari ayam ke ayam maupun dari
kandang ke kandang. Ayam yang menderita penyakit ini akan akan menhasilkan
telur yang mengandung virus ND, sehingga telur yang mengandung virus tersebut
tidak akan menetas. Dua hari setelah virus menginfeksi ayam, ayam sudah
menjadi sumber penyakit yang siap menebar pada kelompoknya, dan dari kandang
ke kandang lain (Murtidjo, 1992). Virus ND berada di udara pernafasan, tinja,
ayam yang mengalami sakit dan pada karkas ayam yang mati karena ND. Di
samping oleh ayam, penyebaran penyakit dapat melalui burung piaraan atau
burung liar yang ada di sekitar atau masuk ke dalam kandang ( Akoso, 1998).
Peranan dari berbagai faktor di atas dalam penularan virus ND tergantung pada
berbagai faktor manajemen dan lingkungan tempat suatu peternakan beroperasi.
Keberhasilan penularan virus ND erat hubungannya dengan kemampuan virus
tersebut bertahan dalam bangkai ayam atau ekskresi dari ayam sakit. Di dalam
bangkai ayam yang terinfeksi, virus ND dapat bertahan selama beberapa minggu
pada temperatur rendah atau selama beberapa tahun jika disimpan pada
temperatur beku. Feses dapat mengandung virus ND dalam jumlah yang banyak,
pada temperatur 37○C virus tersebut masih tetap hidup selama lebih dari satu
bulan ( Tabbu, 2000).
2.7.3. Gejala Klinis
Penyakit Newcastle Disease menyebabkan gangguan yang serius pada
sistem pernafasan, sistem pencernaan dan juga sistem saraf dari unggas
penderitannya, bersifat akut dan menular. Gejala yang teramati dari penyakit ND
digai dalam 3 bentuk yaitu, yang pertama bentuk velogenik gejala yang
ditimbulkan mencakup gejala pernapasan ditandai dengan paru yang terbuka,
terdengar suara seperti tercekik, ngorok dan batuk. Kemudian pada gejala
pencernaan veses terlihat menjadi encer dan berwarna kehijauan, dan pada gejala
syaraf pada ayam berupa tremor otot, tortikolis, dan paralilis sayap dan kaki
bentuk ini adalah yang paling ganas dengan mortalitas mencapai 100% pada ayam
muda. Bentuk yang kedua adalah mesogenik gejala pernapasan terdapat pada
ayam muda dan penurunan produksi telur pada ayam dewasa. Bentuk yang ketiga

9
adalah lentogenik biasanya tidak disertai dengan gejala klinis pada ayam dewasa
(Alexander and Senne, 2008).
2.7.4.Diagnosa
Perubahan patologi anatomi yang patognomonis pada penyakit ND
ditandai dengan ptechie pada proventikulus, ventrikulus, usus, seka tonsil, trakea,
dan paru- paru (Kencana dan Kardena, 2011). Diagnosis sementara penyakit ND
berdasarkan atas pemeriksaan epidemiologi, gejala klinis, dan perubahan patologi
anatomi yang patognomonis. Peneguhan diagnosis berdasarkan atas hasil isolasi
dan identifikasi virus(Alexander,2001).
Isolasi virus ND dapat dilakukan secara in ovo menggunakan telur ayam
berembrio umur 9-12 hari specific pathogen free atau setidaknya bebas antibodi
terhadap virus ND. Sejauh ini inokulasi ditempatkan pada ruang alantois dianggap
yang paling peka, meskipun inokulasi pada ruang amnion maupun pada yolk sac
dapat juga dipertimbangkan (Alexander,1989).Alexander (2003), membedakan
virus ND sebagai patotipe velogenik, mesogenik, dan lentogenik berdasarkan
kemampuan menyebabkan kematian embrio ayam berturut-turut kurang dari 60
jam, antara 60 sampai 90 jam dan di atas 90 jam. Kemampuan menyebabkan
kematian embrio tersebut juga dapat dipakai untuk mengira patogenisitas virus
pada ayam. Pertumbuhan virus ND dalam cairan alantois diketahui dengan
melihat kemampuan hemaglutinasi eritrosit.
Metode diagnosis penyakit ND yang umum digunakan adalah dengan
mengisolasi virus dari spesimen unggas yang terinfeksi pada telur ayam
berembrio (TAB) (OIE, 2009). Identifikasi secara serologi menggunakan serum
anti spesifik terahadap virus ND dengan uji hamaglutinasi inhibisi (HI)
(Alexander, 1989; Fenner, 1993).
2.7.5. Pengobatan dan Pencegahan
Pengobatan pada ternak yang terinfeksi virus tidak memberikan hasil yang
efektif. Pemberian antibiotika termasuk dosis tinggi juga tidak memberikan hasil
yang baik, maka tindakan pencegahan menjadi prioritas utama (Anonim, 2009).
Pencegahan penyakit virus yang efektif pada hewan adalah menjalankan program
manajemen yang ketat berupa program vaksinasi dan biosekuriti (Anonim, 2013).

