Besi Dalam Bubuk Mikronutrien Meningkatkan Microbiota Usus Yang

Tidak Diinginkan Bagi Bayi di Kenya

Abstrak: Suplemantasi zat besi memiliki efek merugikan terhadap kesehatan pada
bayi dapat melalui manipulasi microbiota usus. Penelitian sebelumnya di
pengaturan sumber daya yang rendah telah difokuskan terutama pada bayi anemia.
Penelitian ini menggunkan double blind randomize control trial untuk
membandingkan penambahan beberapa bubuk mikronutrien (Multiple
Micronutrient Powder = MMP) dengan zat besi dan tanpa zat besi. Bayi usia enam
bulan, non atau anemia ringan, terutama yang diberikan ASI bayi di Kenya di
daerah endemik malaria diberikan secara acak : (1) MNP mengandung 12,5 mg
zat besi (MNP + Fe, n = 13); (2) MNP tidak mengandung besi (MNP-Fe, n = 13);
atau (3) Placebo (kontrol, n = 7), 6-9 bulan. Tinja mikrobiota yang ditunjukkan
dari sisi urutan gen Rrna 16s bagian keluaran tertinggi. Penanda peradangan
dalam serum dan sampel tinja juga diukur. Pada awal, filum yang paling
melimpah adalah Proteobacteria (37,6% dari urutan rRNA). Proteobacterial genus
Escherichia adalah genus yang paling banyak di semua filum (30,1% dari urutan).
Pada akhir intervensi, jumlah relatif dari Escherichia menurun secara signifikan di
MNP-Fe (-16,05 ± 6,9%, p = 0,05) dan kontrol (-19,75 ± 4,5%, p = 0,01), tetapi
tidak di kelompok MNP + Fe (-6,23 ± 9%, p = 0,41). Genus yang paling banyak
kedua pada awal adalah Bifidobacterium (17,3%), jumlah relatif yang secara
signifikan menurun pada MNP + Fe (-6,38 ± 2,5%, p = 0,02) dan kontrol (-8,05 ±
1,46%, p = 0,01), tapi tidak di MNP-Fe (-4,27 ± 5%, p = 0,4445). Clostridium
meningkat di MNP-Fe hanya (1,9 ± 0,5%, p = 0,02). Tidak ada perbedaan
signifikan yang diamati pada penanda peradangan, kecuali untuk IL-8, yang
mengalami penurunan di kontrol. Penggunaan MNP selama tiga bulan pada bayi
non atau anemia ringan di Kenya berpotensi dapat mengubah microbiote usus.
Konsisten dengan penelitian sebelumnya, penambahan zat besi ke MNP dapat
mempengaruhi kolonisasi potensi mikroba yang bermanfaat dan menipiskan
penurunan patogen potensial.
Kata kunci: bayi; besi; microbiome; beberapa mikronutrien bubuk
1. Pendahuluan
Kekurangan zat besi (Iron deficiency) dan anemia defisiensi besi (ADB)
adalah salah satu kekurangan mikronutrien yang paling lazim di dunia [1].
Penambahan besi dalam bentuk bubuk mikronutrien oral (MNP) adalah strategi
korektif umum untuk mencegah ID, ADB, atau kekurangan terkait
mikronutrien lainnya, terutama dalam pengaturan sumber daya rendah [1,2].
Namun, suplementasi besi telah dikaitkan dengan peningkatan terjadinya efek
samping, seperti penyakit menular dan inflamasi, yang dapat menyebabkan
peningkatan mortalitas, terutama di daerah endemis malaria. Sebagai contoh,
uji coba yang dilakukan di Pemba, Zanzibar [3] menemukan bahwa
suplementasi besi (12,5 mg / hari) dikaitkan dengan lebih banyak kematian dan
rawat inap pada bayi dan anak-anak dibandingkan dengan kelompok plasebo.
Selain itu, uji coba baru-baru ini di Pakistan juga menunjukkan bahwa MNP +
Fe mengakibatkan peningkatan proporsi diare dan peningkatan kejadian diare
berdarah pada bayi yang usianya lebih tua dan balita [4].
Meskipun besi merupakan mikronutrien penting bagi pertumbuhan bayi
dan perkembangan saraf, juga merupakan nutrisi yang sangat diperlukan bagi
banyak bakteri patogen dalam usus, termasuk Salmonella spp., Shigella spp.,
dan patogen E. coli [5]. Besi tidak diserap dalam usus, biasanya disebabkan
oleh asupan zat besi yang berlebihan (penambahan suplemen), mendorong
pertumbuhan strain patogen dan berpotensi mengubah keseimbangan spesies
mikroba yang menghuni usus, dan mungkin dengan demikian menimbulkan
konsekuensi kesehatan jangka panjang. Namun, penelitian menilai microbiota
usus dalam kaitannya dengan suplementasi zat besi pada bayi sangat terbatas.
Sebuah studi sebelumnya dilakukan pada bayi muda (0-3 bulan) menemukan
bahwa bayi mengkonsumsi susu sapi yang diperkaya zat besi (5 mg / L)
memiliki jumlah yang lebih rendah dari bifidobacteria dan jumlah yang lebih
tinggi dari Escherichia coli, dibandingkan dengan bayi yang mengkonsumsi
susu sapi non-diperkaya atau ASI. Bifidobacteria adalah probiotik umum dan
sangat menyita besi. Strain tertentu pengikat besi tinggi bifidobacteria
menghambat pertumbuhan patogen besi tergantung, termasuk Salmonella
typhimurium (S. typhi) dan Escherichia coli O157: H45 [8]. Kelompok
penelitian kami melakukan studi makan terkontrol di AS bayi diberikan ASI
lebih tua dan menemukan penurunan lebih besar dari genus Bifidobacterium
dari waktu ke waktu pada bayi mengkonsumsi sereal yang diperkaya zat besi
dari usia 5-9 bulan [9]. Perubahan ini dari mikrobiota usus mendukung strain
patogen potensial kurang menguntungkan dan lebih, bisa langsung
mempengaruhi status kesehatan inang. Memang, pada bayi enam bulan, dengan
metode double-blind, acak, percobaan terkontrol di Cote d'Ivoire melaporkan
bahwa penambahan besi (20 mg / hari) tidak hanya menyebabkan profil usus
microbiome yang tidak menguntungkan, tetapi juga meningkatkan peradangan
usus pada anak-anak anemia di Afrika ( berusia 6-14 tahun) [10]. Selain itu, uji
coba baru-baru ini oleh Jaeggi et al. pada bayi di Kenya terutama bayi anemia
menerima 12,5 atau 2,5 mg / hari besi dalam bentuk MNP menemukan bahwa
suplementasi zat besi meningkat Escherichia / Shigella dan Clostridium disertai
dengan statusnya radang usus meningkat. Penelitian-penelitian ini, meskipun
terbatas dan heterogen dalam desain, lokasi dan kelompok usia, menyarankan
kebutuhan mendesak untuk lebih mengevaluasi efek dari suplementasi besi
pada microbiome usus, terutama selama masa bayi ketika mikrobiota awal
penjajahan berlangsung dan pada bayi non-anemia yang mungkin tidak perlu
suplemen zat besi dan, dengan demikian, lebih rentan terhadap efek negatif
dari besi.
