Ezequiel Chesini (1), Juan Cruz Bigliani (1), Juan P. Zanin (2), Roberto A.
Rovasio (2), Ricardo A. M. Taborda (1)
1)LIADE - (2)CEBICEM - FCEFyN - Universidad Nacional de Córdoba
E-mail: echesini@efn.uncor.edu
Resúmen. Una fuente generadora de pulsos de tensión fue desarrollada y construida para ser
utilizada en la electroporación de embriones de pollo. La solución empleada se basa en el uso
de una fuente de tensión continua, con control de corriente y duración de pulsos. Los pulsos
emitidos se aplican a electrodos de platino que al hacer contacto con el embrión del huevo
producen la electroporación con transferencia de la molécula previamente inyectada al interior
de las células embrionarias. Los resultados obtenidos en las pruebas validan el sistema
comprobando su capacidad para electroporar los embriones con alto porcentaje de éxitos.
1. Introducción
La electroporación es un fenómeno transitorio en el que células o tejidos biológicos son expuestos a un
campo eléctrico externo de suficiente intensidad como para incrementar la permeabilidad de la
membrana plasmática. La exposición de células a fuertes campos eléctricos de corta duración, produce
cambios en el transporte de iones y moléculas eléctricamente cargadas a través de la membrana
plasmática de la célula [1]. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al
mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto
período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula[2].
En este estado de alta permeabilidad, la membrana plasmática permite que moléculas cargadas puedan
introducirse en el citoplasma, aunque la membrana plasmática de la célula represente una eficiente
barrera para ellas en su estado normal. Por ejemplo, el ADN exógeno, debido a su carga negativa,
puede ser movilizado por electroporación al interior del núcleo de otras células.
XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica
Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011
2. Desarrollo
La aplicación de electroporación (y sobrevida) de embriones de pollo en etapas muy tempranas del
desarrollo (30-48 horas de incubación) se hace posible mediante la selección apropiada de parámetros
de voltaje, corriente, duración y/o forma de los pulsos de tensión. Se pretende lograr la penetración del
ADN dentro de las células del embrión, con la mínima cantidad de muerte celular y la máxima
sobrevida del lote de embriones inyectados/electroporados.
Históricamente se han utilizado con este fin 2 tipos de pulsos de tensión. Uno consiste en pulsos
de alto voltaje producidos por la carga y descarga de un condensador a través del embrión como se ve
en la ilustración 2. Esto se consigue con un pulso que tiene una fuerte subida y un decaimiento
exponencial. Para poder cambiar la longitud del pulso, debe cambiarse el tiempo de decaimiento para
lo cual se varía la capacidad y la resistencias en paralelo con el capacitor. En este procedimiento la
breve fase de alto voltaje, que es importante para la transferencia de la molécula inyectada (morfolino;
ver Introducción), se opone a la duración del pulso muy largo y lleva a un aumento de la temperatura
en el embrión, que repercute en un porcentaje alto de mortalidad. Este método es complicado y puede
ser considerado obsoleto cuando se lo compara con el segundo método que consiste en generar pulsos
cuadrados de tensión, con tiempo de duración y repetición variables como se ve en la ilustración 3.
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Este segundo método proporciona mayor facilidad para variar el campo eléctrico en forma repetible y
obtener resultados consistentes y reproducibles en la inyección de ADN. Algunas ventajas de este
método son que se consigue controlar el tiempo en que se aplica un voltaje predeterminado; se reduce
la energía térmica disipada en el embrión; se consiguen pulsos de forma exactamente definida
independientemente de la impedancia del punto de contacto de los electrodos en el huevo; se pueden
definir los parámetros del pulso antes de realizar el disparo.
3. Diseño
Siguiendo los lineamientos del segundo método se construyo una fuente generadora de pulsos con
capacidad para modificar los parámetros de la salida. Cuando el operador ordena un disparo, el equipo
genera un tren de pulsos cuyo nivel de tensión, duración y número de repeticiones fueron programados
con anterioridad.
