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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS INMUNOLOGIA BASICA

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INDICE DE CONTENIDOS

DESCRIPCION NUMERO DE PAGINA


REQUISITOS PARA CURSAR 5
SISTEMA DE EVALUACIÓN 5
CONDICIONES PARA PROMOCIONAR 5
CONDICIONES PARA REGULARIZAR 5
CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIÓN DE ASISTENCIA CUMPLIDA 6
REQUISITOS PARA RENDIR EL EXAMEN FINAL 6
BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL 6
BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA 6
PROGRAMA ANALITICO 7
CONCEPTOS BASICOS DE BIOSEGURIDAD 12
TOMA DE MUESTRAS PARA LA EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNE 15
PRUEBAS INMUNOLÓGICAS 19
TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE INMUNIDAD INNATA 20
COMPLEMENTO 27
ANTICUERPOS 29
PURIFICACION Y FRACCIONAMIENTO DE ANTICUERPOS 31
PROTEINAS DEL SUERO 41
ELECTROFORESIS 42
INMUNOHISTOQUIMICA 47
INMUNOFLUORESCENCIA 50
CITOMETRIA DE FLUJO 54
LINFOPROLIFERACION 59
CITOTOXICIDAD 64
ELECTGROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) 69
ELISA 75
INTRODUCCION A LA TECNICAS SEROLOGICAS 82
DILUCIONES 83
CONVERSION SEROLOGICA O SEROCONVERSION 84
FUNDAMENTOS DE LA TECNICAS SEROLOGICAS 85
RIA (RADIOINMUNOENSAYO) 88
INMUNOBLOT 90
INMUNOCROMATOGRAFIA 93
TECNICAS DE INTERACCION SECUNDARIA: PRECIPITACION Y AGLUTINACION 94
GRUPOS SANGUINEOS 106
TECNICA DE SERONEUTRALIZACION 111
INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION 117
TECNICA DE FIJACION DE COMPLEMENTO 120
TECNICA DE POLARIZACION FLUORESCENTE 122
TECNICAS PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS MATERNALES 125
INMUNOELECTROFORESIS 129

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GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
INMUNOLOGÍA BÁSICA

La Inmunología estudia un sistema sumamente interrelacionado y dinámico, pero la


metodología de estudio por temas, obliga a separar contenidos íntimamente relacionados que
deben ser finalmente integrados. Es importante considerar esta característica desde el primer
día de clases para encarar su estudio intentando incorporar paulatinamente los temas y
alcanzar la comprensión global.
Uno de nuestros objetivos es que el estudiante pueda comprender el funcionamiento del
Sistema Inmune y utilizarlo como herramienta de decisión en el diagnóstico, profilaxis y
solución de problemas de la práctica profesional.
En la cursada 2017 hemos decidido abordar los contenidos de Inmunología Básica a través de
diferentes metodologías de clases: Clases teóricas, clases prácticas y laboratorios:
Las clases teóricas consistirán en clases expositivas-dialogadas sobre los contenidos teóricos,
a estudiar por el alumno, que le permitirá conocer los temas en los que debe profundizar y en
los que se explicarán aquellos más complejos para su comprensión.
Es de destacar que estas clases deben ser complementadas con la lectura de la bibliografía
recomendada.
Durante las clases teórico-prácticas se analizarán y resolverán preguntas y problemas en
forma grupal. El objetivo de estas preguntas es utilizarlas como eje temático, para que guíen
al alumno en el estudio de cada tema. Se espera que los alumnos sean capaces de contestar
éstas u otras preguntas similares después de haber estudiado el tema.
Algunas clases consistirán en la discusión de trabajos científicos relacionados con los temas
tratados durante el curso. Nuestro objetivo es que comprendan la metodología de trabajo y de
investigación en Inmunología y que a través de esta discusión puedan integrar contenidos de
la materia.
Otro de nuestros objetivos es que el estudiante se familiarice con la metodología de
investigación científica inmunológica. Para ello, en algunas clases se presentarán y discutirán
trabajos científicos relacionados con los temas tratados en el curso, de modo que el
estudiante pueda integrar los contenidos de la materia y comprender la real utilización de lo
teóricamente aprendido.
Los trabajos prácticos de laboratorio serán realizados en forma directa por los alumnos y
supervisados por los docentes. Los alumnos, formarán grupos de trabajo y presentarán un
informe por cada trabajo práctico realizado en el laboratorio.
La presente guía de Inmunología está destinada a facilitar el abordaje de los contenidos que
se tratarán en las clases prácticas, por lo que es complementaria y de ninguna manera
reemplaza a la bibliografía recomendada.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Esperamos que la información presentada en esta guía les sea útil. Si tienen dudas o
dificultades, acerquen sus inquietudes a los docentes participantes del curso y responsables
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de la redacción de la presente guía. La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del área, los
orientará administrativamente en el horario de 13.30 a 19.30 en forma telefónica (52872155) o
por mail a inmuno@fvet.uba.ar.

Docentes del curso

Dra. Med. Vet. Silvia L. Mundo Profesora Regular Asociada a cargo

Dra. Lic. Silvia Colavecchia J.T.P.

MS. Med. Vet. Adriana M. Fontanals J.T.P.

Dra. Med. Vet. Ana M. Jar J.T.P.

Dra. Vet. Ana Jolly J.T.P.

Vet. Laura Bass Ayudante de 1era.

Dra. Vet. Bárbara Fernández Ayudante de 1era.

Vet. Lucas Goldman Ayudante de 1era.

MS. Med. Vet. Federico Hoffman Ayudante de 1era.

MS. Vet. Ana Stempler Ayudante de 1era.

Vet. Giselle Ingratta Ayudante de 1era

Vet. Hernán Hermida Ayudante de 2da

Vet. Felipe Redondo Ayudante de 2da

Vet. Verónica Rigo Concurrente

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Los días de trabajo práctico en laboratorio, consulte con su docente dónde y
en qué horario debe concurrir. Es obligatorio el uso de guardapolvo o ambo.

REQUISITOS PARA CURSAR


Las materias correlativas son:

REGULARES: Parasitología
Fisiología
Microbiología

APROBADAS: Química biológica


Histología

SISTEMA DE EVALUACIÓN
Los alumnos serán evaluados a través de:
a) El desempeño en los trabajos prácticos.
b) La aprobación de los informes de laboratorio.
c) La aprobación de los dos parciales obligatorios.

Examen recuperatorio: Se podrá recuperar uno solo de los dos parciales, en un parcial
recuperatorio en el que se aplicará la misma metodología y tipo de ejercicio correspondiente al
respectivo examen parcial.
Los parciales serán escritos, a desarrollar, y podrán consistir en: Preguntas de respuesta breve.
Preguntas a completar con una palabra clave. Preguntas de justificación (V-F) Situaciones
problemáticas a resolver. Planteo de experimentos, con interpretación de gráficos de
resultados.

CONDICIONES PARA PROMOCIONAR


 Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos.
 Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos
prácticos de laboratorio.
 Aprobar los parciales con por lo menos el 80% de los contenidos de cada uno.
 Aprobar un coloquio integrador en fecha a convenir con los alumnos.

CONDICIONES PARA REGULARIZAR


 Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos
 Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos
de laboratorio.
 Aprobar los parciales con por lo menos el 60% de los contenidos.

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CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIÓN DE ASISTENCIA CUMPLIDA
 Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos.
 Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos
prácticos de laboratorio.

REQUISITOS PARA RENDIR EL EXAMEN FINAL

Materias correlativas APROBADAS: 1) Fisiología


2) Microbiología
3) Parasitología

EVALUACIÓN DEL CURSO POR LOS ALUMNOS:


A través de una encuesta que se les entregará al finalizar la cursada, los estudiantes podrán
evaluar a sus docentes y expresar sus opiniones con respecto a diferentes aspectos del curso.

BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL

TIZARD I. 2009. Inmunología Veterinaria. Editorial Harcourt 8va. Ed. Grade de España
SA. 592PP.

Material de las clases teóricas y Guía de Trabajos Prácticos. Cátedra de Inmunología. 2017.
Disponible en cartelera web de la FCV-UBA.

DAY MJ. , SCHULTZ RD. 2011. Veterinary Immunology: principles and practice. 1er ed. Manson
Publishing Ltd.

CALLAHAN GN, YATES RM. 2014. Basic Veterinary Immunology. 1er ed. University Press
of Colorado. USA.

BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA

 FAINBOIM L, GEFFNER J. 2011. Introducción a la Inmunología Humana. 6ta ed. Editorial  Médica
Panamericana.

 ABBAS A, LICHTMAN A, PILLAI S. 2008. Inmunología Celular y Molecular. 6ta. ed. Editorial
Elsevier.

 DAY MJ. 2008.Clinical Immunology of the Dog and Cat 2da. ed., Editorial Blackwell. 

MURPHY K., TRAVERS P., WALPORT M. 2009. Inmunobiología de Janeway., 7ma. ed., Editorial
Mc Graw Hill.

REGUEIRO GONZALEZ J., LOPEZ LARREA C., GONZALEZ RODRIGUEZ S., MARTINEZ NAVES
E. 2010. Inmunología: Biología y Patología del Sistema Inmunitario. 4ta. ed., Editorial Panamericana.

ROITT I. 2008.Inmunología. Fundamentos.11va. ed., Editorial Panamericana.



PARSLOW T., STITES D. 2005. Inmunología Básica y Clínica. 10ma ed., Editorial Manual Moderno..

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PROGRAMA ANALÍTICO
Unidad 1- Mecanismos de defensa

 Órganos, tejidos y células linfoides.


o Órganos y tejidos linfoides primarios y secundarios: Estructura.
o Diferencias en las especies domésticas. Ganglios linfáticos en cerdos. Glándulas de
Harder. Órganos linfoides asociados a mucosas: Bolsa de Fabricio. Placas de Peyer del
íleon. Apéndice cecal.
o Patrones de migración celular: expresión de moléculas asociada.

 Sistemas innatos de defensa.


o Barreras naturales: piel y mucosas en mamíferos y en aves.
o Mecanismos humorales: vía alternativa del complemento, vía de las lectinas; proteínas
de fase aguda; interferones.
o Moléculas de superficie: concepto de receptor. Receptores de reconocimientos de
patrones moleculares ligados a patógenos y sus ligandos (TLR).
o Mecanismos celulares: fagocitosis y lisis. Citotoxicidad natural.
o Importancia de los LT gama-delta y de los LB1 en las especies domésticas y de
producción.
 Sistema inmune adaptativo
o Propiedades: especificidad, adaptabilidad y memoria.
o Células que reconocen al antígeno en forma específica: Linfocito B (LB), Linfocito T
(LT).
o Organización clonal. Moléculas de superficie: concepto de receptor específico: BCR y
TCR.
o Filogenia de los mecanismos de defensa.

Unidad 2- Inmunoquímica

 Antígenos (Ags)
o Conceptos de Antigenicidad e Inmunogenicidad.
o Estructura físico-química de los Ags. Haptenos, Carriers.
o Concepto y tipos de determinantes antigénicos: conformacionales (continuos y
discontinuos), secuenciales.
o Tipos de Antígenos: propios (de órgano; de grupos sanguíneos; de género H-Y)
y extraños (de patógenos, de tumores, de transplantes).
o Antígenos timo-dependientes y timo-independientes.
 Anticuerpos (Acs)
o Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas.
o Estructura físico-química: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables.
o Características de las Igs en las diferentes especies domésticas y de producción:
particularidades en equinos, aves y camélidos.
o La Ig como antígeno: isotipo, alotipo e idiotipo.
o Clases y subclases de Igs. Distribución en el organismo. Transporte trans-placentario.
Incidencia de los diferentes tipos de placentación en el pasaje de Igs de la madre al feto
en las especies domésticas. Receptor Fc del Recién Nacido (FcRn)
o Resultado de la unión del Ag-Ac: Neutralización de virus y toxinas, inhibición de la
adhesión de bacterias. Otras funciones biológicas de las diferentes clases de Igs:
Opsonización. Activación de la vía clásica del Complemento. Citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC).

Unidad 3- Moléculas de membrana relacionadas con el reconocimiento antigénico

 Receptor antigénico del linfocito B (BCR)


o Estructura, moléculas asociadas (Igα, Igβ) y otras moléculas co-receptoras.
o Mecanismos de generación de diversidad de las Igs: Recombinación somática,
hipermutación, conversión génica, diversidad N-Terminal. Mecanismos característicos en
las diferentes especies. Órganos de diversificación en artiodáctilos, aves y lagomorfos.
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o Ontogenia del linfocito B. Mecanismos moleculares asociados: Exclusión alélica,
exclusión isotípica. Splicing alternativo.

 Moléculas de histocompatibilidad
o Moléculas de histocompatibilidad clase I, clase II y clase III: Estructura. Localización.
Función.
o Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mapa genético en las
especies domésticas y de producción.
o Moléculas de histocompatibilidad no clásicas

 Procesamiento y presentación antigénica


o Vía endocítica y vía biosintética. Presentación cruzada.
o Receptor antigénico del LT (TCR)
o Estructura, moléculas asociadas (CD3, CD4, CD8) y otras moléculas de adhesión.

 Maduración de los linfocitos T


o Mecanismos de generación de diversidad del TCR.
o Ontogenia del LT. Selección positiva y negativa.
o Mecanismos de autotolerancia.

Unidad 4- Respuesta Inmune

 Colaboración celular
o Activación de los LT, Interleuquinas.
o Influencia del antígeno y el microambiente en la cooperación celular: Perfiles Th1, Th 2,
Th9, Th17, Th3
o Colaboración T-B: Activación del LB y producción de Igs: Switch isotípico, maduración
de la afinidad.
o Colaboración T-T: Citotoxicidad ejercidas por los LT citotóxicos.
o Colaboración T-Macrófagos: Macrófagos activados.
o Memoria inmune.

 Cinética de la respuesta inmune sistémica.


o Respuesta inmune primaria y secundaria.

 Respuesta inmune en mucosas.
o Componentes, sitios inductores y efectores.
o Características diferenciales en las especies domésticas.

 Regulación de la respuesta inmune.


o Mecanismos de regulación intrínseca: Efecto de la desaparición del Ag. Regulación de
los niveles de Igs: retroalimentación positiva y negativa. Regulación por linfocitos T
reguladores.
o Regulación extrínseca: neuroinmunoendócrina.
o Regulación en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central.

Unidad 5
 Alteraciones del Sistema inmune
Hipersensibilidad tipo I
o Inmunopatogenia: Alergia y atopía en los animales domésticos.
o Shock anafiláctico: Órganos de choque en las diferentes especies.
o Diagnóstico.
Hipersensibilidad tipo I
o Inmunopatogenia: Daños mediados por anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
Reacciones alogeneicas
o Anemia hemolítica del recién nacido en equinos, cerdos y felinos. Reacciones post-
transfusionales.
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o Diagnóstico. Determinación de grupos sanguíneos y pruebas de compatibilidad entre
potenciales donantes y receptor.
Hipersensibilidad tipo III
o Inmunopatogenia: Daños mediados por complejos inmunes en enfermedades
autoinmunes y en enfermedades infecciosas crónicas. Enfermedad del suero.
o Diagnóstico
Hipersensibilidad tipo IV
o Bases celulares de la hipersensibilidad retardada.
o Granuloma tuberculoso. Dermatitis por pulgas en caninos. Hipersensibilidad de
contacto.
o Diagnóstico.
Hipersensibilidad tipo V
o Anticuerpos anti-receptores: Anticuerpos agonistas y antagonistas. Fenómenos de
autoinmunidad. Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de
órgano y sistémicas. Inmunodeficiencias.
o Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Diagnóstico.

 Respuesta inmune a tumores



 Mecanismos de rechazo de injertos

Unidad 6

 Respuesta inmune a patógenos
Mecanismos de respuesta inmune frente a bacterias, virus, parásitos y hongos.
o Antígenos involucrados. Mapeo de epitopes.
o Ciclo biológico del patógeno y su relación con la respuesta inmune: Inmunidad innata.
Inmunidad adaptativa.
o Mecanismos de evasión de los diferentes patógenos.
o Consecuencias desfavorables de la respuesta inmune a patógenos.

Unidad 7

 Inmunoprofilaxis
Inmunoprofilaxis pasiva
o Natural: Pasaje de Igs de la madre a la cría. Incidencia de los diferentes tipos de
placentación en el pasaje de Igs de la madre al feto en las especies domésticas.
Composición en Igs de calostro y leche. Importancia de la ingestión de calostro.
o Artificial: administración de sueros hiperinmunes.
o Elaboración de sueros hiperinmunes. Indicaciones de uso. Ventajas y desventajas de
su aplicación. Uso de aves en la elaboración de sueros hiperinmunes.
Inmunoprofilaxis activa
o Ventajas y desventajas de su aplicación.

Tipos de vacunas.
 Vacunas atenuadas.
o Vacunas convencionales: Características y ejemplos.
o Vacunas de nueva generación: Vacunas a vectores recombinantes, Vacunas
deleteadas.
 Vacunas inactivadas.
o Vacunas convencionales: Características y ejemplos.
o Vacunas de nueva generación: vacunas a subunidades. vacunas a péptidos
sintéticos. Vacunas a péptidos recombinantes.
o Vacunas a DNA desnudo.
 Concepto de vacunas que permiten diferenciar animales vacunados de infectados
(DIVA)
 Metodología de elaboración de vacunas.
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o Proceso de producción de inmunógenos a escala industrial.
o Requisitos de bioseguridad.
o Métodos de inactivación.
o Métodos de atenuación.
o Formulación de vacunas: Uso de adyuvantes
o Controles requeridos durante las diferentes etapas de producción
o Aprobación de vacunas por organismos oficiales.
o Controles de inocuidad, esterilidad y potencia.
o Otros controles.

