Isolasi dan Purifikasi Protein

Edited by: Elfandari Taradipa

Source: Departemen Biokimia & Biologi Molekuler FKUI

Teknik isolasi dan purifikasi

• Merupakan proses hilir dalam bioteknologi

• Tidak kurang penting dibanding proses hulu – rekayasa genetik, teknik fermentasi

• Yang diolah – produk dari proses terdahulu

• Protein – produk dari rekayasa genetika

• Yang paling banyak – isolasi / purifikasi protein dari tumbuhan, hewan, mikroorganisme

Teknik isolasi / purifikasi – dapat dalam

• skala laboratorium

• skala industri

Sebelum melakukan isolasi – penting diperhatikan sumber produk yang akan diisolasi

• Hewan

• Tumbuhan

• Mikroorganisme

< tahun 1970 an – digunakan sumber dari

• hewan

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 - tripsin, lipase, rennin

- mahal, sumber terbatas

• tumbuhan

- papain, bromelain, amilase, lipoksigenase

- dipengaruhi cuaca, politik

Sumber dari mikroorganisme

- banyak digunakan setelah perkembangan teknologi fermentasi

- relatif lebih murah

ISOLASI

Metode isolasi tergantung

• Sumber produk

• Skala produksi (lab / industri)

• Stabilitas produk

• Bentuk murni / tidak murni

Proses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / lokasi produk yang akan disolasi

• Intrasel

• Ekstrasel

• Terikat membran

• Protein larut intrasel dari tumbuhan – teknik isolasi tidak rumit – karena jaringan lunak, mudah
dihancurkan

• Protein intrasel dari mikroorganisme – lebih liat – perlu metode lebih kuat

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 • Protein terikat membran – masalah tersendiri – tidak tergantung sumber

Metode penghancuran (lisis) sel

1. Abrasif

- dengan blender laboratorium dengan butiran gelas (glass beads)

2. Liquid shear

- suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi melalui lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan
atmosfir

- karena perbedaan tekanan mendadak – sel pecah

- untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras – misal bakteri Gram negatif

3. Osmotic shock

- sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipotonik sehingga sel lisis

- protein dilepaskan dari sel yang lisis

- tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan

4. Penambahan alkali

- metode paling sederhana untuk melisis sel

- sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 – 12,5

- protein yang diisolasi harus stabil selama 20 – 30 menit pada pH tinggi tsb

5. Penambahan deterjen.

- selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengalami denaturasi

- untuk isolasi protein terikat membran

6. Solid shear

- dengan membekukan sel - 20 oC, dipaksa melalui lubang kecil pada tekanan tinggi

7. Penambahan lisozim dan EDTA

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 - cocok untuk skala kecil karena mahal

- efektif untuk sel bakteri

8. Pelarut organik

- toluen dan aseton – untuk melisis berbagai sel

- tidak untuk skala besar – toksik, mahal, mudah terbakar

9. Sonikasi

- lisis sel dengan getaran ultrasonik

- untuk skala kecil

PURIFIKASI (PROTEIN)

Pemurnian (purifikasi) DNA bertujuan untuk menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa

sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein. Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA
dilakukan menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim RNAse. Senyawa
kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi mendenaturasi protein sedangkan enzim RNAse
berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut. Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan
menggunakan isopropanol dingin yang bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul
sekaligus memisahkannya dari garam-garam mineral sisa CTAB. Pelet hasil presipitasi oleh isopropanol
ini dibersihkan menggunakan alkohol 70 %. Pemurnian ini merupakan tahapan paling penting dalam
Isolasi DNA. Karena bila ada kontaminan selain DNA maka hasil isolasi DNA yang dilakukan diangap
gagal. Kontaminasi ini dapat menurunkan kualitas DNA hasil isolasi dan mengakibatkan data yang
didapat tidak valid.