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk menilai efek dari
pemberian zat besi dalam bentuk MNP pada microbiome usus dan status
peradangan pada bayi usia enam bulan, non atau anemia ringan pada bayi
Kenya. Hipotesis utama kami adalah bahwa suplementasi zat besi akan
meningkatkan jumlah bakteri patogen dan mengurangi jumlah bakteri
menguntungkan lebih intervensi tiga bulan. Penanda peradangan usus diduga
juga meningkat seiring waktu.
2. Bahan dan Metode
2.1. Penelitian Desain
Penelitian ini dilakukan di pedesaan Kenya, sekitar 150 km dari
Eldoret. Di antara desa-desa di mana subjek direkrut, mayoritas
penduduk hidup di bawah garis kemiskinan yang ditetapkan Bank Dunia,
dan prevalensi malaria dianggap endemik. Rincian lingkungan
diterbitkan sebelumnya [2]. Subyek penelitian direkrut dari registri
kelahiran Jaringan Global untuk Kesehatan Perempuan dan Anak [12].
Administrator registry menyediakan daftar 45 bayi berturut-turut pada
usia ini dari register mereka berdasarkan kriteria studi inklusi (lihat di
bawah). Untuk tujuan mengidentifikasi peserta, staf lapangan studi dan
administrator registry mengunjungi rumah masing-masing bayi sebelum
pendaftaran [2].
Penelitian ini menggunakan double blind randomized controlled
trial dengan dua tujuan utama: (1) Untuk mengidentifikasi efek dari besi
pada usus microbiota dan peradangan status tuan rumah di non atau bayi
ringan-anemia; dan (2) Untuk menentukan efek dari besi di MNP pada
penyerapan seng dan ukuran ditukar kolam renang seng, sebagai
indikator status seng, setelah tiga bulan di rumah fortifikasi dengan MNP
harian dalam diet berbasis jagung [2]. Singkatnya, mata pelajaran (15 per
kelompok) secara acak salah satu dari tiga kelompok MNP: (1) The MNP
+ Fe kelompok: MNP dengan besi (12,5 mg / hari) dan seng (5 mg /
hari); (2) MNP-Fe kelompok: yang MNP yang sama, kecuali ada besi;
(3) kelompok kontrol: plasebo tanpa mikronutrien. Intervensi dimulai
pada usia 6 bulan dan berakhir pada usia sembilan bulan. Penelitian ini
telah disetujui oleh Colorado Beberapa Institutional Review Board dan
Moi Universitas Kelembagaan Dewan Ulasan. Potensi keluarga
dikunjungi dan dididik tentang studi yang diusulkan sebelum kunjungan
pendaftaran dan studi perawat atau lab teknologi diperoleh persetujuan
tertulis dari orang tua / wali ditambah saksi setelah konfirmasi bahwa
anak memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Empat puluh lima potongan
kertas dengan huruf ditandai A, B, atau C untuk mewakili tiga kelompok
 penelitian digulung menjadi bola dan ditempatkan dalam wadah plastik.
Potongan-potongan dicampur secara menyeluruh melalui gemetar wadah.
Orang yang mandiri kemudian mengambil potongan satu per satu dari
wadah. Unik Jumlah huruf menjadi subjek dan kelompok tugas untuk
setiap individu [2]. Studi ini telah terdaftar di ClinicalTrials.gov
NCT02101723. Temuan di sini adalah dari subyek (n = 33 Total) yang
memiliki sampel tinja dikumpulkan pada kedua titik waktu.
2.2. Bubuk Mikronutrien dan Diet
Komposisi Mikronutrien dari dua MNPs intervensi dan plasebo
yang tercantum dalam Tabel 1. Besi adalah dalam bentuk fumarat besi
dan mikroenkapsulasi. Plasebo itu terbuat dari bubuk tidak aktif. Analisis
laboratorium di Universitas Colorado (UC) memverifikasi keakuratan
seng dan besi isi dari produk. Semua sachet MNP adalah diidentifikasi
oleh produsen (Hexagon Nutrisi Pvt. Ltd, Mumbai, India) untuk kedua
subyek penelitian dan staf lapangan studi. Selama intervensi, tujuh sachet
MNP disediakan di kunjungan mingguan rumah untuk ibu untuk minggu
berikutnya, ditambah tiga tambahan dalam kasus keterlambatan dalam
kunjungan berikutnya. Ibu menerima instruksi untuk memberikan satu
sachet setiap hari dan untuk menambahkan seluruh isi sachet untuk satu
kali makan. Diet bayi secara langsung diamati selama persidangan
sebagai bagian dari studi penyerapan zinc (bertujuan 1 dari uji coba ini).
Makanan yang terutama bubur berbasis jagung, ugali (jagung), dan
sayuran [2]. Selama kunjungan rumah mingguan, subjek ditindak lanjuti
oleh perawat atau petugas klinis untuk memeriksa status kesehatan
umum, memastikan kepatuhan, dan menjawab pertanyaan yang ibu
miliki [2]. Untuk memantau kepatuhan, perawat atau petugas klinis
mengumpulkan paket sachet kosong dan mereka yang tidak dikonsumsi
(jika ada).
Tabel 1. Isi Micronutrient dari MNP 1 per sachet.
MNP+Fe MNP-Fe Placebo
Iron 12.5 mg 0 0 Iron 12.5 mg 0 0
Zinc 5 mg 5 mg 0
Vitamin A 300 ug 300 ug 0
 Vitamin C 30 mg 30 mg 0
Folic acid 160 ug 160 ug 0

2.3. Pengumpulan Sampel

Untuk tujuan analisis ini, sampel tinja dikumpulkan pada awal
(enam bulan) dan akhir intervensi (sembilan bulan). Personil penelitian
dari UC melatih peneliti lapangan lokal di prosedur pengumpulan tinja.
Setiap sampel tinja dikumpulkan dari popok kain dilengkapi dengan
liners biodegradable, yang secara efektif dikumpulkan bangku, tetapi
memungkinkan lewatnya urin [9]; dua sampel tinja duplikat ditempatkan
di terpisah tabung koleksi steril (Sarstedt, Newton, MA, USA)
mengandung RNAlater (ThermoFisher Ilmiah, Waltham, MA, USA).
Para pekerja lapangan dibantu ibu-ibu dengan koleksi tinja,
menggunakan sarung tangan kelas klinis dan penyeka kotoran steril
untuk menghindari kontaminasi mikroba. Seorang perawat studi pada
awal (enam bulan) dan akhir intervensi (sembilan bulan) juga
mengumpulkan sampel darah menggunakan Vacutainers heparin dan
jarum kupu-kupu. Tabung darah diinkubasi tanpa gemetar pada suhu
kamar selama 45 menit sebelum disentrifugasi untuk pemisahan serum.