 Administración de vacunas
o Vías y esquemas de inmunización.
o Vacunas mixtas, vacunas polivalentes.
o Consideraciones para establecer esquemas de vacunación en las diferentes
especies animales.
o Fracasos de la vacunación.
o Reacciones adversas a la vacunación.

Unidad 8

 Elaboración de reactivos diagnósticos


o Técnicas de p
o
o Electroforesis en acetato de celulosa. Electroforesis en geles de poliacrilamida
(PAGE)
o Hibridomas y anticuerpos monoclonales
o Hibridomas: Producción y selección.
o Anticuerpos monoclonales: Aplicaciones.
o Producción de anticuerpos por métodos biotecnológicos. Aplicaciones.

Unidad 9
 Técnicas inmunológicas de diagnóstico


 Técnicas de detección primaria de la interacción Ag-Ac
o Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA. Inmunoblot. Inmunohistoquímica.
o Inmunofluorescencia. Citometría de flujo.
o Radioinmunoensayo.
o Inmunocromatografia

 Técnicas de detección secundaria de la interacción Ag-Ac


o Inmunodifusión. Inmunoelectroforesis.
o Aglutinación.
o Lisis por Complemento.

 Técnicas de detección terciaria de la interacción Ag-Ac


o Inhibición de la hemoaglutinación.
o Seroneutralización. Seroprotección.
o Fijación de Complemento.
o Intradermorreacción.

o Fagocitosis.
o Linfoproliferación.
o Intradermorreacción.
o Citotoxicidad.

 Aplicación de las técnicas inmunológicas
o Evaluación del sistema inmune en un individuo.
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o Detección de la respuesta inmune frente a patógenos.

 Diagnóstico de hipersensibilidades.
o Evaluación del resultado de la inmunoprofilaxis.
o Diagnóstico de enfermedades infecciosas

 Hipersensibilidad tipo IV


o Bases celulares de la hipersensibilidad retardada.
o Granuloma tuberculoso. Dermatitis por pulgas en caninos. Hipersensibilidad de
contacto.
o Diagnóstico.
o Hipersensibilidad tipo V

 Anticuerpos anti-receptores: Anticuerpos agonistas y antagonistas. Fenómenos


de autoinmunidad
Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de órgano y sistémicas.
Inmunodeficiencias
o Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Diagnóstico.
o Respuesta inmune a tumores
o Mecanismos de rechazo de injertos

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CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOSEGURIDAD

Cuando en un ambiente se manipulan agentes infecciosos se producen una serie de riesgos a


los que están expuestas las personas, el medio ambiente e incluso toda la comunidad. Estos
riesgos varían según el agente, su patogenia y otros factores como las maniobras o
procedimientos empleados.

Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la


manipulación de material peligroso. Por ello, se efectúa una evaluación de los riesgos
biológicos para darles a las personas una contención (instalaciones, equipo de protección y
prácticas de trabajo) que reduzca la exposición hasta límites mínimos, de forma que estén
expuestos al menor riesgo posible (el riesgo cero no existe).

Clasificación de agentes biológicos

Los agentes biológicos se clasifican en grupos según su peligrosidad hacia el hombre:

Grupo 1. Microorganismos que presentan poca probabilidad de causar enfermedad en el


hombre. Ejemplos: Bacillus subtilis, Saccharomyces sp.

Grupo 2. Aquéllos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un
peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la población.
Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:

Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp,
Cryptococcus neoformans.

Grupo 3. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves en el hombre y presentan


un serio peligro para las personas expuestas, con riesgo de que se propaguen a la población.
Generalmente existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes.
Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis, Brucella sp, Histoplasma capsulatum, Neisseria
meningitidis, Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis, Virus de la encefalomielitis equina.

Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro
para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la población.
Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Virus de Lassa, Machupo y Ébola.

Niveles de contención

El primer principio de Bioseguridad es la contención.

El término "contención" se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de
materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la
exposición del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes
potencialmente peligrosos.

Se suelen describir cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en


la combinación, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biológica: la técnica
microbiológica, el equipo de seguridad y el diseño de la instalación. Cada combinación está
específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vías de transmisión de los
agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio.

a) Nivel de contención 1:

Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1.

Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros


docentes donde se emplean cepas no patógenas (E. coli K12, B. subtilis, Naegleria sp,

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Saccharomyces cerevisiae, etc.).También, es el que se utiliza en la industria de la alimentación
para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos, etc.

b) Nivel de contención 2:

Es el obligatorio para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia
flora habitual del hombre, son capaces de originar patologías infecciosas humanas de gravedad
moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (veterinarios y otros
profesionales de la salud) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de
Diagnóstico Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma,
Clostridium sp, etc.).

c) Nivel de contención 3:

Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos


que cursan con patologías graves, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas
y son capaces de producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la
infección adquirida a través de aerosoles y fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas
a tomar en este caso son la correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad.

En los Laboratorios de Diagnóstico Veterinario debe evitarse la contaminación ambiental y la


infección del operador con patógenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de la
encefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos sólo pueden ser procesados por personal
calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es
decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión,
cabinas de seguridad, etc.

d) Nivel de contención 4:

Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patógeno exótico o no, que
produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe
tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de
dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Agentes del grupo 4 ó animales de experimentación
infectados con ellos: ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de
Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de
contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que
los eleven al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar
fallecimiento por fracaso terapéutico.

En la práctica veterinaria diaria, el profesional se encuentra expuesto a agentes patógenos


pertenecientes a los grupos 2, 3 y eventualmente al grupo 4, que son potencialmente
peligrosos tanto para él mismo como para sus pacientes y otras personas. Por lo tanto, deben
tomarse todas las precauciones y establecer y respetar medidas de contención adecuadas para
evitar el riesgo de la diseminación a la comunidad. El inicio de algunas enfermedades
profesionales es lento y muchas veces enmascarado por otros trastornos físicos. Por esto, el
profesional veterinario tiene que tener una clara conciencia del riesgo de su profesión y conocer
en cada una de sus actividades los riesgos a los cuales puede verse expuesto.

Sólo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario, su forma de
transmisión y exposición, se podrán realizar las acciones correspondientes a fin de prevenirlas.

Bioseguridad en el consultorio veterinario

Durante la revisación clínica se contaminan las manos del profesional, por lo tanto deben
lavarse entre la atención de pacientes.

Para ciertas maniobras de exploración como el examen de la cavidad bucal, la exploración de


mucosas aparentes, la toma de muestras de orina, la punción exploradora, etc., se debe utilizar
guantes descartables.

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Asimismo, debe desinfectarse la camilla y todos los elementos empleados durante la consulta.
Es común la toma de muestras (sangre, orina, materia fecal, biopsias, etc.) para efectuar
análisis complementarios que ayuden al diagnóstico o al seguimiento de un caso clínico. Estas
muestras, en general, son analizadas por laboratorios de diagnóstico externos a la clínica, por
lo tanto debe evitarse la diseminación de patógenos durante su traslado:

 Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados (nunca se debe
 enviar la sangre dentro de la jeringa de extracción).
 Las muestras de orina (para urinálisis o bacteriología), tejidos u órganos (para
diagnóstico histopatológico, conservados en formol al 10%), deben ser conservadas en frascos
de tapa a rosca cerrados herméticamente.
 Las muestras de órganos remitidas en frío para diagnóstico microbiológico deben
colocarse en bolsas plásticas cerradas. Nunca se deben colocar muestras de diferentes
órganos en la misma bolsa.
 Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas, preferiblemente de telgopor (con
refrigerantes, cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su apertura
accidental.
 Las muestras deben ir acompañadas de un protocolo de remisión de muestras (ver más
adelante), de manera que el destinatario esté advertido de los riesgos potenciales antes de
tomar contacto con la muestra.

Residuos patogénicos

Son considerados residuos patogénicos todos aquellos desechos o elementos materiales en


estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que presumiblemente presenten o puedan
presentar características de infecciosidad, toxicidad o actividad biológica que puedan afectar
directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminación del suelo, del agua o de la
atmósfera, que sean generados en la atención de la salud humana o animal por el diagnóstico,
tratamiento, inmunización o provisión de servicios, así como también en la investigación o
producción comercial de elementos biológicos o tóxicos”. (Ley 154 de la Ciudad Autónoma de
Buenos Aires, 18 de febrero de 1999).

Residuos patogénicos son, por ejemplo:


 Los provenientes de cultivos de laboratorio, restos de sangre y sus derivados.
 Restos orgánicos provenientes del quirófano, de servicios de hemodiálisis, hemoterapia,
anatomía patológica, morgue.
 Algodones, gasas, vendas, jeringas, objetos cortantes o punzantes, materiales
descartables y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patogénicos y que
no se esterilicen (Nivel de bioseguridad 3).
 Todos los residuos, cualesquiera sean sus características, que se generen en áreas de
alto riesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4).
 Restos de animales provenientes de clínicas veterinarias, centros de investigación y
académicos.
 Frascos de medicamentos y vacunas vacíos.

Los residuos patogénicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Esta
actividad está reglamentada en la ley Nº 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Todos
los residuos patogénicos deben colocarse en bolsas rojas de más de 120 micrones de espesor.
Estas bolsas se colocan en cajas de cartón o en recipientes plásticos debidamente sellados e
identificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas
que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar patógenos
al medio ambiente. En general los residuos patológicos son incinerados en hornos a
temperaturas mayores a los 1200ºC que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas
(hornos pirolíticos).

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Bioseguridad en la producción agropecuaria

Son varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prácticas rutinarias en la
producción agropecuaria, por lo tanto también deben tomarse precauciones.
 Usar mameluco descartable o de algodón resistente al lavado intenso y botas de goma.
 Revisar el estado de la manga, andenes, cepos, puertas laterales, etc.
 Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias.
 Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metálicas, verificar que no
tengan pérdidas cuando se inyecta. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso.
 No reutilizar las jeringas descartables, eliminar las jeringas en una bolsa roja y las
agujas en un frasco con tapa con hendidura.
 Luego del trabajo en la manga, desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa
plástica y luego lavarla, separada de otras, en agua a 90ºC.
 Enterrar o incinerar los cadáveres de animales sospechosos
de haber muerto por enfermedades infecciosas graves o zoonóticas.
La práctica dependerá de la enfermedad de la que se sospeche.
 Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente.
Bioseguridad en el laboratorio de diagnóstico

El laboratorio de diagnóstico recibe muestras que deben ser consideradas como


potencialmente peligrosas y deben tomarse todos los recaudos necesarios para evitar el
contagio y la diseminación de los agentes infecciosos.

 No comer, beber o fumar en el laboratorio.


 Trabajar con el cabello recogido y uñas cortas.
 Evitar el uso de anillos y pulseras.
 Debe usarse guardapolvo u otra indumentaria diferente a la ropa de calle, además usar
calzado cerrado para proteger los pies.
 Utilizar guantes para manipular las muestras.
 Nunca pipetear con la boca, usar pipetas automáticas, propipetas o peras de goma.
 Luego de trabajar, desinfectar las mesadas y todos los elementos utilizados.
 Luego de procesadas, tratar las muestras como residuos patogénicos.
 Rotular todos los frascos utilizados en el laboratorio indicando su contenido, la fecha de
apertura o preparación, la fecha de vencimiento y la peligrosidad de la solución o sustancia
química (irritante, carcinogénica, inocua, etc.).

TOMA DE MUESTRAS PARA LA EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNE

Frente a un caso clínico, el médico interviniente deberá conocer cuáles son las pruebas
laboratoriales inmunológicas más adecuadas para corroborar o desestimar su diagnóstico
presuntivo y también para la correcta toma de muestra a enviar.
La calidad y utilidad de los análisis de laboratorio depende en gran medida tanto de la correcta
toma de muestra según la prueba diagnóstica a solicitar como de su conservación y envío al
laboratorio. Los errores cometidos en este paso repercutirán en el resultado de la prueba,
dando errores diagnósticos que tendrán consecuencias negativas para la resolución del cuadro
clínico.

Toma de muestras de sangre


La toma de muestras de sangre es una de las prácticas más habituales en la clínica diaria. Se
realiza en razón de múltiples objetivos. La mayoría de las enfermedades infecciosas pueden
ser diagnosticadas por técnicas serológicas estandarizadas como por ejemplo la detección de
anticuerpos, en las que también se requiere muestras de sangre, fundamentalmente suero
sanguíneo.

Las reglas básicas para la toma y remisión de muestras de sangre o suero al laboratorio
son las siguientes:

15
- Informar al laboratorio la/las pruebas inmunológicas a solicitar ya que algunas de ellas
requieren de un tratamiento especial de envío, de una muestra control para ser procesada
paralelamente a la muestra del paciente, como por ejemplo la prueba de estimulación de
linfocitos, etc.

- Cuando la muestra debe ser extraída con anticoagulante, previo a la extracción debe ser
consultado el laboratorista, quien indicará el más conveniente para las pruebas que deba
realizar. Los más usados son los quelantes del Ca++, como el citrato de Na, o la solución de
Alsever, que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato de Na como
anticoagulante.
- Para la correcta toma de muestra y para evitar los posibles riesgos de envío, es
aconsejable que la misma sea obtenida en el laboratorio, particularmente en las pruebas de
evaluación celular o de los factores del complemento.
- Las pruebas que requieren células viables hacen necesario que la sangre se transporte en
frio hasta el laboratorio y dentro de las 3 a 4 horas de extracción. Si esto no es posible, se
debe enviar la muestra acondicionada del modo más conveniente para cada caso y lo más
rápidamente posible.
- La toma de muestra de sangre se obtiene por punción venosa de sangre periférica (con o
sin anticoagulante dependiendo de la prueba a solicitar), en condiciones de asepsia,
utilizando jeringas y agujas descartables.
- Extraer la cantidad mínima necesaria para las pruebas. Esto es crítico cuando se deben
hacer sangrías sucesivas a pequeños animales.
- El uso de elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes), el manipulación
brusca y la formación de espuma cuando se trasvasa la muestra de la jeringa al tubo de
ensayos pueden producir hemólisis. La predisposición a sufrir hemólisis en la muestra de
sangre depende de la especies y en orden creciente es: equinos, bovinos, ovinos, aves,
felinos y caninos.
- Las muestras se envían al laboratorio dentro de contenedores (frascos o recipientes con
tapa a rosca) con la correcta etiqueta identificatoria escrita con letra clara y legible. En ella
constan los datos de: nº de historia clínica, especie, sexo, edad, utilización del animal,
diagnóstico presuntivo, material y conservante enviado, además de los datos del
profesional interviniente. Si las muestras provienen de una necropsia, se describe los
puntos más relevantes de los hallazgos. Se adjunta, como ejemplo, el protocolo de envío de
muestras utilizado en el servicio que brinda el área de Inmunología de la Facultad.
- Hasta el envío o procesamiento de las muestras, éstas deben ser conservadas en
heladeras (4ºC) en cajas de telgopor con refrigerantes y abundante papel a fin de prolongar
el efecto refrigerante y protegen a los envases de rupturas. La caja de transporte debe
tener una etiqueta con el rótulo RIESGO BIOLÓGICO.

Extendidos de Sangre:
Los extendidos de sangre se realizan inmediatamente después de extraída la muestra, junto al
animal, utilizando las últimas gotas de sangre que quedan en la aguja. Preparados
correctamente estos extendidos son estables aún si no están fijados. Pueden teñirse hasta
varios días después si se conservan secos y protegidos de la humedad. Envueltos en papeles
limpios y colocados en un recipiente hermético, pueden remitirse por correo. El método de
fijación puede variar según la tinción, pero en general se pueden fijar con calor o con distintos
alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida.

Extracción de Suero:
Para extraer el suero de la sangre, se la deja coagular en un tubo de ensayo. Una vez formado
el coágulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la mayor
cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37°C durante 30 minutos a 1 hora y con el
fin de obtener la mayor retracción del coágulo, se lo deja en heladera (4°C) durante una noche.
A partir de aquí, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30 minutos) o extraer
directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos se debe operar
cuidadosamente tratando de evitar tocar el coágulo para no producir hemólisis.

El suero puede mantenerse a 4°C durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminación,
conviene agregarle una pizca de azida sódica (este conservante puede ser tóxico por lo que es
conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro
16
de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20°C (lo óptimo es a -70°C). Si bien
a estas temperaturas prácticamente no hay degradación proteica, sí la hay durante cada ciclo
de congelación – descongelación.

Para los exámenes serológicos de diagnóstico específico se puede emplear un suero que ha
sido conservado congelado, no así para exámenes electroforéticos donde es conveniente evitar
el congelamiento. En el rótulo de la muestra debe especificarse si la muestra ha sido
congelada, conservada a 4ºC y cualquier otra observación que se considere necesario.