10
 Vaksinasi dapat dilakukan sejak anak ayam berumur 1-4 hari melalui tetes
mata atau aerosol dengan menggunakan galur F atau B1. Vaksinasi berikutnya
menggunakan galur lentogenik seperti lasota yang dilakukan pada umur minggu
yang di ulangi setiap tiga bulan. Ayam yang selamat dari serangan virus ND,
tetapi masih meninggalkan gejala saraf hendaknya disingkirkan (dipotong) agar
tidak menularkan penyakit pada ayam lain (Soeharsono, 2005).

2.8. Kerangka Konsep

Newcastle Disease (ND) menyebabkan gangguan pada sistem pencernaan,
sistem pernafasan dan sitem saraf pada unggas penderita tergantung pada virulensi
yang ditimbulkan ( Alexander, 2001).
Virus ND galur virulen mempunyai kemampuan untuk menghambat
pertumbuhan sampai menimbulkan kematian embrio ayam, hal ini dapat
digunakan sebagai penilaian karakter virulensi virus ND. Pada bentuk valogenik,
menyebabkan kematian embrio ayam kurang dari 60 jam, contoh kasus adalah
isolat Salatiga. Virus bentuk mesogenik menyebabkan kematian embrio ayam
antara 60-90 jam, sedangkan bentuk lentogenik menyebabkan kematian embrio
ayam lebih dari 90 jam pasca inokulasi, seperti pada virus ND La Sota (Putra et
al.,2012; Alexander and Senne, 2008; NRC, 1997). Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui lesi yang ditimbulkan akibat infeksi virus strain virulen baik
gangguan pertumbuhan (berat badan) dan histopatologi organ otak, paru-paru,
usus dan bursa fabrisius pada embrio ayam.

BAB III
MATERI DAN METODE

3.1. Materi Penelitian

3.1.1. Sampel Penelitian
Jumlah sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah mengikuti.......

11
Rumus t(r-1)>15....check ref please
Sehingga jumlah TAB yang dipakai 20...

8 TAB (Telur Ayam Berembrio) yang masing – masing berumur 11 hari, TAB
yang dipakai dalam penelitian berasal dari TAB yang SPF (Spesific Pathogen
Free). Telur berembrio didapat dari Balai Besar Veteriner (BBVET) Denpasar,
Provinsi Bali.
3.1.2. Alat Penelitian
Alat yang digunakan antara lain: jarum, jarum suntik 1ml, jarum suntik
5ml, mikro pipet, plat mikro dengan dasar “U”, kapas, skapel, pinset, sarung
tangan, masker, pot yang telah diberikan label berjumlah 8 buah, timbangan
elektrik, pensil, senter, inkubator, objek glass dan cover glass, mikroskop optik,
tissue prosesor untuk pembuatan preparat, 1 set tempat pewarnaan HE, kamera
dan lemari pendingin.
3.1.3. Bahan Penelitian
Isolat Badung 2/AK/2014 (Adi,2015), TAB (Telur Ayam Berembrio),
eritrosit ayam konsentasi 5%, larutan antibiotik Penstrep (Penicilin dan
Streptomicin), larutan PBS (Phosphate Buffered Saline), cairan Neutral Buffer
Formalin 10% (NBF 10%), paraffin cair, alkohol 10%, alkohol 70%, alkohol
80%, alkohol 90%, alkohol 96 % dan alkohol absolut.