Kedua sampel tinja dan darah ditempatkan di atas es, dan dipertahankan
di suhu 20 dan diinapkan dirumah sakit setempat sampai hai
berikutnya pa suhu -70 .
2.4. Pengukuran Antropometri
Pengukuran antropometri, termasuk berat dan panjang, diukur pada
awal (enam bulan) dan akhir intervensi (sembila bulan) dalam rangkap
tiga oleh staf penelitian. Rincian dari berat dan panjang pengukuran
diterbitkan di tempat lain [2].
2.5. Analisis Sampel tinja
2.5.1 16 S amplikon Perpustakaan Konstruksi
Microbiota sequencing dilakukan di Research Consortium
Microbiome di University of Colorado Denver. Jumlah masyarakat
DNA genomik dibuat dari ~ 50 mg tinja menggunakan ultraclean
tinja DNA Isolasi Kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA).
Profil bakteri ditentukan dengan luas jangkauan amplifikasi dan
analisis urutan gen 16S rRNA mengikuti metode kami sebelumnya
dijelaskan [13,14]. Singkatnya, amplikon yang dihasilkan
menggunakan primer yang menargetkan sekitar ~ 270 pasangan
basa dari V4 wilayah variabel dari gen 16S rRNA (primer 534F:
GTGCCAGCMGCCGCGGTAA dan 805R:
GACTACCAGGGTATCTAAT) [15,16]. Reaksi berantai
polimerase (PCR) produk yang dinormalisasi menggunakan
SequalPrepTM kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), dikumpulkan,
liofilisasi, dimurnikan dan terkonsentrasi menggunakan DNA
Bersih dan Concentrator Kit (Zymo, Irvine, CA, USA). Amplikon
menggenang dikuantifikasi menggunakan qubit Fluorometer 2.0
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kolam renang terdilusi menjadi
4 nM dan terdenaturasi dengan 0,2 N NaOH pada suhu kamar.
DNA terdenaturasi terdilusi menjadi 15 pM dan dibubuhi 25% dari
phix (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) kontrol DNA sebelum
memuat sequencer. Illumina dipasangkan-end sequencing
dilakukan pada platform Illumina Miseq (Illumina, Inc., San Diego,
CA, USA) dengan versi v2.4 dari Control Software MiSeq,
menggunakan 500 siklus versi 2 reagen kit (Illumina, Inc., San
Diego, CA, USA).
Illumina MiSeq dipasangkan hinga berbunyi yang
disesuaikan dengan referensi manusia genom hg19 dengan bowtie2
dan urutan pencocokan dibuang [17,18]. Seperti dijelaskan
sebelumnya, non-manusia urutan dipasangkan-end yang tersisa
diurutkan menurut sampel melalui barcode di dipadankan membaca
dengan script python [14]. Dipadankan diurutkan berbunyi
berkumpul menggunakan phrap [19,20]. Pasangan yang tidak
merakit dibuang. Dirakit urut ujung dipangkas atas jendela
bergerak dari lima nukleotida sampai kualitas rata-rata memenuhi
atau melampaui 20. urutan pakai dengan lebih dari satu ambiguitas,
atau lebih pendek dari 350 nt, dibuang. Potensi chimera
 diidentifikasi dengan Uchime (usearch6.0.203_i86linux32) [21]
menggunakan Schloss [22] referensi urutan Silva telah dihapus dari
analisis selanjutnya. Urutan Rakitan yang selaras dan
diklasifikasikan dengan SINA (1.3.0-r23838) [23] menggunakan
418.497 urutan bakteri di Silva 115NR99 [24] sebagai referensi
dikonfigurasi untuk menghasilkan taksonomi Silva. Unit taksonomi
operasional (Otus) yang diproduksi dengan cara mengelompokkan
urutan dengan tugas taksonomi identik. Proses ini menghasilkan
12.309.588 urutan 150 sampel (median: 82.064 urutan / sampel,
ukuran sampel minimum: 3619; maksimum ukuran sampel:
168.818) eksklusif kontrol negatif yang mendekati nol. Barang
median skor cakupan adalah ≥99% pada titik penghalusan dari
15.000. Paket perangkat lunak Explicet (v2.10.5,
www.explicet.org) [25] digunakan untuk pengelolaan data, display,
dan analisis (nilai dijernihkan untuk cakupan median Baik itu).
2.5.2 Analisis tinja Calprotectin
Sebuah uji PCR kuantitatif (qPCR) ekspresi gen digunakan
untuk mengukur ekspresi gen calprotectin, penanda digunakan
untuk mendeteksi peradangan pada usus. Tingkat protein
Calprotectin tidak terukur karena sampel direndam dalam
RNAlater. Semua reaksi dilakukan dalam piring 96-baik
menggunakan instrumen Biorad CFX96. Reaksi PCR berisi 10 mL
Dynamo ColorFlash penyelidikan qPCR mastermix (ThermoFisher
Ilmiah, Waltham, MA USA), 7 uL steril air nuklease bebas
(ThermoFisher Ilmiah, Waltham, MA, USA), 1 uL primer S100A8,
dan 2 uL sampel Template. Primer berikut digunakan:
Gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase (GAPDH)
Hs.PT.51.22847819.gs dan S100A8 Hs.PT.51.19654111.gs.
Normalisasi internal yang dilakukan dengan menggunakan gen
GAPDH rumah tangga. Lipat perubahan ekspresi S100A8 relatif
GAPDH dihitung dengan menggunakan metode AACt [26].
2.6. Analisis Sampel darah
Penanda inflamasi sistemik, termasuk α glikoprotein 1-asam
(AGP), protein C-reaktif (CRP), TNF-α, IL-6 dan IL-8 dianalisis dalam
serum oleh R & D Sistem Quantikine Enzyme-linked Immunosorbant
Assay (ELISA) di Laboratorium Nutrisi Anak di University of Colorado
Denver. Besi status subjek juga diukur dan sudah dilaporkan [2].
2.7. Analisis statistik
Perhitungan ukuran sampel didasarkan pada hipotesis utama bahwa
suplementasi zat besi akan meningkatkan jumlah bakteri patogen dan
mengurangi jumlah bakteri yang lebih menguntungkan pada intervensi
tiga bulan. Kami memperkirakan ukuran sampel 10-15 per kelompok
untuk mendeteksi perbedaan 10% dari jumlah relatif dari organisme
generik antara kelompok, mempertimbangkan SD dari 15% dengan alpha
= 0,05. Ukuran sampel ini memberikan kekuatan 71-89%.