Si bien no es aconsejable, se puede enviar al laboratorio muestra de sangre entera refrigerada


nunca congelada, y con un breve tiempo entre la extracción y la entrega. Si se prevén demoras
en la entrega, se debe enviar el suero ya separado. La razón de esta exigencia es el riesgo de
hemólisis en el trayecto inutilizándose así la muestra ya que la presencia de hemoglobina
puede afectar algunos resultados.

17
EJEMPLO DE PROTOCOLO DE ENVÍO DE MUESTRAS

18
PRUEBAS INMUNOLÓGICAS

Las pruebas inmunológicas tienen dos objetivos principales: el diagnóstico de enfermedades


infecciosas y la evaluación del sistema inmune.

Objetivo 1: Diagnóstico de enfermedades infecciosas


Estas pruebas son reacciones de tipo antígeno-anticuerpo y pueden tener dos propósitos
diferentes:
1a) Identificar y tipificar antígenos presentes en el suero del animal, como por
ejemplo los virus de la diarrea viral bovina (DVB), herpes virus bovino (IBR), Influenza
equina, Parvovirus canino, etc. En estos casos se utilizan anticuerpos específicos contra el
patógeno o contra subtipos o cepas del mismo, existentes en el laboratorio.
1b) Identificar la producción de anticuerpos específicos en el animal contra un
determinado patógeno. Por ejemplo detectar anticuerpos anti-Brucella abortus, anti- virus de
la Fiebre Aftosa, etc.

Según la técnica empleada, los resultados obtenidos se expresan de la siguiente


manera:
- presencia o ausencia de Antígenos o Anticuerpos, si la técnica es cualitativa;
- títulos de estos anticuerpos, si la técnica es semicuantitativa;
- miligramos de Ags o anticuerpos, si la técnica es cuantitativa.

Objetivo 2: Evaluación del sistema inmune (SI)


Estas pruebas se emplean para estudiar el SI, su funcionalidad, etc. Como ejemplos podemos
nombrar:
- 2a) determinación de los niveles de inmunoglobulinas totales o de alguna clase de
inmunoglobulina en particular, por ejemplo, cuando queremos saber si un animal tiene niveles
normales de IgG en suero,
- 2b) determinación de la relación entre ciertas células del SI; por ejemplo, relación
CD4/CD8,
- 2c) evaluación de la funcionalidad de las células del SI, midiendo su
proliferación o la producción de citoquinas.

19
TÉCNICAS DE EVALUACIÓN DE INMUNIDAD INNATA

La respuesta inmune innata representa la primera línea de defensa del huésped a la


infección. Una de sus características primordiales es la capacidad de responder a patógenos
que no ha visto previamente. Esta capacidad inherente del sistema innato se debe a su
habilidad de reconocer estructuras muy conservadas y compartidas por diversos patógenos.
Dichas estructuras son conocidas como patrones moleculares asociados a patógenos
(PAMPs, acrónimo proveniente del nombre en inglés: pathogen associated molecular patterns)
entre los que podemos ejemplificar a componentes de la pared bacteriana como
lipopolisacáridos (LPS), peptidoglicanos y ácido lipoteicoico entre otras estructuras. Estas
moléculas pueden ser vistas como firmas moleculares de los microorganismos invasores.
Si bien las bacterias de distintas cepas presentan algunas diferencias estructurales, se
describen patrones conservados. Por ejemplo, el lípido A que forma parte del LPS de las
bacterias Gram negativas es siempre constante y es el responsable de los efectos
proinflamatorios, mientras que el antígeno O es variable entre las distintas especies y no es
reconocido por el sistema inmune inespecífico.
De esta forma, el sistema inmune innato puede responder a muchas infecciones sólo con un
repertorio limitado de receptores. El reconocimiento de los PAMPs está mediado por
estructuras también muy conservadas en la evolución y que son conocidas como
receptores para el reconocimiento de patrones (PRRs, acrónimo proveniente del nombre en
inglés: pattern recognition receptors).
Entre los PRRs se describen varias familias, entre ellas, los receptores de tipo Toll
(TLR) son capaces de reconocer distintos PAMPs. Al menos diez miembros de la familia de
TLR se identificaron en mamíferos y cada miembro es capaz de reconocer distintos PAMPs.
Por ejemplo, el TLR 2 reconoce peptidoglicano y ácido lipoteicoico del S. aureus. El TLR 4
reconoce LPS de bacterias gram negativas incluyendo a E. coli.

Fagocitosis
Los mecanismos que tienen las células para incorporar en su interior fluidos, solutos y
partículas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores
específicos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las células fluidos y
solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores específicos, entran a la célula
macromoléculas, virus y otras partículas de pequeño tamaño. Ambos mecanismos son
independientes de la polimerización de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestión
de partículas de mayor tamaño, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las células
más eficientes para fagocitar partículas son los monocitos, macrófagos y neutrófilos a los que
se los denomina fagocitos profesionales.
Los polimorfonucleares neutrófilos se originan en la médula ósea (MO) y son
continuamente enviados a la circulación. Viven pocos días y tan pronto como los
microorganismos invaden los tejidos dejan el torrente circulatorio, se adhieren al endotelio
celular activado y se mueven a través de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesión. Son
considerados como la primera barrera de defensa frente a los microorganismos, ya que son los
primeros en llegar al sitio de invasión atraídos por los factores quimiotácticos que se generan
en el foco inflamatorio. Los factores quimiotácticos son principalmente componentes
bacterianos, productos de degradación de las bacterias, mediadores de la inflamación y otras
moléculas endógenas liberadas por el daño tisular.

Los monocitos se originan también en MO y pasan a la circulación, desde donde se


extravasan a los tejidos y se diferencian en los distintos órganos, tomando características
propias como es el caso de las células de Kupffer en el hígado, los macrófagos alveolares en el
pulmón y los histiocitos en el tejido conectivo. La transformación de monocito a macrófago
tisular involucra una serie de cambios morfológicos y metabólicos en la célula, como son el
aumento del tamaño celular, la modificación en la calidad y cantidad de enzimas lisosomales,
etc.

La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos


asociados al sistema inmune que aparece más tempranamente en la escala filogenética. Se
conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partícula es ingerida por una célula. Las
20
partículas pueden ser bacterias, parásitos, células muertas y partículas inertes como el carbón,
etc. La partícula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la
naturaleza de la misma.
No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir el
reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultáneamente con esta evasión, el
sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factores
séricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestión de
microorganismos.
Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento
(C3b, C3bi, etc.) y las proteínas de fase aguda. Entre las proteínas de fase aguda se
encuentran la proteína C reactiva, las proteínas de unión al lipopolisacárido (LBP) y proteínas
de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la
unión de éstos a la molécula de CD14 presente en la membrana de las células fagocíticas. La
fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como
puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN).
El reconocimiento del microorganismo está mediado por diferentes receptores de
membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas.
Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activación del
proceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmento
cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la proteína C3 y C3b
del complemento (CR1, CR3 o CD11b/CD18 respectivamente), y los receptores de patrones
(PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroñero.
Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestión de un
microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si éste además está recubierto por C3b.
Estos receptores actúan cooperativamente para estimular vías de señalización, no sólo para
iniciar la polimerización de la actina sino también para activar la NADPH-oxidasa para la
producción de O2. Este último es uno de los mecanismos citotóxicos que entran en juego
luego de la fagocitosis.

Activación del polimorfonuclear / macrófago


Los PMN responden a una gran variedad de factores quimiotácticos, incluyendo los N-
formilpéptidos, factores derivados de la activación del complemento como el C5a, los
leucotrienos B4 (LTB4), la interleuquina 8 y el factor activador de plaquetas (PAF). Algunos de
los receptores de los factores quimiotácticos han sido identificados como miembros de la
superfamilia de los receptores unidos a la GTPasa (proteínas G), cuya característica estructural
es que poseen 7 dominios transmembrana. Estos receptores existen en estados
interconvertibles de alta y baja afinidad a consecuencia de que desarrollan un ciclo de
intercambio del nucleótido guanina e hidrólisis de GTP durante el cual estas proteínas sufren
varios cambios conformacionales. Estos estados de alta o baja afinidad dependen del
microambiente y los niveles de factores quimiotácticos.
Las proteínas G funcionan como intermediarios entre los receptores de superficie celular y las
enzimas efectoras responsables de la generación de segundos mensajeros: AMP cíclico
2+
inositoltrifosfato (IP3), Ca , diacilglicerol (DAG), ácido fosfatídico (PA), ácido araquidónico
(AA).
Estos segundos mensajeros son generados directa o indirectamente como consecuencia de la
activación de las fosfolipasas A2, C y D. La activación de los segundos mensajeros permite la
remodelación de la membrana citoplasmática, el aumento del metabolismo de los fosfolípidos,
la polimerización de la actina y el estallido respiratorio.

Los eventos tempranos de activación están interrelacionados y son fundamentalmente cuatro:


1- fosforilación en tirosina de proteínas de membrana y citoplasmáticas
2- hidrólisis del fosfolípido inositol de membrana

21
3- incremento del Ca2+ citoplasmático
4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)

Los neutrófilos contienen una gran variedad de quinasas de serina/treonina y de tirosinas.


Estas enzimas son blanco específico de los segundos mensajeros.
El entrecruzamiento de FcR induce la activación de diversas familias de quinasas y de
tirosinas. Macrófagos y PMN defectivos para estas quinasas exhiben una considerable
disminución de la fagocitosis y producción de O2.

Mecanismo de fagocitosis
La interacción receptor-ligando entre el fagocito y la partícula a ingerir activa la
maquinaria de la fase de ingestión para lo cual es necesario la modificación de las proteínas
involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y
proteínas de unión a la actina. Los microfilamentos de actina en la porción de citoplasma que
subyace al sitio de unión comienzan a polimerizarse. Esta polimerización lleva a que la
membrana envuelva la partícula, formándose seudópodos (extensiones de la membrana en
forma de dedos). Estos rodean a la partícula y finalmente se fusionan formando la vesícula
fagocítica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los gránulos citoplasmáticos se funden
con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma,
la partícula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como
oxígeno independientes y oxígeno dependientes.
Moléculas efectoras independientes del oxígeno
Estas sustancias están localizadas en los lisosomas o gránulos citoplasmáticos, se
liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la producción de oxidantes para ser
activas. Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partícula
sea muy grande para ser ingerida generando lesión en el tejido subyacente y efecto
conocido como fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas
hidrolíticas como fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que
actúan sobre las membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las
bacterias de este elemento indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los
mucopéptidos de la pared celular bacteriana.
Moléculas efectoras dependientes del oxígeno
Durante el proceso de fagocitosis las células pueden incrementar en 50 veces la
cantidad de oxígeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al
gran consumo de oxígeno, este fenómeno se denomina estallido respiratorio. El
consumo de oxígeno es utilizado para la producción de metabolitos tóxicos como anión
superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo, oxígeno singulete, hipocloritos y
cloraminas.
Se ha confirmado experimentalmente la relación entre la citoxicidad de los macrófagos y la
producción aumentada de los reactivos del nitrógeno e intermediarios del oxígeno. En los
sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados por citoquinas se encuentran niveles
elevados de nitritos inorgánicos (NO2-) y de anión superóxido (O2-), ambos asociados con la
actividad antimicrobiana. Las vías oxidativas productoras de estos dos metabolitos son
diferentes y no comparten precursores comunes.
El siguiente esquema muestra las vías de producción de moléculas efectoras,
señalando algunos de los estímulos necesarios para su activación, a saber: interferón gamma
(IFN), lipopolisacárido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).

22
L-
arginina oxígeno

Activación por Oxido nítrico Estimulación NADPH


INF sintasa (INOS) por fagocitosis o oxidasa
y LPS tratamiento con
PMA

Óxido nítrico anión superóxido


(NO) (O2)

Otros reactivos
nitrito intermediarios y peróxido de hidrógeno
-
(NO2 ) moléculas efectoras (H2O2)

nitrato radicales hidroxilo


-
(NO3 ) (OH)
Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2, Uno de ellos
es la acción de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidación y halogenación de
diferentes estructuras presentes en los microorganismos.

El óxido nítrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interactúa con una serie
de moléculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxígeno y agua, el NO
genera otros reactivos intermedios del nitrógeno y por último se descompone para formar NO2 -
y NO3-.

Los niveles de formación de los reactivos del oxígeno y producción de NO están


relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemos
citar la Enfermedad Granulomatosa Crónica que se presenta en individuos genéticamente
deficientes en la enzima NADPH oxidasa.

Métodos de evaluación de las fases de la fagocitosis


a) Quimiotaxis:
La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a través de un gradiente de concentración de
sustancias (como la formil-metionina) que producen migración dirigida. Los factores
quimiotácticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulación de
los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activación del complemento (el C5a está
considerado como uno de los más potentes factores quimiotácticos).
Las pruebas de quimiotaxis se utilizan, en determinados pacientes sospechados de
padecer una inmunodeficiencia, para evaluar la capacidad de sus células principalmente
neutrófilos frente a factores comprobadamente inductores de migración

Técnica de migración celular bajo capa de agarosa: Consiste en preparar un medio


soporte de agarosa sobre un portaobjeto en el cual se siembran las células en posición central,
ubicando frente a las mismas la sustancia quimiotáctica y una sustancia control. Durante la
incubación las células migran. Luego se fijan con metanol, se desprende la capa de agarosa y
se tiñen las células. La migración de los PMN se evalúa microscópicamente comparando la
distancia recorrida en dirección al factor quimiotáctico (dirigida) y la migración espontánea de
las células (al azar). Los valores normales deben determinarse para cada especie y en el
laboratorio de referencia.

b) Quimiotaxis y adherencia
Técnica de migración y adherencia a través de una membrana: para ello se utiliza la
cámara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de
diámetro. Se colocan las células en un compartimento y los factores quimiotácticos en otro y se
lleva a incubar. La capacidad de las células para migrar hacia el estímulo se evalúa tiñendo las
que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con
células del mismo animal (sin estímulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como
control de valor de animal sano.
23
b) Activación:
La activación de las células fagocíticas se señaliza a través de eventos de fosforilación de las
proteínas celulares involucradas en la trasmisión de la señal de activación. La posibilidad de
identificar proteínas fosforiladas con el uso de anticuerpos monoclonales que detectan, por ej.,
tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de activación de las células fagocíticas.
Para esta evaluación es necesario recurrir a las técnicas de PAGE e Inmunoblot a partir de las
células activadas (ver capítulos correspondientes en la presente guía).
La identificación de la migración de proteínas del citoplasma al núcleo celular para regular la
trascripción de moléculas relacionadas con la inflamación y fagocitosis constituye también una
manera de identificar los primeros eventos de activación celular. Como ejemplos de estos
sistemas podemos incluir la activación del factor NF-kB que involucra la degradación del factor
inhibidor de kB citoplasmático (proteína IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en
el núcleo celular. Esta modificación en los componentes proteicos celulares también se estudia
utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de técnicas de SDS-PAGE e inmunoblot.

c) Ingestión:
La etapa de ingestión se puede evaluar utilizando como partícula a ingerir diferentes
microorganismos. La utilización de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae,
se fundamenta en el tamaño de las partículas (fácil de ver en el microscopio óptico) y cuya
estructura de manosas son fácilmente detectados por los PRRs. La capacidad de ingestión de
las células provenientes del individuo a evaluar se determina realizando una cuantificación del
número de levaduras ingeridas en un determinado tiempo de incubación.
El recuento de las partículas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante
diversas metodologías:
- Tinción de las células con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se
diferencian las células que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200
células y determinar cuántas partículas por citoplasma celular es considerado como ingestión
positiva. Los métodos microscópicos requieren una laboriosa observación para determinar la
asociación de los microorganismos a las células y discriminar si estos microorganismos fueron
ingeridos o no.
-Marcación de las partículas a ingerir con fluoresceína; se utiliza la marcación de la partícula
con isotiocianato de fluoresceína u otro colorante fluorescente previo a la incubación con las
células, luego se elimina por lavado las partículas no ingeridas y se detectan las células que
ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometría de flujo (ver capítulo correspondiente
en la presente guía). La utilización de la coloración combinada diferencial con bromuro de etidio
permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aquéllas
internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluoresceína).
-Marcación con sustancias radiactivas de componentes bacterianos como proteínas, DNA y/o
RNA. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminoácidos o
nucleótidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucleótidos: tritio y luego del experimento de
ingestión en el que se incuban las células y las bacterias durante un periodo de tiempo
generalmente entre 30 a 60 minutos a 37ºC se lavan las células para eliminar las bacterias no
ingeridas. Se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo líquido o
sólido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se
relaciona con el número de partículas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de
ingestión de las células fagocíticas del individuo evaluado.

d) Digestión:

Evaluación del estallido respiratorio

Reducción del colorante nitroazul de tetrazolio


El nitroazul de tetrazolio (NBT) es un aceptor de un electrón utilizado para detectar en
forma indirecta la producción de superóxido por parte de los PMN estimulados.
El NBT de color amarillo y soluble, se transforma en formazán de color azul e insoluble
que precipita intracelularmente.

24
-
NBT (color amarillo y soluble) + O2 ----------› Formazán (color azul e insoluble) + O2

Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera, estimulados
con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubación de 30 minutos a 37C, la
formación del formazán puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.

Los cristales del colorante pueden identificarse intracelularmente por microscopía y realizar un
recuento del número de células que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden
ser solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificación por
espectrofotometría obteniendo los datos en densidad óptica.

