BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kopertis wilayah X selama 6

bulan dimulai pada bulan Februari 2017 dan berakhir pada bulan Juli 2017

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan adalah seperangkat alat destilasi vacuum “rotary

evaporator”, spektrofotometer UV-VIS, corong pisah, corong, gelas ukur, sudip,

spatel, pipet tetes, erlenmeyer, labu ukur, beaker glass, kaca arloji, vial,

aluminium foil, timbangan analitik, plat tetes, cawan penguap, spidol , blender,

botol, kapas, oven, plat KLT, seperangkat alat kromatografi lapis tipis (KLT) dan

pipet volume.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan adalah daun piladang (Solenostemon

scutellarioides(L). Codd) yang telah dikeringanginkan, n-heksan, etil asetat,

etanol 70%, aquadest, natrium sulfat anhidrat, 2N HCL, 2N H3PO4, 2N Asam

Asetat, metanol, DPPH, kloroforom, FeCl3, reagen Folin-Ciocalteu, natrium

karbonat, asam galat.

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Pengambilan sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun piladang

(Solenostemon scutellarioides (L.) Codd) sebanyak 7kg yang diambil di daerah

Padang Pariaman, Sumatera Barat.

25
3.3.2 Identifikasi sampel

Sampel diidentifikasi di Herbarium ANDA Jurusan Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Universitas Andalas, Padang.

3.3.3 Penyiapan sampel

3.3.3.1 Ekstraksi Daun Piladang

Daun yang telah diambil dibersihkan dari pengotor dan ditimbang

sebanyak 7kg, lalu dikeringanginkan tanpa bantuan sinar matahari langsung

hingga dapat dipatahkan dengan jari. Setelah kering daun dirajang, kemudian

diserbukan dengan menggunakan blender lalu ditimbang. Ekstrak dibuat dengan

cara maserasi dimana sampel dimasukan dalam botol berwarna gelap terlindung

dari cahaya matahari kemudian masukan satu bagian serbuk kering simplisia

kedalam maserator, tambahkan 10 bagian Etanol 70%. Rendam selama 6 jam

pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian diamkan selama 18 jam. Pisahkan

maserat dengan cara pengendapan. Ulangi proses penyarian sampai didapatkan

maserat jernih. Kumpulkan semua maserat lalu uapkan dengan rotary evaporator

hingga diperoleh ekstrak kental (Kemenkes RI. 2011)

3.3.3.2 Fraksinasi Daun Piladang

Ekstrak etanol daun piladang sebanyak 25gram difraksinasi dengan n-

heksan dan air dengan perbandingan (1:1) sebanyak 200ml dalam corong pisah,

dikocok secukupnya. Setelah itu dibiarkan sampai terbentuk dua lapisan yaitu

lapisan n-heksan dan lapisan air. Perlakuan ini dilakukan beberapa kali

pengulangan sampai lapisan n-heksan terlihat jernih sehingga diperoleh fraksi n-

heksan. Lapisan air kemudian difraksinasi dengan etil asetat dilakukan beberapa

kali pengulangan seperti perlakuan diatas sehingga diperoleh fraksi etil asetat dan

26
fraksi air. Selanjutnya masing-masing fraksi diuapkan dengan rotary evaporator

(Monika, 2015).

3.3.4 Karakteristik Fraksi Daun Piladang

3.3.4.1 Pemeriksaan Organoleptis Fraksi Air Sebelum Hidrolisis

Pengamatan dilakukan secara visual dengan mengamati warna, bentuk bau

dan rasa

3.3.4.2 Rendemen

Timbang daun piladang yang telah dihaluskan dan timbang ekstrak yang

didapatkan, kemudian timbang hasil fraksinasi. Hitung rendemen dengan rumus:

berat fraksi yang diperoleh

Rendemen = x 100 %
berat fraksi sampel kering

3.3.5 Uji Skrining Fitokimia Fraksi Air Sebelum Hidrolisis

Fraksi air daun piladang (Solenostemon scutellarioides (L.) Codd)

