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UNIVERSIDAD ESTATAL DE MILAGRO

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

MATERIA: MICROBILOGÍA

TEMA: HONGOS FITOPATOGENOS EN FRUTAS(NARANJA)

DOCENTE: ING.SIMÓN PEREZ

CURSO: BIOTECNOLOGÍA A1

SEMESTRE: 2 NIVEL

AÑO: 2019
Objetivos:

Investigar microorganismos patológicos presentes en las naranjas (hongos, bacterias, entre


otros)

Objetivos específicos:

 Localizar el lugar específico del que se obtendrá la muestra a utilizar.


 Al llegar al lugar, obtener las muestras necesarias para la debida investigación (frutos
sanos, medios sanos y dañados).
 Evaluar y comparar, para tener conocimiento del tipo de fruto que se está utilizando.
 Cultivar el/los microorganismos en una placa petri con los debidos nutrientes.
 Observar el crecimiento que estos presentan.

Materiales y Métodos

Materiales

 Recipientes previamente esterilizados de boca ancha de tapa de rosca.


 Cucharones, espátulas, cuchillo o pinzas.
 Etiquetas auto adheribles
 Bata, Cubre boca y Guantes esterilizados
 Fósforos o Encendedores
 Alcohol 70%
 Placa Petri
 Bisturí
 Mechero
 Matraz de Erlenmeyer
 Agua destilada
 Papel parafilm
 Cámara de Neubauer
 Fundas esterilizadas

Reactivos

 Agar PDA
 Hipoclorito de sodio a 5 %
 Lactofenol

Equipos

 Autoclave
 Microscopio

Métodos

Los frutos de la naranja (Citrus sinensis) cultivar blanca sulistiana en estado de madurez
fisiológica fueron recolectadas de plantaciones de la provincia del Guayas, Milagro, Ecuador.
Los frutos presentaban lesiones como pudriciones, moho superficial entre otras.

Aislamiento de hongos filamento:

Partimos obteniendo frutos con síntomas de daño fúngico, procedemos a realizar un corte
cuadrado de aproximadamente 5 mm2, se coloca de manera directa en medio PDA acidificado,
los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente por 5 días y reaislados hasta obtener un
cultivo monospórico en el mismo medio (Suárez-‐Quiroz, 2013).

Muestreo

El muestreo se realizó en el cantón Simón Bolívar en el reciento las Huaijas, específicamente en la finca "
los morenos".

La recolección fue directamente de las naranjas tipo: Blanca Sullistiana que yacen en las ramas y que a la
vista denotaba putrefacción, pero sólo en algunas de ellas.

Se recolecto 1 naranja por mata en forma aleatoria, que cuando fueron recogidas, mostraron a su
alrededor un color opaco y se pudo definir que la fruta estaba en estado de putrefacción.

Se tomaron las muestras y se colocó en un recipiente esterilizado para su transporte.

Se observó que la zona en donde fueron recolectados los frutos tenían condiciones específicas para el
desarrollo del hongo (Monroy & Lizarazo, 2010).

Procedimiento

Área de estudio:

Selección y toma de la muestra:

1. Preparación del material y los equipos necesarios para la recolección de la muestra.


2. Seleccionar 4 árboles naranjos al azar en un perímetro de 15 metros y tomar una sola
muestra por árbol.
3. Tomar los frutos que tengan mayor probabilidad de infestación.
4. Colocar las muestras en fundas esterilizadas y etiquetadas.

Tabla 1: Etiqueta para muestreo de fruto en campo

Colector:
Fecha de recolección:
Lugar:
Procedencia: Árbol Suelo
Peso del fruto:

Traslado de muestras:
5. Colocar las muestras en recipientes previamente esterilizados de boca ancha de tapa
de rosca para mantenerlas frescas.
6. Trasladar las muestras al laboratorio en un periodo máximo de 24 horas.

