BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental in vitro pada bakteri

Escherichia coli strain BL21(DE3) yang mengekspresikan gen pab. Gen ini

berasal dari M. tuberculosis dan disisipkan di pMB38 sebagai vektor.

4.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2013 sampai dengan

bulan Desember 2013 di Laboratorium Biomedik dan Laboratorium

Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Kelompok Sampel

Pada eksperimen ini, sampel di bagi ke dalam 4 kelompok

perlakuan dan 1 kelompok kontrol :

Tabel 4.1 Kelompok Kontrol dan Kelompok Perlakuan

No. Kelompok Kontrol Kelompok Perlakuan

1. E.coli/BL21(DE3)/pMB38 E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 ditumbuhkan di
ditumbuhkan di LB, 37°C LB, 37°C diinduksi dengan IPTG

2. E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 ditumbuhkan di

ditumbuhkan di 2XYT, 37°C 2XYT, 37°C diinduksi dengan IPTG

3. E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 ditumbuhkan di

ditumbuhkan di LB, 23°C LB, 23°C diinduksi dengan IPTG

4. E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 E.coli/ BL21(DE3)/pMB38 ditumbuhkan di

ditumbuhkan di 2XYT, 23°C 2XYT, 23°C diinduksi dengan IPTG

22
4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah media (LB dan

2XYT) dan temperatur (37°C dan 23°C).

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sintesa

protein Ag38 M. tuberculosis.

4.5 Bahan dan Instrumen Penelitian

4.5.1 Bahan Penelitian

a. Sampel

Sampel berupa konstruksi plasmid pMB38. Plasmid ini

adalah DNA kromosomal dari M. tuberculosis dalam bentuk

cDNA (pab 1260 bp) yang disisipkan ke vektor pGEM-Teasy

(Promega, USA) (3015 kb) (Raras dan Lyrawati, 2011).

b. Vektor Ekspresi

Vektor ekspresi yang digunakan adalah pPRoExHTc

dibawah kontrol promoter Trc (Raras dan Lyrawati, 2011).

c. Bakteri kompeten

Kultur bakteri yang digunakan untuk ekspresi Ag38 M.

tuberculosis adalah E. coli strain BL21 (DE3) dari hasil

peremajaan media LB padat yang disimpan pada suhu 4°C.

d. Media

Peremajaan kultur bakteri menggunakan media padat.

LB cair dan 2XYT cair digunakan untuk menumbuhkan sel.

e. Reagen Kimia

23
 Reagen kimia yang digunakan dalam penelitian ini

adalah Ampicilin, Isopropyl-B-Dthiogalactopyranoside (IPTG)

0,6 mM, yeast, tryptone, NaCl, peptone, agar,

NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4, KH2PO4, KCl, H2O, aquades, es,

Phenylmethylsulfonyl Fluoride (PMSF), DDl H2O,

acrylamide/Bis, gel buffer, SDS 10%, Tris Cl, Aps, TEMED,

Reducing Sample Buffer (RSB), commasive, alcohol 70%

dan Broad Spectrum Marker.

4.5.2 Instrumen Penelitian

Instrumen-instrumen yang digunakan dalam penelitian ini

antara lain petridish, beaker glass, tabung reaksi, Falcon 50 ml,

timbangan, stirrer, elektroforesis, Inkubator, waterbath, autoklaf,

laminar air flow, filter, vortex, cuvet, sheaker, minisentrifuse,

Laminar cabinet flow, sonicator, spektrofotometer, eppendorf, ,

mikropipet, white tip, yellow tip, blue tip, pH meter, ose, aluminium

foil, bunsen, korek api, dan wrap plastic

4.6 Prosedur Penelitian

4.6.1 Pembuatan Media

Media yang digunakan adalah Broth (LB) cair dan 2XYT

cair untuk larutan inokulum bakteri serta media agar padat untuk

peremajaan bakteri, LB cair dibuat dengan cara mencampurkan

1.75 gram yeast, 3.5 gram tryptone dan 3.5 gram NaCl ke dalam

tabung erlenmeyer. Kemudian dituangkan akuades hingga

mencapai volume setengh dari volume yang diinginkan (125 ml).

Larutan dihomogenisasi dengan stirrer dan diatur pHnya dengan

pHmeter hingga mencapai pH 7. Setelah mencapai pH 7,

dimasukkan akuades hingga mencapai volume 350 ml dan

24
 dihomogenisasi kembali. 350 ml larutan LB tersebut dibagi ke

dalam 4 tabung erlenmeyer dengan volume masing-masing 50 ml.