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SAS (versi 9.3;
SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Berarti kelompok disajikan sebagai
mean ± SD. Parameter dasar dibandingkan dengan menggunakan
Analisis satu arah Variance (ANOVA) dan beberapa perbandingan
Tukey sebagai analisis post-hoc bila diperlukan. Gender dimasukkan
sebagai kovarian dalam analisis berikutnya dan hasil tetap tidak
terpengaruh. Tindakan berulang ANOVA digunakan untuk mengevaluasi
efek utama dari waktu, kelompok, dan interaksi mereka pada variabel
dependen (yaitu, microbiome dan peradangan penanda). Tukey beberapa
tes perbandingan digunakan untuk membandingkan nilai antara
kelompok sebagai analisis post hoc (menyesuaikan untuk beberapa
kelompok). T-test digunakan untuk membandingkan perubahan dari
waktu ke waktu dalam setiap kelompok. Jumlah relatif (%) dari data
microbiota di tingkat filum dan genus dianalisis. Empat filum paling
banyak, Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, dan Proteobacteria,
dianalisis. Pada tingkat genus, tiga genera Clostidium bunga, Escherichia
/ Shigella, dan Bifidobacterium dianalisis berdasarkan penelitian
sebelumnya oleh Jaeggi et al., dari desain yang sebanding. Beberapa
 perbandingan yang disesuaikan berdasarkan jumlah model yang diuji
(tiga strain microbiome dan tujuh penanda peradangan). Dengan
demikian, p-value disesuaikan kurang dari 0.005 dianggap signifikan
setelah Bonferroni koreksi (0,05 / 10 tes = 0,005). p-value antara 0,005
dan 0,05 juga dilaporkan dan dianggap nominal yang signifikan.

3. Hasil
3.1. Karakteristik subjek
Sebuah subkelompok dari 33 subyek yang menyelesaikan
pengumpulan sampel tinja pada kedua titik waktu dimasukkan dalam
analisis ini: MNP + Fe: n = 13; MNP-Fe: n = 13; kontrol: n = 7.
Perbedaan ukuran sampel antara kelompok tampaknya tidak terkait
dengan intervensi: (1) intervensi adalah double-blind; (2) beberapa
sampel tinja yang hilang label selama pengiriman atau kuantitas tidak
memadai. Demografi subyek dan data antropometri diringkas dalam
Tabel 2. Secara singkat, tidak ada perbedaan dalam pengukuran
demografi atau antropometri antara kelompok-kelompok. Kedua berat
dan panjang badan meningkat dari waktu ke waktu seperti yang
diharapkan di antara semua mata pelajaran (data tidak ditampilkan) tanpa
perbedaan kelompok. Tidak ada kasus malaria diidentifikasi dalam mata
pelajaran selama periode penelitian. Pemantauan kepatuhan untuk MNP
ditugaskan ditunjukkan> konsumsi 90% di antara para peserta [2].
Tabel 2. Demografi dan antropometri pada usia enam bulan
MNP+Fe (n = 15) MNP-Fe (n = 15) Control (n = 15)
Male 5 (33%) 7 (47%) 10 (67%)
Female 10 (67%) 8 (53%) 5 (33%)
Weight, kg 7.25 0.25 7.55 0.27 7.49 0.22
-0.39 0.25 -0.16 0.31 0.21 0.25
Length, cm 65.0 0.7 66.5 0.9 64.6 0.8
-0.68 0.27 -0.19 0.40 -1.01 0.39
Rata-rata ± SEM; ada perbedaan antara kelompok parameter
apapun; WAZ: berat badan-untuk-usia skor Z; LAZ: panjang-untuk-usia
 Z skor.
Tidak ada perbedaan antara kelompok-kelompok untuk
hemoglobin, feritin, transferin reseptor larut, seng plasma, atau ditukar
seng poo (EZP) pada awal. Setelah intervensi, konsentrasi seng plasma
menurun tanpa perbedaan antara kelompok. Serum ferritin tidak berubah
dari waktu ke waktu atau antar kelompok, tetapi reseptor transferin larut
menunjukkan peningkatan yang signifikan, dengan tren peningkatan
yang lebih besar pada kelompok kontrol [2].
3.2. Perubahan microbiota seiring perkembangan waktu
Indeks baik itu dari masing-masing urutan enam dan sembilan
bulan untuk tiga kelompok yang semua lebih tinggi dari 99%,
menunjukkan bahwa sebagian besar keanekaragaman hayati ditangkap di
masing-masing perpustakaan (subjek), dan bahwa kedalaman sequencing
sudah cukup untuk mewakili keanekaragaman hayati di spesimen. Indeks
ekologi kekayaan (Schao1) meningkat lembur dari 6-9 bulan (p <0,0001)
namun tidak ada perbedaan antara kelompok yang dicatat. Peningkatan
keanekaragaman berhubungan dengan peningkatan subyek dalam
berbagai makanan. Angka-angka ini berada dalam kisaran yang sama
sebelumnya kami melaporkan pada bayi ASI di Denver, CO, USA [9].
Empat filum yang paling melimpah pada awal adalah
Actinobacteria (20 ± 13% kelimpahan relatif), Bacteroidetes (17 ± 19%
RA), Firmicutes (24 ± 13% RA), dan Proteobacteria (38 ± 21% RA),
dimana sisa filum menyumbang kurang dari 1% dari urutan 16S rRNA.
Tidak ada pengaruh yang signifikan dari kelompok (p = 0,1) di tingkat
filum tapi efek yang signifikan nominal waktu untuk Actinobacteria (p =
0,02), Bacteroidetes (p = 0,009) dan Proteobacteria (p = 0,008). Gambar
1 menunjukkan rincian dari perubahan jumlah relatif masing-masing
kelompok. Ketika mengkonsumsi diet biasa mereka ditambah plasebo
MNP di sana bulan (kontrol), kelimpahan relatif Bacteroidetes (p = 0,04)
meningkat dan Proteobacteria (p = 0,02) menurun. Ada juga penurunan
batas dari Actinobacteria di pengendalian (p = 0,07). Jumlah
Actinobacteria juga menurun pada MNP + Fe (p = 0,02).
 Gambar 1. Perubahan relatif di tingkat filum.

Pada tingkat genus pada awal, Escherichia / Shigella, (30,1 ± 23%)

dan Bifidobacterium (17,3 ± 11,1%) adalah genera yang paling
berlimpah pertama dan kedua di antara semua kelompok, sementara
Clostridium (1,4 ± 3,5%) adalah kedelapan yang paling berlimpah marga.
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, kelimpahan relatif dari Escherichia
/ Shigella menurun secara signifikan dari waktu ke waktu di MNP-Fe (-
16,05 ± 6,9%, p = 0,05) dan kontrol (-19,75 ± 4,5%, p = 0,01) kelompok,
tetapi tidak dalam kelompok MNP + Fe (-6,0 ± 9%, p = 0,41).
Kelimpahan relatif dari Bifidobacterium menurun di MNP + Fe (-6,38 ±
2,5%, p = 0,02) dan kontrol (-8,05 ± 1,46%, p = 0,01), tetapi tidak pada
kelompok MNP-Fe (-4,3 ± 5%, p = 0.44). Selain itu, Clostridium
meningkat kelimpahan di MNP-Fe hanya (1,94 ± 2%, p = 0,007). Tidak
ada perbedaan signifikan yang ditemukan untuk rasio Escherichia /
Shigella ke Bifidobacterium atau Escherichia / Shigella ke Clostridium
antara kelompok (log dari kelimpahan).