Reagent-reagent yang umum digunakan dalam teknik isolasi DNA yaitu Nitogen Cair, Polyvinyl
Pyrrolidone (PVP), Bufer CTAB, Mercaptoethanol, CHISAM, isopropanol dingin, bufer Tris-EDTA (TE),
RNAse, dan ethanol 70%. Sedangkan alat-alatnya adalah sebagai berikut, yaitu Mortar dan Pestle,
Tabung Nitrogen, Tube Eppendorf 1,5 ml atau 2 ml, mikropipet, oven, freezer, mesin elektrofotometer,
mesin spektrofotometer, mesin sentrifuse, pipet tip 1000 µl dan 20 µl.

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 Pada waktu lisis sel – seluruh isi sel keluar – banyak kontaminan oleh karena itu harus disingkirkan,
antara lain asam nukleat

Asam nukleat – meyebabkan viskositas tinggi – pada tahap awal harus disingkirkan

• Presipitasi – penambahan polikation BM (protamin, streptomisin, polietileneimin) – mahal

• Digesti – dengan nuklease – mudah, murah

Setelah asam nukleat disingkirkan – sisa sel yang tidak larut (dinding sel, protein membran, bagian sel
yang hancur) harus disingkirkan dengan

• Sentrifugasi – sangat baik untuk solid yang bersifat licin (slimmy or gelatinous solids)

• Filtrasi

Sentrifugasi

• Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.000 xg

• Dapat memisahkan organel sel

berdasarkan massa dan densitasnya

- 3000 g = sel dan nukleus

- 12.000 g = mitokondria / kloroplas

- 100.000 g = mikrosom, ribosom

Penyingkiran asam nukleat + debris sel (=presipitat, pelet) - menghasilkan supernatan yang
mengandung

- protein yang diinginkan

- kontaminan (protein yang tidak diinginkan, molekul organik dan inorganik)

Penyingkiran kontaminan – presipitasi dengan

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 • Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi

- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkan

dengan konsentrasi yang lebih tinggi

- paling banyak digunakan

- pada skala besar – masalah penanganan dan pembuangan – korosif

• Natrium sulfat

- tidak bersifat korosif

- kelarutan rendah, perlu suhu > 35 o C untuk fraksinasi

• Pelarut organik

- skala lab, jarang skala industri karena mudah terbakar

• Polimer

- polietilen glikol (PEG)

- tidak toksik

- tidak mudah terbakar

- penggunaan terbatas karena meningkatkan viskositas larutan

- polyacrylic acid

- non toksik

• Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)

Pemisahan selanjutnya (fraksinasi) – melibatkan 3 komponen

1. Fasa solid / stasioner

- berupa film, kolom, gel atau membran

2. Pelarut

- fasa mobil pada kromatografi

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 3. Solut

- molekul yang harus dipisahkan

Pada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan

Sifat Prosedur
Muatan - kromatografi pertukaran ion

- elektroforesis
Polaritas - kromatografi adsorpsi

- kromatografi kertas
Ukuran molekul - dialisis dan ultrafiltrasi

- gel elektroforesis

- kromatografi gel filtrasi

- ultrasentrifugasi
Spesifisitas - kromatografi afinitas

Dialisis

• Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam (molekul kecil) dan kontaminan berukuran
kecil

• Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berpori kecil

• Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandung akuades / bufer, sambil di putar dengan
pemutar magnetik semalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapa kali dalam wadah

• Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekul besar tertahan di dalam kantong

• Dapat untuk memekatkan larutan – dengan meletakkan kantong dialisis dalam polimer desikan ,
misal polietilen glikol

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 Kromatografi

Pemisahan molekul berdasarkan perbedaan struktur dan atau sifat fisik pada saat berinteraksi dengan

• fasa mobil

• fasa stasioner (matriks)

- kertas saring ( krom. kertas)

- lapis tipis selulosa / silika / alumina – kromatografi lapis tipis

Kromatografi Kertas

• Beberapa tetes larutan yang mengandung komponen yang akan dipisahkan diteteskan pada
sepotong kertas – dibiarkan kering

• Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang terdiri dari campuran pelarut polar dan nonpolar

• Komponen polar akan terikat pada kertas membentuk fasa stasioner, sedangkan komponen
nonpolar bergerak membentuk fasa mobil

• Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahkan berdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa
stasioner atau fasa mobil – koefisien partisi

• Setelah bergerak dalam jarak tertentu – kromatogram diangkat dan dikeringkan

• Dideteksi dengan

- radioaktif

- sinar UV

- pewarnaan dengan zat warna

• Kecepatan migrasi – Rf (rate of fractionation)

– perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh solven

Kromatografi kolom

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 • Fasa stasioner – kolom butiran kecil selulosa / akrilamid/ silika

• Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasarkan

- muatan

- interaksi hidrofobik

- interaksi ligan

• Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom, kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)

• Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fraksi-fraksi dengan volume tertentu

Matriks yang digunakan

Cross-linked dextran (Sephadex)

Agarosa (Sepharose, Biogel)

Cross-linked agarosa (Sepharose CL)

Poliakrilamid (Biogel P)

Porous glass (Bio-glass)

Polistiren (Bio-beads)

Kromatografi Partisi

• Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan afinitas relatif berbagai protein terhadap fasa
mobil dan fasa stasioner

• Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akan tertahan

• Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matriks tergantung dari komposisi fasa stasioner dan
fasa mobil

• Pemisahan protein optimal – diperoleh dengan manipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 Kromatografi Berdasarkan Ukuran Molekul (Filtrasi Gel, Size Exclusion Chromatography)

• Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran molekul dan melewatkannya melalui kolom gel
yang telah mengembang

• Yang paling banyak dipakai – Sephadex – partikel kecil hidrofilik, tidak larut karena cross-linking
dekstran membentuk jaringan 3 dimensi

• Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertahan, karena masuk ke dalam butiran gel

• = Molecular sieving

• Dapat memperkirakan BM suatu sampel

Kromatografi adsorpsi

• Teknik kromatografi paling tua – I x digunakan oleh Tswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan

• Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom – terjadi keseimbangan antara molekul yang terikat pada
matriks

dengan yang terdapat di dalam pelarut

• Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan van der Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen,
struktur senyawa yang dipisahkan

• Adsorben – alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel

• Eluen – kloroform, heksan, etil eter, campuran pelarut organik

Kromatografi pertukaran ion

• >> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kecil

• Matriks – bahan inert dengan gugus terionisasi – DEAE selulosa, CM selulosa

• Atom N dari DEAE pada pH < 9 – mengikat molekul bermuatan negatif – disebut penukar anion
(anion

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 exchanger)

• CM selulosa – penukar kation (cathion exchanger)

• Peluruhan protein – berdasarkan muatan atau konsentrasi garam dalam bufer

• Penting diperhatikan – resin yang dipakai, pH, ionic strength larutan bufer

Kromatografi afinitas

• Ligan – terikat secara kovalen pada matriks porous yang inert

• Ligan

- spesifik – substrat, analog, inhibitor

- umum – AMP, hidrokarbon, zat warna

• Dalam skala besar jarang digunakan – mahal, keterbatasan kapasitas, tidak stabil

• Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepat

Kromatografi lapis tipis

• Pemisahan senyawa pada lempeng tipis

• Dasar – adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel

• Berlangsung cepat

• Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus

• Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu

– diukur kadarnya secara spektrofotometri

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

• Separasi berdasarkan – adsorpsi, pertukaran ion atau filtrasi

• Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolom dengan tekanan tinggi (sp 5000 psi)

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 • Eluat dideteksi dengan mengukur serapan pada gelombang UV

• Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat mengukur sampai ng

• Sering digunakan untuk steroid, vitamin

Elektroforesis

• Merupakan teknik pemisahan protein yang paling sering digunakan di lab

• Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalam medan listrik

• Pada pH > pI, protein bermuatan negatif – bergerak ke anoda; pada pH < pI, protein bermuatan
positif – bergerk ke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak

• Matriks yang digunakan – membran selulosa asetat, starch gel, akrilamid, agarosa

SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

• SDS = Sodium dodecyl sulphate

• Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked – membentuk matriks yang porous

• SDS – membuat protein bermuatan negatif, sehingga pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan
bergerak dalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul

• Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibanding molekul kecil

• Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna – Coomassie blue

Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan

• Pengukuran volume sampel

• Penetapan kadar protein

 Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir penetapan – untuk mengetahui seberapa jauh terjadi
pemurnian produk

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncak setelah melalui berbagai tahap purifikasi – presipitasi,
krom pertukaran ion, filtrasi gel, krom afinitas – dapat dikatakan protein telah murni

Bila mungkin – protein murni disimpan dalam bentuk kristal

IDENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEIN DALAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI

- secara spektrofotometri

- serapan pada  280 nm (sinar UV)

- serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna yang bereaksi dengan asam amino / protein

- ninhidrin ( biru )

- biuret (lembayung)

- Bradford (biru)

- fluoresamin

Dibandingkan terhadap serapan larutan standar yang diketahui kadarnya

Untuk enzim – dihitung aktivitas dan aktivitas spesifik pada setiap tahap purifikasi

• Aktivitas (Unit) enzim = jumlah protein yang dapat mengubah 1 mol substrat menjadi produk per
menit pada suhu 25o C pada pH optimum

• Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein

Elektroforsis DNA
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat
molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa
dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel
menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya
dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium
bromid.

Biasanya, gel agarose digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (>200bp) dan gel
poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (<200bp).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen, yaitu:

 Comb: untuk membentuk well pada gel agarose

 Tray: untuk cetakan gel agarose
 Chamber: sebagai wadah gel agarose
 Sumber listrik: untuk memberi arus saat proses elektroforesis

Dalam elektroforesis juga mebggunakan bahan seperti Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom
Fenol Blue, karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya flouresensi dari DNA sehingga dapat terlihat
jelas.

Alat dan Bahan:

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

  Alat:
1. Satu set alat elektroforesis
2. Mikropipet dan tip
3. Gel Doc./box UV
4. Power supply
5. Parafilm

 Bahan:
1. DNA Marker
2. Produk DNA
3. Ethidium Brommide (EtBr)
4. ddH2O
5. Gel Agarose
6. Loading dye
7. TAE Buffer
8. Aquades

Cara Kerja:

 Pembuatan Gel Agarose

1. 1 gram bubuk Agarose dilarutkan pada 50ml TAE Buffer
2. Campur bahan tersebut kemudian panaskan.
3. Diamkan agar-agar hingga suhunya menurun
4. Siapkan gen comb pada tangki elektroforesis
5. Tuangkan larutan Agarose pada tangki elektroforesis dan dinginkan
6. Setelah mengeras, angkat perlahan dan gel Agarose siap digunakan.
 Elektroforesis
1. Rendam gel Agarose dalam TAE Buffer

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 2. 1 μl loading dye dicampur 3 μlproduk DNA pada parafilm yang sudah tersedia dengan bantuan
mikropipet
3. Tuangkan campuran ke sumur/well pada gel Agarose
4. Tuangkan 3 μl DNA Marker pada sumur/well bagian bawah
5. Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan hubungkan ke power supply
6. Nyalakan power supply (400 mA, 90V) selama 30 menit
 Dokumentasi
1. Rendam gel agarose hasil elektroforesis dalam larutan EtBr selama kurang lebih 15 menit
2. Kemudian rendam dalam aquades selama kurang lebih 15 menit
3. Visualisasikan dengan Gel Doc. dan kemudian ambil gambarnya.

Keterangan: eter dapat ditambahkan pada larutan Agarose.

PCR ( Polymerase Chain Reaction )

PCR adalah salah satu teknik atau metode untuk memperbanyak DNA secara IN vitro. Teknik ini di
kembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985 dengan mengunkan Klenow polymerase. Namun pada tahun
1988 klenow polymerase diganti dengan DNA Polymerase.
Secara umum, komponen-komponen yang diperlukan pada saat proses PCR;