Quimioluminiscencia
El estallido respiratorio en los PMN normales está asociado con la generación de
energía luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la producción
del oxígeno singulete (1O2). Este oxígeno se produce cuando uno de los electrones
desapareados de oxígeno es elevado a una órbita superior con la inversión del spin. La luz se
emite cuando el electrón retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El
oxígeno singulete es producido por la reacción entre H2O2 y el hipoclorito:
- 1 -
H2O2 + OCl ----------› O2 + H2O + Cl

La luz emitida se mide por la detección fluorométrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se
incrementa por el uso de hidracina cíclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol)
que actúan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo
usando el canal del 3H o a través de placa radiográfica.
Evaluación de la producción de Óxido Nítrico (NO)
Puede realizarse mediante la evaluación de la producción de NO o de la enzima que cataliza su
producción (iNOS o NOS2)

- Producción del NO
Los niveles de producción de NO en los cultivos de macrófagos estimulados con
bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activación de estas células.
La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluación de su producción se realiza
mediante la cuantificación de nitritos en el medio de cultivo.
La síntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo
de macrófagos y es lineal por 72 horas. La identificación de este metabolito en los
sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilización del reactivo de Greiss (sulfanilamida
y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la
coloración con los niveles de NO producidos en un cultivo. El cambio de color se evalúa por
espectrofotometría a 550 nm. Se realiza una curva patrón utilizando diferentes concentraciones
conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relación que permite
estimar la producción de NO in vitro.
Los análogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen acción
inhibitoria de la producción de nitritos a partir del NO por la vía de la iNOS por un fenómeno
competitivo. La utilización de estas moléculas permite confirmar que el aumento de producción
de nitritos en un cultivo está dado por este mecanismo.

- Incremento de la síntesis de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS o NOS2)


La producción de NO en altos niveles se cataliza por la acción de la enzima óxido nítrico
sintasa inducible. La expresión de esta enzima se produce por la acción de IFN y LPS en los
cultivos y se relaciona con la activación de macrófagos in vivo. Para la evaluación del aumento
en la producción de esta enzima se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen su
estructura antigénica marcados con enzimas. Este reactivo se utiliza para identificarla en los
extractos proteicos celulares evaluados mediante las técnicas de SDS-PAGE e Inmunoblot.

Evaluación del efecto bacteriostático o bactericida


La digestión de las partículas ingeridas depende no sólo de los mecanismos O
dependientes y O independientes descriptos sino de la capacidad del microorganismo de evadir
o inhibirlos, las bacterias intracelulares pueden permanecer en estas células fagocíticas que se

25
transforman en su hábitat. En el caso de bacterias extracelulares u otros patógenos este
mecanismo es capaz de contener o eliminar al agente agresor constituyéndose en un
mecanismo efector bacteriostático o bactericida. Estos mecanismos pueden ser evaluados
utilizando técnicas de cultivo bacteriano y determinando el número de unidades formadoras de
colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis.

Deficiencias en el mecanismo de fagocitosis


Las deficiencias pueden estar dadas en el número de células fagocíticas que posee un
individuo (diferencias cuantitativas) o sobre la funcionalidad de alguno de los mecanismos
descriptos (diferencias funcionales).
Las granulocitopenias son frecuentes en las deficiencias secundarias a enfermedades
linfoproliferativas, tratamientos inmunosupresores o excesiva destrucción mediada por
anticuerpos anti-leucocitarios. Las deficiencias funcionales pueden afectar la movilidad y
adherencia o la capacidad de ingestión y digestión.

Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clínicas en las especies domésticas son:

Deficiencia en la adhesión leucocitaria, principalmente en caninos


(CLAD) y bovinos (BLAD)
Deficiencia en glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa
Neutropenia cíclica. Descripta en caninos de razas Collie
Sindrome de Chediak-Higashi: es deficiencia en los gránulos secundarios
descripta en bovinos de raza Hereford y Brangus

Para el diagnóstico de estas inmunodeficiencias se trabaja con niveles de


complejidad crecientes.

Ensayos de nivel básico:


1. Determinación cuantitativa y morfológica de los granulocitos y monocitos.
2. Estudios de mecanismos microbicidas oxigeno dependientes.
a) Prueba de la reducción del nitroazul de tetrazolio.
b) Quimioluminiscencia.

Ensayos de nivel complejo:


1. Estudio de la expresión de las proteínas de adhesión (antígenos LFA-1,
CD11b/CD18, etc.)
2. Ensayos de quimiotaxis.
3. Estudios enzimáticos: mieloperoxidasa, glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa, etc.

Bibliografía

1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994.

26
2. Margni R.A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Médica
Panamericana S A 1996.
3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous
disease. N.Engl. J. Méd. 278: 971-976. 1968.
4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992.
5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol
1999. 17:593-623.

COMPLEMENTO

El sistema de complemento (C) está formado por unas 30 proteínas del suero que
interaccionan entre sí de modo regulado formando una cascada enzimática que permite una
amplificación de la respuesta inmune humoral.
Las principales consecuencias de la activación del C son:
1. Lisis del microorganismo o célula diana
2. Opsonización, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destrucción del
microorganismo fagocitado
3. Quimiotaxis sobre los fagocitos
4. Acción anafilotóxica,
5. Eliminación de inmunocomplejos circulantes
6. Regulación de la función de la inmunidad adaptativa (LB)

El complemento puede activarse por tres vías:


1. La vía alternativa, en la que interacciona directamente con la superficie del microorganismo.
2. La vía de las lectinas, con componentes similares a los de la vía clásica, pero que se inicia
sin necesidad de anticuerpos
3. La vía clásica, a través de la interacción del C con inmunocomplejos.

Las tres rutas comparten las últimas fases, consistentes en el ensamblaje del denominado
complejo de ataque a la membrana (CAM).

El complemento puede ser estudiado para determinar su concentración o funcionalidad en


un animal sospechoso de padecer una inmunodeficiencia o una enfermedad autoinmune.

La concentración de los factores del complemento en un suero problema se miden por


inmunodifusión simple radial o prueba de Mancini (ver capítulo sobre reacciones secundarias).

La funcionalidad del complemento en un suero problema se evalúa por la técnica de


hemólisis.

Por otra parte, el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reacción Ag-Ac
tuvo lugar, ya sea para identificar antígenos como anticuerpos. Por ejemplo, la lisis por
complemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguíneos en animales utilizando
anticuerpos específicos. Mientras que, la técnica de fijación de complemento se emplea para
detectar Acs específicos para el diagnóstico de algunas enfermedades infecciosas, utilizando
un Ag de referencia.

Fundamentos de la hemólisis mediada por complemento:


Cuando a una suspensión de GR sensibilizados con anticuerpos específicos se le agrega
complemento, se produce la hemólisis y la consiguiente liberación de hemoglobina (Hb) en el
sobrenadante. Esta concentración de Hb está en función directa con el grado de hemólisis que
tuvo lugar en la muestra y puede ser evaluada por absorción a 542 nm en un
espectrofotómetro. Los estudios de cinética de esta inmuno-hemólisis han demostrado que la
27
sensibilidad de estas valoraciones es mayor cuando el título se establece sobre la base de la
dosis de complemento que produce la lisis del 50% de los hematíes del sistema.

Esto tiene una explicación clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de
hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado al sistema, puede observarse
que dicho gráfico no corresponde a una recta, sino a una curva sigmoidea que presenta una
marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemólisis. Los extremos de la curva,
que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemólisis, presentan una
pendiente significativamente menor o nula.

Figura 1: Porcentaje de hemólisis en una muestra de GR sensibilizados en función de la


cantidad de complemento agregado. El porcentaje de hemólisis se mide como la
concentración de Hb que se obtiene en el sobrenadante por absorción a 542 nm. Fuente
de complemento: suero fresco de cobayo.

De este gráfico se deduce que, cuando se hacen cuantificaciones de C a 50% de hemólisis, el


consumo de pequeñas cantidades de complemento produce cambios significativos en el
porcentaje de hemólisis. Esta relación no se observa cuando las cuantificaciones de C se
realizan sobre la base del 100% de hemólisis. Por esto, la técnica es más sensible basándose
en el 50% de hemólisis.
Se define así la unidad de complemento hemolítica 50% (CH50), que corresponde a los
mililitros de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para
producir la lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de
incubación a 37ºC. La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos óptimamente
sensibilizados, resuspendidos en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones
óptimas de Calcio y Magnesio, a una fuerza iónica y a un pH óptimo para cada especie.

Evaluación de la funcionalidad del complemento en un suero problema


En la prueba para evaluar la funcionalidad del complemento, los sueros de los animales
problema y de referencia se diluyen en forma seriada en un rango que va desde 1/20 a 1/320.
Luego se agrega una suspensión estándar de eritrocitos óptimamente sensibilizados a cada
dilución de suero. El complemento presente en el suero se activa por los Acs que recubren los
GR (complejos inmunes) y causa la lisis de los eritrocitos (hemólisis). El porcentaje de
hemólisis es proporcional a la concentración de complemento dentro de cada dilución de cada
suero en particular. La hemoglobina liberada se mide en un espectrofotómetro luego del
período de incubación.

Se deben realizar los siguientes controles:


 0% de hemólisis (buffer + GR sensibilizados), y
100% de hemólisis (agua destilada + GR sensibilizados).

El porcentaje de hemólisis para cada dilución de suero evaluado se calcula de la siguiente


forma:
28
DO del suero problema - DO (control de lisis espontánea 0% lisis)
% de hemólisis = x 100

DO (100% lisis) - DO (0% lisis)


Este ensayo produce también una curva sigmoidea si se grafica el % de hemólisis versus la
dilución del suero problema. El valor del 50% de hemólisis es el elegido para definir el título de
un suero como la inversa o recíproca de la dilución del suero que produce un 50% de
hemólisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la función del C deben
haber sido conservadas a -70ºC dentro de las 2 hs de extraídas, dada la labilidad de las
proteínas del C. Mediante esta técnica se evalúa la vía clásica de activación del complemento.
Este ensayo también puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR
sensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que
difunda durante 20 hs a 4ºC. Las placas se incuban luego a 37ºC por 90 min para permitir la
hemólisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo diámetro es proporcional al
logaritmo de la concentración del complemento en el suero.

ANTICUERPOS

Obtención de anticuerpos policlonales o sueros hiperinmunes:


Cuando se inmuniza un animal con un antígeno se genera una respuesta inmune compleja,
generalmente aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Igs específicas
frente al antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los linfocitos B
que poseen receptores que interaccionan con el antígeno, el cual puede presentar diferentes
epitopes, y cada uno de ellos ser reconocido por varios clones de linfocitos B que producirán
células plasmáticas productoras de inmunoglobulinas específicas. Como consecuencia de esta
respuesta inmune humoral específica se acumulan un número desconocido, posiblemente
elevado, de diferentes moléculas de inmunoglobulinas específicas frente al antígeno en el
suero del animal inmunizado. Se trata de un suero producido por la activación de numerosos
clones de linfocitos B y por ello se denomina policlonal.
Anticuerpo policlonal
El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno sólo o con
adición de adyuvantes, cuya función es favorecer su inmunogenicidad. Cuando la inmunización
se realiza sobre animales vírgenes o “naive”, a la primera dosis se la describe como:
inmunización primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilización del
individuo generando la expansión de los clonos específicos y la aparición de células de
memoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y células específicas puede
ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunización se
aplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunización, con una duración
variable, aunque una fase de inmunización primaria suele durar de 1 a 3 meses con
inyecciones cada 15 a 21 días, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar también
de acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antígeno dependerá del animal
empleado. Los más comúnmente utilizados son ratón, rata, conejo, cabra y gallina. Las
cantidades oscilan de los 50 a 1000 μg de antígeno para una dosis en ratón a los 0,25 a 5 mg
por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo.
Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de
diagnóstico o inmunidad pasiva, los planes están compuestos por varias dosis. Si nuestro
objetivo es la producción de reactivos diagnósticos que nos permitan identificar
Inmunoglobulinas de diferentes especies, debemos considerar la distancia filogenética para la
elección de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilización de la gallina como especie
para obtención de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogenética existente con los
mamíferos, y la obtención de los anticuerpos de la yema de huevo que no afecta la vida del
animal dador.
Así, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han respondido a múltiples
inoculaciones de un antígeno determinado. Las aplicaciones son numerosas, por ejemplo,
como reactivos para el diagnóstico de ciertas enfermedades. Estos sueros contendrán
anticuerpos policlonales en alta concentración contra los distintos componentes de un antígeno.

29
Anticuerpos monoclonales
Kohler y Milstein desarrollaron una técnica que permitió la producción de anticuerpos
producidos a partir de un solo clon de linfocitos B. El fundamento de la técnica consiste en
fusionar linfocitos B provenientes de un ratón inmunizado con el antígeno de interés con líneas
celulares provenientes de mielomas no secretante murino. Los híbridos resultantes presentan
dos propiedades: secretan anticuerpos específicos hacia el antígeno empleado en la
inmunización, proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como líneas celulares.
Esta tecnología ha revolucionado el empleo de los anticuerpos, tanto en lo referido al enfoque
diagnóstico como terapéutico. Es importante destacar que mediante esta metodología se
pueden obtener anticuerpos homogéneos (ya que proviene de un único clon de linfocitos B) y
de muy alta especificidad, lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de las técnicas
inmunológicas que los aplican.
Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un único clon de linfocitos
B y por lo tanto, con idéntica secuencia aminoacídica en sus regiones variables. Poseen una
especificidad única, con una afinidad hacia el antígeno determinada e invariable y presentan un
único isotipo. En estas características residen las principales ventajas que presentan los
anticuerpos monoclonales para su uso en investigación y diagnóstico. Por el contrario, los
anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de
distintos clones de linfocitos B. A continuación se enumeran las principales diferencias entre
anticuerpos monoclonales y policlonales (Figura 1)
Figura 1: Esquema de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales

Anticuerpos monoclonales:
1. Son químicamente homogéneos, poseen una única secuencia de aminoácidos por lo cual
sus propiedades son estables.
2. Son de especificidad definida porque todas las moléculas tienen la misma región
hipervariable.
3. Poseen una única avidez y afinidad.
4. Su estabilidad físico-química depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden
ser sensibles o resistentes a cambios de pH, temperatura, liofilización y a la marcación con
enzimas o isótopos.
5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antígeno-
anticuerpo insolubles con antígenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antígeno tiene
epitopes repetitivos.
6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas.
7. Pueden conservarse las células (clonos) productoras a través de varios años si se las
manipula con cuidado (según técnicas de cultivo celular)

Anticuerpos policlonales:
30
1. Son heterogéneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los
distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero).
2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del
inmunógeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros
antígenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales.
3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varían en
función del momento de la respuesta inmune en que se realizó la determinación. Así, la
afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune será menor
que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a medida que
la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduración de la afinidad de los
anticuerpos.
4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean más
resistentes frente a distintos cambios físico-químicos.
5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de múltiples anticuerpos dirigidos
contra distintos epitopes en la molécula antigénica, lo que permite la formación de una red
antígeno-anticuerpo.
6. Se producen en animales inmunizados, por lo tanto, son difíciles de estandarizar.

PURIFICACIÓN Y FRACCIONAMIENTO DE ANTICUERPOS

1-Aislamiento y Purificación de Anticuerpos


El aislamiento de los anticuerpos es necesario para realizar un gran número de técnicas,
tanto destinadas al diagnóstico como a la investigación. Existe una amplia variedad de métodos
utilizados para purificar anticuerpos.
La correcta elección del método de purificación dependerá de un número de variables, dentro
de ellas las más importantes son: el uso posterior de los anticuerpos purificados, la especie de
origen del anticuerpo y el tipo de material biológico a partir del cual se realizará la purificacion,
así como también de la clase o isotipo y subclase o subisotipo de la molécula de anticuerpos a
purificar.

31
En la tabla 1 se muestran las posibles fuentes de anticuerpos y sus características

Tabla 1: Comparación de diferentes fuentes de anticuerpos


Concentración de Concentración de Posible pureza de
Tipo de Anticuerpos Anticuerpos
Fuentes Anticuerpos anticuerpos
Anticuerpo específicos contaminantes
totales (mg/ml) específicos (%)
(mg/ml)
10% como
Suero Otros Ac del
Policlonal 10 1 máximo
suero

Sobrenadante Anticuerpos
de cultivo de bovinos
Monoclonal 1 0.05 > 95%
hibridoma provenientes del
(con 10% de Suero de Feto
Suero Fetal Bovino
Bovino)

Sobrenadante
de cultivo
Monoclonal 0.05 0.05 Ninguno >95%
(sin Suero Fetal)

Líquido ascítico
Anticuerpos de
Murino Monoclonal 1-10 0.9-9 90%
ratón

Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988.
pp726.

Aislamiento de las Inmunoglobulinas

- Precipitación
Las interacciones de una proteína disuelta en agua ocurren entre las moléculas de proteína-
agua y proteína-proteína. Cuando predominan las interacciones proteína-agua, las proteínas se
hallan en solución; cuando predominan las interacciones proteína-proteína, éstas precipitan.
Cuando a una proteína disuelta en agua le agregamos una sal, se produce una competencia
por la molécula de agua y como la sal es más hidrofílica que la proteína como consecuencia
predominan las interacciones proteína-proteína y se logra la precipitación de la proteína.

