Anda di halaman 1dari 22

Pendahuluan

Generasi in vitro dari Beberapa laporan telah menunjukkan


bahwa diferensiasi terarah dari sel induk
pluripotent stem sel berpotensi majemuk (hPSCs), yang
organoid paru-paru mencakup sel induk embrio (hESCs) dan
induced (iPSCs), adalah salah satu yang
manusia paling efisien pendekatan untuk mencapai
diferensiasi sel atau jaringan yang menarik
Abstrak
(D’Amour et al., 2005; Kroon et al., 2008;
Terobosan baru dalam budaya organoid 3 Si-Tayeb et al., 2009; Spence et al., 2011;
dimensi (3D) untuk banyak sistem organ Wong et al., 2012). Menggunakan
telah menyebabkan model-model in vitro pendekatan ini, diferensiasi hPSCs ke garis
fisiologis baru yang kompleks untuk silsilah paru telah dicapai menggunakan
mempelajari perkembangan manusia dan beragam metodologi dengan beragam
penyakit. Di sini, kami melaporkan tingkat keberhasilan (Kadzik dan Morrisey,
diferensiasi langkah-bijaksana sel punca 2012; Longmire dkk., 2012; Mou et al.,
pluripoten manusia (hPSCs) (embrio dan 2012; Wong et al., 2012; Ghaedi dkk.,
diinduksi) ke organoids paru-paru. Dengan 2013; Huang et al., 2013; Firth et al.,
memanipulasi jalur sinyal perkembangan 2014). Sejauh ini, sebagian besar upaya
hpscs menghasilkan sparoid depan untuk membedakan garis keturunan paru
ventral-anterior, yang kemudian dari hPSCs telah difokuskan pada
berkembang menjadi organ paru manusia penggunaan Budaya monolayer 2 dimensi
(HLOs). HLO terdiri dari kompartemen (2D). Beberapa kemajuan terbaru dalam
epitel dan mesenkimal paru-paru, menghasilkan 3 dimensi (3D) jaringan
terorganisir dengan struktural fitur yang seperti organ, yang disebut 'organoid',
mirip dengan paru-paru asli. HLO memiliki telah dilaporkan (Meyer et al., 2011;
epitel saluran napas atas dengan sel basal Spence et al., 2011; Nakano et al., 2012;
dan sel-sel bersilia yang belum matang Takebe et al., 2013; Lancaster et al., 2013;
dikelilingi oleh otot polos dan McCracken et al., 2014). Seperti 3D eLife
miofibroblast serta alveolar-like domain digest your behavior secara tradisional
dengan jenis sel yang sesuai. telah dipelajari di lab dalam situasi dua
Menggunakan RNA-sequencing, kami dimensi, di mana sel-sel tumbuh dalam
menunjukkan bahwa HLO sangat luar lapisan tipis di piring sel-budaya. Namun,
biasa mirip dengan paru-paru janin sebagian besar sel di tubuh ada di
manusia berdasarkan profil dalamnya lingkungan tiga dimensi sebagai
transkripsional global, yang menunjukkan bagian dari jaringan dan organ kompleks,
bahwa HLO adalah model yang sangat dan begitu peneliti telah mencoba untuk
baik untuk mempelajari perkembangan menciptakan kembali lingkungan ini di lab.
paru-paru manusia, pematangan dan Sampai saat ini, beberapa 'organoids'
penyakit. semacam itu telah berhasil dihasilkan,
termasuk model usus manusia, perut, otak laboratorium selama lebih dari 100 hari
dan hati. Organoids ini dapat meniru dan berkembang menjadi struktur yang
respon dari jaringan nyata dan dapat terorganisasi dengan baik yang
digunakan untuk menyelidiki bagaimana mengandung banyak jenis sel yang
organ bentuk, berubah dengan penyakit, ditemukan di paru-paru. Analisis lebih
dan bagaimana mereka dapat menanggapi lanjut mengungkapkan aktivitas gen di
terapi potensial. Di sini, Dye et al. organoids paru-paru menyerupai paru-
mengembangkan model tiga dimensi baru paru janin manusia yang sedang
dari paru-paru manusia dengan berkembang, menunjukkan bahwa organ
membujuk manusia sel punca untuk paru-paru yang tumbuh di piringan tidak
menjadi jenis sel tertentu yang kemudian sepenuhnya matang. Temuan Dye et al
membentuk jaringan kompleks dalam memberikan pendekatan baru untuk
cawan petri. Untuk membuat organ-organ menciptakan organ paru-paru manusia
paru-paru ini, Dye et al. memanipulasi dalam budaya yang mungkin membuka
beberapa jalur pensinyalan yang jalan baru untuk menyelidiki
mengontrol pembentukan organ selama perkembangan paru-paru dan penyakit.
perkembangan embrio hewan. Pertama, model menawarkan beberapa
sel-sel induk diinstruksikan untuk keunggulan; mereka sering memiliki
membentuk sejenis jaringan yang disebut organisasi struktural yang mirip dengan
endoderm, yang ditemukan pada embrio penduduk asli organ, jenis sel dari
awal dan menimbulkan paru-paru, hati berbagai lapisan kuman (misalnya,
dan beberapa organ internal lainnya. mesoderm dan endoderm (Spence et al.,
Kemudian, Dye et al. mengaktifkan dua 2011; McCracken dkk., 2014; Wells and
jalur perkembangan penting yang Spence, 2014), dan beberapa garis
diketahui untuk dibuat endoderm keturunan seluler, membuatnya model
membentuk jaringan usus tiga dimensi. fisiologis kompleks untuk mempelajari
Namun, dengan menghambat dua kunci proses perkembangan, homeostasis
lainnya jalur perkembangan pada saat jaringan dan kondisi patologis secara in
yang sama, endoderm menjadi jaringan vitro. Pekerjaan sebelumnya telah
yang menyerupai awal paru-paru menunjukkan bahwa aktivasi FGF dan
ditemukan pada embrio saja. Jaringan sinyal WNT secara sinergis mendorong
mirip paru-paru ini membentuk struktur CDX2 + komitmen garis usus dalam
bola tiga dimensi saat berkembang. endoderm yang diturunkan hpsc dan juga
Selanjutnya Tantangannya adalah mendorong 'morfogenesis dalam
membuat struktur ini berkembang hidangan ', di mana jaringan 2D mengatur
menjadi jaringan paru-paru. Dye et al. dirinya sendiri menjadi spheroids 3D yang
bekerja metode untuk lakukan ini, yang terdiri dari mesenchymal dan lapisan
melibatkan mengekspos sel-sel ke protein epitel terpolarisasi yang terlepas dari
tambahan yang terlibat dalam paru-paru lapisan sel yang patuh (Spence et al.,
pengembangan. Organ paru-paru yang 2011). Itu juga Telah ditunjukkan bahwa
dihasilkan bertahan dalam kultur penghambatan pensinyalan BMP dan
TGFβ mampu mendorong jaringan paru PAX8Lo / NKX2.1Hi dan kondisi FGFHi
menjadi SOX2 + garis keturunan foregut / HHLo mendukung nasib PAX8Hi /
(Green et al., 2011; McCracken et al., NKX2.1Lo. Diberikan bahwa Pax8
2014). Membangun studi-studi diperlukan untuk pengembangan tiroid,
sebelumnya, kami menunjukkan bahwa kami fokus pada mendefinisikan kondisi
stimulasi simultan WNT dan FGF signaling yang paling kuat menginduksi NKX2.1
sambil menghambat BMP / TGFβ jalur sambil meminimalkan ekspresi PAX8
pensinyalan dalam kultur endoderm hPSC (Kimura et al., 1996; Mansouri et al.,
mencegah komitmen garis usus, dan 1998; Yuanet al., 2000; Vilain et al., 2001;
sebaliknya, nikmatkan nasib depan SOX2 + Li et al., 2004; Kusakabe et al., 2006; Carre
anterior sementara juga dengan kuat et al., 2009 ´; Narumi et al., 2012). Dengan
menghasilkan SOX2 + foregut anterior menerapkan kondisi HHHi selama
Struktur spheroid 3D. Untuk lebih generasi spheroids foregut kami mampu
membatasi spreoid foregut ke garis silsilah meningkatkan ekspresi NKX2.1 di
paru, studi saat ini berfokus pada spheroids foregut dan kemudian
memanipulasi FGF dan HH signaling. Di memperluas spheroids di media
mouse, level tinggi dari sinyal Fgf telah mengandung FGF10, memungkinkan
terbukti menginduksi ekspresi Shh di mereka untuk tumbuh menjadi organoid.