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 1. DNA Tamplate
• Berfungsi sebagai cetakan untuk amplifikasi atau perbanyakan DNA baru yang sama
(DNA Template)
2. Sepasang Primer
• Primer adalah suatu urutan DNA dengan panjang berkisar antara 18-30 pasang basa
yang bersifat komplemen terhadap DNA template)
3. dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates) – 200 mikroM
• merupakan campuran yang teridi atas dATP, dTTP, dCTP dan dGTP.
• dNTPs itu berfungsi sebagai building block DNA.
4. Buffer PCR
• Berfungsi untuk menjaga pH tetap pH medium.
5. Magnesium klorida (MgCl2)
• Berfungsi sebagai kofaktor yang menstimulasi aktivitas DNA polymerase.
6. Enzym Polymerase DNA,
• Berperan sebagai katalisis untuk reaksi polimerasi DNA.
• Fungsinya dalam proses ekstensi atau perpanjangan DNA yang baru.
• DNA Polimerase ini di dapatkan dari isolas bakteri hipertermofilik, yang bertujuan agar
enzyme tahan terhadap suhu tinggi.

TAHAP-TAHAP PCR
PCR memiliki 3 tahap, yaitu;
1. Denaturasi
• Denaturasi merupakan proses pemutusan ikatan hydrogen DNA, sehingga menjadi berkas DNA
tunggal.
• Proses ini berlangsung pada suhu 94-960C (di IT 940C)
• Berlangsung selama 5 menit

2. Penempelan (annealing)
• Anneling adalah proses penempelan primer pada bagian DNA Tamplat yang komplementer
urutan basanya.
• Proses ini berlangsung pada suhu 50-65oC (di IT 500C)
• Berlangsung selama 1-2 menit

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 3. Pemanjangan (elogasi)
• Elogasi adalah proses pemanjangan dengan Taq-polimerase,
• Poses ini berlangsung pada suhu 720C. –sesuai suhuoptimum Enzim Taq.

Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhir siklus PCR dapat dihitung secara
teoritis menurut rumus:

Y=(2n –2n)X
Y : jumlah amplicon
n : jumlah siklus
X : jumlah molekul DNA templat semula

Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlah amplicon yang diperoleh pada akhir
proses PCR adalah 1.074 x 109. Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan teknik PCR
dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan (amplicon) secara eksponensial dalam waktu
relatif singkat.
Umumnya jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30 siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih
dari 30 siklus tidak akan meningkatkan jumlah amplicon secara bermakna dan memungkinkan peningkatan
jumlah produk yang non-target.

Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh
target templat terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya reannealing
untai target.

Tipe-tipe PCR

Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR.
Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Teknik ini
dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut. Pada analisa PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan
pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis, namun analisa menggunakan Real-Time PCR

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung. Pada Real TimePCR pengamatan
hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan
penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time
mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.
o Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) merupakan metode yang digunakan untuk
mengamplifikasi cDNA dari mRNA. RT-PCR digunakan untuk mendapatkan kembali dan menyalin utas 5’ dan 3’
dari mRNA, menghasilkan kumpulan cDNA yang banyak dari jumlah mRNA yang sangat sedikit. RT-PCR dapat
dengan mudah digunakan untuk mengidentifikasi mutasi, polimorphisme dan mengukur kekuatan ekspresi
gen. Konsep utama yang digaris bawahi pada teknik ini yaitu mengkonversi mRNA ke bentuk rantai tunggal
untuk cetakan cDNA. Primer Oligodeoxynukleotida di hibridisasikan ke sehingga cDNA dapat teramplifikasi.
Tergantung pada tujuan penelitian, primer untuk sintesi cDNA rantai pertama dapat disusun secara khusus
untuk hibridisasi gen target atau dapat mengikat secara umum semua mRNA.

Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (reverse transcriptase). Enzim transcriptase balik adalah
enzim DNA polymerase yang menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk mensintesis molekul DNA
(cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim transcriptase balik yang dapat
digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis
(AMV) maupun oleh virus moloney murine leukemia (M- MuLV), dan Tth DNA polymerase. RTase yang dikode
oleh AMV maupun M-MuLV mampu mensintesis cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA
polymerase mampu mensintesis cDNA sampai sepanjang 1 – 2 kb.
Berbeda dengan Tth DNA polymerase, enzim RTase AMV dan M-MuLV mempunyai aktivitas RNase H yang
akan menyebabkan terjadinya degradasi RNA dalam hybrid RNA: cDNA. Aktivitas degradasi semacam ini akan
berkurang jika berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai pertama cDNA. Enzim
RTase yang berasal dari M-MuLV mempunyai aktivitas RNasse H yang lebih rendah disbanding dengan yang
berasal dari AMV.
Enzim M-MuLV mencapai aktivitas maksimum pada suhu 37°C sedangkan enzim AMV pada suhu 42°C dan Tth
DNA polymerase mencapai aktivitas maksimum pada suhu 60 - 70°C. Penggunanaan enzim M-MuLV kurang
menguntungkan jika RNA yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur sekunder yang ekstensif. Di
lain pihak, penggunaan Tth DNA polymerase kurang menguntungkan jika ditinjau dari kebutuhan enzim ini
terhadap ion Mn karena ion Mn dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis DNA. Meskipun demikian,

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan karna dapat digunakan untuk reaksi transkripsi balik
sekaligus proses PCR dalam satu langkah reaksi.
Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa macam primer yaitu:
a. Oligo (dT) sepanjang 12-18 nukleotida yan akan melekat pada ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA mamalia.
Primer semacam ini pada umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap
b. Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan mRNA yang komplementer pada bagian manapun.
Primer semacam ini akan menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial).
c. Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan secara selektif untuk menyalin mRNA tertentu (Yuwono T
2006)

o Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA
menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi
fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan
bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR
adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Nested PCR dan PCR biasa berguna untuk
memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang
primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen DNA
dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam
reaksi nested PCR lebih lama dari pada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR
sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan
kesalahan amplifikasi gendengan menggunakan 2 pasang primer. Mekanisme kerja dari nested PCR sendiri
yakni pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan. Fase
Penempelan, sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di
antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR
pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di manapasangan primer kedua (nested primer) akan
mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi
bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens
DNA hasil PCR pertama.

Adanya perbedaan target DNA yang ingin diteliti serta pola fragmen yang berbeda menjadikan nested PCR ini
banyak digunakan. Dengan adanya perbedaan seperti itu maka teknik nested PCR dikembangkan sesuai tujuan
dan kegunaannya. Beberapa pengembangan teknik nested PCR adalah:

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

1. Random amplified polymorphic DNA (RAPD)
RAPD adalah teknik molekuler untuk mendeteksi keragaman DNA didasarkan pada penggandaan DNA. RAPD
juga merupakan penanda DNA yang memanfaatkan primer acak oligonukleotida pendek (dekamer) untuk
mengamplifikasi DNA genom organisme. Prinsip teknik RAPD didasarkan pada kemampuan primer menempel
pada cetakan DNA. Primer yang didesain berupa primer tunggal pendek agar dapat menempel secara acak
pada DNA genom organisme. Dengan demikian akan terdapat banyak pola fragmen DNA. Perbedaan ini dapat
dilihat dengan adanya pola pita pada gel agarosa setelah diwarnai dengan pewarnaan DNA seperti etidium
bromide. Disamping ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik ini
ditentukan juga oleh kemurnian dan keutuhan DNA cetakan. DNA cetakan yang tidak murni akan mengganggu
penempelan primer pada situsnya dan akan menghambat aktifitas enzim polymerase DNA. Enzim ini berfungsi
untuk melakukan polimerisasi DNA. Sedangkan DNA cetakan yang banyak mengalami fragmentasi dapat
menghilangkan situs penempelan primer.