 Gambar 2. Perubahan relatif pada tingkat genus.

3.3. Penanda Peradangan

AGP dan CRP konsentrasi dilaporkan sebelumnya [2]. Tabel 3
merangkum serum penanda inflamasi AGP, CRP, TNF-α, IL-6, IL-8, dan
calprotectin tinja di enam dan sembilan bulan. Secara singkat, tidak ada
penanda peradangan berubah dari waktu ke waktu atau antar kelompok,
kecuali untuk IL-8, yang menurun pada kontrol (kelompok-by-time
interaksi p = 0,02). CRP di atas batas atas kisaran normal untuk semua
kelompok pada kedua titik waktu.
Tabel 3. Rata-rata (± SEM) penanda peradangan pada enam dan
sembilan bulan usia
Biomarker MNP+Fe MNP-Fe Control
s (Normal SixMont Nine SixMont Nine SixMont Nine
Range) s s s
AGP 87 14 91 19 81 17 81 12 82 15 80 13
(mg/dL) (10) (10) (7) (7) (9) (9)
(50–120)
CRP 7.7 4.5 6.2 3.4 11.5 5.9 8.3 4.2(8 5.3 1.8 6.2
(mg/L) (10) (10) (8) ) (8) 1.7
(<3) (9)
IL-6 7.5 4.0 5.1 2.4(1 8.8 3.0 3.2 0.9 5.8 2.4 5.0 1.
(pg/mL) (12) 5) (14) (14) (10) 6 (11)
(<39)
IL-8 39 11 30 4 (14) 40 20 32 8 51 13 22 3
(pg/mL) 2 (12) (14) (14) (10) (1)
(<81.8)
TNF-α 8.7 _ 1.1 8.6 _ 0.8 12.2 _ 8.3 _ 1.0 9.1 _ 1.3 7.3 _
(pg/mL) (14) (15) 3.0 (15) (10) 1.1
(<3.3) (11)
Fecal 1.6 _ 0.6 2.1 _ 0.6 3.4 _ 0.8 2.5 _ 0.8 4.3 _ 1.4 2.3 _
calprotecti (10) (11) (12) (8) (6) 1.1 (6)
n (fold
change)
Rata-rata ± SEM (n); 2 Penurunan di kontrol (kelompok-by-time
interaksi p = 0,02).

4. Pembahasan
Pada penelitian ini menunjukkan bahwa 6-9 bulan bayi di Afrika yang
umumnya tidak anemia, dan mendapat penambahan zat besi yang mengandung
MNP dapat mengubah mikrobiota usus mendukung patogen potensial,
dibandingkan dengan bayi yang menerima MNP tanpa besi atau tidak ada
MNP sama sekali. Jaeggi et al., melakukan double-blind randomise control
trial pada bayi Kenya dengan desain sebanding dengan penelitian kami, namun
dengan ukuran sampel yang lebih besar. Dalam studi Jaeggi et al. [11], pada
bayi enam bulan di Kenya, yang memiliki tingkat IDA tinggi (64%), secara
acak menerima MNP dengan besi (12,5 atau 2,5 mg / hari) atau MNP tanpa
besi selama empat bulan. Hasil penelitian mereka menunjukkan bahwa
suplementasi zat besi meningkatkan Escherichia / Shigella dan Clostridium
disertai dengan peningkatan status peradangan usus[11]. MNP FE 12,5 mg /
hari yang digunakan memiliki komposisi yang sama dengan penelitian kami,
kecuali untuk asam folat lebih rendah. Namun, penelitian yang terbatas telah
menunjukkan bahwa asam folat memiliki dampak minimal pada mikrobiota
usus [27]. MNP FE 2,5 mg / hari dalam penelitian Jaeggi et al. [11] juga berisi
11 mikronutrien lain dan mengakibatkan dampak yang sedikit berbeda pada
microbiota, terutama untuk Escherichia / Shigella. Dampak diferensial ini bisa
disebabkan kuantitas yang berbeda dari besi atau mikronutrien lain dalam mnp
fe 2,5 mg / hari, tapi ini tidak dapat dibedakan dengan desain studi [11]. Studi
lain oleh kelompok yang sama menunjukkan bahwa pada anak-anak di Afrika
yang usianya lebih tua, penambahan zat besi 20 mg / hari mengakibatkan
peningkatan yang signifikan dalam jumlah enterobacteria, penurunan
laktobasilus, dan peningkatan yang signifikan dalam calprotectin tinja. Temuan
dari intervensi pemberian makanan tambahan pada bayi yang lebih tua, dengan
ukuran sampel yang lebih besar dan intervensi lagi, menyarankan bahwa sereal
yang diperkaya zat besi dikaitkan dengan inflamasi sistemik yang lebih tinggi
dan gangguan pertumbuhan linear; efek pada mikrobiota usus tidak dilaporkan
[28]. Pada penelitian-penelitian sebelumnya, meskipun berbeda dari penelitian
kami, dosis zat besi, dan usia subyek, semua menunjukkan potensi alam
patogen meningkatkan besi meningkat pada usus manusia di pengaturan
sumber daya rendah.
Keempat filum yang dominan diamati dalam penelitian ini sebanding
dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh kelompok kami dan lain-
lain [30]. Namun, kami menemukan jumlah lebih tinggi dari Proteobacteria,
yaitu 38% dibandingkan dengan penelitian lain yang melaporkan jumlah khas
kurang dari 10%. Meskipun membandingkan hasil penelitian microbiota dapat
menantang karena perbedaan metodologi, hasil ini menunjukkan kemungkinan
bahwa bayi di Kenya pada usia enam bulan dijajah oleh microbiota yang
berpotensi lebih patogen dari yang diamati di lingkungan lain. Selain
lingkungan, diet juga memainkan peran penting dalam modulasi microbiota
tersebut. Misalnya untuk, anak-anak dari Eropa dan Afrika pedesaan telah
dilaporkan untuk menampilkan komunitas mikroba jelas berbeda. Perbedaan
yang paling mendalam diamati pada Bacteroidetes, khususnya genus
Prevotella, yang dikenal untuk polisakarida hidrolisis. Temuan ini konsisten
dengan karakteristik diet kaya serat yang banyak pada anak-anak Afrika di
pedesaan, dibandingkan dengan anak-anak dari Eropa. Dalam penelitian kami,
jumlah relatif Bacteroidetes juga meningkat dari waktu ke waktu, bersamaan
dengan meningkatnya pemberian makanan tambahan dan berbagai makanan,
terutama asupan makanan berbasis jagung.