endoderm paru (Hebrok et al., 1998; Organoid bertahan dalam budaya selama
Morrisey dan Hogan, 2010; Rankin dan lebih dari 100 hari dan mengembangkan
Zorn, 2014) yang disertai dengan induksi struktur epitel saluran napas proksimal
Nkx2.1 + progenitor paru-paru (Hebrok et seperti terorganisir dengan baik yang
al., 1998; Serls, 2004). Kemudian sinyal mencakup banyak sel jenis yang
dari endoderm ke mesoderm, dan mutasi ditemukan di epitel paru proksimal,
pada Shh, Gli2 atau Gli3 menyebabkan termasuk sel basal dan bersilia bersama
perkembangan paru yang terganggu, dengan klub langka sel. Selain itu, struktur
dengan Gli2 / Gli3 double knockout tikus saluran napas proksimal sering dikelilingi
menunjukkan agenesis paru (Bellusci et oleh aktin otot polos (SMA) jaringan
al., 1997a; Motoyama et al., 1998; Li et al., mesenchymal positif. Organoid juga
2004). Kami hasil menunjukkan bahwa memiliki sel epitel distal seperti yang
FGF2 menginduksi NKX2.1, PAX8, dan SHH diekspresikan penanda progenitor, SFTPC
dalam budaya endoderm foregut / SOX9 dan HOPX / SOX9, konsisten
manusia. Dengan menggunakan inhibitor dengan alveolar bipoten awal sel
farmakologis FGF dan HH signaling kami progenitor terlihat pada tikus (Desai et al.,
menunjukkan bahwa SHH diperlukan 2014; Treutlein et al., 2014). Untuk
untuk Ekspresi ekspresi NKX2.1 dari FGF2, mendukung gagasan itu organoids
dan FGF2 juga menginduksi PAX8 secara mungkin lebih mirip dengan paru-paru
independen dari pensinyalan HH. berkembang dengan sel-sel progenitor
Observasi ini menunjukkan suatu yang melimpah, kami menggunakan
paradigma di mana kondisi FGFLo / HHHi RNAsequencing untuk membandingkan
secara istimewa menginduksi Progenitor profil transkripsi global organoids dengan
janin manusia dan dewasa paru-paru, melakukan ini, kami menguji apakah
hESCs tidak terdiferensiasi dan endoderm penghambatan ganda BMP dan TGFβ
definitif. Analisis komponen utama, mampu anteriorisasi budaya, seperti yang
hirarkis Pengelompokan dan korelasi dijelaskan sebelumnya (Green et al.,
Spearman semuanya menunjukkan bahwa 2011). Kami memperlakukan hESC dengan
organoids memiliki kesamaan yang ActivinA (100 ng / ml) selama 4 hari untuk
mencolok dengan manusia paru-paru menginduksi endoderm, diikuti oleh 4 hari
janin. Secara bersama-sama, data kami Noggin (NOG, 200 ng / ml) dan molekul
menunjukkan sistem in vitro yang efisien kecil TGFβ inhibitor, SB431542 (SB, 10
dan kuat untuk menghasilkan kompleks, μM). Kami menegaskan bahwa kondisi ini
Organ paru manusia 3D yang belum bisa untuk menginduksi mRNA dan
matang / janin di alam. Kami ekspresi protein yang kuat dari SOX2, yang
mengantisipasi bahwa model ini akan mengekspresikan penanda endodermal
berfungsi sebagai model yang tak FOXA2, sambil menekan penanda garis
tertandingi untuk studi pengembangan usus usus CDX2 (Gambar 1A – C, Gambar
paru-paru manusia, pematangan dan 1 — gambar suplemen 1A). Analisis QRT-
penyakit. PCR juga menunjukkan bahwa
dibandingkan dengan kontrol (di mana
Hasil
endoderm adalah diinduksi tetapi tidak
Diferensiasi hPSC menjadi spreoid depan terkena NOG / SB), paparan NOG / SB
anterior Kami dan orang lain telah anterior ventral kuat diinduksi foregut gen
melaporkan induksi endoderm manusia NKX2.1 dan PAX8, sedangkan transkrip
yang efisien menggunakan ActivinA foregut posterior, PDX1 dikurangi. HHEX,
(D’Amour et al., 2005; Zhang et al., 2010; yang diekspresikan dalam hati
Spence et al., 2011), dan pembatasan berkembang, sistem empedu dan tiroid,
garis keturunan lebih lanjut ke SOX2 + tetapi tidak ada pada paru primordium,
anterior foregut endoderm menggunakan tetap tidak berubah (Gambar 1B).
penghambatan pensinyalan BMP dan Mengingat bahwa NKX2.1 diekspresikan di
TGFβ (Green et al., 2011; Loh et al., 2014). paru-paru dan tiroid primordium, dan
Kami baru-baru ini menunjukkan bahwa PAX8 dinyatakan dalam primordium tiroid,
penghambatan BMP signaling selama hasil ini menunjukkan bahwa 4 hari
induksi garis keturunan usus dengan ligan Perawatan ActivinA diikuti oleh
WNT dan FGF cukup untuk menghambat pengobatan NOG / SB 4 hari bias budaya
CDX2 usus dan menginduksi SOX2 + menuju ventralanterior garis keturunan
foregut posterior spheroids mampu foregut. Penambahan FGF4 plus WNT3A
menimbulkan organoroid lambung (atau Chir99021, penghambat GSK3β yang
manusia (antral) (McCracken et al., 2014). meningkatkan β-catenin bergantung pada
Diberikan bahwa paru-paru berasal dari pensinyalan WNT) mempromosikan
foregut anterior, kami berusaha untuk komitmen garis usus CDX2 dan spheroid
menentukan kondisi untuk menghasilkan 3D pembentukan dalam kultur endoderm
ventral spheroids depan anterior. Untuk (Spence et al., 2011; Xue et al., 2013;
Chen et al., 2014b). Berbasis pada hasil jaringan saraf dengan menambahkan NOG
kami pada Gambar 1B-C, kami / SB ke kultur hESC yang tidak diterapi
berhipotesis bahwa menggabungkan FGF, dengan ActivinA (Chambers et al., 2009).
Chir99021, NOG dan SB akan Dengan memeriksa induksi penanda
menghasilkan generasi SOX2 + ventral- neural NESTIN, SOX1, dan PAX6, kami
anterior foregut spheroids. Untuk menguji menegaskan bahwa transkrip ini sangat
ini, kami menghasilkan endoderm (4 hari diinduksi dalam budaya saraf NOG / SB
ACTA) dan tidak menambahkan faktor ganda, tetapi rendah dalam kultur
pertumbuhan (kontrol Endoderm) atau spheroid ventral foregut. Sebaliknya,
NOG, SB, FGF4, dan Chir99021 (NOG / SB / FOXA2, yang diekspresikan dalam foregut
F / Ch) (Gambar 1D). Penambahan (Monaghan et al., 1993; Ang dan Rossant,
keempat faktor menghasilkan generasi 3- 1994; D'Amour dkk., 2005, 2006; Kroon
dimensi SOX2 +, spheroids CDX2− dkk., 2008; Si-Tayeb et al., 2009;
(Gambar 1E, F). SOX2 + spheroids juga DeLaForest et al., 2011) dan dalam
menyatakan protein endodermal FOXA2, beberapa jaringan saraf (Stott et al.,
dan epitel, co-expressing E-Cadherin 2013), memiliki ekspresi yang tinggi di
(ECAD) (Gambar 1F, Gambar 1 — gambar ventral foregut spheroids, tetapi secara
tambahan 2). Selain SOX2, spheroids signifikan berkurang pada saraf NOG / SB
menunjukkan ekspresi mRNA yang lebih ganda kondisi (Gambar 1 — gambar
tinggi penanda garis depan foregut tambahan 4). Secara keseluruhan, hasil ini
anterior NKX2.1 dan PAX8 dibandingkan sangat menyarankan spheroids memang
dengan kontrol endoderm, menunjukkan foregut, dan bukan berasal dari saraf.
bahwa mereka adalah ventral-anterior
foregut spheroids (Gambar 1E),
bagaimanapun, imunofluoresensi
terungkap bahwa kadar protein NKX2.1
hanya di atas ambang deteksi (Gambar 1
— gambar 2). Spheroids juga memiliki
populasi kecil sel yang mesodermal di asal
pewarnaan positif Vimentin protein (VIM)
(Gambar 1 — gambar tambahan 3).
Diberikan bahwa jaringan saraf juga
mengekspresikan NKX2.1, PAX8, SOX2,
dan FOXA2, dan bahwa protokol induksi
saraf menggunakan dual BMP dan TGFβ
penghambatan, kami ingin mengecualikan
kemungkinan bahwa spheroids adalah
saraf di alam. Untuk melakukan ini, kami
menghasilkan kultur kontrol endoderm,
spheroids foregut (ActivinA diikuti oleh Gambar 1. Generasi spheroid anterior tiga
NOG / SB / F / Ch), dan menginduksi dimensi ventral depan dari endoderm
monolayers. (A) hESC dibedakan menjadi Banyak jalur pensinyalan penting untuk
foregut endoderm dengan induksi dan perkembangan paru (ditinjau
memperlakukan sel dengan 4 hari Activin dalam Min et al., 1998; Weaver et al.,
A (ACTA) diikuti oleh 4 hari NOG + SB. (B) 2000; Morrisey dan Hogan, 2010; Rankin
Foregut endoderm (NOG + SB) memiliki dan Zorn, 2014). Tingkat FGF yang tinggi
ekspresi yang tinggi dari penanda foregut signaling telah ditunjukkan untuk
SOX2 sementara marker hindgut CDX2 menginduksi ekspresi Shh dan Nkx2.1 di
berkurang secara signifikan dibandingkan endoderm foregut pada tikus (Hebrok et
dengan kontrol endoderm yang tidak al., 1998; Serls, 2004); lebih lanjut, Gli2 / 3
diobati (End). NOG + SB monolayers nol embrio tikus gagal membentuk paru-
memiliki ekspresi yang tinggi dari gen paru (Motoyama et al., 1998) dan
foregut anterior ventral NKX2.1 dan PAX8 pensinyalan Hh penting untuk proliferasi
sementara posterior foregut marker PDX1 mesenkim paru secara in vivo (Bellusci et
berkurang. Penanda foregut HHEX al., 1997a). Data ini mengkonfirmasi
diekspresikan dalam hati yang sedang bahwa pensinyalan Fgf dan Hh sangat
berkembang, sistem biliaris, dan tiroid dan penting untuk spesifikasi paru dan ligan
tetap tidak berubah. (C) Mayoritas sel di dari kedua jalur pensinyalan telah
NOG + SB diperlakukan budaya yang SOX2 diterapkan pada garis turunan paru-paru
positif (hijau) dibandingkan dengan hPSC dalam 2D budaya (Wong et al., 2012;
kontrol, di mana hanya sel yang tersebar Huang et al., 2013). Dalam budaya kami,
gugus SOX2 positif. Batang skala mewakili kami telah melaporkan bahwa kira-kira
200 μm. (D) hESC dibedakan menjadi 85–95% sel adalah endoderm, tetapi
spreoid foregut dengan memperlakukan sebagian sel yang tersisa mesodermal dan
sel dengan 4 hari ACTA dan kemudian berukuran kecil populasi mesodermal
tambahan 4-6 hari NOG + SB + FGF4 + Ch. dipertahankan di spheroids dan organoids
Gambar perwakilan dari spheroid dalam (Spence et al., 2011; McCracken dkk.,
tetesan matrigel ditampilkan sebagai 2014) (Gambar 1 — gambar tambahan 3).