3.2. Rancangan Percobaan

Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap(RAL) post test-only group
control design dengan dua perlakuan dan 9 ulangan pada setiap perlakuan.
Perlakuan 1 adalah.....tab diinokulasi dengan.....virus isolate......
Perlakuan 2 tab diinokulasi dg pbs....
Percobaan mengunakan 18 TAB (Telur Ayam Berembrio) yang dibagi
kedalam 2 perlakuan. Kelompok I adalah kelompok kontrol terdiri dari 4 9 TAB
yang diinokulasi dengan PBS sedangkan kelompok II yang terdiri dari 4 9 TAB
adalah kelompok perlakuan yang diinokulasi dengan ND isolat Badung
2/AK/2014 (Adi, 2015).

12
3.3. Variable yang Diamati
Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah : Berat badan embrio
dan gambaran histopatologi organ otak, paru-paru, usus dan bursa fabrisius.
1. Variabel terikat : BB (berat badan)
2. Variabel bebas : Inokulasi ND
Inokulasi PBS
3. Variabel Kendali : TAB

3.4. Metode Penelitian

Pada penelitian ini digunakan 2 metode yaitu metode kuantitatif dan
metode kualitatif. Metode kuantitatif yaitu pengaruh variabel berat badan embrio
dalam gram. Metode kualitatif yaitu dengan membuat preparat histopatologi dari
organ otak, paru – paru, usus, dan bursa fabrisius, kemudian perubahan diskors
menjadi tidak ada perubahan (TAP), perubahan ringan (PR), perubahan sedang
(PS), dan parah (P).
3.4.1. Perlakuan
Dalam penelitian ini digunakan 18 TAB (Telur Ayam Berembrio) yang
berumur 11 hari. Kemudian TAB ini dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok
kontrol dan kelompok perlakuan, masing – masing kelompok ini terdiri atas 4 9
TAB. Pada kelompok kontrol diinokulasi dengan PBS sebanyak 0,2ml pada
masing – masing TAB, sedangkan pada kelompok perlakuan diinokulasi dengan
ND isolat Badung 2/AK/2014 sebanyak 0,2 ml pada masing masing TAB.
Kemudian kedelapan TAB tersebut diinkubasi selama 3 hari, di hari ketiga TAB
dipanen dan diambil cairan alantoisnya selanjutnya dilakukan pengujian HA/HI.
Setelah pengujian HA/HI dilakukan, masing – masing TAB dipecahkan
dan diambil embrionya untuk ditimbang dan diamati perubahan – perubahan yang
terjadi. Tahap selanjutnya embrio dinekropsi dan diambil beberapa organnya yaitu
otak, paru – paru, usus, dan bursa fabrisius dan dimasukan kedalam pot-pot yang
berisi BNF 10% untuk selanjutnya digunakan untuk pembuatan preparat histologi
dengan metode pewarnaan Hematoxylin – Eosin (HE).