Algunos factores afectan este proceso, a saber:

El pH: Cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la carga


neta de dicha proteína es cero y por lo tanto sus moléculas se aglomeran y precipitan.

La temperatura: Una de las sales más utilizadas para la precipitación de las proteínas en
este caso Inmunoglobulinas o Anticuerpos es el sulfato de amonio. La solución de esta sal
utilizada como reactivo conviene usarla a 4ºC, ya que a mayor temperatura, mayor solubilidad
proteica y como el objetivo es precipitarla a menor temperatura es más favorable la reacción.
Esta relación entre solubilidad y temperatura se cumple dentro del rango de 0 a 40ºC.

La estructura química: factores como: el número y la posición de los grupos polares de dicha
proteína y el peso molecular de la proteína a purificar, deben ser considerados en la selección
del método.

 Precipitación salina
La precipitación salina es un método que permite separar las distintas fracciones proteicas
del suero. Las sales más comúnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.
La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni a
temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio.

32
La concentración de sal a la cual precipitan los anticuerpos varía según la especie. Por
ejemplo, la mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan con una solución saturada al 40%,
mientras que los anticuerpos de ratón necesitan entre 40-50%.

 Precipitación con ácido caprílico


La adición al suero de ácidos grasos de cadena corta como el ácido caprílico en
condiciones medianamente ácidas, precipita la mayoría de las proteínas con excepción de las
inmunoglobulinas del isotipo G (IgGs).
Esta metodología, por lo tanto, permite obtener IgG purificada a partir de suero si se la realiza
en combinación con otras metodologías (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico).

Método de Purificación:
-Cromatografía
La característica que distingue a los métodos cromatográficos es la presencia de dos fases
mutuamente no miscibles: una móvil y una estacionaria, que se hallan en contacto.

La muestra a purificar se introduce en la fase móvil y es transportada a lo largo de una columna


que contiene la fase estacionaria homogéneamente distribuida. Los diferentes componentes de
la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en función de su interacción
con la fase estacionaria: el componente que menos interactúa es el menos retenido y eluye
primero, el que más interactúa resulta retenido más fuertemente y eluye último.

Una separación óptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el
componente que eluye en segundo término es retenido lo suficiente como para impedir su
superposición con el componente que eluyó en primer término.

Las macromoléculas biológicas difieren en sus características fisicoquímicas: tamaño,


forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura
tridimensional. La separación de las muestras entre las fases aprovecha éstas diferencias entre
las propiedades fisicoquímicas de cada uno de los componentes de una muestra dada.

Es lógico, por lo tanto, que los métodos cromatográficos más comunes para la purificación de
estas moléculas sean:

 Cromatografía de exclusión molecular (discriminación por tamaño y forma),


 Cromatografía de intercambio iónico (discriminación por carga)
 Cromatografía de interacción hidrofóbica (discriminación por superficie hidrofóbica)
 Cromatografía de afinidad (distribución de aminoácidos específicos en la superficie de las

proteínas.

 Cromatografía de Exclusión Molecular

Fundamentos:
Este tipo de cromatografía utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente
tamaño.
Una columna tendrá dos volúmenes medibles, el volumen externo (Vo), constituido por el
volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de gel), y el volumen interno (Vi)
correspondiente al volumen de las esferas a los que los solutos y solventes pueden acceder
cuando se introducen dentro de aquéllas, a través de sus poros.
Las moléculas que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamaño es mayor al de los poros,
sólo se equilibrarán en el Vo, mientras que las de menor tamaño se equilibrarán en ambos
volúmenes.
Cuando una muestra compleja de proteínas y otros componentes, disuelta en un pequeño
volumen, es aplicada éstas columnas, filtrará a través de la misma: las proteínas de mayor
peso molecular eluirán con el Vo y por lo tanto se obtendrán primero, mientras que las
proteínas de menor tamaño, que pueden acceder al Vi, aparecerán más tardíamente y en un
volumen de elución (Ve) determinado que dependerá de su peso molecular. (Ver esquema).
33
ASPECTOS METODOLÓGICOS:

La matriz utilizada en este tipo de cromatografía es Sephadex®, que se expende en forma de


polvo y puede tener diferentes tamaños de poro, lo que permite seleccionar el correspondiente
para la separación de proteínas de diferente tamaño.
Las muestras no pueden contener una concentración proteica mayor a 50 mg/ml.
Las muestras deben ser clarificadas por centrifugación a fin de eliminar todo el material
insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma previo a
la cromatografía.
La fuerza iónica de los solventes cromatográficos debe ser lo suficientemente elevada como
para impedir la adsorción inespecífica del soluto a la matriz por interacciones electrostáticas o
uniones de Van Der Waals.
Aplicación:
Como las moléculas de IgM son mucho más grandes que las moléculas de IgG y de otras
proteínas que se encuentran en el suero, la cromatografía de exclusión molecular puede ser
usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparación pura de IgM, se puede
utilizar esta técnica combinada primero el aislamiento por precipitación con sulfato de amonio y
luego la aplicación de la columna de exclusión molecular.

 Cromatografía de Intercambio Iónico

Fundamentos:
La cromatografía de intercambio iónico trabaja por la unión de biomoléculas con una carga
determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta.
Las biomoléculas se unen a resinas de intercambio iónico cuando tienen carga opuesta a la de
los iones fijos de la resina. Esta unión es de tipo electrostático y reversible. La fuerza puede ser
modificada variando la concentración salina y el pH de la solución buffer utilizada como
eluyente.
La separación de dos o más sustancias se consigue por un mecanismo de adsorción
reversible, que consiste en la fijación inicial y posterior remoción. Si las sustancias fijadas
tienen diferentes propiedades eléctricas, mediante la variación del pH o fuerza iónica del
eluyente se conseguirá que cada una de ellas eluya por separado.

Matrices y solventes:
La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintéticas, polisacáridos
como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina
el tipo y la fuerza de unión del ión intercambiador.
Los dos tipos de resinas más utilizadas son:
 de intercambio catiónico (con matrices con carga negativa) y
 de intercambio aniónico (con matrices con carga positiva).

34
La elección correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le
aporta la carga, dependerá de la carga neta de la sustancia que se desea separar.
En los casos de moléculas anfotéricas como las proteínas, que poseen grupos cargados
positiva y negativamente, su carga neta dependerá del pH del medio. Estas sustancias, según
sea el pH del medio, podrán unirse a resinas aniónicas o catiónicas; en su punto isoeléctrico
(pI), tendrán carga neta cero y no se fijarán a ningún tipo de resina intercambiadora.

 Cromatografía de Afinidad

Fundamentos:
La técnica de cromatografía de afinidad es una de las técnicas más utilizadas para la
purificación de proteínas. Consiste en una cromatografía de adsorción la que se fundamenta en
la especificidad de interacciones biológicas como las interacciones antígeno-anticuerpo,
enzima-inhibidor, lectina-hidrato de carbono, etc.
La biomolécula que se quiere purificar (por ejemplo, un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de
reconocimiento a través del cual puede interactuar con otra molécula natural o artificial a la que
se llama ligando (por ejemplo, un antígeno).
El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimérica y es usado para capturar selectivamente
a la biomolécula que se desea purificar, cuando ésta se encuentra en una mezcla impura.
La biomolécula deseada puede ser eluída del ligando por cambios en las condiciones externas
(pH, fuerza iónica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interacción biomolécula–
ligando y permiten que la molécula deseada sea eluída en forma purificada.
Existe una gran diversidad de biomoléculas que pueden purificarse por este método
cromatográfico, entre ellas: antígenos, anticuerpos, enzimas, proteínas unidas a hormonas,
proteínas unidas a vitaminas, receptores, glicoproteínas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus,
fagos, células y proteínas producidas por ingeniería genética.
La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las
condiciones experimentales debe ser física y químicamente estable.
Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para
ser utilizadas como soporte para el ligando. La activación de la matriz se realiza para que el
ligando quede inmovilizado en ella a través de una interacción química que produzca una unión
estable entre matriz y ligando.
En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacárida, en su mayoría derivados de la
agarosa. Debido a su estructura química, estas matrices tienen la característica de ser casi
inertes, de forma que no producen interacciones inespecíficas. Esto es esencial porque la
cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas.

La selección del ligando utilizado en cromatografía de afinidad debe tener en cuenta:


1- que la afinidad de unión del ligando sea específica y reversible por la sustancia que será
purificada.
2- que el ligando posea grupos químicamente modificables que permitan su unión a la matriz
sin que se destruya su capacidad de unión a la sustancia que será purificada.

Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, éste se va a unir a la matriz a través de su porción


Fc, y por lo tanto, quedará libre el sitio de unión al antígeno. Al agregar un antígeno, éste será
reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las demás moléculas
presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado.
Posteriormente, el antígeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma
pura.

El ligando idealmente debería tener una afinidad de unión de 10-4 a 10-8 M-1 en solución.
Si la constante de disociación es mayor que 10-8 M-1 esta técnica no puede ser utilizada para la
purificación de estas moléculas pues la unión es muy estable y la separación de la biomolécula del
ligando se hace muy difícil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interacción hormona-
receptor para lo cual este método no resulta útil.

Ejemplos:

Purificación por columna de proteína A-sepharosa:


35
La proteína A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureus y tiene la
particularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos. Se han encontrado proteínas similares
en otras bacterias (por ejemplo proteína G en Streptococcus sp.). Aunque se desconoce la
explicación biológica de la fuerte afinidad que tienen la proteína A y la proteína G con las
moléculas de IgG, se supone que representaría un mecanismo de escape de las bacterias a la
respuesta inmune del huésped. A partir del estudio de estas proteínas, se las comenzó a
utilizar para purificar específicamente anticuerpos a partir de una muestra impura.

La proteína A se acopla a una matriz de sepharosa activada.

En la Tabla 2 se muestran las afinidades de las proteínas A y G con anticuerpos de diferentes


especies:
Tabla 2

Especie Afinidad por Proteína A Afinidad por proteína G


Humano ++++ ++++
Caballo ++ ++++
Vaca ++ ++++
Cerdo +++ +++
Oveja +/- ++
Cabra - ++
Conejo ++++ +++
Hamster + ++
Pollo - +
Cobayo ++++ ++
Rata +/- ++
Ratón ++ ++
Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring
Harbor Laboratory. 1988. pp726.

-Purificación por columnas de inmunoafinidad


En este caso se puede utilizar una columna a la que se une un anticuerpo específico frente al
antígeno que se va a purificar o una columna a la que se une un antígeno. En este último caso
al colocar la muestra a purificar solo se unirán los anticuerpos específicos frente a ese
antígeno. (Ver figura)

-Purificación por columnas de afinidad a metales


El níquel es un metal que tiene afinidad por el aminoácido histidina. Esta propiedad es
aprovechada para la purificación de proteínas recombinantes a las que se le agrega una cola
de 6 histidinas. La columna unida al níquel permite la purificación de las proteínas que poseen
histidina.

36
Posibles métodos de elución de la muestra:

La fuerza de los complejos antígeno-anticuerpo depende de la afinidad relativa y la avidez de


los anticuerpos. La orientación estérica, la densidad de acoplamiento y las interacciones no
específicas pueden también influenciar la unión.

Antígenos y anticuerpos están unidos por una variedad de fuerzas, las cuales incluyen:
 Fuerza iónica
 Interacciones hidrófobas
 Puentes de hidrógeno
 Fuerzas de Van Der Waals

El objetivo de la elución es recuperar la proteína unida específicamente con un alto


rendimiento, pureza y estabilidad.

Las soluciones de elución pueden poseer diferentes características como alto (NaOH 1M,
Dietilamina 0.05 M pH 11.5) o bajo (Glicina-HCl 0.02M) pH 2.5pH, presencia de calcio o
magnesio, presencia de agentes quelantes como el EDTA, agentes caotrópicos como
guanidinio.
En la Figura se esquematiza la metodología de purificación de proteínas por columna de
afinidad.

Regeneración de las columnas


El último paso, luego de la elución por cualquier método de elección, es la regeneración de las
columnas de afinidad. Este paso es importante dado que las columnas pueden reusarse y tras
sucesivos lavados con soluciones buffer se pueden utilizar para otras muestras.

37
Figura: Esquema de purificación de una proteína a través de una columna de afinidad

Interacción ligando-receptor (unión reversible)

a) Inmovilización del ligando

Matriz
+
Ligando

b) Adsorción del ligando al receptor en una muestra

+ Impurezas
Muestra

c) Elución de la muestra unida (receptor) en forma pura

En la tabla se muestran los métodos de purificación de anticuerpos. Generalmente es


necesario utilizar varias técnicas para obtener una mejor purificación.

38
Tabla: Métodos de aislamiento y purificación de anticuerpos
Aplicaciones Ventajas Desventajas
Precipitaciones y cromatografía de intercambio iónico (DEAE)
Aislamiento y concentración de
Fácil. Bajo costo. Útil para Rinde anticuerpos impuros.
Anticuerpos
grandes volúmenes. Ácido
o

e
t

Por ej. Ácido caprílico para IgG


Concentra la muestra. caprílico no se usa para IgM.

Sulfato de amonio/ Ac. Caprílico – DEAE/ Sulfato de amonio


Bajo costo. Útil para grandes Requiere múltiples pasos.
Aislamiento a partir de líquido
volúmenes. Rinde Rendimiento moderado.
ascítico y suero policlonal.
anticuerpos casi puros.
Exclusión molecular
Separa IgM de otros Rinde anticuerpos impuros.
Obtención de IgM. No como
anticuerpos en sueros Diluye la muestra.
paso único.
policlonales.
Cromatografía de afinidad: Proteína A
Anticuerpos puros. Fácil. Un
Obtención de IgG. Caro.
paso. Altos rendimientos.
Cromatografía de afinidad: Antígeno (Inmunoafinidad)
Caro. Muchos pasos.
Purificación de líquido ascítico y Rinde anticuerpos puros y
Antígenos puros.
sueros policlonales. específicos.
Inactivación de anticuerpos.
Cromatografía de afinidad: Anticuerpo (Inmunoafinidad)

subclases de anticuerpos Rinde anticuerpos Caro. Rendimiento bajo a


específicos de sueros específicos de especie. moderado. Muchos pasos.
policlonales.

2- Fraccionamiento de anticuerpos

El uso de un anticuerpo intacto en algunas técnicas inmunoquímicas introduce ciertos


problemas. Por ejemplo, muchas células tienen receptores para el fragmento Fc de los
anticuerpos y al interaccionar con ellos puede ocurrir activación celular, lisis, etc. Estos
problemas se pueden resolver si se utilizan fragmentos de anticuerpos.

Como método de estudio de la estructura de las inmunoglobulinas, se han empleado


enzimas proteolíticas que clivan a los anticuerpos en diferentes fragmentos. Las enzimas que
más se utilizan son la papaína, la tripsina y la pepsina.
En la figura 2 se muestran los resultados esperados de la digestión de los anticuerpos con las
diferentes enzimas.

 La papaína cliva la molécula de IgG en tres fragmentos de semejante peso molecular (45 a
50kDa). Dos de estos fragmentos, idénticos entre sí, son denominados Fab (fragmento de
unión al Ag). En ellos reside la capacidad de reconocimiento antigénico, expresando una única
valencia. El tercer fragmento, denominado Fc (fragmento cristalizable) no participa en el
reconocimiento antigénico.


 La tripsina actúa de manera similar a la papaína y permite obtener los mismos fragmentos.

39
 La pepsina, por su parte, cliva el fragmento Fc en piezas pequeñas y deja el resto de la
molécula intacta. Esta porción intacta, denominada (Fab’)2, se halla constituida por dos
fragmentos Fab unidos a través de los puentes disulfuro intercatenarios. Presenta, por lo tanto,
dos sitios de reconocimiento antigénico por lo que su valencia es dos.

Un tercer fragmento de anticuerpos, el Fv, es de gran utilidad para los estudios de afinidad de
antígeno y anticuerpo. Este fragmento está compuesto por las porciones variables de las
cadenas liviana y pesada, con lo cual posee un sólo sitio de combinación al antígeno. Tanto el
fragmento Fab como el fragmento (Fab’)2 están estabilizados por los puentes disulfuro
intercatenarios. Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones, debe estabilizarse
agregando un péptido de unión o “linker”. El fragmento linker es una pequeña secuencia que
une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena
pesada. La estructura que se obtiene recibe el nombre de “single chain fracción variable” (scFv)
que se puede sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante.

Papaina Pepsina

Bibliografía:

1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
2. Affinity Chromatography: principles and methods. Pharmacia fine chemicals.
3. Cuatrecasas, P; Wilchek, M and Anfinsen, C. B. Selective enzyme purification by affinity
Chromatography. 1968. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 636-643.
4. Fainboim, L; Geffner, J. Introducción a la Inmunología Humana. 6ta Edic. 2011.
5. Gagnon, P. Purification tools for monoclonal antibodies.1996. Validated Biosystems. Inc.249
pp.