 Tiga genera Bifidobacterium, Escherichia / Shigella, dan Clostridium
dipilih untuk analisis berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Jaeggi et al. dari
desain yang sebanding. Genus Bifidobacterium biasanya dominan pada bayi
dan merupakan salah satu strain yang bermanfaat sebagai “penghalang” yang
mencegah kolonisasi patogen dan adhesi ke sel epitel host [31]. Jumlah
Bifidobacterium biasanya menurun seiring dengan usia. Dalam penelitian
kami, kelimpahan Bifidobacterium pada bayi enam bulan adalah rata-rata
17,3%, yang jauh lebih rendah dari apa yang dilaporkan Jaeggi et al. [11], yaitu
63%. Perbedaan ini bisa disebabkan gen primer 16S rRNA Bias [32], meskipun
primer yang digunakan dalam penelitian ini dirancang untuk meminimalkan
bias dalam memperkuat bifidobacteria [33]. Selain itu, temuan kami berada di
kisaran penelitian sebelumnya, termasuk studi kami sendiri [9,35]. Dalam
penelitian kami, Bifidobacterium menurun dari waktu ke waktu di kedua MNP
+ Fe dan kontrol, tapi tidak MNP-Fe. Penurunan kontrol diharapkan karena
Bifidobacterium biasanya menurun jumlahnya berdasarkan usia [31]. Selain
itu, penurunan MNP + Fe konsisten dengan penelitian sebelumnya oleh Jaeggi
et al. yang juga menunjukkan penurunan jumlah Bifidobacterium dari usia 6-10
bulan dengan suplementasi besi harian yang sama. Namun, penelitian oleh
Jaeggi dkk. tidak termasuk kelompok kontrol untuk mencerminkan perubahan
alami kolonisasi mikroba dengan waktu. Dengan demikian, setidaknya untuk
Bifidobacterium, penelitian kami menunjukkan bahwa dimasukkannya 12,5 mg
zat besi dalam MNP tidak memiliki efek negatif aditif untuk tuan rumah.
Meskipun demikian, dalam kelompok MNP-Fe, Bifidobacterium tidak
menurun secara signifikan dari waktu ke waktu, menunjukkan efek
menguntungkan yang potensial dari MNP tanpa zat besi, pada pelemahan
penurunan alami Bifidobacterium pada bayi-bayi ini. Hasil kami juga
menunjukkan bahwa genus Escherichia / Shigella menurun secara melimpah di
MNP-Fe dan kontrol, tetapi bukan MNP + Fe. Ini adalah temuan yang menarik
karena, tidak seperti penelitian oleh Jaeggi et al., suplementasi zat besi dalam
penelitian kami tidak mendorong pertumbuhan Escherichia / Shigella, tetapi
mencegah penurunan seiring waktu, seperti yang diamati pada MNP-Fe dan
kontrol. Selanjutnya, jumlah genus Clostridium tidak berubah pada MNP + Fe
dan control, tetapi hanya MNP-Fe. Secara keseluruhan, temuan kami
menunjukkan bahwa pada tingkat genus, suplementasi besi standar (12,5 mg /
hari) dalam bentuk MNP mempengaruhi mikrobioma usus berpotensi
merugikan dengan menghambat penurunan alami Escherichia / Shigella pada
bayi. Sementara itu, MNP tanpa zat besi memiliki efek campuran pada
microbiota dengan menghambat penurunan Bifidobacterium sambil
meningkatkan pertumbuhan Clostridium. Tanpa penentuan tingkat sub-filum,
tidak mungkin untuk memprediksi kemungkinan dampak dari yang terakhir.
Dalam penelitian kami sebelumnya di Denver, asupan zat besi yang tinggi
dikaitkan dengan kelompok Clostridium yang lebih rendah, yang termasuk
spesies clostridial yang memproduksi butirat dan imunomodulator [9].
Meskipun penelitian kami menemukan bahwa suplementasi zat besi
menurunkan strain yang berpotensi menguntungkan (misalnya,
Bifidobacterium spp.) Dan mengurangi penurunan temporal strain patogen
(misalnya, Escherichia spp.), Tidak ada pengaruh yang signifikan secara
statistik pada status peradangan yang ditemukan. Dalam kontrol, IL-8 menurun
seiring waktu, tetapi MNP + Fe dan MNP-Fe tidak meningkatkan penanda
peradangan secara signifikan, termasuk calprotektin fecal, yang mana studi
sebelumnya ditemukan meningkat dengan suplementasi besi [10,11].
Kurangnya perubahan yang signifikan ini bisa disebabkan, oleh ukuran sampel
yang relatif kecil. Selain itu, bayi-bayi ini sudah memiliki beban peradangan
yang tinggi pada awal, yang dapat mengurangi efek intervensi. Selain itu,
karena sifat penyimpanan sampel, fecal calprotectin dalam penelitian ini diukur
sebagai ekspresi gen, yang tidak selalu mencerminkan kadar protein. Namun,
tidak seperti penelitian sebelumnya, kami tidak menemukan peningkatan strain
patogenik (Escherichia / Shigella, Clostridium) dengan suplementasi zat besi,
yang juga dapat berkontribusi pada status peradangan tidak berubah pada bayi
ini.
Kekuatan penelitian kami termasuk penargetan bayi non-anemia di
pedesaan Kenya, kelompok yang mungkin tidak membutuhkan suplementasi
besi dan dengan demikian lebih rentan terhadap efek buruk dari suplementasi
zat besi, terutama dalam pengaturan beban inflamasi yang tinggi dan malaria
endemik [3]. Selain itu, kami memasukkan kelompok kontrol untuk
menunjukkan perubahan alami dari mikrobiota usus pada bayi ini. Ada juga
sejumlah keterbatasan uji coba ini. Pertama, ukuran sampel kami jauh lebih
kecil dibandingkan dengan Jaeggi et al. [11]. Studi kami dimulai pada tahun
2011 dan kekuatan dan ukuran sampel dihitung berdasarkan penelitian yang
sangat terbatas yang tersedia pada waktu itu. Data yang menunjukkan
variabilitas substansial telah muncul sejak saat itu dan penelitian kami
tampaknya kurang bertenaga. Meskipun demikian, temuan kami berkontribusi
pada topik penelitian penting ini karena populasi yang kami targetkan dan
dimasukkannya kelompok kontrol. Keterbatasan lain, umum untuk penelitian
lain, adalah kurangnya tindak lanjut jangka panjang. Meskipun jumlah relatif
dari beberapa patogen potensial tetap dengan suplementasi zat besi, tidak jelas
bagaimana ini akan mempengaruhi status kesehatan bayi dalam jangka
panjang, misalnya, dalam kaitannya dengan pertumbuhan [28]. Terakhir,
beberapa bayi (dalam semua kelompok) sudah mulai makanan pendamping
pada awal, tetapi makanan itu kemungkinan hampir sama dengan yang
dikonsumsi selama periode intervensi. Dengan melaporkan perubahan dari
waktu ke waktu, kita dapat mengendalikan sebagian varians individu dari
mikrobioma usus.
