2018_2019
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Índice de Tabelas
1. Introdução
2.1. Proteínas
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Estrutura Primária
• Sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.
Estrutura Secundária
• Refere-se à configuração espacial da cadeia polipeptídica, como ela se
enrola ou forma camadas.
Estrutura Terciária
• Especifíca a forma na qual a α-hélice, a folha plissada β e outras regiões
estão dobradas.
Estrutura Quaternária
• Associação entre proteínas individuais para formar um arranjo específico.
Calor;
Radiações eletromagnéticas de certos comprimentos de onda;
Ácidos e bases;
Solventes orgânicos;
Iões de metais pesados.
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•Quantificação
•Separação e purificação da
proteína
Métodos
•Determinação da
composição e sequência dos
aminoácidos
•Estudo da estrutura
tridimensional
•Caracterização da
funcionalidade
Absorção de Método do
Reagente Método de
proteínas no BCA
de Bradford Biureto Lowry
ultravioleta
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𝐴𝑏𝑠 = 𝜀 × 𝐶 × 𝑙
Em que:
Abs - Absorvância;
𝐴𝑏𝑠 = 𝜀 × 𝐶 ⇔ 𝐶 =
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Espetrofotometria
UV-Vis
Assim, estes métodos são sempre feitos através de comparação com uma
amostra de concentração proteica bem definida, tipicamente uma solução da
proteína BSA (Albumina do Soro Bovino) cuja concentração não é dada em
mol/dm3, mas sim em mg/ml. Efetua-se uma curva de calibração utilizando
amostras com concentrações sucessivamente menores de BSA, de modo a
obter uma expressão matemática que corresponde a uma resposta linear entre
a concentração de proteína e a leitura de absorvância ao comprimento de
onda especificado no método.
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Este método envolve duas etapas, tal como mostra o esquema representado
abaixo.
A grande vantagem deste método é que é 100 vezes mais sensível (limite de
deteção inferior) do que a reação inicial do “biureto”, em que se forma a ténue
cor azul. A reação do BCA é muito influenciada pela presença de 4 tipos de
resíduos de aminoácidos (cisteína ou cistina, tirosina e triptofano) na sequência
de aminoácidos da proteína. No entanto, ao contrário de métodos à base do
corante Coomassie, o esqueleto da proteína também contribui para o
desenvolvimento de cor, tornando-o menos suscetível a variabilidade por
composições proteicas muito distintas.
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2. Descrição Experimental
5.1 Material
Tubos de ensaio
Suporte para tubos de ensaio
Copos de 50 mL
Cuvettes de quartzo
Cuvettes normais
Micropipetas P1000 e P200
Pontas descartáveis azuis e amarelas
b. Equipamento
c. Reagentes
Pureza
Nome Fórmula Química Marca Pictograma
(%)
Mínimo
Cloreto de Sódio NaCl Merck N.P
99,5
Mínimo
Hidróxido de sódio NaOH JNGS
99,14
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d. Soluções
Data de
Solução Concentração
preparação
Solução padrão de BSA 2 mg/mL 16/11/2018
Leite magro S.I 16/11/2018
S.I – Sem informação
e. Segurança
f. Preparação de soluções
i. Amostra de Leite
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BSA 500 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 125 µL de solução padrão e 500 µL
de água desionada.
BSA 1000 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 250 µL de solução padrão e 250
µL de água desionada.
BSA 500 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 12,5 µL de solução padrão e 37,5
µL de água desionada;
BSA 750 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 18,75 µL de solução padrão e 31,25
µL de água desionada;
BSA 1000 µg/mL: pipetou-se para o microtubo 25 µL de solução padrão e 25 µL
de água desionada.
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3. Resultados Experimentais
0, 002mg g
1, 0 106 1 g 2000 g
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Em que:
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Ci Vi C f V f
Em que:
VH 2O VTotal VBSA
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Em que:
VH 2O 300 15 VH 2O 285 L
0.35
0.3 y = 0.0003x + 0.0195
R² = 0.9888
0.25
0.2
ABS
0.15
0.1
0.05
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentração (µ/mL)
0.6
0.5
0.4
y = 0.0004x + 0.1059
ABS
0.3 R² = 0.992
0.2
0.1
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentração (µ/mL)
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Equação da reta:
y = mx + b
x - concentração em µg/mL
y - absorvância
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5. Conclusão
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia
para a determinação de proteínas totais, porém, um deles é essencial: o
conhecimento, o mais preciso possível, da natureza dos constituintes da
amostra e de suas concentrações aproximadas. Isto facilitará a identificação
dos possíveis interferentes e consequentemente ajudará na escolha do método
mais apropriado para cada situação.
Nesta atividade laboratorial, foi possível testar dois métodos o UV e BCA com
níveis de sensibilidade diferentes, contudo foi possível observar as
concentrações proteicas das amostras.
6. Bibliografia
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