13
3.4.2. Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 18 TAB ( Telur Ayam
Berembrio) yang berumur 11 hari. Kemudian TAB inokulasi dan dipanen cairan
alantoisnya langkah selanjutnya dilakukan pengujian HA/HI. TAB kemudian
dipecahkan dan embrionya diambil untuk ditimbang dan dilakukan nekropsi
sesuai prosedur. Organ yang diambil pada saat nekropsi adalah organ otak, organ
paru – paru, organ usus dan bursa fabrisius, organ – organ ini dimasukan kesalam
pot – pot berisi larutan NBF 10%.
3.4.3. Inokulasi TAB (Telur Ayam Berembrio) pada Ruang Alantois
(Allantoic Cavity)
Prosedur yang dilakukan sebagai berikut :
Telur ayam yang digunakan pada penelitian ini berusia 11 hari . cara
inokulasinya yaitu dengan melakukan pengamatan pada cangkang telur
terutama keadaan embrionya dengan teropong. Tandai daerah kantong
udara dengan pensil, sebelum di lubangi bersihkan daerah tersebut dengan
alkohol 70%. Selanjutnya buatlah lubang pada cangkang telur diatas garis
pembatas antara kantong udara dengan daerah embrio. Kemudian isolat
virus ND pathogenik dan PBS ditambah dengan larutan antibiotik penstrep,
biarkan pada suhu ruang selama 1-2 jam agar memberi waktu bagi
antibiotik untuk bereaksi terhadap bakteri. Berikutnya lakukan inokulasi
dengan cara menyuntik inokulum sebanyak 0,2 ml/butir telur. Setelahnya
tutup lubang pada cangkang telur dengan cairan paraffin dan berikan label
seperlunya, lalu telur diinkubasi dengan suhu 28oC selama 3 hari. Selama
proses inkubasi telur diamati setiap harinya.
Pada hari ketiga cairan alantois dipanen, keluarkan telur yang embrionya
telah mati dari inkubator pemeriksaan dilakukan dengaan cara memeriksa
keadaan pembuluh darah didalam telur. Kemudian masukan telur kedalam
lemari es selama beberapa jam. Selanjutnya buka dan potong cangkang
telur dengan gunting didaerah ruang alantois (allantoic cavity), isap cairan
allantois dengan pipet Pasteur atau pipet jenis lain dan ditambung dengan
tabung steril.

14
3.4.4. Pengujian Hemaglutinasi dan Hambatan Hemaglutinasi HA/HI
3.4.4.1. Prosedur yang dilakukan pada pengujian hemaglutinasi (HA) :
Isi setiap lubang pada pelat mikro masing masing dengan 0,025 ml
PBS dengan menggunakan penates mikro, kemudian tambahkan pada
lubang pertama dan lubang kedua suspensi antigen yang akan diuji dan
selanjutnya buat pengenceran seri kelipatan dua mulai dari lubang kedua
sampai lubang kesebelas dengan menggunakan pengencer mikro. Setelah
itu tambahkan 0,025 ml PBS kedalam tiap-tiap lubang, yaitu dari lubang 1-
12 dan selanjutnya aduk dengan pengocok mikro. Tambahkan kedalam
setiap lubang masing masing 0,05 ml suspensi eritrosit 1% dan ayak selama
30 detik. Langkah selanjutnya eram pada suhu kamar selama satu jam dan
dilakukan pengamatan setiap 15 menit reaksi aglutinasi eritrosit.
3.4.4.2. Prosedur yang Dilakukan pada pengujian Hambatan Hemaglutinasi
(HI)
Panaskan serum yang akan digunakan pada air penangas dengan suhu
56C selama 30 menit,bertujuan untuk menghilangkan faktor–faktor
penghambat yang tidak spesifik didalamnya. Masukan kedalam lobang titer
dari lobang 1 – 12 isi dengan 0,025 ml PBS. Selanjutnya isi lobang pertama
dan lobang kedua dengan serum dan selanjutnya dencerkan secara seri
kelipatan dua dari lobang kedua sampai lobang kesepuluh dengan
pengencer mikro. Kemudian tambahkan masing – masing 0,025 ml PBS
suspensi antigen 4 unit HA ke lubang 1 – 11 sedangkan lubang ke 12 hanya
diidi dengan 0.025 PBS. Kemudian ayak selama 30 detik dan eramkan pada
suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya tambahkan ke lobang 1 – 12
masing – masing 0.05 ml suspensi eritrosit 1 % lalu ayak kembali selama
30 detik. Langkah terakhir eram plat mikro pada suhu kamar selama 1 jam
dan dilanjutkan dengan pembacaan setiap 15 menit.
3.4.5. Pembuatan Preparat Histologi
Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut:
Setelah embrio ayam dinekropsi dan diambil jaringannya, janringan
tersebur kemudian diredalam kedalam netrak buffer formalin 10% kira –