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 mL aquadest dan 5 mL

kloroform, dikocok dan dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan air dan kloroform.

a. Uji Flavonoid (Metode Sianidin Test)

Ambil lapisan air 1–2 tetes, teteskan pada plat tetes lalu tambahkan serbuk

Mg dan HCl (p), terbentuknya warna merah menandakan adanya flavonoid.

b. Uji Fenolik

Ambil lapisan air 1–2 tetes, teteskan pada plat tetes lalu tambahkan pereaksi

FeCl3, terbentuknya warna biru menandakan adanya kandungan fenolik.

c. Uji Saponin

Ambil lapisan air, kocok kuat–kuat dalam tabung reaksi, terbentuknya busa

yang permanen (± 15 menit) menunjukkan adanya saponin.

27
d. Uji Terpenoid dan Steroid (Metode Simes)

Ambil sedikit lapisan kloroform difiltrasi dengan norit, diambil 2-3 tetes

filtrat dan dibiarkan mengering pada plat tetes, setelah kering ditambahkan asam

asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (Pereaksi Lieberman-Bouchard),

terbentuknya warna biru atau hijau menandakan adanya steroid, sedangkan bila

terbentuk warna merah menunjukkan adanya terpenoid.

e. Uji Alkaloid (Metode Culvenor – Fristgerald)

Ambil sedikit lapisan kloroform tambahkan 10 mL kloroform amoniak 0,05

N, aduk perlahan tambahkan beberapa tetes H2SO4 2N kemudian dikocok

perlahan, biarkan memisah. Lapisan asam ditambahkan beberapa tetes pereaksi

mayer, reaksi positif alkaloid ditandai dengan adanya kabut putih hingga

gumpalan putih.

3.3.6 Pengujian Profil Kimia dan Aktivitas Antioksidan Fraksi Air Daun

Piladang

3.3.6.1 Hidrolisis Asam Terhadap Fraksi Air

Metode hidrolisis asam dilakukan berdasarkan penelitian Wang

dkk.(2002) dengan modifikasi dimana 3gram fraksi air dilarutkan dalam 25 ml 2N

HCL dan 25ml etanol 70%. Larutan dimasukan dalam labu alas bulat dan

direfluks selama 60 menit. Menggunakan metode markham (1988), setelah larutan

didinginkan partisi cair-cair berulang dengan etil asetat (1:1). Fraksi etil asetat

disaring menggunakan natrium sulfat anhidrat untuk menghilangkan tapak air.

Fraksi etil asetat kemudian di Rotary evaporator hingga kental. Lakukan hal yang

sama dengan menggunakan asam phospat, dan asam asetat

28
3.3.6.2 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Fraksi Air Daun Piladang

Sebelum dan Setelah Hidrolisis

Analisis kualitatif fraksi air daun piladang dilakukan dengan kromatografi

lapis tipis. Hasil analisis dengan KLT ini digunakan untuk mengamati bercak

ekstrak daun piladang. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254.

Diaktifkan terlebih dahulu pada suhu 105̊ C selama 10 menit. Ekstrak ditotolkan

pada fase diam kemudian dikembangkan dengan fase gerak.

Fase gerak yang digunakan heksan : etil asetat (6:4) dan (7:3) digunakan

untuk melihat profil bercak fraksi heksan, fraksi etil asetat, fraksi air, fraksi air

terhidolisis HCl 1 jam, fraksi air terhidrolisis H3PO4 1 jam dan fraksi air

terhidrolisis asam asetat 1 jam. Bercak yang muncul kemudian dilihat pada sinar

tampak, UV254 dan UV365. Pereaksi semprot FeCl3 dan DPPH digunakan untuk

melihat golongan senyawa (Irianti, dkk, 2016).

3.3.6.3 Penetapan Kadar Fenolat Fraksi Air Daun Piladang

1. Pembuatan Reagen

a. Penyiapan Larutan Induk Asam Galat (500 µg/ml)

Sebanyak 12,5mg asam galat dilarutkan ke dalam 0,5 ml metanol kemudian

ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 25 ml dalam labu ukur.

