DIDÁXIS COOPERATIVA DE ENSINO – RIBA DE AVE

FUNDAMENTOS DE ENGENHARIA GENÉTICA

Autores do trabalho:
- Jéssica Lemos
- Ludovina Rebelo

Professora: La Salete Carvalho

Data de entrega: 16/05/2016

Riba de Ave
Maio 2016
 Fundamentos de Engenharia Genética

Definição e Função
A engenharia genética é o termo usado para descrever algumas técnicas modernas
em biologia molecular que vem a revolucionar o antigo processo da biotecnologia. Pode
também ser definida como o conjunto de técnicas capazes de permitir a identificação,
manipulação e multiplicação de genes em organismos vivos, é uma ciência recente que
tem possibilitado a realização de experiências na área da genética, com resultados
bastante surpreendentes sobre a vida.
A Engenharia Genética consiste na utilização de tecnologias que permitem alterar o
genoma de organismos, inserindo um ou mais genes no DNA, ou silenciando a expressão
de um gene já existente. O objetivo da engenharia genética é adicionar ou retirar
características de seres vivos para benefício do homem.

Esquema 1- Fundamentos de engenharia genética

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Enzimas de restrição
Durante 25 anos, desde 1950 a 1975, a molécula de DNA foi considerada “intocável”. A
partir da década de 70, porém, ocorreu uma verdadeira revolução biotecnológica. Um dos
contributos mais importantes para esta revolução biotecnológica foi, sem dúvida, a
descoberta das enzimas de restrição ou endonucleases de restrição, em bactérias.
Os vírus invadem frequentemente as bactérias e afetam o seu DNA. Algumas bactérias
possuem um mecanismo de defesa contra os vírus que consiste na produção de enzimas
chamadas endonucleases de restrição, isto é, enzimas que cindem a cadeia de DNA
quando encontram uma determinada sequência de pares de bases. Atuam, portanto, em
pontos específicos, catalisando a fragmentação do DNA em porções menores.

Figura 1- Funcionamento das enzimas de restrição numa bactéria

Desta forma, estas enzimas reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a

molécula nestes locais, as zonas de restrição, ou seja, reconhecem e cortam sequências
específicas do DNA viral, inativando-o. Estas zonas correspondem a sequências de DNA
simétricas que se lêem da mesma forma nas 2 cadeias na direção 5`- 3`.
Originam fragmentos de DNA em dupla hélice, fragmentos de restrição, com
extremidades em cadeias simples - extremidades coesivas.

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Figura 2- Fragmentos de restrição e extremidades coesivas

 Nomenclatura das enzimas de restrição

Figura 3- Nomenclatura das enzimas de restrição

Enzimas ligases
As extremidades coesivas do DNA deixadas livres como resultado da atuação das
enzimas de restrição podem ligar-se por complementaridade a outro DNA. Neste processo
intervêm outras enzimas chamadas ligases do DNA que catalisam o processo que permite
que fragmentos de DNA se voltem a ligar.

Figura 4- Formação de um DNA recombinante

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Vetores e plasmídeos
A descoberta das enzimas de restrição e das ligases do DNA forneceu aos
investigadores a oportunidade de manipular e transferir genes de uma molécula de DNA
para outra, isto é, de um organismo para outro.
Para esta transferência só faltava um vetor, isto é, uma entidade que pudesse levar o
material genético do genoma de onde foi retirado para o genoma que o fosse receber.
Existem, hoje, diferentes tipos de vetores os quais se salienta os plasmídeos das
bactérias.
Muitas bactérias possuem, para além da molécula de DNA principal pequenas
moléculas de DNA circulares que se designam por plasmídeos. Desta forma, os
plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA que, geralmente, não possuem genes
essenciais para a sobrevivência da bactéria, que podem ser retirados e replicar-se
independentemente da molécula de DNA principal. Alguns plasmídeos são particularmente
interessantes porque possuem um único local que reconhece uma determinada enzima de
restrição, abrindo, portanto, num único ponto. Possuem genes que lhes conferem
resistência a um antibiótico, o que permite localizar as bactérias que têm o DNA
recombinante.