Procesamiento de las muestras de Naranja:


Aislamiento de microorganismos patógenos en Naranja:
7. Con ayuda de un bisturí se realiza un corte de aproximadamente unos 0,5cm de
diámetro en la zona afectada de la muestra.
8. Se coloca las muestras en una caja Petri con hipoclorito de sodio al 5% durante un
minuto y medio.
9. Pasar las muestras a una caja Petri con alcohol al 70% durante un minuto y medio.
10. Lavar las muestras en una caja Petri con agua destilada.
11. Colocar las muestras en la caja Petri con el medio de cultivo PDA y sellar con papel
parafilm.
12. Incubar de forma invertida en una estufa a 28oC por 72 horas.

Conteo celular en cámara de Neubauer:

13. Colocar la colonia del hongo en un tubo con 10ml de agua destilada y agitar durante
dos minutos con movimientos circulares.
14. Decantar la suspensión y adicionar cuatro gotas de lactofenol. Agitar el tubo y dejar
reposar durante cinco minutos. Agitar el tubo de nuevo durante dos minutos.
15. Con ayuda de una pipeta de dilución colectar 2 ml de la suspensión, y agitar durante
dos minutos.
16. Descartar las tres primeras gotas y colocar la cuarta en la rendija de la cámara de
Neubauer.
17. Dejar quieta la cámara por un minuto para que las colonias se sedimenten.
18. Observar en el microscopio, utilizando el objetivo 10X.
19. Contar todas las células en todas las áreas de los cuatro milímetros cuadrados de las
esquinas y del centro.
20. En el caso de que haya células sobre las líneas límites, se deberán contar aquellas que
se encuentres depositadas sobre los límites de abajo y de la derecha.
21. Registrar el número de células en cada milímetro cuadra, de los dos lugares de conteo
de la cámara.
22. Realizar el cálculo del número de células/ml de suspensión con la siguiente formula:
23. No total de células= (No células X dilución X 104) / N0 áreas mm2 contadas

Tabla 2: Datos obtenidos de la cámara de Neubauer por muestra

Muestra NO: _______________


Fecha:____________________________

Observaciones:

Cámara Número de células

1
2

Total de células: Ufc/ml:

Variables e indicadores a evaluar

Crecimiento:

Tabla 3: Crecimiento de colonias por 24, 48 y 72 horas

Crecimiento de colonias
Muestra 24 H 48 H 72 H
Si No Si No Si No
A
1
B
A
2
B
3 A
B
A
4
B

Tabla 4: Número de unidades formadoras de colonias por días (Ufc/ml)

Días
Muestra
1 2 3
A
1
B
A
2
B
A
3
B
A
4
B

Tabla 5: Número de unidades formadoras de colonias por medios de cultivo

Muestra Cultivo Ufc/ml


Bacteria
1A Hongo
Indeterminado
Bacteria
1B Hongo
Indeterminado
Bacteria
2A Hongo
Indeterminado
Bacteria
2B Hongo
Indeterminado
3A Bacteria
Hongo
Indeterminado
Bacteria
3B Hongo
Indeterminado
Bacteria
4A Hongo
Indeterminado
Bacteria
4B Hongo
Indeterminado

Morfología

Tabla 6: Aspecto de crecimiento (bacteriano o fúngico) de los medios de cultivos

Aspecto de Crecimiento
Muestra Bacteriano Fúngico Indeterminado
Si No Si No Si No
A
1
B
A
2
B
A
3
B
A
4
B

Tabla 7: Textura de las colonias aisladas y purificadas


Características
Muestra Cultivo
Forma Borde Elevación Coloración
Bacteria
1 Hongo
Indeterminado
Bacteria
2 Hongo
Indeterminado
Bacteria
3 Hongo
Indeterminado
Bacteria
4 Hongo
Indeterminado
Referencias
Monroy, L., & Lizarazo, L. (2010). IDENTIFICACIÓN DE HONGOS FITOPATÓGENOS ASOCIADOS
AL ROBLE. Revista Colombia Forestal , 349.

Suárez-‐Quiroz, M. &.-.‐B.-.‐R.-.‐M.-.‐G.-.‐R. (2013). AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y


SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS DE HONGOS FITOPATÓGENOS DE PAPAYA CV.
MARADOL (Carica papaya L.). Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, 117.

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