2 tabung digunakan untuk inokulum sekunder dan sisanya

digunakan untuk blanko. LB digunakan ajuga untuk membuat

media untuk inokulum primer dengan memasukkan LB ke dalam 6

tabung reaksi sebanyak 4 ml pada masing-masing tabung.

Media 2XYT dibuat dengan mencampurkan 2 gram yeast,

3.2 gram tryptone dan 1 gram Nacl ke dalam tabung erlenmeyer

dan akuades ditambahkan hingga mencapai volume 200 ml. 200

ml larutan 2XYT dibagi ke 4 tabung erlenmeyer dengan volume

50 ml pada setiap tabung. 2 tabung digunakan untuk inokulum

sekunder dan sisanya digunakan untuk blanko. Media agar padat

dibuat dengan cara melarutkan sejumlah agar ke dalam larutan LB

hingga mencapai volume 100 ml. Seluruh tabung ditutup dengan

kapas dan ditutup dengan aluminium foil. Selanjutnya, media

disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada temperatur

121°C.

4.6.2 Peremajaan Biakan Murni E. coli BL21(DE3)/pMB38 pada Media

Padat

Biakan murni E. coli BL21(DE3)/pMB38 diambil sebanyak

1 ose. Kemudian digoreskan pada media padat yang telah

ditempatkan pada petri dish dan dilakukan di dekat api.

Peremajaan bakteri dillakukan di dalam laminar air flow.

Selanjutnya, petri dish ditutup dan dibungkus dengan wrap

plastic. Bakteri diinkubasi pada temperatur 370C selama semalam.

25
4.6.3 Pembuatan Inokulum Primer

4 µl Ampicilin ditambahkan ke masing-masing tabung

reaksi yang berisikan LB cair. Biakan Murni E. coli

BL21(DE3)/pMB38 dari media padat diambil masing-masing 1

ose dan dicelupkan ke dalam media LB cair yang telah

ditempatkan pada 6 tabung reaksi. 3 tabung digunakan sebagai

inokulum primer pada temperatur 370C dan 3 tabung sisanya

sebagai inokulum primer pada temperatur 230C. Pembuatan

inokulum primer dilakukan di dekat api, di dalam laminar air flow.

Seluruh tabung ditutup dengan kapas dan ditutup dengan

aluminium foil. Kemudian tabung-tersebut digojok di dalam shaker

dengan kecepatan 200 rpm selama semalam dengan temperatur

370C.

4.6.4 Pengukuran Optical Density (OD ) Bakteri

Ampicilin ditambahkan ke dalam 2 media LB cair (kontrol

dan perlakuan) dan 2 media 2XYT cair (kontrol dan perlakuan)

dengan volume masing-masing sebanyak 50 ml. sebanyak

masing-masing 50 µl. 3 tabung yang berisikan inokulum primer

digabung menjadi satu, diencerkan dengan perbandingan 1:100

dan diinokulasikan ke media LB cair. 3 tabung lainnya digabung

menjadi satu pula, diencerkan dengan perbandingan 1:100 dan

dinokulasikan media 2XYT cair. Inokulum yang baru disebut

dengan inokulum sekunder.

Kemudian temperatur shaker diatur sesuai dengan

temperatur yang diinginkan (370C atau 230C). Inokulum sekunder

ditempatkan pada shaker dan digojok dengan kecepatan 200 rpm.

26
 Kemudian dilakukan pengecekan OD inokulum dengan

spektrofotometer setiap jam hingga mencapai OD 0,6. Setelah

mencapai OD 0.6, kelompok kontrol dimasukkan ke dalam

pendingin dengan temperatur 40C dan ekspresi Ag38 pada

kelompok perlakuan diinduksi dengan penambahan isopropyl-B-

Dthiogalactopyranoside (IPTG) sebanyak 31,25 µl pada setiap

tabung dan dilanjutkan inkubasi di dalam shaker selama 3 jam.

4.6.5 Pemanenan Sel Bakteri

Sel-sel dipanen dan dilakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit dan pada temperatur 40C.

Supernatant dibuang dan dilakukan washing pellet dengan

Phosphated Buffer Saline (PBS). Sentrifugasi dilakukan hingga

dua atau tiga kali. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit dan pada temperatur 40C.

Pellet diambil, dan ditempatkan pada eppendorf. Seluruh sampel

di masukkan ke dalam nitrogen cair dan disimpan di dalam freezer

400C.