Figura 5- Exemplos de vetores

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Técnica DNA recombinante

Uma das primeiras técnicas utilizadas em engenharia genética foi a técnica do DNA
recombinante (rDNA).
A tecnologia do DNA Recombinante é uma técnica que permite produzir moléculas de
DNA a partir da combinação de genes com proveniências diferentes.
Existem três formas fundamentais de obtenção destes genes:
1. Criar-se uma biblioteca de genes ou banco genómico, que consiste numa coleção
de um grande número de fragmentos de DNA do genoma que são armazenados
em vetores para posteriores utilizações.

Figura 6- Bibliotecas de vetores ou Bancos genómicos

2. Fabricar-se o gene em laboratório a partir de RNA mensageiro (mRNA);

3. Sintetizar-se o gene na sequência desejada. Isto é feito normalmente para genes
que codificam polipéptidos ou proteínas de pequeno tamanho. Para executar esta
técnica basta conhecer a sequência de aminoácidos da proteína desejada e, com
base no conhecimento do código genético, construir a sequência de nucleótidos
que corresponde exatamente à sequência de aminoácidos da proteína.
Depois de se obter o gene de interesse, é necessário que enzimas de restrição cortem
o DNA em fragmentos manipuláveis que contêm o gene específico pretendido. Este
processo ocorre normalmente em bactérias (o DNA bacteriano está protegido da atividade
das enzimas de restrição), protegendo-as dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem
e cortam sequências específicas do DNA viral, inativando-o. Após a clivagem, formam-se

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fragmentos de restrição, em dupla hélice, mas com uma pequena extensão em cadeia
simples em cada extremidade (extremidades coesivas).
Os fragmentos de DNA que contêm os genes de interesse são, depois, incorporados
numa entidade constituída por DNA capaz de transportar o fragmento de DNA para uma
célula. Estas entidades designam-se vetores (é um espécie de “transportador” que
transfere o material genético de um genona para outro.). Os bacteriófagos, vírus que
atacam as bactérias, podem ser usados como vetores. Muitas bactérias, para além da
cadeia de DNA principal, possuem cadeias de DNA livres e de forma circular, os
plasmídeos, cujos genes, geralmente, não são essenciais à sobrevivência da bactéria,
podendo ser retirados e usados também como vetores.
Os plasmídeos podem replicar-se independentemente da molécula de DNA principal e
podem também fundir-se com ela. Para além destes vetores mais conhecidos, são usados
ainda os lipossomas. Estes são, no essencial, esferas formadas por camadas bilipídicas
preenchidas com DNA. Fundem-se espontaneamente com a membrana celular, libertando
o seu conteúdo no citoplasma. Desta forma, a mesma enzima de restrição que atua no
DNA com o gene de interesse, agora atua sobre o vetor, cortando a cadeia de DNA deste
em zonas específicas, expondo uma sequência nucleotídica complementar. As
extremidades coesivas do fragmento ligam-se, então, à cadeia exposta de DNA do vetor,
estabelecendo-se ligações de hidrogénio entre bases complementares. A enzima DNA
ligase promove a formação de ligações fosfodiéster (ligação com o fosfato – ligação entre
nucleótidos complementares entre duas cadeias) entre as extremidades coesivas de cada
uma das moléculas de DNA.
Desta forma, é produzida uma molécula híbrida estável, o DNA recombinante.

Figura 7- Atuação da enzima DNA ligase

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Uma vez preparados os vetores é necessário inseri-los em células bacterianas. Assim,

os vetores são postos em contacto com estas células. Mas, só, algumas bactérias
conseguem absorver o DNA novo, sendo necessário selecionar as bactérias que realmente
incorporaram o DNA recombinante.
Para facilitar a identificação das bactérias que incorporaram o DNA recombinante, os
engenheiros da engenharia genética utilizam os plasmídeos que possuem genes que
apresentem resistência a determinado antibiótico. Estes plasmídeos são colocados em
contacto com bactérias sensíveis ao antibiótico, sendo que algumas destas os incorporam.
Para selecionar as bactérias que incorporaram o plasmídeo basta adicionar o antibiótico
ao meio de cultivo. Todas as bactérias sem o plasmídeo morrem, restando somente as que
possuem o plasmídeo com o gene para resistência ao antibiótico. Estas bactérias
reproduzem-se e todos os clones resultantes possuirão o plasmídeo com o gene novo.