Una vez configurados estos parámetros el tren de pulsos generado para lograr la electroporación será
de la forma como los se muestra en la ilustración 4.
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La fuente de tensión programable con regulación lineal es alimentada por un circuito transformador
seguido de un rectificador y filtro, desde la red de 220Vac. Se obtiene una tensión no regulada en
continua de 55V. El regulador lineal es controlado por el microcontrolador con 8 bits de resolución,
obteniendo una tensión variable entre 1 y 50 volt (pasos de 0.01V). La fuente está limitada en
corriente, y nunca entregará más de 1A. Tanto este nivel de tensión como los tiempos que caracterizan
al pulso (T y τ) son ingresados por el operador a través del teclado y visualizados en el display. El
nivel de tensión programado es conmutado hacia los electrodos a través una llave electrónica de salida,
manejada por el microcontrolador. En serie con los electrodos de platino que hacen contacto con el
embrión se conecta un resistor para sensar la corriente de descarga. La tensión que aparece en este
resistor cuando circula corriente es medida por el conversor A/D conectado al microcontrolador. El
valor máximo de corriente se muestra en el display al finalizar la electroporación. Este dato es útil para
que el operador verifique que se produjo la descarga del pulso a la vez que se puede utilizar como
parámetro para calcular la impedancia del embrión durante la descarga.
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4. Resultados experimentales.
Se procedió a medir con un osciloscopio marca Tektronik modelo TDS2024B la forma de onda del
pulso de tensión y corriente. La tensión se midió conectando el canal 1 del osciloscopio en paralelo
con los electrodos de platino. La corriente se midió conectando una resistencia de 39 Ω en serie con
los electrodos y midiendo con el canal 2 del osciloscopio los niveles de tensión en ella. Se emplearon
cuatro cargas diferentes: un resistor de 1000 Ω, un embrión de pollo, un embrión de pollo humedecido
con solución salina y un embrión de pollo inyectado con tinta y humedecido con solución salina.
La primera medición se realizo sobre una resistencia de 1000 Ω simulando la impedancia del embrión
para comprobar el funcionamiento del equipo. Los resultados de esta medición se muestran en la
ilustración 6.
La segunda medición se realizo con los electrodos de platino sobre un embrión de pollo y se muestra
en la ilustración 7. La corriente esta en fase con la tensión.
La tercera medición se realizo con los electrodos de platino sobre un embrión humedecido con algunas
gotas de solución salina. En la ilustración 8 se observa un corriente mayor debido a la solución, y se
mantiene la corriente en fase con la tensión.
La cuarta medición se realizo con los electrodos de platino sobre un embrión de pollo inyectado con
tinta china y humedecido con algunas gotas de solución salina. En la ilustración 9 se observa la
corriente medida. La Ilustración 10 muestra el montaje de los electrodos sobre el embrión.
Se observó que los embriones se comportan como cargas mayormente resistivas, y la fuente puede
entregar la corriente necesaria para mantener la fase entre la forma de onda de corriente y tensión.
5. Conclusión
Se logró desarrollar una herramienta apta para ser empleada en investigación básica en el Centro de
Biología Celular y Molecular [CEBICEM] de la FCEFyN de la UNC. El equipo fue diseñado
atendiendo específicamente a los requerimientos necesarios para la electroporación de embriones de
pollo y por esto se logró diseñar un equipo de bajo costo y en un corto tiempo, logrando una eficacia
del mismo comparable a la de equipos comerciales.
6. Referencias
[1] Nakamura H, Katahira T, Sato T, Watanabe Y, Funahashi J (2004) Mech Dev 121:
1137–1143.
[2] M. Chuai, Wei Zeng, Xuesong Yang, Veronika Boychenko, James A. Glazier b, Cornelis J. Weijer
Developmental Biology 296 (2006) 137–149
[3] Octavian Voiculescu, Costis Papanayotou & Claudio D Stern, Spatially and temporally controlled
electroporation of early chick embryos (2008)