Kekurangan zat besi adalah defisiensi mikronutrien paling umum di
dunia dan menemukan dosis zat besi yang memadai dan aman untuk
memperbaiki kekurangan ini memiliki dampak kesehatan masyarakat yang luar
biasa [36-38]. Penelitian kami adalah uji coba terkontrol secara acak pertama
yang meneliti efek suplementasi besi standar dan banyak digunakan pada
mikrobiota usus pada bayi Afrika yang tidak anemia atau anemia. Kuantitas zat
besi yang disediakan dalam penelitian ini adalah 12,5 mg / hari, yang
merupakan kuantitas standar dalam "taburan" MNP yang umum digunakan.
Dosis ini telah terbukti efektif dalam hal mengurangi ID dan IDA pada bayi
dan balita di Afrika yang usianya lebih tua. Dosis zat besi yang lebih rendah
juga telah diuji, dengan tujuan mengurangi dampak negatif terhadap kesehatan
(misalnya, peradangan, diare). Misalnya, MNP dengan kandungan besi jauh
lebih rendah (2,5 mg / hari) telah diuji dalam beberapa uji coba pada anak-anak
 Afrika, tetapi hasilnya tidak menjanjikan [39,40]. Selain itu, Jaeggi dkk. [11]
menemukan tidak jelas apakah 2,5 mg / hari zat besi, dibandingkan dengan
12,5 mg / hari, memiliki profil keamanan yang lebih baik. Intervensi zat besi
untuk pencegahan masa depan dapat mempertimbangkan dampak dari dosis
yang lebih rendah, efek dari peningkat penyerapan, seperti vitamin C, dan /
atau agen anti-inflamasi, seperti Vitamin, ke MNP. Pada akhirnya, penelitian
tambahan perlu dilakukan untuk menentukan dosis yang paling efektif dengan
efek samping minimal baik untuk kesehatan bayi dan mikrobiota yang sedang
berkembang. Selain itu, penelitian jangka panjang akan diperlukan untuk
menghubungkan efek perubahan dalam mikrobiota dengan hasil yang relevan
secara klinis.

Ucapan Terima Kasih: Penelitian ini didanai oleh kontrak penelitian Tenaga
Atom Internasional (IAEA) No. 15827 dan kontrak teknis no. 16933; National
Institutes of Health / Pusat Nasional untuk Sumber Daya Penelitian (NIH /
NCRR) Colorado Clinical and Translational Sciences Institute (CCTSI) Nomor
Hibah UL1 TR001082. Dukungan hibah tambahan untuk Nancy F. Krebs
disediakan oleh NIH K24 DK083772. Sponsor pendanaan tidak memiliki peran
dalam desain penelitian; dalam pengumpulan, analisis, atau interpretasi data;
dalam penulisan naskah, dan dalam keputusan untuk mempublikasikan hasil,
namun IAEA telah membatasi masukan kolaboratif ke penyempurnaan protokol
sebelum implementasi di lapangan. Kontribusi Penulis: NFK, FE, KMH dan EL
merancang dan melakukan penelitian dan meninjau makalah. MT dan NFK
menulis kertas itu. DNF, AEH dan DI menganalisis data dan meninjau makalah.
Konflik Kepentingan: Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Daftar Pustaka
1. Pasricha, S.R.; Drakesmith, H.; Black, J.; Hipgrave, D.; Biggs, B.A. Control of
iron deficiency anemia in lowand middle-income countries. Blood 2013, 121,
2607–2617.
2. Esamai, F.; Liechty, E.; Ikemeri, J.; Westcott, J.; Kemp, J.; Culbertson, D.;
Miller, L.V.; Hambidge, K.M.; Krebs, N.F. Zinc absorption from micronutrient
 powder is low but is not affected by iron in Kenyan infants. Nutrients 2014, 6,
5636–5651.
3. Sazawal, S.; Black, R.E.; Ramsan, M.; Chwaya, H.M.; Stoltzfus, R.J.; Dutta,
A.; Dhingra, U.; Kabole, I.; Deb, S.; Othman, M.K.; et al. Effects of routine
prophylactic supplementation with iron and folic acid on admission to hospital
and mortality in preschool children in a high malaria transmission setting:
Community-based, randomised, placebo-controlled trial. Lancet 2006, 367,
133–143.
4. Soofi, S.; Cousens, S.; Iqbal, S.P.; Akhund, T.; Khan, J.; Ahmed, I.; Zaidi,
A.K.; Bhutta, Z.A. Effect of provision of daily zinc and iron with several
micronutrients on growth and morbidity among young children in Pakistan: A
cluster-randomised trial. Lancet 2013, 382, 29–40.
5. Paganini, D.; Uyoga, M.A.; Zimmermann, M.B. Iron Fortification of Foods for
Infants and Children in Low-Income Countries: Effects on the Gut
Microbiome, Gut Inflammation, and Diarrhea. Nutrients 2016, 8.
6. Andrews, S.C.; Robinson, A.K.; Rodriguez-Quinones, F. Bacterial iron
homeostasis. FEMS Microbiol. Rev. 2003, 27, 215–237.
7. Mevissen-Verhage, E.A.; Marcelis, J.H.; Harmsen-Van Amerongen, W.C.; de
Vos, N.M.; Verhoef, J. Effect of iron on neonatal gut flora during the first three
months of life. Eur. J. Clin. Microbiol. 1985, 4, 273–278.
8. Vazquez-Gutierrez, P.; de Wouters, T.; Werder, J.; Chassard, C.; Lacroix, C.
High Iron-Sequestrating Bifidobacteria Inhibit Enteropathogen Growth and
Adhesion to Intestinal Epithelial Cells In Vitro. Front. Microbiol. 2016, 7,
1480.
9. Krebs, N.F.; Sherlock, L.G.; Westcott, J.; Culbertson, D.; Hambidge, K.M.;
Feazel, L.M.; Robertson, C.E.; Frank, D.N. Effects of different complementary
feeding regimens on iron status and enteric microbiota in breastfed infants. J.
Pediatr. 2013, 163, 416–423.
10. Zimmermann, M.B.; Chassard, C.; Rohner, F.; N’Goran, E.K.; Nindjin, C.;
Dostal, A.; Utzinger, J.; Ghattas, H.; Lacroix, C.; Hurrell, R.F. The effects of
iron fortification on the gut microbiota in African children: A randomized
controlled trial in Cote d’Ivoire. Am. J. Clin. Nutr. 2010, 92, 1406–1415.
11. Jaeggi, T.; Kortman, G.A.; Moretti, D.; Chassard, C.; Holding, P.; Dostal, A.;
Boekhorst, J.; Timmerman, H.M.; Swinkels, D.W.; Tjalsma, H.; et al. Iron
fortification adversely affects the gut microbiome, increases pathogen
abundance and induces intestinal inflammation in Kenyan infants. Gut 2015,
64, 731–742.
12. Goudar, S.S.; Carlo, W.A.; McClure, E.M.; Pasha, O.; Patel, A.; Esamai, F.;
Chomba, E.; Garces, A.; Althabe, F.; Kodkany, B.; et al. The Maternal and
Newborn Health Registry Study of the Global Network forWomen’s and
Children’s Health Research. Int. J. Gynaecol. Obstet. 2012, 118, 190–193.