Figura 8- Utilização do plasmídeo na técnica do DNA Recombinante

Assim, esta técnica permite, por exemplo, introduzir porções de DNA provenientes de
vários organismos num microrganismo, e permite a produção de inúmeras cópias do gene
(que poderão ser armazenadas nas bibliotecas de genes) ou da proteína codificada por
este.

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Técnica de DNA complementar

O cDNA é obtido a partir da transcrição inversa de moléculas de RNA mensageiro
(mRNA) funcional. Isto é cDNA é obtido a partir do mRNA por complementaridade de
bases, um mRNA que já sofreu o processamento (não contêm intrões – elementos que não
conseguem codificar a sequência).
A produção de cDNA é possível por ação da enzima transcriptase reversa. O mRNA
funciona como molde para a síntese de uma cadeia de DNA, um processo inverso do que
se passa habitualmente na transcrição.
Após a formação da primeira cadeia de cDNA, a DNA-polimerase forma a cadeia
complementar, constituindo - se uma molécula estável.

Figura 9- Transcrição e da transcrição reversa (presença da enzima transcriptase reversa)

Figura 10- Os cientistas recorrem a esta técnica quando se torna necessário clonar genes sem os seus intrões

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Os cientistas recorrem ao DNA complementar (cDNA) quando se pretende clonar genes

sem os seus intrões. As bactérias utilizadas, por exemplo, na técnica do DNA
Recombinante, por serem seres procariontes, não sofrem o processamento do DNA, desta
forma, quando se incorporam genes com intrões nestes seres, eles executam a sua
transcrição ininterruptamente, incluindo os intrões, gerando uma proteína diferente da
desejada. Assim, é inserido um clone de cDNA, de modo a garantir a produção correta da
proteína.
Para além disto, a comparação entre a molécula de cDNA, que não possui intrões, com
a molécula de DNA original permite localizar os exões, ou seja, as regiões que
verdadeiramente contribuem para a produção da proteína. Enquanto os intrões, são as
regiões que não conseguem codificar um determinado gene. É importante referir ainda que
a descoberta da transcriptase reversa e do seu mecanismo de ação e, consequentemente,
da tecnologia do cDNA, abriu um importante caminho na biologia molecular. A molécula de
RNA é extremamente instável e, dependendo do RNA em questão, o número de cópias
pode estar muito limitado. Desta forma, a possibilidade de se trabalhar com cDNA em invés
de RNA, tem facilitado muito o trabalho dos cientistas, já que o cDNA é uma molécula
estável e a sua multiplicação é bastante simples.

PCR
A PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) é uma técnica que permite amplificar
qualquer porção de DNA de uma única célula.
O objetivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico
de DNA a partir de uma quantidade mínima (exemplo: uma gota de sangue, um fio de
cabelo, …). O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas, obtendo-se
milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse.
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes.
1. Desnaturação: O DNA genómico contendo a sequência a ser amplificada é
desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla
fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
2. Hibridização: Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma
fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita
oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar
à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à
sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que
se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.

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3. Extensão ou polimerização: Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase

adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se
novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma
temperatura de 72°C.

Figura 11- Reações de polimerização em cadeia

Aplicações das Técnicas

 Técnica de DNA recombinante
- Investigação fundamental – esta técnica permite isolar genes de organismos
complexos e estudar as suas funções a nível molecular.
- Obtenção de organismos geneticamente modificados (OGM). Os OGM ou
transgénicos são organismos cujo genoma foi manipulado, apresentando
diferenças relativamente à sua constituição original. Esta manipulação permite:
 Produção de alimentos em maior quantidade e qualidade:
 Resistência biológica a pragas e doenças específicas, reduzindo-se
a necessidade de pesticidas químicos e diminuindo-se o risco de
perdas nas plantações e aumentando a produção;