40
6. Margni, R. A. Inmunología e Inmunopatología. Fundamentos. Editorial panamericana
Buenos Aires quinta edición. 1996. 976pp
7. Roitt, I. Inmunología. Fundamentos”, 11va. ed., Editorial Panamericana. 2008.
8. Subramanian, A. Immunoaffinity Chromatography. 2000 Methods in Molecular Biology
Vol 147: 95-104.
9. Kent, U.M. Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography. 1999. Methods in
Molecular Biology Vol 115: 23-28.
10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods in
Molecular Biology. Vols 147: 1-6.

PROTEÍNAS DEL PLASMA Y SUERO

La sangre está compuesta por células (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y plasma.


Cuando se extrae sangre venosa con anticoagulantes, los elementos celulares en suspensión
pueden ser separados por centrifugación. El sobrenadante que se obtiene, denominado plasma
sanguíneo, posee un 10% de solutos disueltos, compuestos a su vez por un 2 % de nutrientes
orgánicos y sustancias de desecho, un 1% de sales inorgánicas y un 7% de proteínas
plasmáticas.
Si la extracción se realiza sin el agregado de anticoagulante la sangre extraída coagula
y al centrifugar se obtiene suero, que no posee fibrinógeno ya que es el precursor de la fibrina,
proteína formadora del coágulo sanguíneo y se consume durante la coagulación. El suero
contiene las mismas proteínas del plasma excepto el fibrinógeno y los factores V y VIII de la
coagulación que son consumidos durante la formación del coágulo. El fibrinógeno, precursor de
la fibrina, es producido por el hígado y constituye el 4 – 6 % de las proteínas totales del plasma.

Si se somete un suero a una corriente eléctrica y bajo determinadas condiciones


(electroforesis) las proteínas del suero se distribuyen en diferentes fracciones, a saber:

*Albúminas: es la proteína más abundante del suero, varía según la especie entre un 35 y 50%
de las proteínas totales. Es sintetizada por el hígado y su principal función es el mantenimiento
del volumen (equilibrio osmótico). Además es transportadora de sustancias poco solubles en
agua (ej: ácidos grasos libres).

*Globulinas: la fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja
que se agrupa en tres fracciones con funciones diferentes: alfa, beta y gamma. Según sean la
especie animal y las condiciones de la corrida electroforética (matriz sólida, buffer, condiciones
eléctricas, tiempo, etc), las fracciones alfa y beta pueden subdividirse en dos sub-fracciones
(alfa-1, alfa-2 y beta-1 y beta-2, respectivamente).

Proteínas componentes de las distintas fracciones del suero identificadas por electroforesis

1-alfa ( globulinas:


 Glicoproteínas
 Globulina fijadora de tiroxina
 Protrombina
 Antitripsinas
 HDL (lipoproteína de alta densidad)
 Factor IX
 Antiplasmina
 Haptoglobina
 Ceruloplasmina
 Amiloide A
 VLDL (Lipoproteína de muy baja densidad)
 VLDL (Lipoproteína de muy baja densidad)

41

2-globulinas:
 Transferrina
 Fibrinógeno
 Factores del complemento
 Proteína C reactiva
 Amiloide A
 Ferritina
 Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domesticas

3-  globulinas:
 IgM
 IgA
 IgE en concentraciones ínfimas
 IgG
  
  

Cada especie posee un perfil electroforético característico.

ELECTROFORESIS

Se conoce como electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de un


campo eléctrico. Cuando una mezcla de moléculas que presentan diferente carga neta y
tamaño es colocada en un campo eléctrico uniforme, migran a distintas velocidades; como
resultado, ocurre su separación.
La velocidad de migración de una sustancia en un campo eléctrico depende de varios
factores tales como la carga, el tamaño de la partícula, el pH, la fuerza iónica, la viscosidad
del medio y además, la temperatura e intensidad de la electricidad.
Las proteínas y los aminoácidos poseen cargas positivas y negativas debido a la presencia
de grupos ionizables como el grupo carboxilo y el grupo amino, lo que hace que en una
solución se comporten como anfolitos. Así, dependiendo del pH de la solución, pueden
existir en tres formas iónicas:
*Cargados positivamente
*Cargados negativamente
*Sin carga o como moléculas neutras (en una solución con pH igual a su punto isoeléctrico).

El punto isoeléctrico (PI) de una molécula (en este caso una proteína) es el pH en el
cual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la proteína no migra
cuando se la somete a la acción de un campo eléctrico. El PI es inherente a la estructura
primaria de la proteína, pues depende de cuáles aminoácidos forman la cadena
polipeptídica. Por lo tanto, a determinado pH, distintas proteínas con distinto punto
isoeléctrico tendrán distinta carga neta, lo que permitirá separarlas e identificarlas por
medios electroforéticos.
J. Tiselius fue el primero que utilizó la electroforesis en 1937 para separar los
componentes del suero. Existen dos métodos generales para separación de proteínas por
electroforesis:
Electroforesis libre o de frente móvil, que se realiza en una fase líquida, y

Electroforesis de zona, que utiliza una matriz sólida o soporte, como el papel de filtro,
membranas de acetato de celulosa o geles de almidón, poliacrilamida, agar o agarosa.
Estos materiales son porosos e hidratados y permiten retener las proteínas.

42
De ambas, la electroforesis de zona es la que tiene mayor aplicación en el laboratorio clínico
por su sencillez y mayor capacidad de resolución. Para la separación de las proteínas del
suero, por ejemplo, se utiliza frecuentemente acetato de celulosa como matriz y se escoge
un pH alcalino, en el que todas las proteínas están cargadas negativamente y migran hacia
el polo positivo (ánodo). En estas condiciones, la albúmina es la que migra más
rápidamente hacia el polo positivo, seguida por: alfa, beta y gammaglobulinas.

Técnica
Se describe a continuación un ejemplo de corrida electroforética. Se debe tener en
cuenta las condiciones de corrida, los reactivos que se utilizan y los pasos metodológicos
son variables de acuerdo a diferentes factores (especie animal, nivel de automatización del
equipo, etc).
La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a
corriente eléctrica. El paso de la corriente provoca la migración de las diferentes proteínas
que conforman la muestra, pero cada una de ellas lo hará a una velocidad diferente según
su punto isoeléctrico.
El pH del buffer utilizado es de 8,6, a este pH, todas las proteínas del suero están
cargadas negativamente. La más cargada es la albúmina, con un PI mucho menor que el pH
del medio (PI de la albúmina: 4,4); las menos cargadas, por el contrario, son las
gammaglobulinas, con un PI mucho más cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas:
6,8-7,2). Por lo tanto, las albúminas son las que migran más rápido hacia el polo positivo,
seguidas por las alfa, beta y por último las gammaglobulinas.
A esta migración se opone el efecto electroendosmótico, que consiste en un
movimiento en sentido opuesto a la corriente eléctrica que detiene parcialmente la corrida de
las proteínas. Este es causado porque la mayoría de los soportes no son neutros. Debido a
su carga fuertemente negativa, las albúminas logran superar ampliamente el efecto,
mientras que las gammaglobulinas, cuya carga negativa es menor, no pueden superarlo tan
fácilmente y quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el
polo negativo.

Materiales
Tiras de acetato de celulosa para electroforesis
Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Cuba de electroforesis
Fuente de poder
Solución colorante de proteínas
Solución decolorante
Solución transparentizante
Densitómetro Integrador

Procedimiento
Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar esté bien limpio y seco.
1. Se sumergen las tiras en la solución amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10
minutos.
2. Se elimina el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro.
3. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaución de que no queden
burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras
diferentes: una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras, la otra
no es penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. Para
diferenciarlas, las tiras tienen uno de sus ángulos recortado, este debe quedar ubicado
en el ángulo inferior derecho.
4. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis.
5. Se siembran las muestras con el sembrador. Los sembradores están estandarizados
para sembrar siempre el mismo volumen de muestra. Los equipos generalmente traen
3 sembradores de diferente volumen. Según el ancho de sembrador que se utilice, se

43
podrán sembrar 1, 2 ó 3 muestras por tira. Una de las muestras se tiñe con azul de
bromofenol, el cual se asocia a las moléculas de prealbúmina y permite identificar el
frente de corrida. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de
corrida, se conecta a la fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200
voltios durante 30 minutos. El grado de separación obtenido para las proteínas de una
muestra dada, varía según sea la especie animal de la muestra y depende del tiempo
de corrida y del voltaje aplicado. Por lo tanto, estos parámetros deben estandarizarse
previamente según las necesidades de cada caso en particular. (Por ejemplo, una
muestra de suero equino se corre a 200 voltios durante 25 minutos; una muestra de
suero canino se corre a 180 voltios durante 20 minutos).
6. Una vez finalizada la corrida, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se
procede a colorear las tiras, sumergiéndolas durante 5 minutos en la solución
colorante de proteínas.
7. Se procede luego a la decoloración de la tira, sumergiendo las tiras en solución
decolorante. El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se unió a las
proteínas. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es
conveniente ir renovando la solución decolorante durante este procedimiento).
8. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solución
transparentizante durante 1 minuto.
9. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ángulo cortado de la tira ubicado en
el ángulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos), de esta forma la
cara sembrada queda boca abajo, mirando el vidrio. No deben quedar burbujas entre
el vidrio y la tira.
10. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 ºC hasta su transparentización total.
La tira de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda
efectuarse la medición por densitometría.
11. Las diferentes bandas de proteínas separadas a partir de la muestra original sobre la
tira de acetato de celulosa, teñidas y transparentizadas, son leídas en un
densitómetro. El aparato debe ser previamente calibrado según la longitud de onda
que vamos a utilizar (generalmente 520 nm), el largo de la tira que vamos a medir y la
concentración de proteínas de la que partimos. El densitómetro detecta y registra los
datos de absorción de luz de cada banda de proteína y los transforma en un valor
numérico de concentración y en un gráfico (ver figuras al final del tema)

Aplicaciones de la electroforesis
La electroforesis es un método valioso para el diagnóstico de las alteraciones
en los componentes proteicos del suero (disproteinemias), orina y líquido
cefalorraquídeo.
Mediante esta técnica se puede detectar un aumento, disminución o alteración de las
proteínas (paraproteínemias), como:
 Hipogammaglobulinemias: por inmunodeficiencia de tipo humoral
 Hipoproteinemias: por pérdida de proteínas por el sistema digestivo
 Hipoalbuminemia: por insuficiencia hepática crónica y síndrome de mala digestión-
mala absorción, secuestro de proteínas en cavidad pleural, peritoneal y tejido
subcutáneo, glomerulopatías, quemaduras, etc.
 Hiperalbulinemia: por deshidratación etc.
 Disminución de la alfaglobulina: por déficit de alfa 1-antitripsina, insuficiencia
hepática severa.
 Aumento de beta y/o gammaglobulinas:
1. Policlonal: en inflamaciones crónicas (de origen infeccioso, autoinmune,
neoplásico).
2. Monoclonal: por ejemplo, el mieloma múltiple, en el que se detecta la aparición del
denominado componente monoclonal en la región donde corren las beta o las gamma
globulinas. Éste se manifiesta como una banda homogénea en la corrida

44
electroforética que se traduce a su vez en forma de un pico de base estrecha en el
proteinograma.

45
Ejemplos de patrones de electroforesis
Se observan las corridas electroforéticas (izquierda) y sus respectivos proteinogramas
(derecha).

Suero normal de perro

Albúmina AlfaBeta Gamma


Albúmina Alfa Beta Beta Gamma

Suero de perro con


componente monoclonal
(mieloma múltiple)

46
Suero de perro con aumento policlonal
de beta y gammaglobulinas
(leishmaniasis)

Bibliografía
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana.1º edición,
septiembre de 1986. Capítulo 6.
2. Margni R. A. Inmunología e Inmunohistoquímica Fundamentos. Bs.As.: Editorial médica
Panamericana 1º edición, octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de
1996. Capítulo V.
3. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunología Básica y Clínica Editorial El Manual Moderno
S.A. de C. V. México D.F. 7° edición. 1993 Sección II. Capítulo 18.
4. Inmunología básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.
5. Informes del Servicio de Diagnóstico Inmunológico de la Cátedra de Inmunología de la
Facultad de Ciencias Veterinarias de la UBA.

INMUNOHISTOQUIMICA

La historia de la inmunohistoquímica comienza en 1941 cuando Coons identifica


neumococos usando un método de fluorescencia directa. Más tarde, se desarrollan la
inmunofluorescencia indirecta y las técnicas inmunoenzimáticas.
En las últimas décadas, el uso de las técnicas inmunohistoquímicas ha ido creciendo
progresivamente hasta consolidarse como tecnología esencial en el diagnóstico
anatomopatológico de rutina.
La inmunohistoquímica (IHQ) y la inmunocitoquímica (ICQ) son técnicas cualitativas o
semicuantitativas. Para ello se utilizan software, como por ejemplo Image J (de uso libre), que
permiten semicuantificar las áreas marcadas por el anticuerpo.
Todas las técnicas de IHQ e ICQ utilizan anticuerpos o sistemas amplificadores (sistema
avidina: biotina) conjugados con enzimas y un cromógeno que precipita sobre los tejidos
generando una reacción coloreada.
Existen diversos métodos:

 Directo: el anticuerpo primario (dirigido contra el antígeno de interés) se encuentra


conjugado con la enzima. Es fácil y rápido de realizar, pero tiene bajo límite de
detección.
 Indirecto: el anticuerpo primario, dirigido contra el antígeno, no está marcado luego
se agrega un anticuerpo secundario conjugado con la enzima, que reconoce
específicamente al anticuerpo primario (anti-Ig de la especie). El límite de detección
de este método es 4 a 5 veces mayor que el método directo. La ventaja del uso de

47
dos anticuerpos es la amplificación de la reacción en cada paso, es decir, por cada
anticuerpo primario que reaccione lo reconocerán dos o más moléculas de
anticuerpos secundarios.

Los anticuerpos utilizados en estas técnicas pueden ser monoclonales o policlonales. En


ambos casos tienen que tener alta afinidad y especificidad por el antígeno. En el caso de los
sueros hiperinmunes, es deseable que tengan títulos elevados. De esta forma, pueden ser
usados en diluciones altas (muy baja concentración) y se evita la aparición de falsos positivos
Si los anticuerpos no tienen elevada especificidad pueden producir reacciones inespecíficas
que lleven a falsos positivos. También, algunas veces, puede aparecer reactividad cruzada
cuando los anticuerpos reconocen sitios similares en moléculas relacionadas.
Para evitar estas falsas interpretaciones, la técnica necesita realizarse con controles estrictos
de todos los pasos y de todos los reactivos.
Las ventajas de las técnicas inmunohistoquímicas son que permiten una localización más
precisa de la reacción antígeno-anticuerpo; la tinción es permanente, estable, puede
contrastarse y puede evaluarse con microscopio óptico. El material así estudiado puede
archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción.
Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecíficas o cruzadas,
especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales han
permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta técnica.
Algunos colorantes son carcinógenos potenciales y su manipulación debe ser cuidadosa,
requieren de estandarización precisa y estricto control de calidad.
Existen diversos tipos de técnicas, cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar
(monoclonal o policlonal), del material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y de
los antígenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmáticos o nucleares).
Estas técnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos.
En los tejidos, las uniones inespecíficas se pueden bloquear con albúmina bovina, con leche
descremada, o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenéticamente de
la que se está estudiando.

Métodos que utilizan la interacción avidina-biotina:


La avidina es una glucoproteína tetramérica de 67 kDa, presente en la clara de huevo,
que posee en su superficie regiones hidrofóbicas que unen con gran afinidad la biotina. Por
otra parte, las cadenas glucídicas de la avidina tienen una carga tal que las hace adhesivas con
regiones cargadas del tejido, lo que aumenta el ruido de fondo (uniones inespecíficas).
La estreptavidina es una proteína tetramérica de 60 kDa procedente de Streptomyces
avidinii, con alta afinidad por la biotina.
La biotina es una proteína soluble en agua (vitamina H) de peso molecular bajo (244
Da) con un grupo carboxílico que permite su unión a los restos amino de las proteínas. La
biotinilización es una reacción bioquímica que permite unir biotina por unión covalente a una
gran variedad de moléculas como enzimas, lectinas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc. El
pequeño tamaño de la biotina hace que la biotinilización no afecte drásticamente las
propiedades biológicas de las moléculas conjugadas.
Se han desarrollado varios métodos que combinan los tres reactivos mencionados, puesto que
a medida que se amplifican las señales, se aumenta ostensiblemente el límite de detección de
la técnica.

El esquema general del método IHQ sería:


 Preparación histológica de los tejidos o células a estudiar
 Bloqueo de las peroxidasas endógenas
 Incubación de los tejidos con el anticuerpo primario
48
 Incubación con el anticuerpo secundario unido a biotina (anticuerpo biotinilado)
 Incubación con una solución de estreptavidina marcada con enzima peroxidasa
 Agregado del sustrato de la enzima y el cromógeno.

Enzimas utilizadas:
Las enzimas más utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan
dando distintos colores con los diferentes sustratos según la reacción, lo cual servirá para
detectar distintas uniones antígeno-anticuerpo.