4.6.6. Pemecahan Sel Bakteri

Pellet yang telah dikeluarkan dari freezer diresuspensi

dengan Lysis-Equilibration-Wash Buffer ( 5 ml LEW Buffer untuk

1 gram sampel) Pellet disuspensikan dengan phenyl methyl

sulphonyl fluoride (PMSF) sebanyak ujung whte tip (konsentrasi

akhir sebanyak 1 mg/ml, up & down pipetting di atas es) selama

30 yang kemudian dihancurkan dengan menggunakan sonicator

pada konsentrasi 40% selama 15 detik dan dilakukan sebanyak

27
 10 kali dengan jeda waktu 15 detik di atas es. Ekstrak sel tersebut

disentrifugasi selama 30 menit pada 12.000 rpm dengan

temperatur 40C. Supernatant dan pellet dipindahkan ke eppendorf

baru. Sampel dimasukkan ke dalam nitrogen cair kemudian

disimpan di freezer -400C.

4.6.7 SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulphone-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE) berfungsi untuk memisahkan protein

crude (total protein) menjadi protein molecular weight (tiap protein

memiliki perbedaan molecular weight). SDS-PAGE dimulai dari

pembuatan gel dengan volume 10 ml. oembuatanya dengan

mempersiapkan larutan monomer dengan mencampurkan semua

reagen kecuali TEMED dan 10 % APS. Penelitian ini

menggunakan gel 12% oleh karena berat protein yang dicari ada

38 kDa dan stackling gel 4%.

Tabel 4.2 Komposisi Gel

Bahan Stacking (µl) Separating (µl)

Acrylamide 1.3 8
Tris Cl pH 8.8 - 5
Tris Cl pH 6.8 2.5 -
SDS 10% 0.1 - 0.2
DDi H20 6.1 6.8

Komposisi untuk 20 ml larutan monomer (sampel) adalah

untuk separating gel digunakan 100 µl 10

% APS ditambahkan 10 µl TEMED. Sedangkan stacking gel terdiri

28
dari 50 µl 10% APS dan 10 µl TEMED. Fungsi dari APS 10% dan

TEMED dalah untuk mempercepat pembentuan gel.

Setelah separating gel dan stacking gel dipersiapkan,

sampel dipersiapkan sebanyak 10 µl per well (kapasitas maksimal

well adalah 20 µl). Penelitian ini menggunakan 8 sampel (LB,

37°C tanpa IPTG (1), LB, 37°C dengan IPTG (2),2XYT, 37°C

tanpa IPTG (3), 2XYT, 37°C dengan IPTG (4), marker (5), LB,

23°C tanpa IPTG (6), LB, 23°C dengan IPTG (7), 2XYT, 23°C

tanpa IPTG (8), 2XYT, dan 23°C dengan IPTG (9) dan 1 marker.

Marker yang digunakan adalah Broad Spectrum Marker 200-10

kDA (Thermoscientific). Sampel diencerkan dengan perbandingan

1:1 untuk supernatantt dan 1:10 untuk pellet. Running Buffer

Solution (RBS) ditambahkan pada masing-masing sampel dengan

perbandingan (1:1). Sampel dihomogenisasi dengan

menggunakan vortex. Untuk menonaktifkan enzyme dan memutus

ikatan polimer protein maka dilakukan pemanasan sampel yang

telah diberikan RBS dengan memanaskan eppendorf sampel di

dalam air mendidih selama 4 menit. Masukkan sampel ke dalam

well gel SDS-PAGE.

Running sampel pada 200 Volt selama 30 menit.

Kemudian bersihkan gel dan staining gel dengan commassive

blue selama 30 menit di atas shaker. Setelah 30 menit, jika pita

telah muncul maka pewarna dibuang dan dilakukan destaining

dengan destaining solution di atas shaker selama 30 menit.

Setelah pewarna dihilangkan, pita dapat dilihat di bawah lampu.

29
4.7 Alur Penelitian

E. coli BL21DE(3)/ pMB38

LB Amp (37°C) semalam

(OD600: 0.6)

Pengenceran 1:100

starting OD600 : 0.05

Induksi IPTG (+) Induksi IPTG (-)

Media LB Media 2XYT Media LB Media 2XYT

37°C 23°C 37°C 23°C 37°C 23°C 37°C 23°C

Cek OD600

Panen

Pemecahan sel

SDS-PAGE
BAB V

30