gambar gunung utuh. Batang skala Oleh karena itu, berdasarkan mouse dan
mewakili 100 μm. (E) Foregut spheroids hPSC studi, kami berhipotesis bahwa FGF
(NOG + SB + FGF4 + Ch) memiliki ekspresi dan / atau HH signaling akan menginduksi
yang tinggi dari penanda foregut SOX2 garis keturunan paru-paru NKX2.1 + di
sementara marker hindgut CDX2 endoderm depan anterior. Untuk menguji
berkurang secara signifikan dibandingkan hipotesis kami, kami awalnya berfokus
dengan kontrol endoderm yang tidak pada endoderm patuh budaya monolayer
diobati (End) (panel atas). Spheroids untuk mengoptimalkan kondisi induksi.
punya ekspresi yang tinggi dari gen Kultur diperlakukan selama 4 hari dengan
foregut anterior NKX2.1 dan PAX8 ActivinA diikuti oleh tambahan 4 hari
sementara marker foregut posterior PDX1 dengan NOG / SB (disebut sebagai
adalah Gambar 1. berlanjut pada halaman Foregut). Kontrol terdiri dari ActivinA
berikutnya. perawatan hanya diikuti oleh tidak ada
faktor pertumbuhan tambahan (kontrol
Endoderm), atau ActivinA diikuti oleh peningkatan sederhana dalam ekspresi
NOG / SB, diikuti oleh tidak ada faktor NKX2.1, dan ketika FGF ditambahkan
tambahan (kontrol Foregut). Semua bersama dengan Sant-2, Ekspresi NKX2.1
kelompok eksperimen adalah berkurang secara signifikan (Gambar 2C).
dibandingkan dengan kontrol endoderm Bersama-sama, hasil kami menunjukkan
dan foregut (Gambar 2). Kami pertama hierarki di mana FGF berada di hulu SHH
menguji kemampuan FGF2 ke dan PAX8, dan di mana SHH berada di
menginduksi SHH, NKX2.1 dan PAX8 hulu NKX2.1. Untuk menguji apakah HH
dengan mengekspos budaya foregut ke signaling mampu menginduksi NKX2.1
konsentrasi FGF2 rendah dan tinggi (50, dalam budaya foregut, kami
500 ng / ml) (Gambar 2A). Kami menambahkan agonis Smoothed, SAG (1
mengamati peningkatan yang bergantung μM) untuk budaya foregut. Penambahan
pada konsentrasi kuat pada SHH dan PAX8 SAG menginduksi peningkatan ekspresi
mRNA ekspresi dibandingkan dengan NKX2.1 sebesar 6,5 kali lipat di atas
kontrol foregut atau endoderm, dan kontrol foregut (Gambar 2D). Namun, SAG
peningkatan sederhana dari Ekspresi sendiri tidak mengurangi ekspresi PAX8.
NKX2.1 pada dosis tertinggi FGF2 (500 ng / Berdasarkan hasil ini, kami selanjutnya
ml) (Gambar 2A). Kami juga mengamati berhipotesis bahwa peningkatan HH
bahwa dual Penghambatan NOG / SB signaling akan menghasilkan
dalam kultur endoderm menginduksi meningkatkan ekspresi NKX2.1 hilir FGF,
ekspresi NKX2.1 dan PAX8 yang kuat dan bahwa penghambatan FGF secara
tanpa menambahkan FGF2 (Angka 1B, bersamaan signaling akan mengurangi
2A). Dengan demikian, kami ingin ekspresi PAX8; oleh karena itu, kami
menentukan apakah ekspresi NKX2.1 menghambat pensinyalan FGF endogen
dalam budaya foregut adalah karena FGF dengan SU saat mengaktifkan HH dengan
endogen dan / atau pensinyalan HH. SAG (Gambar 2D). Kombinasi ini
Untuk menguji ini, kami menghambat menyebabkan tambahan peningkatan
jalur FGF atau HH dengan molekul kecil ekspresi NKX2.1 (21 kali lipat vs 6,5 kali
SU5402 (SU, 10 μm) dan Sant-2 (10 μm) lipat dengan SAG saja, jika dibandingkan
masing-masing (Gambar 2B – C). dengan foregut) dan penurunan seiring
Mengobati budaya foregut dengan PAX8 mRNA (Gambar 2D). Yang penting,
inhibitor FGF SU menyebabkan penurunan imunofluoresensi adalah berkorelasi
PAX8 dan reduksi sederhana dalam SHH, dengan data QRT-PCR yang menunjukkan
sementara ekspresi NKX2.1 tidak berubah peningkatan jumlah sel NKX2.1 + dengan
dibandingkan dengan kontrol foregut penambahan dari SAG saja. Budaya yang
(Gambar 2B). Sebaliknya, penghambatan diperlakukan SAG + SU menunjukkan
sinyal HH menyebabkan penurunan yang peningkatan lebih lanjut dalam jumlah
signifikan dalam NKX2.1 ekspresi, tetapi NKX2.1 mengekspresikan sel, dengan
tidak PAX8 dibandingkan dengan foregut ∼77% dari semua sel mengekspresikan
yang tidak diobati. Ketika FGF2 NKX2.1 dibandingkan dengan ∼20% dalam
ditambahkan ke budaya, kita mengamati foregut kontrol, dan hampir tidak ada sel
mengekspresikan PAX8 (Gambar 2 - tidak berbeda secara signifikan
gambar suplemen 1). SAG dan SAG+ Sel dibandingkan dengan kontrol foregut, di
yang diperlakukan dengan SU juga mana tidak ada faktor pertumbuhan
mengekspresikan FOXA2 dan SOX2 yang ditambahkan setelah SB + NOG. (C)
mengonfirmasi asal endodermalnya Penambahan inhibitor HH Sant-2
(Gambar 1 — gambar suplemen 1). menyebabkan penurunan yang signifikan
dalam NKX2.1 dibandingkan kontrol
foregut. Demikian pula ketika FGF2 (500
ng / ml) dan Sant-2 ditambahkan secara
bersamaan, NKX2.1 sederhana induksi
yang disebabkan oleh FGF2 berkurang
secara signifikan sedangkan ekspresi PAX8
tetap tidak berubah. (D) Foregut
endoderm diobati dengan SAG atau SAG +
SU selama 8 hari memiliki peningkatan
ekspresi NKX2.1 sebesar 6,5 kali lipat dan
21 kali lipat, Gambar 2. melanjutkan pada
halaman berikutnya

HH-menginduksi spheroid foregut


menimbulkan organoids paru manusia
(HLOs)
Gambar 2. Induksi NKX2.1 di endoderm Berdasarkan pengamatan yang
foregut anterior dengan memodulasi FGF menstimulasi HH dan menghambat sinyal
dan HH signaling. (A) hESCs adalah FGF sangat meningkatkan NKX2.1 ekspresi
dibedakan menjadi endoderm (Akhir) atau sambil mengurangi ekspresi PAX8
foregut anterior dengan NOG + SB (Gambar 2), kami menguji beberapa
(Untuk). Foregut anterior diobati dengan kondisi aktivasi HH dan penghambatan
rendah (50 ng / ml) dan tinggi (500 ng / FGF untuk menginduksi spheroid foregut
ml) konsentrasi FGF2. FGF2 menyebabkan NKX2.1HI / PAX8LO (NOG / SB / F / Ch)
peningkatan tergantung dosis pada SHH (diringkas dalam Gambar 3 — gambar
dan PAX8 Ekspresi dengan sedikit tambahan 1). Konsisten dengan peran
peningkatan ekspresi NKX2.1 penting dari sinyal FGF dalam
dibandingkan dengan kontrol endoderm pertumbuhan paru-paru dan
yang tidak diobati. Perhatikan itu Ekspresi morfogenesis bercabang (Hebrok et al.,
NKX2.1 ditingkatkan oleh eksposur NOG + 1998; Min et al., 1998; Weaver et al.,
SB saja (tidak ada FGF2). (B) Penambahan 2000; Abler et al., 2009; Morrisey dan
inhibitor FGF SU5402 (SU) ke NOG + SB Hogan, 2010; Rankin dan Zorn, 2014),
foregut culture (Untuk) menyebabkan kami menemukan bahwa kondisi di mana
pengurangan ekspresi SHH dan PAX8 yang Penghambatan FGF digunakan
signifikan, tetapi NKX2.1, GLI1, dan PTCH1 menyebabkan penurunan jaringan epitel
relatif terhadap jaringan mesenkim, yang peningkatan, tetapi tidak signifikan dalam
bisa karena hilangnya epitelium atau tingkat transkrip PAX8 di NOG / SB / F / Ch
pertumbuhan mesenkim yang berlebih; ini / SAG diperlakukan foregut spheroids
menunjukkan bahwa endogen (Gambar 3B). Yang penting, ekspresi
Pensinyalan FGF diperlukan untuk protein PAX8 adalah tidak terdeteksi
mempertahankan jaringan epitel dalam dalam NOG / SB / F / Ch / SAG
budaya 3D (Gambar 3 — gambar diperlakukan spheroids foregut dan
suplemen 2). Oleh karena itu, kami juga ekspresi tetap rendah / tidak terdeteksi
menguji beberapa kondisi yang sepanjang waktu dalam budaya. (Gambar
menstimulasi pensinyalan HH 3 — gambar tambahan 4). Mirip dengan
menggunakan SAG saja, tanpa NOG / SB / F / Ch diperlakukan spheroids,
penghambatan FGF. Kami menemukan spheroids NOG / SB / F / Ch / SAG
bahwa metode yang paling efisien untuk diperlakukan memiliki umur populasi sel
meningkatkan ekspresi NKX2.1 adalah dalam spheroids mesodermal di asal,
dengan menambahkan SAG selama fase mengekspresikan Vimentin (VIM) (Gambar
spheroid foregut (Gambar 3A). 3 — gambar tambahan 5). NOG / SB / F /
Membandingkan spheroids foregut (NOG Ch / SAG diperlakukan spheroids foregut
/ SB / F / Ch) dengan yang diperlakukan tertanam di Matrigel untuk memberikan
dengan SAG (NOG / SB / F / Ch / SAG), pertumbuhan 3D lingkungan Hidup.