Preparación de tejidos para inmunohistoquímica:


El éxito de la inmunohistoquímica depende de la preservación de los antígenos y del
manejo de los anticuerpos. La conservación de los tejidos por congelación puede afectar los
tejidos y la estructura celular, debido a la formación de cristales de agua intracelulares. La
necesidad de mantener la estructura tisular hace de la fijación un paso fundamental en las
técnicas histológicas. Esta necesidad de fijación se contrapone al riesgo de provocar cambios
estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las células o tejidos
destinados a la observación microscópica. En IHQ, la fijación y el tratamiento previo de los
tejidos debe satisfacer diferentes criterios como:
 Retener los antígenos
 Preservar la estructura
 Permitir la interacción antígeno anticuerpo.

Fijación:
El mayor problema que suelen presentar los fijadores químicos es que pueden impedir
la unión antígeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antígeno debido a cambios
conformacionales que ocurren en el antígeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos
los casos hay que realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones
de fijación) para cada antígeno y para cada tejido. El fijador más utilizado es el formol
tamponado, (formaldehído al 10 % en fosfato disódico y monobásico) debido a que es más
accesible por costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro.

Bloqueo de peroxidasas endógenas


Los tejidos tienen sus propias peroxidasas que interfieren con la reacción cuando se
utilizan anticuerpos marcados. Para bloquear las estas enzimas endógenas se pueden incubar
los cortes con una solución de peróxido de hidrógeno y metanol absoluto (entre 10 y 30
minutos) a temperatura ambiente. El método es muy eficiente sin afectar la inmunoreactividad.

Aplicaciones de la IHQ en medicina veterinaria


 Diagnóstico de infecciones: detección de microorganismos en los tejidos afectados.
 Diagnóstico de enfermedades autoinmunes: detección de depósitos de anticuerpos o
complejos inmunes en los tejidos afectados.
 Diagnóstico de neoplasias: detección de marcadores tumorales específicos en las
células neoplásicas.
 Investigación: por ejemplo, utilizando marcadores leucocitarios (CD “Cluster of
diferentiation”) a fin de determinar poblaciones leucocitarias predominantes en ciertas
afecciones o tejidos.

49
INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencia (IF) es una técnica de interacción primaria que permite la


localización de antígenos o anticuerpos en tejidos, frotis de microorganismos, células o cultivos
en monocapa. Utiliza como reactivo una inmunoglobulina marcada con colorantes
fluorescentes.

Esta técnica puede ser:


 Directa
 Indirecta

Inmunofluorescencia Directa (IFD):


Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante la reacción con un
anticuerpo específico marcado con un colorante fluorescente. Por ejemplo, en el diagnóstico de
rabia (Figura 1a).

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI):


En este caso se busca, en el suero del paciente la presencia de anticuerpos específicos
para un antígeno determinado. Se preparan improntas de los antígenos sobre un soporte, por
ejemplo, T. gondii, células infectadas por virus, etc. Sobre las improntas se coloca el suero en
el cual se sospecha la presencia de anticuerpos específicos. Si la reacción es positiva, habrá
formación de complejos inmunes. Para hacer ostensible esta unión antígeno-anticuerpo, se
debe utilizar una inmunoglobulina (anti-especie o antigamma) marcada, que reaccionará con el
anticuerpo del paciente. La ventaja de la técnica indirecta es que no se necesita un anticuerpo
marcado para cada antígeno.

Ventajas y desventajas de las técnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta:


Ventajas:
 Son muy versátiles y seguras para la detección de antígenos o anticuerpos.
 Permiten implementar rápidamente nuevos ensayos.
 En la IF indirecta, la señal es más brillante que en la técnica directa debido a que varias
moléculas de anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada uno de los
complejos antígeno-anticuerpo formados en la primera etapa (es decir que la señal se
amplifica).
 En la IF indirecta, el uso de un reactivo conjugado anti-especie único, para estudiar los
anticuerpos problema frente a diferentes antígenos, permite ahorrar tiempo y dinero.

Desventajas:
 Es necesario tener un microscopio de fluorescencia.
 Es difícil la evaluación de detalles básicos.
 Las preparaciones tienen vida muy corta debido a la pérdida de color de los
fluorocromos
 Se necesita personal muy entrenado para poder determinar entre una reacción positiva
y una impronta negativa, ya que habitualmente las células poseen autofluorescencia,
que puede llevar a error cuando quien efectúa la lectura no tiene experiencia suficiente.

50
Figura 1: Esquema de la prueba de inmunofluorescencia a) directa, b) indirecta.

Fluorocromos
Los anticuerpos específicos pueden marcarse con fluorocromos. Estos colorantes permiten
identificar su presencia cuando son excitados por luz ultravioleta. Para unir los fluorocromos a
un anticuerpo, estos deben cumplir con una serie de requerimientos:

 Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la señal emitida sea
visible y no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido.
 Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molécula de anticuerpo.
 Que sea soluble en soluciones acuosas, ya que los solventes pueden producir la
desnaturalización de las proteínas durante la unión.
 Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos.
 Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos.
 Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la acción de la luz.

La marcación de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en la formación de uniones


covalentes y se conoce como conjugación dando lugar al conjugado fluorescente. Esta unión
se hace a pH alcalino y depende de la temperatura y del tiempo de reacción.
Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo, se obtienen conjugados que
emiten escasa fluorescencia. Cuando sucede lo contrario, es decir, cuando hay mucho
fluorocromo unido al anticuerpo, se corre el riesgo de tener marcación inespecífica.
Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminoácidos de los
anticuerpos, particularmente de la lisina.
El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es el fluorocromo más usado para la conjugación con
anticuerpos. Produce una muy buena señal de color verde, que se diferencia notablemente de
la autofluorescencia generalmente más amarillenta y pálida de los tejidos. La fluoresceína es
muy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisión se obtiene a pH 8-9. El inconveniente
más importante es que pierde color rápidamente. Por ello, durante el tiempo que se mantengan
las improntas teñidas hay que tener la precaución de guardarlas envueltas en papel de aluminio
y en un sitio oscuro, para evitar el deterioro que les produce la exposición a la luz.

Microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia consta de:
- el microscopio óptico

51
- una lámpara de mercurio o halógena que emite luz ultravioleta
- un sistema de filtros:

 El primer filtro es el de excitación o selección de luz, ubicado entre la fuente de luz y el


preparado. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz que produzcan emisión de luz
fluorescente.
 El segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación.
 El tercer filtro es el de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos
que podrían ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejo
dicrómico.

Preparación de los reactivos:


Obtención de los anticuerpos:
Se obtienen mediante inmunización en animales. Las inmunoglobulinas se aplican en 2
ó 3 inyecciones a intervalos de 3 a 4 semanas. El suero se recoge 7 a 10 días luego de la
última inyección. La respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos (ver
capítulo de producción de sueros hiperinmunes).

Aislamiento del Anticuerpo:


Se logra mediante precipitación con soluciones saturadas de sales de amonio. Los
anticuerpos precipitados pueden permanecer en solución salina de fosfatos (PBS) a pH 7.1.
Conjugación:
Es posible conjugar las inmunoglobulinas a partir de suero completo o fracciones de
suero luego de aislar los anticuerpos. Se debe añadir al suero buffer carbonato-bicarbonato
para mantener condiciones óptimas de pH (9.0). Se agita en baño de hielo añadiendo
fluorocromo en un período de 15 minutos, Luego se mantiene el preparado en heladera toda la
noche, en agitación, ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas.
Purificación del conjugado:
Se logra mediante la eliminación por diálisis de las sales del buffer y de los elementos
utilizados como solventes del fluorocromo (acetona) que podrían dañar al conjugado. Además
se utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar los restos de
fluorocromo que no se conjugaron y que pueden ocasionar tinción inespecífica.

Manejo de cortes y tejidos:


Los cortes y frotis montados sobre portaobjetos que no se estudien de inmediato, se
pueden proteger por inmersión en poletilenglicol y almacenamiento a -20°C. Los cortes

52
liofilizados, protegidos con resina de poliéster, se pueden conservar varios meses en un
desecador a 0°C sin que pierdan sus antígenos.
Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar
se acompaña de difusión o pérdida del antígeno.
Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo, los más empleados
son alcohol etílico al 95% entre 4-30°C, alcohol metílico, acetona o formol. Para bacterias es
muy útil la fijación mediante calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede
lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación.

ASPECTOS METODOLÓGICOS
Procedimiento recomendado para la tinción por inmunofluorescencia directa:
1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura
ambiente.
2) Colocar de 10 a 50 µl (dependiendo del tamaño de la muestra) de anticuerpo anti-antígeno
conjugado en el portaobjetos.
3) Incubar en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos
4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en buffer
de lavado (PBS)
5) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel. No deben
secarse las superficies teñidas. No lavar con agua
6) Colocar una gota de líquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio
de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.

Procedimiento recomendado para la tinción con inmunofluorescencia indirecta


1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura
ambiente.
2) Colocar de 10 a 50µl (dependiendo del tamaño de la muestra) de suero problema
diluido en el portaobjetos.
3) Incubar el portaobjetos en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos.
4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en
el mismo buffer.
5) Secar la parte posterior y bordes del portaobjetos. Colocar sobre la muestra 10 a 50 µl
de anti-IgG o anti-IgM conjugado con FITC.
6) Incubar como en el paso 3.
7) Lavar como en el paso 4.
8) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel. No se
deben secar las superficies teñidas. No lavar con agua.
9) Colocar una gota de líquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en
microscopio de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.

Bibliografía

1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center
for Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological
Sciences
2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502,
Pullman, WA 99163, U.S.A.
3. Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
5. Manual de procedimientos. Instituto Malbrán.
53
CITOMETRÍA DE FLUJO

La citometría de flujo es una técnica que permite la medición y análisis de múltiples


características de una misma partícula. Estas partículas, generalmente células, fluyen a través
de una tubuladura sobre la cual incide un rayo láser.
Las propiedades que pueden ser medidas incluyen el tamaño de las partículas, la granularidad
relativa (que es una medida de la complejidad interna) y la intensidad de la fluorescencia
emitida. Estas características se determinan usando simultáneamente un sistema óptico y un
sistema electrónico, que permiten conocer cómo la célula o partícula desvía el rayo láser
incidente, y la fluorescencia que emite.
Esta técnica permite analizar partículas de un tamaño comprendido entre 0,2 y 150
micrómetros (rango bacterias – células). La luz desviada por las partículas así como la
fluorescencia emitida por ellas son captadas por lentes posicionados para tal fin. Luego la
información es trasmitida a detectores que producirán señales electrónicas proporcionales a la
señal óptica recibida y que serán procesadas por una computadora. En algunos casos, cuando
el aparato tiene sistema de separación de partículas, el sistema electrónico identifica cuáles de
las células o partículas separar y cuáles desechar.
Un citómetro de flujo consta de tres sistemas:
1. Sistema de fluidos
2. Sistema óptico
3. Sistema electrónico

1-Sistema de fluidos
La zona del citómetro donde las células (o partículas) se juntan con el fluido se la
conoce como cámara de flujo El fluido del citómetro se encuentra a presión y conduce la
muestra a través de la cámara de flujo. Las partículas de la muestra a ser analizadas llegan
separadas y en una corriente de fluido presurizado. El propósito de este sistema es permitir que
el rayo láser atraviese la muestra justo por el centro, incidiendo en UNA célula a la vez.

2-Sistema óptico
Está formando por un sistema de excitación y uno de recolección.

El sistema de excitación consiste en un láser y lentes que se usan para enfocar el rayo láser.
El sistema de recolección consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interacción entre
el rayo láser y la partícula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas
determinados de la luz colectada a detectores ópticos específicos.

Generación de dispersión:
Cuando una partícula es incidida por el rayo láser se produce una desviación de la luz
que dependerá de las propiedades físicas de las partículas, es decir: su tamaño y complejidad
interna. La membrana celular, el núcleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro
de la célula, afectan la desviación de la luz. La morfología y la topografía de la superficie celular
también contribuyen a la desviación total de la luz.

La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o
tamaño celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en
dirección frontal.
La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad
celular y a la complejidad interna de las células. SSC es, esencialmente, una medida de la luz
refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la célula donde hay un cambio en el

54
índice de refracción. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo láser mediante
lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.
Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una
población heterogénea. La mayoría de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse
usando FSC y SSC.

Fluorescencia:
Un compuesto fluorescente absorbe energía de cierto rango de longitud de onda que es
característico para ese compuesto. Esta absorción de luz provoca que un electrón de la
sustancia fluorescente alcance un mayor nivel de energía. El electrón así excitado decae en
energía emitiendo el exceso como un fotón. Esta transición de energía se denomina
fluorescencia. Cuanta más energía es consumida en la absorción, más energía es emitida en la
fluorescencia.

- El rango de onda en el cual un compuesto fluorescente puede ser excitado se conoce como
su espectro de absorción.
- El rango de onda emitido por este compuesto es denominado su espectro de emisión.

El láser de argón es comúnmente usado en citometría debido a que su longitud de onda de 488
nm puede excitar más de un fluorocromo. Entonces, se puede usar más de un fluorocromo
simultáneamente, siempre que todos sean excitados a 488nm y que sus picos de emisión se
encuentren lo suficientemente alejados entre sí.
La combinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE) satisfacen este
criterio. La magnitud de la señal detectada es proporcional al número de moléculas de
fluorocromo en la partícula.
En una mezcla de células se pueden usar diferentes fluorocromos conjugados a anticuerpos
monoclonales para distinguir las diferentes subpoblaciones celulares. La marcación de cada
célula junto con los valores de FSC y SSC, pueden ser usados para identificar cada
subpoblación presente en una muestra y los porcentajes relativos de las mismas.
3-Sistema electrónico: recolección de datos.
Las señales de luz se convierten finalmente en señales electrónicas, lo que permite que
los datos puedan guardarse en una computadora.
Pero cómo se define la muestra a tomar?

Adquisición de las muestras:


Se denomina así a la toma de muestra por parte del citómetro
Qué tipo de datos guardará la computadora, dependerá de los parámetros que previamente
establezca el operador. Estos parámetros varían de acuerdo con las muestras a analizar.

Umbral:
Se usa para limitar el número de eventos que adquiere un citómetro. El umbral se
establece en un parámetro. Por ejemplo, si el umbral se establece en FSC, sólo serán
registradas las señales generadas por partículas cuyo tamaño sea mayor que el umbral
establecido. Este control se usa para eliminar señales generadas por polvo, restos celulares, o
ruido electrónico en el sistema. En aquellos equipos que tienen más de un láser, se puede
establecer un segundo umbral. En ese caso la señal emitida por la partícula a ser analizada
deberá alcanzar los dos umbrales para ser procesada como un evento.
Los datos se guardan en un formato standard denominado “Flow Cytometry Standard Format”.
Una vez que los datos han sido guardados, pueden ser presentados y graficados de diversas
maneras: como histogramas, gráficos tridimensionales, gráficos de puntos, etc. Para esto
puede usarse software de versión libre on line, como el WinMDI.
55
Determinación de regiones o “Gating”:
Un grupo de datos puede ser definido por un “gate” que es una barrera numérica o
gráfica. Esta barrera se usa para definir las características de las partículas que se analizarán.
Por ejemplo, en una muestra de sangre, el operador puede querer analizar sólo la
población linfocitaria. Basado en la FSC o el tamaño celular la barrera (gate) puede
establecerse en una curva de FSC vs SSC para permitir el análisis de células que tengan sólo
el tamaño de los linfocitos.

Gate 1

Otro ejemplo. De la muestra sólo se desea tomar la población indicada, entonces se establece
una barrera (gate 1) en esa zona y el equipo sólo adquiere las partículas de esa región.

Esquema de un citómetro de flujo

Una vez adquirida la muestra, los datos son guardados en la computadora del citómetro y
pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras.

Análisis de datos para la determinación de subpoblaciones:


Consiste en mostrar en un gráfico los datos colectados en un archivo y luego evaluar la
distribución de los eventos dentro de la curva. Los datos pueden ser subdivididos creando
barreras (gates) sobre poblaciones específicas. Cabe aclarar, que en este caso los gates o
barreras establecidos no son para la toma de muestras, sino para el análisis de muestras ya
adquiridas por el citómetro. Esto quiere decir que si el operador se equivocó cuando definió los
parámetros de adquisición de la muestra, esos datos los perdió. Por eso es muy importante
conocer el material en análisis.
56
Por ejemplo, se puede establecer un gate sobre la población linfocitaria, para obtener y
analizar los datos de los eventos que se encuentran exclusivamente en esa región
determinada.
Los datos obtenidos de esta región delimitada, se analizan en gráficos como: histogramas de
un parámetro, gráficos de puntos de dos parámetros, curvas tridimensionales, etc. A partir de
estos datos luego se obtienen análisis estadísticos, que también son producidos por el
citómetro.

Por ejemplo, un histograma permite analizar el número de eventos que comparten un mismo
parámetro. Los marcadores son usados para especificar el rango de eventos que serán
considerados positivos para un parámetro. Una vez que se ha establecido el primer marcador
sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador considerada con niveles de
fluorescencia positiva (M2). (Ver figura 1).