15
 kira 15 – 20 x volume jaringan dan dibiarkan dalam suhu kamar selama 24
jam. Langkah selanjutnya jaringan dipotong dengan ukuran 1x1x1cm,
kemudian dimasukan dalam cassette jaringan. Setelah jaringan selesai
difiksasi dan dimasukan kedalam cassette, jaringan dipindahkan untuk
didehidrasi dengan menggunakan alcohol secara berturut – turut dengan
konsentrasi alkohol masing – masing 70%, 80%, 90%, jaringan diredam
pada setiap konsentasi alkohol selama 2 jam. Langkah selanjutnya adalah
clearing, yaitu proses yang dilakukan untuk mengeluarkan alcohol dari
jaringan dengan merendamkannya dalam xylene. Kemudian, keluarkan
jaringan dari cassette. Selanjutnya jaringan siap dimasukan ke dalam bok
paraffin. Setelah itu dilakukan embedding atau impregnasi dan blocking.
Organ ditanam pada blok yang telah disediakan kemudian disimpan dalam
lemari es selama 24 jam. Setelah itu organ dipotong (cutting) dengan
menggunakan mikrotom denga ketebalan 4-5 mikron. Proses selanjutnya
organ diwarnai dengan pewarnaan Harris – Hematoksilin – Eosin (sesuai
prosedur 3.4.4).
3.4.4. Pewarnaan Harris Hematoksilin- Eosin
Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut :
Preparat diparafinisasi dalam xylol selama 3x5 menit. Kemudian
didehidrasi dalam larutan alkohol 100% sebanyak 2 kali dengan durasi
masing masing 5 menit, bilas dengan aquades selama 1 menit. Lalu
diinkubasi dalam larutan Harris Hematoksilin selama 15 menit. Kemudian
dicelupkan naik turun dalam aquades selama 1 menit, selanjunya celup
dalam campuran asam alcohol secara cepat 5-7 celup. Cek diferensiasi
warna dibawah mikroskop, warna tidak boleh sampai pucat. Selanjutnya
dibilas dalam aquades selama 1 menit, dan dibilas kembali dengan aquades
selama 15 menit. Lalu dicelup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium
atau lithium karbonat hingga potongan berwarna biru cerah dan kemudian
cuci dalam air mengalir selama 15 menit. Kemudian diinkubasi dalam eosin
selama 2 menit. Selanjutnya didehidrasi dalam alcohol dengan konsentrasi
96%, 96%, 100%, dan 100%, masing masing selama 3 menit, lalu

16
diinkubasi dalam xylol selama 2x2 menit. Kemudian dilakukan proses
mountingyaitu penutupan preparat dengan cover glassdimana digunakan
permountdipakai sebagai perekat. Selanjutnya preparat histologi diamati
dari bawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan 400x per 5 lapang
pandang yang berbeda dari tiap preparat. Selanjutnya dilakukan pencatatan
terhadap perubahan mikroskopis yang ditemukan.

3.5 Variabel Yang Diperiksa

Berat badan (BB) masing-masing embrio ditimbang kemudian
dicatat,lalu dirata-ratakan antara kelompok yang diinokulasi ND dan
kelompok yang diinokulasi PBS.

3.6 Analisis Data

Analisis data berat badan embrio menggunakan uji T-Test tidak
berpasangan dilanjutkan dengan uji Wilcoxon atau dapat digunakan
alternatif lain yaitu uji Mann Whitney.Sedangkan gambaran histopatologi
disajikan secara deskriptif.

3.7 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Virologi dan
Laboratorium Patologi Balai Besar Veteriner Denpasar, Bali. Penelitian
ini akan dilaksanakan bulan ……………….

17