kami mengamati substansial penurunan Spheroids dipertahankan di media basal
ekspresi SOX2 dibandingkan dengan (lihat ‘Bahan dan metode’) ditambah
spheroids NOG / SB / F / Ch dan dengan 1% FBS kehilangan struktur epitel
peningkatan yang signifikan dalam NKX2.1 ECAD + dan terutama terdiri dari
mRNA. Selain itu, ekspresi protein NKX2.1 mesenkim dalam 20 hari setelah 3D
nuklir ditemukan di epitel ECAD + yang budaya (Gambar 3 — gambar tambahan
menyatakan penanda epitel endodermal 2D, E). FGF10 sangat penting untuk
FOXA2 dan SOX2 (Gambar 3B, C, Gambar morfogenesis bercabang dan
3 — gambar suplemen 3). Menariknya, pemeliharaan sel progenitor paru selama
selama spesifikasi paru pada tikus, tabung pengembangan serta homeostasis
usus awalnya mengekspresikan Sox2 jaringan di paru-paru dewasa (Bellusci et
sepanjang endoderm, tetapi Sox2 al., 1997a; Min et al., 1998; Weaver et al.,
diregulasi ke bawah di bidang paru-paru 2000; Volckaert et al., 2013). Kita
selama spesifikasi paru-paru dan Induksi mengamati bahwa penambahan FGF10
Nkx2.1 (Hebrok et al., 1998; Serls, 2004; (500 ng / ml) memungkinkan spheroids
Domyan et al., 2011). Dengan demikian, berkembang dan dilewatkan selama lebih
downregulation secara bersamaan SOX2 dari 100 hari. FGF10 mempromosikan
dan peningkatan NKX2.1 yang diamati pemeliharaan ECAD + struktur epitel
pada SAG yang dirawat spheroids foregut dengan lebih sedikit kontribusi
konsisten dengan perubahan transkripsi mesenchymal dibandingkan dengan
awal yang terjadi selama spesifikasi paru kondisi inhibitor basal dan FGF (Gambar
pada tikus. Kami juga mengamati sedikit 3D). NOG / SB / F / Ch / SAG dikultur
selama 15 hari di FGF10 memiliki epitel tambahan 4-6 hari NOG + SB + FGF4 + Ch
ECAD + melimpah yang menunjukkan dengan penambahan agonis HH SAG.
penanda paru-paru proksimal SOX2 dan Perwakilan seluruh me-mount gambar
penanda paru-paru distal SOX9. SOX2 + spheroids dalam tetesan matrigel
domain dan SOX9 + domain ditunjukkan pada rendah (kiri, skala bar
didistribusikan ke seluruh HLO yang 200 μm) dan pembesaran tinggi (kanan,
ditentukan oleh seluruh gunung skala bar 100 μm). (B) Penambahan SAG
immunofluorescence dan confocal Z- ke NOG + SB + FGF4 + Ch spheres
sections. (Gambar 3 — gambar tambahan menyebabkan pengurangan transkrip
6). FGF10 diobati spheroids foregut SOX2 dan CDX2 (panel atas) dan
mempertahankan ekspresi NKX2.1 seiring peningkatan signifikan dari transkrip
waktu; Namun, konsisten dengan mouse NKX2.1 (panel bawah) dibandingkan
pengembangan, penanda progenitor dengan NOG + SB + FGF4 + Ch spheres
distal, NMYC dan ekspresi ID2 mRNA (tanpa SAG). Garis keturunan foregut
menurun dari waktu ke waktu sementara lainnya (PAX8, PDX1, HHEX) tidak berbeda
penanda sel Alveolar Tipe I dan II distal, secara signifikan ketika SAG berada
HOPX dan SFTPC meningkat dari waktu ke ditambahkan. (C) Mayoritas sel-sel di bola
waktu (Okubo, 2005; Rawlins et al., 2009) NOG + SB + FGF4 + Ch + SAG
(Gambar 3E). Data ini menunjukkan mengekspresikan protein FOXA2, SOX2
bahwa HLO melewati suatu tahap dan NKX2.1. Batang skala mewakili 50 μm.
menyerupai perkembangan paru-paru Gambar 3. berlanjut pada halaman
janin awal pada tikus. berikutnya. (D) Garis waktu menunjukkan
NOG + SB + FGF4 + Ch + SAG menginduksi
spreoid foregut yang ditanam dan
dipertahankan dalam FGF10. Perhatikan
bahwa Hari 1 adalah hari spheroids
berlapis di Matrigel. Batang skala mewakili
100 μm. (E) Organoids mengekspresikan
penanda paru dengan cara yang konsisten
dengan perkembangan paru-paru tikus.
Semua ekspresi ditunjukkan relatif
terhadap sel induk berpotensi majemuk
yang tidak terdiferensiasi (hPSC), dan paru
manusia dewasa ditampilkan sebagai
referensi. Spoiler for progenitor paru-paru
NMYC dan ID2 sangat rendah pada paru
dewasa, dan diekspresikan pada tingkat
Gambar 3. HH-induced ventral foregut
tinggi pada kultur organoid awal, tetapi
spheroids menimbulkan organoids paru-
berkurang seiring waktu (D = Hari dalam
paru. (A) hESCs dibedakan menjadi
budaya), sedangkan ekspresi NKX2.1
spheroids foregut dengan memperlakukan
relatif konstan. Sebaliknya, SFTPC
sel dengan 4 hari ACTA dan kemudian
diketahui diekspresikan pada level rendah pewarnaan immunofluorescence dan
pada progenitor paru distal, tetapi confocal z-stack. Selain itu, ekspresi SMA
meningkat dan sangat diekspresikan terkuat di pinggiran HLO (Gambar 4 -
dalam sel AECII. Secara konsisten, SFTPC gambar tambahan 1). P63 + sel proksimal
sangat diekspresikan pada paru-paru saluran nafas juga bekerja bersama SOX2
manusia dewasa dan meningkat seiring dan NKX2.1 sebagaimana ditentukan pada
waktu dalam kultur organoid dan AECI bagian serial (Gambar 4 — gambar 2).
marker HOPX juga sangat diekspresikan Terletak di permukaan luminal HLO
pada paru manusia dewasa dan proksimal saluran napas-seperti struktur
meningkat seiring waktu di organoid. * p adalah sel-sel mengekspresikan
<0,05. Semua bar kesalahan mewakili SEM multisiliatif faktor transkripsi sel FOXJ1
(Gambar 4B). Sangat sedikit sel yang
mengekspresikan penanda sel klub
HLO memiliki struktur seperti saluran SCGB1A1, dan protein ini diamati dalam
napas proksimal pola ekspresi ber-pixilated (Gambar 4D).