13. Hara, N.; Alkanani, A.K.; Ir, D.; Robertson, C.E.; Wagner, B.D.; Frank, D.N.;
Zipris, D. Prevention of Virus-Induced Type 1 Diabetes with Antibiotic
Therapy. J. Immunol. 2012, 189, 3805–3814.
14. Markle, J.G.; Frank, D.N.; Mortin-Toth, S.; Robertson, C.E.; Feazel, L.M.;
Rolle-Kampczyk, U.; von Bergen, M.; McCoy, K.D.; Macpherson, A.J.;
Danska, J.S. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent
regulation of autoimmunity. Science 2013, 339, 1084–1088.
15. Lane, D.J.; Pace, B.; Olsen, G.J.; Stahl, D.A.; Sogin, M.L.; Pace, N.R. Rapid
determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 6955–6959.
16. Weisburg,W.G.; Barns, S.M.; Pelletier, D.A.; Lane, D.J. 16S ribosomal, DNA
amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 1991, 173, 697–703.
17. Homo Sapiens UCSC Hg19 Human Genome Sequence from iGenome:
Illumina. 2009. Available online: http:
//support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn
(accessed on 14 August 2014).
18. Langmead, B.; Salzberg, S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat.
Methods 2012, 9, 357–359.
19. Ewing, B.; Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred.
II. Error probabilities. Genome Res. 1998, 8, 186–194.
20. Ewing, B.; Hillier, L.; Wendl, M.C.; Green, P. Base-calling of automated
sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res. 1998, 8,
175–185.
21. Edgar, R.C.; Haas, B.J.; Clemente, J.C.; Quince, C.; Knight, R. UCHIME
improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 2011, 27,
2194–2200.
22. Schloss, P.D.;Westcott, S.L. Assessing and improving methods used in
operational taxonomic unit-based approaches for 16S rRNA gene sequence
analysis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 3219–3226.
23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glockner, F.O. SINA: Accurate high throughput
multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics 2012,
28, 1823–1829.
24. Quast, C.; Pruesse, E.; Yilmaz, P.; Gerken, J.; Schweer, T.; Yarza, P.; Peplies,
J.; Glockner, F.O. The SILVA ribosomal RNA gene database project:
Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Res.2013, 41,
D590–D596.
25. Robertson, C.E.; Harris, J.K.; Wagner, B.D.; Granger, D.; Browne, K.; Tatem,
B.; Feazel, L.M.; Park, K.; Pace, N.R.; Frank, D.N. Explicet: Graphical user
interface software for metadata-driven management, analysis and
visualization of microbiome data. Bioinformatics 2013, 29, 3100–3101.
26. Livak, K.J.; Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods
2001, 25, 402–408.
27. MacFarlane, A.J.; Behan, N.A.; Matias, F.M.; Green, J.; Caldwell, D.; Brooks,
S.P. Dietary folate does not significantly affect the intestinal microbiome,
inflammation or tumorigenesis in azoxymethane-dextran sodium sulphate-
treated mice. Br. J. Nutr. 2013, 109, 630–638.
28. Ma, J.; Sun, Q.; Liu, J.; Hu, Y.; Liu, S.; Zhang, J.; Sheng, X.; Hambidge, K.M.
The Effect of Iron Fortification on Iron (Fe) Status and Inflammation: A
Randomized Controlled Trial. PLoS ONE 2016, 11, e0167458.
29. Tang, M.; Frank, D.N.; Sherlock, L.; Ir, D.; Robertson, C.E.; Krebs, N.F.
Effect of Vitamin E with Therapeutic Iron Supplementation on Iron Repletion
and Gut Microbiome in US Iron Deficient Infants and Toddlers. J. Pediatr.
Gastroenterol. Nutr. 2016, 63, 379–385.
30. De Filippo, C.; Cavalieri, D.; Di Paola, M.; Ramazzotti, M.; Poullet, J.B.;
Massart, S.; Collini, S.; Pieraccini, G.; Lionetti, P. Impact of diet in shaping gut
microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural
Africa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 14691–14696.
31. Ottman, N.; Smidt, H.; de Vos, W.M.; Belzer, C. The function of our
microbiota: Who is out there and what do they do? Front. Cell. Infect.
Microbiol. 2012, 2, 104.
32. Koenig, J.E.; Spor, A.; Scalfone, N.; Fricker, A.D.; Stombaugh, J.; Knight, R.;
Angenent, L.T.; Ley, R.E. Succession of microbial consortia in the developing
infant gut microbiome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108 (Suppl. S1),
4578–4585.
33. Frank, J.A.; Reich, C.I.; Sharma, S.;Weisbaum, J.S.;Wilson, B.A.; Olsen, G.J.
Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of
bacterial 16S rRNA genes. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 2461–2470.
34. Fallani, M.; Amarri, S.; Uusijarvi, A.; Adam, R.; Khanna, S.; Aguilera, M.;
Gil, A.; Vieites, J.M.; Norin, E.; Young, D.; et al. Determinants of the human
infant intestinal microbiota after the introduction of first complementary foods
in infant samples from five European centres. Microbiology 2011, 157 Pt 5,
1385–1392.
35. Brumbaugh, D.E.; Crume, T.L.; Nadeau, K.; Scherzinger, A.; Dabelea, D.
Intramyocellular lipid is associated with visceral adiposity, markers of insulin
resistance, and cardiovascular risk in prepubertal children: The EPOCH study.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 2012, 97, E1099–E1105.
36. American Academy of Pediatrics CoN. Iron. In Pediatric Nutrition Handbook,
6th ed.; Kleinman, R., Ed.; American Academy of Pediatrics: Elk Grove
Village, IL, USA, 2009; pp. 403–422.
37. Lutter, C.K. Iron deficiency in young children in low-income countries and
new approaches for its prevention. J. Nutr. 2008, 138, 2523–2528.
38. Baker, R.D.; Greer, F.R. Diagnosis and prevention of iron deficiency and iron-
deficiency anemia in infants and young children (0–3 years of age). Pediatrics
2010, 126, 1040–1050.
39. Troesch, B.; van Stuijvenberg, M.E.; Smuts, C.M.; Kruger, H.S.; Biebinger,
R.; Hurrell, R.F.; Baumgartner, J.; Zimmermann, M.B. A micronutrient powder
with low doses of highly absorbable iron and zinc reduces iron and zinc
deficiency and improves weight-for-age Z-scores in South African children. J.
Nutr. 2011, 141, 237–242.
40. Macharia-Mutie, C.W.; Moretti, D.; Van den Briel, N.; Omusundi, A.M.;
Mwangi, A.M.; Kok, F.J. Zimmermann, M.B.; Brouwer, I.D. Maize porridge
enriched with a micronutrient powder containing low-dose iron as NaFeEDTA
but not amaranth grain flour reduces anemia