Keunggulan teknik RAPD terletak pada beberapa kemudahan sebagai berikut:

a. Pengetahuan latar belakang genom organisme tidak diperlukan
b. Hasil RAPD dapat diperoleh secara cepat terutama jika dibandingkan
dengan analisis RFLP yang memerlukan banyak tahapan
c. Beberapa jenis primer arbitrary dapat dibeli dan digunakan untuk analisis
genom semua organisme
Kelemahan RAPD sebagai berikut:
a. Pemunculan pita DNA kadang – kadang tidak konsisten. Hal ini lebih sering terjadi jika suhu annealing yang
digunakan terlalu tinggi. Dalam analisis kekerabatan hal ini dapat diatasi dengan menggunakan primer yang
lebih banyak.
b. Ruas DNA yang berulang sering berlipat ganda (Talbert et al.1994)
c. Homologi urutan nukleotida pada pita-pita DNA dengan mobilitas yang
sama pada gel tidak diketahui
d. Penanda RAPD bersifat dominan

2. Amplified fragment lengh polymorphism (AFLP)

AFLP merupakan teknik amplifikasi DNA yang segera dapat dilihat perbedaan fragmennya setelah PCR melalui
gel agarose atau poliakrilamid. Teknik ini dapat digunakan untuk melihat adanya fragmen DNA yang berbeda
karena adanya insersi ataupun delesi basa nukleotida dalam jumlah yang cukup besar. AFLP merupakan teknik
yang lebih sensitive dari RAPD untuk menghasilkan polimorfisme antar genotip. AFLP banyak digunakan di

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

antaranya untuk mendeteksi sifat-sifat yang berhubungan erat dengan lokus suatu karakter tertentu, sidik jari
DNA, keragaman genetic, penelusuran pola segregasi penelusuran hasil mutasi, menetapkan jarak genetic dan
mengidentifikasi keterpautan gen dengan resistensi penyakit. AFLP memiliki beberapa kelebihan dibandingkan
dengan RAPD antara lain amplifikasi DNA dapat bersifat spesifik dan lebih stabil. AFLP dapat digunakan untuk
mengenali hubungan kekerabatan yang sangat dekat antar-genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar,
keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit, atau adanya perbedaan genetik yang
sangat kecil.
Fragmen yang dihasilkan dari analisis AFLP yang tampak sebagai pita DNA diterjemahkan menjadi data biner
berdasarkan ada atau tidaknya pita yang dimiliki secara bersama oleh individu tanaman yang dianalisis. Nilai
satu (1) diberikan untuk yang memiliki pita dan nilai nol (0) untuk yang tidak memiliki pita.

3. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

RFLP merupakan teknik PCR yang menggunakan enzim restriksi untuk mendeteksi keragaman DNA. Amplikon
dipotong dengan menggunakan enzim restriksi untuk mendapatkan fragmen DNA. Enzim restriksi yang
umumnya digunakan yaitu enzim yang biasanya ditemukan pada organisme prokariotik. Organisme yang
menghasilkan enzim restriksi endonuklease mampu melindungi genomnya sendiri dari metilasi nuklotida di
dalam sekuen endonuklease yang dikenali. Secara umum ada dua macam tipe enzim restriksi yaitu:
a. Enzim yang mengenali sekuen spesifik tetapi memotong dibeberapa tempat
b. Enzim yang memotong hanya pada situs yang dikenali
Tipe enzim yang kedua yaitu enzim yang sangat penting. Umumnya
sekuen potongannya diketahui. Biasanya panjangnya enzim restriksi ini 4 sampai 6 nukleotida. Enzim pada
kelompok ini membuat bentuk potongan yang berbeda yaitu:
a. Bentuk potongan yang lancip
b. Bentuk potongan yang tumpul

4. Single strand conformation polimorphim (SSCP)

Single strand conformation polimorphims merupakan salah satu teknik PCR yang dapat mendeteksi
perbedaan nukleotida dari DNA produk PCR dengan perbedaan satu nukleotida. Metode ini memanfaatkan
perbedaan laju migrasi utas tunggal DNA setelah didenaturasi dalam formamide dye dan perlakuan panas
pada gel poliakrilamid yang diikuti dengan pewarnaan perak.
Gerakan pita ganda DNA pada gel elekroforesis pada umumnya tergantung pada ukuran dan panjang basa.
Sedangkan gerakan pita tunggal sangat jelas dipengaruhi oleh perubahan yang sangat kecil dalam sekuen.