Multi-Ciliated dan mRNA khusus sel klub,
HLO berbudaya lebih dari 2 bulan memiliki FOXJ1 dan SCGB1A1 berturut-turut
struktur epitel yang mencolok menyerupai meningkat secara signifikan budaya HLO
saluran udara proksimal, berkepanjangan (Gambar 4A). Meskipun
mengekspresikan penanda tipe-spesifik penanda sel goblet ekspresi mRNA
sel proksimal, termasuk sel basal (P63), sel MUC5AC adalah terdeteksi, ekspresi
bersilia (FOXJ1, ACTTUB) dan sel klub protein tidak terdeteksi oleh
(SCGB1A1) (Gambar 4). Jaringan saluran immunofluorescence (Gambar 4A dan
napas proksimal sering dikelilingi oleh data tidak ditampilkan). Meskipun faktor
otot polos aktin positif (SMA +) transkripsi sel bersilia ganda FOXJ1
kompartemen mesenkhi. Meskipun melimpah di saluran napas proksimal
ekspresi mRNA P63 dipertahankan di struktur, kami mengamati bahwa ACTTUB
seluruh budaya (Gambar 4A), hanya dilokalisasi ke sisi apikal sel-sel ini, tetapi
dalam budaya yang berkepanjangan (> 2 tidak muncul dilokalisasi ke silia pada
bulan) di mana Sel P63 + secara spasial permukaan sel apikal (Gambar 4C),
diatur sepanjang sisi basal dari struktur menunjukkan bahwa ini dapat mewakili
seperti tabung epitel, bersebelahan sel yang belum sepenuhnya
dengan SMA + mesenkim, mirip dengan terdiferensiasi. Yang lain telah
bronkus dan bronkiolus manusia (Gambar menunjukkan bahwa diferensiasi yang
4B) (Boers et al., 1998; Nakajima dkk., kuat dari multi-ciliated sel-sel dari hPSCs
1998; Evans et al., 2001; Rock et al., membutuhkan modifikasi kondisi budaya
2009). Dengan 65 hari in vitro (D65) untuk mempromosikan diferensiasi tipe
seperti proksimal struktur epitel sel fungsional (Firth et al., 2014). Dengan
membentuk struktur seperti kista yang demikian, ada kemungkinan bahwa
mengekspresikan P63, sebagaimana lingkungan HLO, seperti Matrigel atau
ditentukan oleh seluruh gunung media kaya FGF10, tidak mempromosikan
diferensiasi terminal dari semua tipe sel. menunjukkan bahwa HLO memiliki
Untuk mengubah HLO lingkungan, kami myofibroblasts dan sel otot polos
menumbuhkan spheroids NOG / SB / F / (Gambar 5B). The HLOs tidak menodai
Ch / SAG foregut ke matriks paru-paru positif untuk Safranin O yang
manusia aseluler (Booth et al., 2012). menunjukkan di sana tidak ada jaringan
Spheroids unggulan pada irisan matriks kartilago, sedangkan teratoma iPSC
paru-paru acellular terutama berasal memiliki tulang rawan yang
memunculkan struktur seperti saluran melimpah (Gambar 5C). Secara bersama-
napas proksimal di mana jumbai stereotip sama, populasi mesenkimal HLO beragam
dari struktur positif ACTTUB yang bersilia dengan miofibroblas, fibroblast, dan sel
pada permukaan apikal sel diamati otot polos.
menghadap ke lumen. Di bagian serial,
HLO memiliki struktur seperti saluran
saluran udara ini berlimpah Sel FOXJ1 +
napas alveolar yang belum matang
(Gambar 4E). Dengan demikian, HLOs
memiliki kapasitas untuk menghasilkan Epitel paru-paru distal pada tikus dan
sel-sel bersilia lebih dewasa mengingat manusia membentuk alveoli gas-tukar,
stimulus atau lingkungan yang benar. yang terdiri dari sel epitel tipe alveolar
Seperti disebutkan, saluran proksimal tipe I dan tipe II (AECI, AECII). Selama
sering berhubungan erat dengan perkembangan, paru-paru bagian distal
mesenkim SMA + (Gambar 4B) sedangkan epitel mengungkapkan penanda
pada paru-paru murine dewasa, saluran progenitor termasuk SOX9, ID2, dan
udara proksimal juga terkait dengan NMYC (Okubo, 2005; Rawlins et al., 2009;
Pdgfrα + dan Vim + sel mesenchymal Chang et al., 2013; Rockich et al., 2013).
(Boucherat et al., 2007; Hinz et al., 2007; Semua penanda distal hadir di HLO;
Chen et al., 2012). Dengan demikian, kami Namun, ID2 dan NMYC diekspresikan
menyelidiki populasi mesenkimal dalam pada tingkat tinggi dalam budaya awal,
HLO secara lebih rinci. tetapi diatur di bawah berkepanjangan
Immunofluorescence mengungkapkan budaya (Gambar 3F) sementara ekspresi
bahwa D65 HLOs memiliki PDGFRα + / SOX9 tetap konsisten sepanjang waktu
VIM + double positif dan Populasi sel dalam budaya (Gambar 6A). Baru-baru ini,
PDGFRα− / VIM +, yang merupakan ada kemajuan besar pada tikus ke arah
indikasi myofibroblast dan fibroblast mendefinisikan nenek moyang alveolar
masing-masing (Gambar 5A). bipoten populasi selama periode akhir
Miofibroblast dewasa murine juga janin / awal neonatal (Desai et al., 2014;
mengekspresikan Sma dan Pdgfrα Treutlein et al., 2014), dan pekerjaan ini
sedangkan otot polos yang terdiferensiasi telah menyoroti fakta bahwa banyak
adalah Sma + / Pdgfra− (Leslie et al., 1990; penanda yang sebelumnya dianggap
Low dan White, 1998; Boucherat et al., diferensiasi terminal penanda-penanda
2007; Hinz et al., 2007; Chen et al., 2012), diekspresikan bersama dalam progenitor
dan kami mengamati PDGFRα + / SMA + bipoten. Secara khusus, penanda AECII
dan PDGFRα− / SMA + populasi sel yang SftpC dan AECI marker Hopx dapat
diekspresikan dalam nenek moyang transmisi electron microscopy (TEM)
bipotent sebelum berkomitmen pada satu untuk menentukan apakah HLO memiliki
garis keturunan atau yang lainnya. Selain sel yang mengandung pipih tubuh, yang
itu, kami telah menunjukkan bahwa Sox9 diperlukan untuk perdagangan protein
menandai populasi nenek moyang awal di dan sekresi surfaktan (Schmitz dan Muller,
mengembangkan paru-paru tikus dan ¨ 1991; Stahlman et al., 2000; Weaver et
Sox9 juga menandai nenek moyang al., 2002). Menggunakan TEM, kami
bipoten pada kehidupan janin akhir mengamati tubuh lamelar baik di sel-sel
(Rockich et al., 2013; Treutlein et al., dalam HLO, dan di ruang terbuka antar
2014). Dalam HLO yang tumbuh dalam sel, menunjukkan bahwa tubuh lamelar
budaya yang berkepanjangan (> 2 bulan), sedang disekresikan (Gambar 6D). Secara
kami mengamati hal itu Penanda jenis sel bersama-sama, data kami menunjukkan
AECII (SFTPC, SFTPB) dan AECI (PDPN, bahwa HLO sebagian besar memiliki sel-
HOPX) hadir (Gambar 6A-B). Namun, kami sel progenitor alveolar yang tidak
juga mengamati bahwa tingkat SFTPC berdiferensiasi dengan sel AECI dan AECII
sangat rendah (Gambar 3F), dan bahwa yang terdiferensiasi yang berbeda diselingi
sel SFTPB + adalah di seluruh jaringan seperti distal.

langka (Gambar 6B). Hal ini menunjukkan


bahwa sel-sel saluran napas bagian distal
yang ada di HLO mungkin seperti
progenitor populasi. Untuk menguji
kemungkinan ini, kami menggabungkan
SFTPC (AECII) atau HOPX (AECI) dengan
SOX9 dan menemukan berlimpah SFTPC /
SOX9 dan HOPX / SOX9 sel-sel positif
ganda (Gambar 6B). Mewarnai bersama
secara serial bagian menunjukkan bahwa
SFTPC / SOX9 sel-sel positif ganda juga
NKX2.1 + (Gambar 6-angka suplemen 1).
Sebaliknya sel co-expressing ini tidak
ditemukan pada paru manusia dewasa Gambar 4. Organisme paru membentuk
(Gambar 6C). Meskipun jarang, beberapa struktur mirip saluran napas proksimal. (A)
SFTPB + yang diamati pada HLO Gen yang diekspresikan di saluran
menyerupai sel AECII yang terlihat pada proksimal adalah diperiksa di organoids
orang dewasa sel paru-paru manusia, dan sepanjang waktu. Proximal airway spidol
PDPN + menyerupai sel AECI memanjang SOX2 menurun seiring waktu dalam
di paru-paru manusia (Gambar 6B-C). budaya HLOs dibandingkan dengan HLO
Untuk meningkatkan kepercayaan bahwa D10. Dibandingkan dengan hPSC yang
sel-sel yang mengekspresikan penanda tidak terdiferensiasi, organoids
AECII adalah sel AECII, kami menggunakan mengekspresikan level tinggi dari sel basal
marker P63 di semua titik waktu, μM) dan pembesaran tinggi (skala bar 10
sementara ekspresi penanda sel klub μM). (B – D) ‘L’ dalam gambar
SCGB1A1 dan spidol sel bersilia FOXJ1. pembesaran tinggi menunjukkan lumen. *
Lanjutan meningkat secara signifikan p <0,05. Semua bar kesalahan mewakili
dalam budaya yang berkepanjangan SEM.