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 Adaptabilidade a condições adversas de crescimento, tais como

seca, solo com alto teor de sal e temperaturas extremas. Por
exemplo, modificando a produção de ácido linoleico de uma planta,
esta pode resistir melhor a temperaturas baixas;
 Características funcionais desejáveis, como o retardo no
amadurecimento, aumento do conteúdo de amido, ou uma
durabilidade maior. Por exemplo, com o rDNA, batatas modificadas
podem ter um conteúdo maior de amido, absorvendo menos óleo
quando fritamos, resultando em batatas fritas com menos gordura.
Também tomates modificados de forma ao seu amadurecimento ser
retardado podem permanecer no tomateiro por mais tempo,
resultando num sabor e numa cor melhores antes de serem colhidos
e enviados para o mercado;
 Características nutricionais desejáveis, como a alteração do
conteúdo de proteínas ou gorduras. Alimentos enriquecidos
nutricionalmente podem até mesmo ajudar a prevenir doenças
crónicas, por conterem níveis ótimos de nutrientes.
- Produção de grandes quantidades de substâncias com aplicação farmacêutica ou
médica.
- Produção de substâncias com aplicação industrial – A manipulação genética de
organismos pode ser posta em prática para produção de certas proteínas de
interesse para a indústria têxtil. Um exemplo disto é proteína da seda produzida por
bactérias geneticamente modificadas tendo como objetivo o melhoramento das
propriedades da fibra. Também na produção de corantes são usados
microrganismos.
- Tratamento de doenças – Por exemplo, o rDNA permitiu reverter os efeitos de
uma doença genética chamada imunodeficiência combinada grave ligada ao
cromossoma X (SCID). Os indivíduos que sofrem desta doença são obrigados a
viver em ambientes completamente isolados já que o seu sistema imunitário não
defende o corpo de infeções. Num destes casos, a doença impede a produção de
glóbulos brancos pela medula óssea. Assim, os cientistas retiram do vírus (vetor)
os genes que o tornam capaz de causar doenças. No lugar destes, insere-se o gene
que produz, de forma correta, a proteína que se encontra defeituosa no paciente.
O vírus modificado é misturado com células da medula óssea retiradas dos
pacientes, infetando-as. Com o gene terapêutico, as células passam a produzir a
proteína responsável pela estimulação das células de defesa, fazendo com que
estas se desenvolvam e se espalhem pelo corpo, destruindo os invasores.

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Figura 12- Aplicações do DNA recombinante

 Técnica de DNA complementar

- Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse – torna
possível a produção de proteínas humanas por procariontes que podem ser
cultivados facilmente em biorreatores.

 PCR
- Diagnóstico de doenças infeciosas e genéticas;
- Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão;
- Determinação de variabilidade genética;
- Deteção de OGMs;
- Sexagem de embriões;
- Estudo da expressão génica;
- Grande potencial na Medicina Forense (impressão digital de DNA).

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Referências
 Amparo Silva, Maria Santos, Almira Mesquita, Ludovina Baldaia, José Félix,
“Terra, Universo de Vida – Biologia 12ºano
 Salsa, José (2005). CienTIC. Retirado em 10 de Janeiro de 2016 em:
http://www.cientic.com/tema_heredit.html
 Gonçalves, Fabiana Santos. InfoEscola. Retirado em 10 de Janeiro de 2016 em:
http://www.infoescola.com/biologia/engenharia-genetica/
 Genética em Movimento. Retirado em 10 de Janeiro de 2016 em:
https://sites.google.com/site/geneticaemmovimentoo/musicas
 Bioesc`s. Retirado em 12 de Janeiro de 2016 em:
https://bioesc.wordpress.com/patrimonio-genetico/
 Galvão, João (2011, março). Diário de Biologia. Retirado em 12 de maio de 2016
em: http://diariodebiologia12.blogspot.pt/2011/03/fundamentos-da-engenharia-
genetica.html;
 Martins, Ana Silva (2006, setembro). BioHelp. Retirado em 12 de maio de 2016
em: http://biohelp.blogs.sapo.pt/2575.html
 Silva, Wesley Carlos . Ebah. Retirado em 12 de maio de 2016 em:
http://www.ebah.pt/content/ABAAAAJoQAB/pcr;
 Smith, Yolanda. News medical. Retirado em 13 de maio de 2016 em:
http://www.news-medical.net/life-sciences/Recombinant-DNA-Applications-
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 Moreira, Carlos e Mendes, David (2000, junho). Evunix. Retirado em 13 de maio
de 2016 em:
http://evunix.uevora.pt/~sinogas/TRABALHOS/1999/foco99_vectores.html#_Toc43
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