Konsentrasi larutan yang diperoleh untuk pengukuran 500 µg/ml.

b. Penyediaan Larutan Natrium Karbonat 1M

Sebanyak 10,6g Natrium karbonat dilarutkan dengan aquadest dalam labu

ukur 100 ml sampai tanda batas, kocok hingga homogen.

29
2. Pengukuran Kadar Fenolat Total dengan metode Folin-Ciocalteu

a. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Asam Galat

Larutan induk asam galat di pipet sebanyak 2 ml ke dalam labu ukur 10 ml,

lalu encerkan dengan metanol: aquadest (1:1) sampai tanda batas sehingga

didapatkan kosentrasi 100 µg/ml. Kemudian di pipet 0,5 ml kemudian campur di

dengan pereaksi Folin–Ciocalteu sebanyak 5ml (di encerkan 1: 10 aquadest).

Kemudian tambahkan 4 ml larutan natrium karbonat 1M kocok homogen. Biarkan

pada suhu kamar selama 15 menit dan diukur panjang gelombang serapan

maksimum dari asam galat dengan spektrofotometer UV-VIS.

b. Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat

Larutan induk asam galat di pipet (0,4 0,8; 1,2; 1,6; 2,0) ml diencerkan

dengan metanol : aquadest (1: 1) dalam labu ukur 10 ml sampai tanda batas

sehingga di peroleh konsentrasinya 20, 40, 60, 80, 100 µg/ml asam galat. Dari

masing- masing larutan di pipet 0,5 ml kemudian di campur dengan 5 ml reagen

Folin-Ciocalteu ( diencerkan 1: 10 aquadest) tambahkan 4 ml larutan natrium

karbonat 1M biarkan selama 15 menit, ukur serapannya pada panjang gelombang

maksimum (Mosquera,O.M et al, 2006)

c. Penentapan Kadar Fenolat Total Fraksi Air Daun Piladang

Dipipet 0,5 ml larutan Fraksi air tambahkan 5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu

(diencerkan 1: 10 aquadest), kemudian tambahkan 4 ml larutan natrium karbonat

1M kocok homogen, biarkan pada suhu kamar selama 15 menit dan ukur serapan

panjang gelombang serapan maksimum dengan spektro UV-VIS yang

memberikan warna komplek biru (Poumarad,F dkk, 2006). Dilakukan 3x

pengulangan kadar fenolat total ditentukan dengan rumus:

30
 konsentrasi fenolat yang terukur (µg/ml)
Ksf = x 100 %
konsentrasi fraksi dalam larutan (µg/ml)

Keterangan: Ksf = Kadar fenolat total ekstrak sampel

d. Penentapan Kadar Fenolat Total Fraksi Air Daun Piladang Terhidrolisis

Dipipet 0,5 ml larutan Fraksi air terhidrolisis asam HCl, H3PO4 dan asam

asetat selama 1 jam tambahkan 5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu (diencerkan 1: 10

aquadest), kemudian tambahkan 4 ml larutan natrium karbonat 1M kocok

homogen, biarkan pada suhu kamar selama 15 menit dan ukur serapan panjang

gelombang serapan maksimum dengan spektro UV-VIS yang memberikan warna

komplek biru. Dilakukan 3x pengulangan kadar fenolat total ditentukan dengan

rumus:

konsentrasi fenolat yang terukur (µg/ml)

Ksf = x 100 %
konsentrasi fraksi dalam larutan (µg/ml)

Keterangan: Ksf = Kadar fenolat total ekstrak sampel

e. Analisis Data

Pengolahan data berdasarkan perolehan dari pengukuran larutan standar

dengan membuat kurva kalibrasi. Konsentrasi sampel dihitung berdasarkan kurva

kalibrasi larutan standar. Sehingga kandungan fenolat total dihitung dengan:

𝐶 𝑥 𝑉 𝑥 𝐹𝑝
Fenolat total (ppm) =
𝐵𝑠

Keterangan:

C = Konsentrasi larutan sampel (𝜇𝑔/𝑚𝑙)

V = Volume larutan sampel (ml)

Fp = Faktor Pengenceran

Bs = Berat sampel (g)

31
3.3.6.4 Pengujian Aktivitas Antioksidan Fraksi Air Daun Piladang

1. Pembuatan larutan DPPH

Serbuk DPPH ditimbang sebanyak 100 mg kemudian dilarutkan dalam 100

ml metanol dalam labu ukur sehingga diperoleh larutan dengan kosentrasi

1000ppm. Dari laruan tersebut, dipipet 3,5 ml, diencerkan dengan metanol sampai

100 ml dalam labu ukur sehingga diperoleh larutan dengan kosentrasi 35 ppm.

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum DPPH

Sebanyak 3,8 ml larutan DPPH 35 ppm dipipet kemudian ditambah 0,2 ml

metanol, dibiarkan 30 menit di tempat yang gelap. Serapan larutan diukur dengan

spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-600 nm.

3. Pemeriksaan aktivitas antioksidan fraksi air daun piladang sebelum

hidrolisis
i. Fraksi air ditimbang sebanyak 100 mg, kemudian ditambahkan metanol

dalam vial dan saring kedalam labu takar.

ii. Kemudian tambahkan metanol sampai 50 mL, sehingga diperoleh

konsentrasi 2000µg/ml atau 2000 ppm.

iii. Buat pembanding asam galat dengan konsentrasi 5mg/50ml atau 100 ppm.

Larutan ini digunakan sebagai larutan induk dan nanti dibuat seri kadar

yang sesuai.

iv. Sejumlah larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 35ppm

dipergunakan sebagai bahan pengujian antioksidan. larutan disimpan pada

wadah gelap dilapisan aluminium foil dan disimpan pada suhu -4º C.

v. 0,2 mL larutan fraksi direaksikan dengan 3,8 mL DPPH

vi. Fraksi air diukur dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelompang

maksimum DPPH.

32
vii. Absorban sampel diperoleh dari pengurangan nilai absorban sampel dengan

DPPH dan absorban sampel tanpa DPPH.

4. Pemeriksaan aktivitas antioksidan fraksi air daun piladang setelah

hidrolisis
i. Fraksi air daun piladang terhidrolisis asam HCL, H3PO4 dan asam asetat

selama 1 jam ditimbang masing-masing sebanyak 50 mg, 55 mg, dan 100

mg kemudian ditambahkan metanol dalam vial dan saring kedalam labu

takar.

ii. Kemudian tambahkan metanol masing-masing sampai 25 mL, 50 mL dan

50mL sehingga diperoleh konsentrasi masing-masing 2000 ppm, 1100 ppm,

dan 2000 ppm.

iii. Buat pembanding asam galat dengan konsentrasi 5mg/50ml atau 100 ppm.

Larutan ini digunakan sebagai larutan induk dan nanti dibuat seri kadar

yang sesuai.

iv. Sejumlah larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 35ppm

dipergunakan sebagai bahan pengujian antioksidan. larutan disimpan pada

wadah gelap dilapisan aluminiumfoil dan disimpan pada suhu -4º C.

v. 0,2 mL larutan fraksi direaksikan dengan 3,8 mL DPPH

vi. Fraksi setelah hidrolisis diukur dengan spektrofotometri UV-VIS pada

panjang gelompang maksimum DPPH.

vii. Absorban sampel diperoleh dari pengurangan nilai absorban sampel

dengan DPPH dan absorban sampel tanpa DPPH.

Persentase inhibisi terhadap radikal DPPH dari larutan sampel dapat

dihitung dengan rumus :

33
 absorban kontrol−absorban sampel
%inhibisi = x 100 %
absorban kontrol

Absorban kontrol = serapan radikal DPPH pada panjang gelombang

maksimum
Absorban sampel = serapan sampel dalam radikal DPPH

34