(dibandingkan dengan D10 HLOs). Ada
Penilaian kuantitatif komposisi HLO
peningkatan tetapi tidak signifikan tren
dalam ekspresi MUC5AC sel goblet dari Kami telah menunjukkan bahwa HLO
waktu ke waktu dalam budaya. (B) D65 memiliki epitel seperti proximal dan distal
HLO memiliki struktur yang menyerupai seperti di samping jaringan mesenkim
proksimal saluran napas, di mana sekitarnya. Untuk lebih baik mengukur
epitelium (β-catenin, merah) memiliki sel komposisi HLO, kami melakukan analisis
basal P63 + (hijau), dan dikelilingi oleh kuantitatif kuantitatif jenis dan struktur
SMA + (putih, atas dan bawah panel kiri) sel. Kami membagi 48 individu HLO, dan
jaringan mesenchymal. Berdampingan memeriksa mereka untuk P63 + struktur
dengan lapisan sel basal positif P63 (hijau, seperti saluran napas proksimal (seperti
rendah, panel kanan) adalah sel-sel positif yang ditunjukkan pada Gambar 4B-D), dan
FOXJ1 (putih). Batang skala mewakili 50 saluran napas distal seperti struktur
μM (atas) dan 10 μM (bawah). (C) (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6
Proksimal epitel yang menyerupai airway — gambar tambahan 1). Kami
(β-catenin, hijau) terkilir bersama untuk menemukan bahwa 39/48 (81%) dari
ACTTUB pada sisi apikal sel (merah). HLOs memiliki struktur epitel saluran
Batang skala mewakili 50 μM (atas) dan napas proksimal, sementara 48/48 (100%)
10 μM (bawah). (D). Epitel seperti saluran dari HLO memiliki saluran napas distal
napas (E-cadherin, red) proksimal juga seperti struktur (Gambar 7A). Kami
diwarnai bersama Penanda sel klub CC10 kemudian menghitung luas penampang
(putih, panel kanan). Batang skala rata-rata terdiri dari P63+ jaringan yang
mewakili 50 μM (atas) dan 10 μM menyerupai saluran napas proksimal dan
(bawah). (E) manusia Acellular Matriks P63− / SFTPC + distal dan menemukan
paru-paru diunggulkan dengan spheroids bahwa struktur proksimal terdiri 14,5% (±
dan dibiakkan selama 40 hari (D40). 0,6%) dari seluruh area HLO, sedangkan
Matriks memiliki aliran udara proksimal 85,5% (± 0,6%) bersifat distal di alam
yang berlimpah struktur yang memiliki sel (termasuk epitel dan mesenkim) (Gambar
multi-sili pada permukaan apikal yang 7B). Untuk menentukan persentase sel
diberi label oleh ACTTUB (merah, panel tertentu jenis dalam HLO, kami membagi
atas) dalam keadaan rendah (batang skala dan menodai 15 HLO individual (n = 15)
50 μM) dan pembesaran tinggi (skala bar dan menghitung sel positif untuk penanda
10 μM). Bagian serial menunjukkan bahwa khusus, dan jumlah total nuklei Dapi +
sel-sel juga FOXJ1 positif (putih, panel dalam suatu bagian (Gambar 7C – G).
bawah) dengan epitel yang digariskan Rata-rata, 57% dari semua sel di HLOs
dalam ECAD (hijau) di rendah (skala bar 50 adalah NKX2.1 + (Gambar 7C), 39% dari
semua sel adalah P63 +, 3% adalah FOXJ1 tidak membentuk struktur multi-sila
+, 5% adalah SFTPC +, dan 4% dari semua matang sampai ditempatkan ke
sel adalah HOPX + (Gambar 7D-G). dekelluarized matriks paru-paru (Gambar
4B, E) dan sel SCGB1A1 + langka tidak
menyerupai sel-sel klub dewasa (Gambar
4D). Selain itu, sebagian besar epitel
seperti distal mengekspresikan penanda
bipolar progenitor (Gambar 5). Untuk
langsung mengatasi kematangan HLO,
kami melakukan RNA-sequencing
(RNAseq) pada HLOs (n = 6; 3 D65 HLOs, 3
D110 HLOs), pada hESC yang tidak
terdiferensiasi dan pada endoderm
definitif. Kami juga memanfaatkan dataset
RNAseq yang tersedia untuk paru-paru
Gambar 5. Organ-organ paru memiliki janin manusia yang mewakili berbagai
banyak jenis sel mesenkimal. (A) D65 HLO tahap gestasional, dan untuk paru-paru
memiliki PDGFRα + (hijau) VIM + (putih) manusia dewasa (file Tambahan 1). Untuk
myofibroblas ganda positif dan fibroblas menentukan global kesamaan antara
PDGFRα− / VIM +. Skala bar mewakili 50 jaringan-jaringan ini relatif terhadap HLOs,
μm. (B) D65 HLOs juga memiliki PDGFRα + kami melakukan analisis komponen utama
(hijau) SMA + (putih) double-positif (PC) (Gambar 8A, B) (Ringner, 2008 ´),
myofibroblasts dan PDGFRα− / SMA + pengelompokan hierarkis (Gambar 8C)
halus otot dan myofibrblast. Skala bar (Eisen et al., 1998) dan Spearman korelasi
mewakili 50 μm. (C) D65 HLOs tidak rank-order (Jiang et al., 2004) analisis
mengandung kartilago mana pun positif matriks (Gambar 8D) dari tabulasi lengkap
kontrol teratoma yang berasal dari iPSC Matriks FPKM dihasilkan dari dataset
memiliki pewarnaan Safranin O yang jelas rangkaian RNA dan mewakili ekspresi gen
khusus untuk kartilago. Hijau cepat total melengkapi dalam setiap sampel.
menandai sitoplasma dan hematoxylin inti Konsisten di semua tiga jenis analisis
dari kedua jaringan. Batang skala mewakili informatika, transkripsi aktivitas di HLOs
100 μm. memiliki tingkat kemiripan terbesar
dengan paru-paru janin manusia. Data ini
HLO secara global mirip dengan paru-
sangat kuat menunjukkan bahwa
paru janin manusia
transkripsi global HLO sangat mirip
Mengumpulkan bukti menunjukkan dengan paru-paru janin manusia, dan
bahwa HLO tidak dewasa. Misalnya, mendukung ide tersebut bahwa HLO
penanda progenitor distal awalnya berada dalam keadaan janin yang kurang
dinyatakan kuat sedangkan ekspresi SFTPC terdiferensiasi ketika tumbuh dalam
sangat rendah sepanjang waktu dalam kondisi yang dijelaskan di sini.
HLOs (Gambar 3E), Sel FOXJ1 + tampaknya
sel AECI yang khas. Sel AECI manusia
mengekspresikan HOPX (hijau, panel
kanan), tetapi tidak co-express SOX9. (B –
C) Skala bar dalam gambar pembesaran
rendah di B (panel atas) mewakili 50 μM
dan skala bar pada gambar pembesaran
yang lebih tinggi dalam B, C (panel bawah)
mewakili 10 μM. (D) D50 HLO
mengandung badan pipih yang
merupakan organel khusus untuk sel
AECII. Batang skala mewakili 500 nm.

Pembahasan

Sampai saat ini, sejumlah kelompok telah


menetapkan metode untuk menghasilkan
jenis sel paru-paru spesifik menggunakan
Gambar 6. Organ-organ paru memiliki sel- 2D sistem budaya (Green et al., 2011;
sel progenitor bipotent distal yang Longmire dkk., 2012; Mou dkk., 2012;
melimpah. (A) Ekspresi distal penanda Wong et al., 2012; Ghaedi et al., 2013;
progenitor SOX9 tetap tidak berubah dari Huang et al., 2013). Meskipun sel-sel garis
waktu ke waktu dan ekspresi penanda keturunan paru-paru telah dihasilkan
AECI PDPN rendah di HLO budaya. (B) dengan berbagai efisiensi (∼30–80%
Mayoritas sel SFTPC + (hijau, panel kiri) NKX2.1 + sel [Wong et al., 2012; Huang et
diekspresikan bersama SOX9 (merah). al., 2013; Firth et al., 2014]) dan dapat
Sama halnya dengan banyak sel menghasilkan keduanya proksimal (∼5–
mengekspresikan penanda awal AECI 36% sel [Wong et al., 2012; Huang dkk.
HOPX + (hijau, panel kanan) bersama- 2013; Firth et al., 2014]) dan jenis sel
diekspresikan SOX9 (merah). Sedikit, sel- distal (hingga 50% sel [Huang et al.,
sel yang tersebar mengungkapkan AECII 2013]), organisasi spasial yang tepat dari
marker SFTPB (putih, panel kedua) atau jenis sel dan Morfologi jaringan spesifik
penanda AECI, PDPN (panel ketiga, putih). belum dilaporkan dalam sistem 2D. Di sini,
Beberapa Sel PDPN + juga menunjukkan kami menunjukkan bahwa HLO memiliki
morfologi skuamosa memanjang yang keduanya mesenchymal dan paru-paru
terlihat pada paru-paru dewasa. (C) Sel epitel (∼60% NKX2.1 +) sel dengan
AECII paru manusia berlabel SFTPC (hijau, struktur seperti saluran napas proksimal
panel kiri) tidak co-express SOX9. SFTPB + yang memiliki Sel P63 + (∼40%) dan FOXJ1
sel (putih, panel kedua) pada dewasa paru + (∼3%) bersama dengan struktur seperti
manusia memiliki morfologi yang mirip saluran napas bagian distal yang memiliki
dengan sel SFTPB + di HLOs. Sel AECI paru SFTPC + (∼5%) dan HOPX + (∼4%) sel. Saat
manusia mengekspresikan PDPN (putih, ini tidak jelas apakah sistem budaya 2D
ketiga panel), dan menunjukkan bentuk yang dijelaskan memiliki kemampuan
untuk menimbulkan mesodermal garis leluhur bipoten di embrionik / paru-paru
keturunan. Dengan demikian, HLO neonatal yang menimbulkan baik sel AECI
memungkinkan seseorang untuk dan AECII (Desai et al., 2014; Treutlein et
menjawab pertanyaan mengenai al., 2014). Sel-sel bipoten ini
organisasi jaringan spasial dan interaksi mengekspresikan penanda progenitor
epitel-mesenkimal. Karena HLO distal Sox9 bersama dengan penanda
membentuk struktur terorganisir yang diferensiasi Sel AECI dan AECII, termasuk
menyerupai bronchi dan bronkiolus SftpC, HopX, dan Pdpn. Kami
dengan mesenkim yang berdekatan, menunjukkan bahwa HLOs menyatakan
jaringan rumit yang terorganisir ini keduanya Penanda AECI dan II; Namun,
memungkinkan eksplorasi, untuk contoh, sebagian besar sel-sel ini juga menyatakan
renovasi saluran napas setelah cedera. SOX9 menunjukkan bahwa Sebagian besar
Apalagi penataan ruang dari tipe sel epitelium distal terdiri dari progenitor
tertentu akan sangat penting untuk bipoten. Dengan demikian, HLO akan
mempelajari dinamika jalan napas memungkinkan kita untuk
proksimal selama homeostasis dan memperolehnya wawasan tentang
cedera. Misalnya, lokasi sel P63 + yang populasi bipoten ini, telusuri bagaimana
berdekatan dengan sel FOXJ1 + di HLOs progenitor bipoten diatur, dan tentukan
akan diperlukan untuk mempelajari sel mekanisme bagaimana keputusan nasib
basal diferensiasi ke dalam jenis sel napas dibuat ketika diferensiasi terminal terjadi.