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

Perubahan yang sangat kecil jelas terjadi karena secara alami pita tunggal tidak stabil. Dengan demikian dapat
terjadi lekukan karena ada atau tidak adanya pita pasangannya yang menyebabkan pasangan basa terletak
diantara pita dan menghasilkan struktur pita 3D yang unik. Perubahan satu nukleotida berpengaruh terhadap
gerakan dalam gel elektroforesis. Untuk mendapatkan pita tunggal, amplikon dipanaskan pada suhu tinggi dan
kemudian didinginkan secara mendadak. Pita tunggal yang diperoleh dirunning pada gel poliakrilamid.

o Multiplex-PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal
untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan
penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan
membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. Temperatur Annealing untuk
masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran
amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda
ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel

o PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat
yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian
hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan
pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan
metode Real Time PCR. PCR- ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk
mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi
sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari
sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah
sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam
membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang
mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

o Touchdown PCR
Sebuah modifikasi dari PCR yang mencegah amplifikasi sekuens nonspesifik
dengan mempermainkan suhu annealing. sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi latar
belakang spesifik secara bertahap menurunkan suhu anil sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 ° C) di atas m T primer yang digunakan, sedangkan pada siklus
kemudian, ini adalah beberapa derajat (3-5°C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang
lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin lebih amplifikasi efisien dari produk
tertentu terbentuk selama siklus awal.
Masih banyak jenis modifikasi dari PCR ini, seperti :
 Allele-specific PCR
 Assembly PCR
 Assymetric PCR
 Dial-out PCR
 Hot start PCR, dan lainya.

ELISA

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ialah suatumetode untuk menguji kadar protein yang terikat
pada antibodi atau untuk mengetahui kadar suatu antibodi pada sampel. ELISA terbagi menjadi tiga yakni :
1) ELISA Kompetitif
Antigen yang sudah ditandai dikompetisikan dengan pada antibodi primer dengan

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 antigen sampel. Semakin banyak antigen pada sampel, maka semakin sedikit antigen yang telah
ditandai yang tersisa di dalam well.
2) ELISA Sandwich/ELISA direct
Pada ELISA sandwich dimasukkan antibodi primer kemudian dimasukkan target protein. Setelah itu
dimasukkan pula antibodi sekunder, antibodi HRP, kemudian antibodi 3. ELISA sandwich dilakukan
pada antigen yang memiliki minimal 2 sisi antigen.
Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1.         Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi
antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2.         Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer
3.         Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak
berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4.         Membilas protein yang tidak melekat.
5.         Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk berikatan
dengan antigen spesifik dari sampel.
6.         Membilas antigen yang tidak terikat.
7.         Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope yang
berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8.         Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9.         Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10.     Inkubasi sampai muncul warna.
11.     Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar
kadarantigen spesifi dalam sampel.

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

 3) ELISA Indirect
Perbedaan mendasar ELISA indirect dengan kedua jenis ELISA lainnya yakni yang mula-mula
dimasukkan adalah antigen. Setelah itu baru dimasukkan antibodi, antibodi sekunder, substrat, dan
stop solution untuk menghasilkan reaksi warna. ELISA indirect banyak digunakan untuk mendeteksi
dan mengukur antibodi.
Dalam proses pengerjaannya, tiap-tiap langkah setelah memasukkan antigen atau antibodi, dilakukan proses
pencucian guna membuang antigen ataupun antibodi yang tidak menempel pada dinding well. Setelah semua
langkah dikerjakan, hasilnya akan dibaca dan dihitung kadarnya pada ELISA reader.

Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:

1.            Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi
antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2.            Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 

3.            Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak
berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk)
4.            Membilas protein yang tidak melekat.
5.            Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody spesifik
untuk berikatan dengan antigen.
6.            Membilas antibody yang tidak terikat.
7.            Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik (sebagai
contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan
berikatan secara kovalen dengan enzim.
8.            Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9.            Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10.        Inkubasi sampai muncul warna, dan
11.        Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar
antibody spesifik dalam sampel.

Divisi Praktikum Beta 2014 Selamat Belajar 