proksimal yang berbeda selama Bukti-bukti yang mendukung bahwa HLOs
homeostasis atau setelah cedera. Sebagai bersifat janin dapat mencerminkan fakta
tambahan Untuk morfologi jaringan dan bahwa satu blok penuh pematangan ada
struktur selama kultur yang in vitro, seperti halnya dengan organageis
berkepanjangan, HLO terdiri dari kedua garis endoderm lainnya (usus dan
epitelium dan mesenkim dalam budaya lambung), yang tampaknya belum
awal yang dipertahankan dari waktu ke matang. Artinya, sementara mereka
waktu. Karena pengembangan paru memiliki sel khusus garis keturunan
membutuhkan pembicaraan silang yang tertentu jenis, sel mungkin tidak
luas antara epitel dan mesenkim untuk menunjukkan fungsi dewasa seperti
mengatur perkembangan proses, dewasa (McCracken et al., 2014; Watson
proliferasi dan diferensiasi, HLOs mungkin et al., 2014). Ini juga merupakan kasus
merupakan sistem in vitro yang ideal untuk sel mirip β pankreas dan sel mirip
untuk mempelajarinya interaksi jaringan- hepatosit yang dihasilkan in vitro (Si-
jaringan yang kompleks. Baru-baru ini, ada Tayeb et al., 2009; Hrvatin et al., 2014).
dorongan untuk menentukan populasi Atau, negara bagian nenek moyang
progenitor selama perkembangan paru- mungkin mencerminkan tingginya tingkat
paru dan homeostasis dewasa untuk lebih FGF10 dalam media kultur, karena FGF10
memahami diferensiasi dan transisi antara dikenal untuk mempertahankan sel
percabangan dan alveolarisasi. Dua progenitor di paru-paru (Ramasamy et al.,
kelompok telah mendefinisikan populasi 2007; Nyeng et al., 2008). Mengingat
bahwa HLO mirip dengan paru-paru janin (Bower et al., 2014), dan sementara
manusia, ini jaringan adalah model yang vaskulatur mungkin tidak penting untuk
ideal untuk mempelajari pematangan paru-paru bercabang (Havrilak dan
paru dari kedua epitel proksimal dan distal Shannon, 2015), yang lain telah
bersama interaksi epitel-mesenkimal menunjukkan endotelium vaskular
dalam konteks perkembangan. Sementara diperlukan untuk menginduksi program
komposisi multi-garis, multi-seluler HLOs bercabang dari epitel saluran napas
adalah keuntungan utama, salah satunya terisolasi dalam budaya 3D (Franzdottir ´
peringatan untuk sistem ini adalah bahwa et al., 2010). Terakhir, lingkungan mikro
HLOs tidak muncul untuk menjalani sangat penting untuk morfogenesis
morfogenesis bercabang bona fide atau bercabang terjadi termasuk perubahan
memiliki zona transisional yang ditemukan dinamis dalam matriks ekstraseluler di
di paru-paru dewasa, seperti sambungan sekitar ujung tunas pucuk paru-paru di
duktal bronchioalveolar (BADJ). The HLOs mana ECM terus berubah dan berinteraksi
memiliki proximal SOX2 + domain dan dengan sitoskeleton epitelium bercabang
SOX9 distal + domain yang diamati selama untuk memfasilitasi pergerakan sel dan
percabangan Morfogenesis, tetapi percabangan percabangan (Moore et al.,
regionalisasi ini terjadi tanpa menyiapkan 2005; Kim dan Nelson, 2012; Wan et al.,
pola bercabang yang stereotip. Ini 2013). Ada kemungkinan bahwa di masa
mungkin karena fakta bahwa organoids depan, ko-budaya dengan input seluler
dikelilingi oleh media yang dilengkapi tambahan mungkin terbukti
dengan FGF10 dibandingkan dengan meningkatkan percabangan HLO. Secara
situasi in vivo di mana FGF10 bersama-sama, kami uraikan di sini
diekspresikan secara dinamis, spasial sebuah sistem baru untuk menghasilkan
terbatas di mesenkim distal (Bellusci et al., organ paru-paru manusia dari manusia sel
1997b; Nyeng et al., 2008; Abler et al., induk berpotensi majemuk. HLO memiliki
2009). Namun, itu baru-baru ini garis keturunan mesenkim dan epitel,
menunjukkan bahwa ekspresi lokal FGF10 serta terorganisir struktur saluran napas
tidak diperlukan untuk percabangan proksimal dengan banyak tipe sel dan
(Volckaert et al., 2013), jadi ini mungkin dikelilingi oleh mesenkim. HLO juga
tidak menjelaskan kurangnya memiliki sel-sel epitel distal yang
percabangan. Atau, mirip dengan yang mengingatkan pada sel progenitor
lain model organoid endoderm, HLO tidak alveolar bipoten baru-baru ini dijelaskan
memiliki beberapa komponen dari organ pada tikus yang kemungkinan merupakan
asli, termasuk sel imun, pembuluh darah, cerminan dari kesamaan HLO pada paru
dan persarafan. Dengan demikian, ada janin manusia. Kita percaya bahwa HLO
kemungkinan bahwa input seluler penting akan menjadi sistem manusia baru yang
untuk morfogenesis bercabang hilang dari sangat baik untuk model diferensiasi paru-
HLOs. Memang, laporan terbaru paru, homeostasis dan penyakit in vitro.
menunjukkan bahwa persarafan
Bahan dan metode
diperlukan untuk percabangan yang tepat
Pemeliharaan hESC Advanced DMEM / F12 ditambah
suplemen N-2 dan B27, 10 mM Hepes, 1 ×
Garis sel ES manusia H1 (NIH registry #
L-Glutamine (200 mM), 1 × Penicillin-
0043) dan H9 (NIH registry # 0062)
streptomisin (5000 U / ml, semua dari Life
diperoleh dari WiCell Institusi penelitian.
Technologies) dengan 200 ng / ml Noggin
Garis ES manusia UM77-2 (NIH registry #
(NOG, R & D Systems) dan 10 μM
0278) diperoleh dari Universitas Indonesia
SB431542 (SB, Stemgent, Cambridge, MA)
Michigan. Jalur iPSC 3-5 dan 20-1
selama 4 hari. Untuk perawatan jangka
dihasilkan di Rumah Sakit Anak-anak
panjang, budaya simpan dalam media
Cincinnati dan telah dijelaskan
‘basal’ sebelum tanpa NOG dan SB, atau di
sebelumnya (Spence et al., 2011). Stem
hadapan faktor-faktor pertumbuhan
cell dipertahankan pada Matrigel (BD
termasuk 50, 500 ng / ml FGF2 (sistem R &
Biosciences, San Jose, CA) dalam medium
D), 10 μM Sant-2 (Stemgent), 10 μM
mTeSR1 (STEMCELL Technologies,
SU5402 (SU, Stemgent), 100 ng / ml SHH
Vancouver, Canada). HESCs adalah
(sistem R & D), dan SAG (Enzo Life
dilewatkan seperti yang dijelaskan
Sciences, Farmingdale, NY) selama 8 hari.
sebelumnya (Spence et al., 2011).
Diferensiasi diarahkan ke spheroid depan
Diferensiasi PSC menjadi endoderm
anterior dan paru-paru organoids
definitif
Setelah diferensiasi menjadi endoderm
Diferensiasi menjadi endoderm definitif
definitif, sel diinkubasi dalam media
dilakukan seperti yang dijelaskan
foregut dengan NOG, SB, 500 ng / ml FGF4
sebelumnya (D’Amour et al.,2005; Spence
(Sistem R & D), dan 2 μM CHIR99021
et al., 2011). Secara singkat, 4-hari Activin
(Chiron, Stemgent) selama 4-6 hari.
A (R & D sistem, Minneapolis, MN)
Setelah 4 hari dengan pengobatan faktor
diferensiasi protokol digunakan. Sel
pertumbuhan, spheroids mengambang
diobati dengan Activin A (100 ng ml − 1)
tiga dimensi hadir dalam budaya.
selama 3 hari berturut-turut dalam RPMI
Spheroids tiga dimensi dipindahkan ke
1640 media (Life Technologies, Grand
Matrigel untuk mendukung pertumbuhan
Island, NY) dengan peningkatan
3D seperti sebelumnya dijelaskan
konsentrasi 0%, 0,2%, dan 2% HyClone
(McCracken et al., 2011). Secara singkat,
mendefinisikan serum janin bovine (dFBS,
spheroids tertanam dalam tetesan
Thermo Scientific, West Palm Beach, FL).
Matrigel (BD Bioscience # 356237) dalam
Diferensiasi endoderm definitif menjadi satu sumur dari 24 piring, dan diinkubasi
foregut anterior pada suhu kamar selama 10 menit.
Setelah Matrigel dipadatkan, foregut
Setelah diferensiasi menjadi endoderm media dengan 1% serum fetal bovine (FBS,
definitif, foregut endoderm dibedakan, CAT #: 16000–044, Life) Teknologi) atau
pada dasarnya sebagai dijelaskan (Green faktor pertumbuhan lain dan molekul kecil
et al., 2011). Secara singkat, sel-sel dilapis dan diganti setiap 4 hari. Organoid
diinkubasi dalam media foregut:
dipindahkan ke tetesan Matrigel baru 2012). Irisan disiapkan menggunakan tisu
setiap 10–15 hari. steril (Fisher) dan disterilisasi dengan
0,18% asam perasetat dan 4,8% EtOH.
Imunohistokimia
Irisan matriks ditempatkan di piring 96
Immunostaining dilakukan seperti yang sumur dan sekitar 50 NOG + SB Sphere + F
dijelaskan sebelumnya (Spence et al., + Ch + SAG dipipet langsung ke matrik.
2009; Rockich et al., 2013). Informasi Sampel disentrifugasi selama 2 menit
antibodi dan pengenceran dapat pada 2000 rpm dan kemudian diinkubasi
ditemukan di file Tambahan 2. Semua pada 37˚C selama 30 menit tanpa media.
gambar diambil mikroskop confocal Nikon Media foregut dilengkapi dengan 1% FBS
A1 atau mikroskop Olympus IX71 dan 500 ng / ml FGF10 kemudian
epiflorescent. ditambahkan ke matriks. Media berubah
setiap hari.
Ekstraksi RNA dan qRT-PCR
Mikroskop elektron transmisi
RNA diekstrak dari monolayers, spheroids,
dan organoids menggunakan Isolasi Total D50 HLO diproses seperti yang dijelaskan
RNA MagMAX-96 Kit (Life Technologies) sebelumnya (Prasov et al., 2012; Rockich
dan MAG Max Express (Terapan et al., 2013). 70 nm bagian adalah bagian
Biosystems, Grand Island, NY). Kuantitas yang dicitrakan menggunakan mikroskop
RNA dan kualitas ditentukan secara elektron Philips CM-100.
spektrofotometri, menggunakan Nano
Luas dan kuantifikasi sel
Drop 2000 (Thermoscientific).
Membalikkan transkripsi dilakukan HLO dengan sel P63 + dihitung sebagai
menggunakan kit SuperScript VILO memiliki epitel seperti epitel proksimal
(Invitrogen, Grand Island, NY), menurut dan HLO dengan SFTPC + sel-sel dihitung
protokol produsen. Akhirnya, qRT-PCR sebagai memiliki epitel seperti saluran
dilakukan menggunakan Quantitect Sybr napas distal. Area epitel proksimal adalah
Green MasterMix (Qiagen) pada sistem ditentukan oleh P63 + ECAD + pewarnaan.
PCR Time One Plus Real-Time (Teknologi Area diukur menggunakan perangkat
Life). Untuk daftar urutan primer lihat File lunak ImageJ. Kuantifikasi sel NKX2.1, P63,
pelengkap 3. dan DAPI dihitung dengan software
penghitung sel Metamorph. FOXJ1, SFTPC,
Menyebar spheroid paru-paru pada
dan HOPX dihitung dalam ImageJ
matriks paru-paru manusia dekellularized
menggunakan plugin penghitung sel.
Paru-paru manusia yang dianggap tidak
Analisis statistik dan ulangan
sesuai untuk transplantasi paru-paru
eksperimental
diperoleh dari detak jantung (atau autopsi
hangat) donor melalui Gift of Life Semua percobaan immunofluorescence
Michigan dan paru-paru diuraikan seperti dan qRT-PCR dilakukan setidaknya dua kali
yang dijelaskan sebelumnya (Booth et al., dengan tiga (n = 3) sampel biologis
independen per percobaan. Satu-satunya GEO (SRA) database (sampel paru-paru
pengecualian untuk ini adalah eksperimen janin) (file tambahan 1). Kualitas mentah
itu termasuk sampel paru-paru manusia membaca data untuk masing-masing
dewasa dalam analisis. Untuk percobaan sampel dievaluasi menggunakan FastQC
ini, n = 1 paru-paru manusia biologis (versi 0.10.1) untuk mengidentifikasi fitur
sampel digunakan dalam ulangan statistik dari data yang mungkin menunjukkan
(rangkap tiga) sedangkan semua sampel masalah kualitas (misalnya, skor kualitas
lain menggunakan biologi bereplikasi (n = rendah, urutan berlebihan, konten GC
3). Untuk kuantifikasi pada Gambar 7, yang tidak sesuai, dll). Laporan QC awal
total 48 HLO berbeda (n = 48) dihitung menunjukkan over-representasi urutan
untuk Komposisi HLO. Untuk area epitel adaptor Illumina dalam sampel dari Set
proksimal, 29 HLO berbeda dihitung (n = data EBI-AE dan set data NCBI-GEO.
29). Untuk sel kuantifikasi, 15 HLO Urutan adaptor dipangkas dari bacaan
berbeda dihitung (n = 15). Perbedaan menggunakan Cutadapt (versi 0.9.5) (Chen
statistik antara kelompok-kelompok itu et al., 2014a). Secara singkat, bacaan
dinilai dengan perangkat lunak Prism, diselaraskan dengan transkriptome
menggunakan beberapa uji t. Semua bar referensi (UCSC hg19) menggunakan
kesalahan mewakili SEM. Hasilnya adalah TopHat (versi 2.0.9) dan Bowtie (versi
dianggap signifikan secara statistik pada p 2.1.0.0) (Langmead et al., 2009). Manset /
<0,05. CuffNorm (versi 2.2.1) digunakan untuk
ekspresi kuantisasi dan ekspresi
Pengurutan dan analisis RNA
diferensial analisis (Trapnell et al., 2012),
Urutan HLOs (n = 3 D65, n = 3 D110) menggunakan UCSC hg19.fa sebagai
dilakukan oleh Universitas Michigan DNA urutan genom referensi dan UCSC
Sequencing Core, menggunakan platform hg19.gtf sebagai anotasi transkriptom
Illumina Hi-Seq. Urutan H9 Stem Cells (SC) referensi. Untuk analisis ini, kami
dan Definitif Endoderm (DE) dilakukan menggunakan pengaturan parameter: ‘–
oleh University of California, San Francisco Multi-baca-benar’ untuk menyesuaikan
DNA Sequencing Core menggunakan perhitungan ekspresi untuk membaca
platform Illumina Hi-Seq. Semua urutan peta itu di lebih dari satu lokus, sebagai
disimpan dalam ArrayExpress EMBL-EBI baik sebagai ‘–kompatibel-hits-norma’
database menggunakan Annotare 2.0 dan dan ‘-peras-kuartil -norm’ untuk
di katalog di bawah nomor aksesi E-MTAB- normalisasi nilai ekspresi. Tabel FPKM
3339 untuk HLO dan E-MTAB-3158 untuk yang dinormalkan dihasilkan
SC dan DE. Universitas Michigan menggunakan fungsi Cuffnorm yang
Bioinformatika Core memperoleh ditemukan di Manset. Analisis kuantisasi
membaca file dan menggabungkannya transkripsi dalam manset dilakukan
menjadi satu file '.fastq' untuk setiap menggunakan Linux Debian 64-bit
sampel. Inti Bioinformatika juga platform stable versi 7.8 (‘Wheezy’).
mengunduh file yang dibaca dari database Matriks FPKM lengkap, berisi jumlah
EBI-AE (Sampel paru dewasa) dan NCBI- frekuensi untuk semua 24.010 gen yang
terkandung dalam genom referensi untuk dataset RNAseq. Selain itu, kami
semua 23 sampel RNAseq, dievaluasi menghitung peringkat Spearman koefisien
menggunakan analisis komponen prinsip korelasi (ρ) dengan cara berpasangan di
unscaled (PCA) untuk memvisualisasikan antara semua 23 sampel RNAseq
dan mengukur variasi multi-dimensi menggunakan yang lengkap menormalkan
antara sampel (Ringner, 2008 ´). Dari data FPKM. Koefisien Spearman diplot
24.010 gen yang dianotasikan dalam sebagai peta panas menggunakan fungsi
genom referensi, 2815 (11,7%) tidak tersebut ‘Heatmap.2’ dalam paket R
terdeteksi dalam analisis RNAseq dari ‘gplots’ (http://CRAN.R
salah satu dari 23 sampel. Komponen project.org/package=gplots). Data lengkap
prinsipnya adalah dihitung menggunakan skrip analisis tersedia di
fungsi ‘prcomp’ yang ditemukan dalam R https://github.com/hilldr/HLO_eLife2015.
(versi 3.1.2) bahasa pemrograman statistik
(http://www.R-project.org/) dan diplot
menggunakan paket R ‘ggplot2’
(Wickham, 2009). Hirarkis analisis klaster
berdasarkan pada jarak Canberra (Eisen et
al., 1998) antara vektor FPKM digunakan
untuk mengklasifikasikan sampel RNAseq
diskrit sesuai dengan tingkat
ketidaksamaan transkripsi total yang
ditunjukkan oleh nilai-nilai FPKM yang
dinormalkan. Analisis bootstrap digunakan
untuk menilai ketidakpastian dalam
ditugaskan hubungan pengelompokan
hierarkis. 10.000 iterasi bootstraping
dihasilkan oleh berulang kali secara acak
sampling dataset FPKM. Probabilitas
bootstrap (BP) dari suatu cluster
didefinisikan sebagai frekuensi hubungan
yang diberikan di antara bootstrap
ulangan. Resampling bootstrap multiskala
adalah digunakan untuk menghitung nilai
p sekitar-kurang (AU) untuk hubungan
yang diberikan, dengan AU> 95
menunjukkan tingkat signifikansi statistik
yang tinggi. Analisis dilakukan
menggunakan paket R ‘pvclust’ (Suzuki
dan Shimodaira, 2006). Korelasi Spearman
diterapkan sebagai penilaian tambahan
dari derajat kumulatif korelasi di antara