Figura 1

Negativo Positivo

M1 M2
células
Nº de

Fluorescencia
de menor a mayor

Un gráfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parámetros. Cada punto puede
representar uno o más eventos, de acuerdo a lo establecido por el operador. (Ver figura 2)
Figura 2

Gráfico de puntos e histograma


SSC-H: Granulosidad y complejidad de la partícula
FSC-H: Tamaño de la partícula

57
El marcador de cuadrantes divide un gráfico de dos parámetros en cuatro secciones y permite
distinguir poblaciones negativas, positivas y doble positivas. (Figura 3)

 El cuadrante inferior izquierdo (LL) muestra la población negativa para ambos


parámetros.
 El cuadrante superior izquierdo (UL) muestra la población que es positiva para el
parámetro graficado sobre el eje vertical.
 El cuadrante inferior derecho (LR) muestra la población positiva para el parámetro
graficado sobre el eje horizontal.
 El cuadrante superior derecho (UR) muestra la población positiva para ambos
parámetros.

Figura 3: Estadísticas de los cuadrantes y Gráfico de puntos (dot plot).
Counts: Número de eventos
FL1-H: Parámetro

Separación de partículas (SORTING)


En la mayoría de las aplicaciones, una vez que la partícula ha pasado a través del rayo
láser, es enviada a desecho.
El sistema de separación de partículas permite capturar aquéllas consideradas de interés para
análisis posteriores. Una vez colectadas, estas partículas pueden ser examinadas
microscópica, bioquímica o funcionalmente.
No todos los citómetros están equipados para hacer separación de partículas.
Para efectuar la separación de partículas, el equipo debe primero determinar cuáles son las de
interés. Una vez que la población de interés ha sido identificada en una curva de adquisición de
58
datos, se dibuja una región alrededor de ella. Luego se carga esta información en el citómetro
como “región de separación”. Esta región identifica aquellas células que serán separadas de la
corriente de fluido por donde transita toda la muestra.
A medida que cada célula pasa por el láser, el equipo determina si la misma pertenece a la
población de interés. Dado que el alineamiento del láser y la velocidad de la corriente son fijos,
el tiempo que toma el pasaje de las células a separar desde el láser hasta el tubo de captura,
es constante.

Bibliografía:
1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for
Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences
2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502, Pullman,
WA 99163, U.S.A.
3. Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
5. Manual de procedimientos. Instituto Malbrán.

EVALUACIÓN DE INMUNIDAD CELULAR POR LINFOPROLIFERACIÓN

La prueba de linfoproliferación consiste en la evaluación de la expansión clonal de los


linfocitos de sangre periférica en cultivos estimulados en forma inespecífica (con mitógenos) o
específica (con antígenos).
Los mitógenos son sustancias que tienen afinidad por determinadas estructuras químicas de
la superficie linfocitaria y que, al unirse a ellas, inducen la activación y proliferación de los
linfocitos en forma policlonal e inespecífica. Son ejemplos de estos mitógenos la
Concanavalina-A (Con-A), la Fitohemaglutinina (PHA), el mitógeno de la hierba carmín (PWM),
el Lipopolisacárido (LPS) y la proteína A del Staphylococcus, entre otros. Las poblaciones
linfocitarias sobre las que actúan estos mitógenos varían según la especie animal. En la
especie canina, por ejemplo, la Con-A se clasifica como mitógeno de células T en tanto que el
LPS, la proteína A y el PWM estimulan la diferenciación de linfocitos B y la PHA activa ambas
poblaciones linfocitarias.
A diferencia de los mitógenos, los antígenos activan sólo los linfocitos de los clones específicos
y desencadenan una respuesta proliferativa, oligoclonal y específica.

ASPECTOS METODOLÓGICOS (Figura 1):


A) Obtención de las células mononucleares por separación en gradiente de densidad
Se centrifuga sangre heparinizada sobre una columna de un reactivo denominado Ficoll-
Hypaque o similar. Este reactivo tiene la propiedad de crear un gradiente de densidad durante
la centrifugación, en el que cada componente de la sangre se ubica en un diferente nivel. De
mayor a menor densidad (desde el fondo a la boca del tubo) se obtienen los siguientes
estratos: eritrocitos, polimorfonucleares, Ficoll-Hypaque, células mononucleares y plasma.
El halo formado por las células mononucleares (linfocitos y un mínimo porcentaje de monocitos)
se aspira con una pipeta.
Las células obtenidas se lavan con solución salina y se resuspenden en medio de cultivo a la
concentración celular de uso.
B) Cultivo en microplacas de 96 hoyos
Las células se resuspenden en medio de cultivo y se siembran en microplacas de
cultivo de 96 hoyos. En estas placas vamos a tener:
Hoyos controles, que contienen la suspensión celular sin estimular.
Hoyos estimulados, que contienen la suspensión celular a la que se le agrega el estímulo
proliferativo, ya sea mitógeno inespecífico o antígeno.
Ambos tipos de cultivo se realizan al menos por triplicado. Las placas se incuban a 37°C en
estufa con ambiente húmedo y 5% de CO2.
C) Identificación de la proliferación celular
59
1-Sustancias radiactivas
Luego de 3 o 4 días de cultivo, se agrega timidina tritiada (precursor del ADN marcado con un
isótopo radiactivo 3H) a cada cultivo. Las moléculas de timidina marcadas con tritio (3H) se
incorporan al ADN de las células en proliferación, que ahora tendrán ADN tritiado en sus
núcleos. Transcurridas 12 a 16 horas de cultivo con el medio que contiene timidina tritiada, las
células de cada hoyo se aspiran con un cosechador quedando retenidas sobre filtros
especiales.
Revelado: El tritio que marca las moléculas de timidina emite radiación beta que puede ser
leída en un contador de centelleo líquido y cuantificada como cuentas por minuto (cpm) o
desintegraciones por minuto (dpm). A mayor proliferación en cada hoyo, mayor será la
radiactividad retenida en cada filtro, o sea mayor el número de cpm leído.
Se realiza el promedio de los triplicados correspondientes a cada muestra. Los resultados se
expresan como índice de estimulación (I.E.), de acuerdo a la siguiente fórmula:

IE= Promedio de cpm en los hoyos estimulados


Promedio de cpm en los hoyos controles

60
Figura 1

Sangre periférica

Gradiente de Ficoll-Hypaque

Plasma
Halo mononucleares
Ficoll Hypaque

Polimorfonucleares
Eritrocitos

Suspensión de células mononucleares (SCM)

Cultivo

Estimulados
Controles
(SCM + medio de cultivo + estímulo:
(SCM + medio de cultivo) mitógeno o Ag)

Incubación

Pulso de timidina tritiada

Cosecha

c.p.m.

IE: X c.p.m. estimulados

61
Se ha desarrollado una variante de la metodología descripta, que utiliza
directamente la sangre entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de
linfocitos. En caninos, se ha demostrado que esta metodología es comparable y aún más
reactiva que la técnica clásica descripta. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor
las condiciones in vivo y evitar la pérdida de células (supoblaciones de L con diferentes
funciones) que conlleva el proceso de purificación en gradiente utilizado en la metodología
convencional.

1- Ensayo de linfoproliferación con 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester


(CFSE).
Este colorante es una molécula de larga vida intracelular que atraviesa fácilmente la
membrana plasmática y realiza una unión covalente en el interior de las células. Cuando la
célula se divide pasa la marca a sus descendientes y la misma se diluye permitiendo
visualizar ocho o más generaciones de células proliferantes antes de que la señal se vea
superada por la auto-fluorescencia celular intrínseca (Figura 2).
Generaciones

Célula teñida
con CFSE

Intensidad del CFSE


Figura 2: Esquema de la celular teñida 100% con CFSE y la dilución del colorante en las
sucesivas divisiones celulares (Izquierda). Histograma del recuento de células teñidas con
CFSE

Lectura de CFSE por citometro

3- Ensayo colorimétrico con MTT:


La linfoproliferación se puede medir a través de un ensayo colorimétrico con el colorante
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide).
La prueba se fundamenta en la reducción de la sal de tetrazolio de color amarillo, en
cristales insolubles de formazán de color azul, debido a la actividad metabólica de las
células vivas. Las células muertas son incapaces de convertir el MTT en formazán.

62
La cantidad de formazán es proporcional a la actividad de las oxidoreductasas
mitocondriales y por lo tanto, proporcional a la cantidad de células vivas presentes en el
cultivo.

ASPECTOS METODOLÓGICOS
Cuatro horas antes de la finalización del cultivo, se agregan una solución de MTT para
lograr una concentración final de 0.5 mg/ml. Finalizada la reacción, los cristales de
formazán que se forman, se solubilizan con isopropanol acidificado con ClH y se miden por
absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas,
El Índice de Estimulación de cada muestra se calcula como la relación entre el promedio de
la densidad óptica (DO) de los cultivos estimulados y el promedio de la DO de los cultivos
no estimulados.

Aplicaciones

 La técnica de linfoproliferación puede aplicarse para evaluar:


 La capacidad funcional de los linfocitos. Los linfocitos normales deben presentar
una respuesta proliferativa a la estimulación con mitógenos inespecíficos.
 La respuesta linfocitaria frente a un antígeno determinado, que nos permite
identificar la
 Sensibilización previa del individuo frente al antígeno.
 El efecto que tienen sobre la capacidad funcional de los linfocitos, aquellas
enfermedades que provocan inmunodeficiencia (ej. Moquillo canino, parvovirosis
canina, leishmaniosis canina, etc.).
 El efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad celular
 El efecto de diferentes tipos de vacunas o esquemas de vacunación sobre la
inmunidad celular. Para ello, se vacuna a los animales in vivo y se mide la respuesta
proliferativa al Ag in vitro.
 La acción inmunosupresora de ciertos fármacos como medicamentos
inmunosupresores (utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
o linfoproliferativas) o de medicamentos cuyos efectos colaterales
inmunosupresores requiere un seguimiento del paciente.
 El efecto que tienen las interleuquinas que se secretan frente a diferente tipo de
situaciones (stress, quemaduras, traumatismos, etc.) sobre los linfocitos.

Por ejemplo, la inmunodeficiencia severa combinada de los caninos (XSCID) es un


desorden genético caracterizado por la falta de funcionalidad de linfocitos B y T. En el
trabajo que se cita infrascripto, esta anomalía se evidencia in vitro mediante la prueba de
proliferación linfocitaria en cultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA).
Los resultados no están expresados en índice de estimulación, sino directamente en cpm.
Como puede observarse en el gráfico que se reproduce, la respuesta proliferativa de los
linfocitos en los caninos con inmunodeficiencia severa combinada es significativamente
menor a la de los linfocitos provenientes de caninos normales.

cpm 30.000

20.000

10.000

Normal XSCID
63
(Felsburg, J et al. Canine X-linked severe combined immunodeficiency. Veterinary
Immunology and Immunopathology, 69 (1999), 127-135).
Bibliografía

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pokeweed mitogen, and lipopolysaccharide on the replication and immunoglobulin
synthesis by canine peripheral blood lymphocytes in vitro. Immunology Letters, 14
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3. Krakowa, Steven, Ringer, Susan. Activation specificity of commonly employed mitogens
for canine B- and T- lymphocytes. Veterinary Immunology and Immunopathology, 11
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CITOTOXICIDAD

Introducción
La citotoxicidad es un mecanismo efector de las células del sistema inmune que
permite eliminar células infectadas o alteradas del organismo o células de microorganismos
u organismos invasores. Varios tipos celulares, receptores y mecanismos están
involucrados en este mecanismo. Su evaluación permite conocer el nivel de protección
frente a enfermedades infecciosas de origen viral, capacidad de eliminar células alteradas
por procesos tumorales, etc. Hay dos condiciones indispensables para que cualquier
mecanismo citotóxico mediado por células se lleve a cabo:

1- viabilidad de las células efectoras


2- contacto estrecho entre la célula efectora y la célula blanco.

La lisis de la célula blanco (o célula diana) es la consecuencia de la reacción citotóxica.

Mecanismos de Citotoxicidad

Los mecanismos de citotoxicidad pueden clasificarse de acuerdo a los requerimientos del


sistema, en:

 Mecanismos de citotoxicidad específicos: es necesaria la sensibilización previa del


animal del cual provienen las células blanco (por ejemplo, citotoxicidad por LT o
ADCC).
 Mecanismos de citotoxicidad innatos: funcionan sin necesidad de sensibilización
previa (por ejemplo. citotoxicidad por células NK o por complemento).

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Mecanismos de citotoxicidad específicos

Mecanismos citotóxicos mediados por linfocitos T: son de gran importancia para la defensa
del individuo contra las infecciones causadas por virus y contra parásitos intracelulares.
Tienen participación, además, en el rechazo de los transplantes y de ciertos tumores.

Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA o ADCC):


Algunas células pueden ejercer citotoxicidad cuando se unen con un anticuerpo ya ligado al
antígeno sobre la célula blanco a través de los receptores para Fc (CD16). Este proceso se
denomina citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
La función de CCDA está comprometida en procesos de inmunidad contra tumores, en el
rechazo de transplantes, en procesos de destrucción de bacterias, parásitos y células
infectadas por virus.
La reacción citotóxica se inicia con el reconocimiento de los anticuerpos que recubren a la
célula blanco por parte de la célula efectora, a través de receptores para el fragmento Fc de
la Ig. En la mayor parte de los casos, el anticuerpo que participa en la CCDA es de la clase
IgG y, por consiguiente, los receptores presentes en la membrana de las células efectoras
intervinientes son los receptores para el Fc de la IgG (FcR). Sin embargo, ciertos linfocitos
con FcR para IgA (FcR) y los polimorfonucleares neutrófilos, son capaces de mediar
CCDA contra células blanco sensibilizadas con IgA. Además, los monocitos y los
polimorfonucleares eosinófilos que expresan FcR para IgE (FcR) inducen la destrucción de
células recubiertas con IgE. Este último sistema tiene relevancia en la inmunidad contra
parásitos.

Mecanismos de citotoxicidad innatos

Células NK:
El sistema inmune presenta poblaciones linfocitarias que tienen la capacidad innata de lisar
cierto tipo de células tumorales y células infectadas por virus. Este fenómeno citotóxico,
descrito alrededor del año 1970, se conoce como citotoxicidad natural killer o actividad NK.
Para que se lleve a cabo no es necesaria sensibilización previa de las células efectoras. La
actividad NK no se ve influida por la exposición previa al antígeno por parte del individuo
del cual provienen estas células.

Citotoxicidad generada por complemento:


Este mecanismo, a diferencia de los detallados anteriormente, no está producido por la
acción de células efectoras sino por la activación del complemento.

Citotoxicidad celular inducida por IL-2


Se ha demostrado que el tratamiento in vitro de linfocitos periféricos con IL-2 (ex vivo),
además de favorecer la citotoxicidad T y NK, induce una actividad citolítica sobre un grupo
de células denominadas células LAK (por la sigla en inglés de células “Killer” activadas por
linfoquinas).
Se cree que estas células pertenecen al linaje de las NK, aunque aún no están bien
definidas. Éstas son capaces de lisar una gran variedad de células tumorales, incluso
muchas que no son sensibles a células NK. La activación de células ex vivo de pacientes
oncológicos ha sido una de las propuestas terapéuticas ensayadas en humanos.

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Evaluación de la funcionalidad celular por medio de reacciones de citotoxicidad
mediadas por LT citotóxicos.

El primer paso de una determinación de citotoxicidad comprende la obtención de los


linfocitos T citotóxicos específicos. Éstos pueden encontrarse pre-estimulados en el
huésped y deben ser expandidos in vitro.
Los linfocitos T citotóxicos no pueden ser detectados habitualmente en sangre periférica sin
una estimulación previa para ampliar el número de células activas por medio de la
expansión clonal, a menos que el individuo se encuentre en el período de actividad de una
infección viral. Cuando se requiere medir la reactividad de los linfocitos T citotóxicos,
generalmente es necesario estimular a las células efectoras in vitro con el antígeno
específico. Para ello, se co-cultivan las células mononucleares obtenidas de sangre
periférica con el antígeno en forma soluble o con células irradiadas que expresan el
antígeno de interés. Los linfocitos T citotóxicos se cosechan después de 5 a 7 días de
cultivo.
Cuando se encara el análisis de un fenómeno de este tipo es necesario contar, en primer
lugar, con un método apropiado para evaluar la muerte de la célula blanco.
Por ejemplo, si se trata de una bacteria o un parásito, es posible observar
microscópicamente su destrucción o la inhibición de su capacidad para proliferar en medios
de cultivo adecuados, luego de su contacto con la célula efectora. En cambio, si la célula
blanco es una célula tumoral o normal, pueden utilizarse colorantes vitales como naranja de
acridina o azul tripán (trypan blue) para poner en evidencia la lisis, ya que estos colorantes
tienen la particularidad de teñir únicamente a las células muertas.
Asimismo, es posible recurrir a alguna característica metabólica particular que pueda
asociarse con la viabilidad de la célula blanco utilizada en la reacción. Por ejemplo, si se
trata de una célula secretora, medir su capacidad para liberar un determinado producto de
secreción.
El método más difundido para el estudio de los mecanismos citotóxicos es el de la
incorporación de sustancias radiactivas a las células blanco. La destrucción de estas
células permite que la sustancia radiactiva se libere al medio y pueda ser cuantificada
fácilmente.

Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas:
 Deben incorporarse a las células blanco en cantidades compatibles con los
sistemas de microrreacciones.
 No deben liberarse al medio espontáneamente.
 Su liberación al medio debe tener correlación directa con el efecto lítico producido.
 Una vez liberadas al sobrenadante, no deben ser reutilizables en forma significativa
por las células restantes.

El agente radiactivo más utilizado es el Na251CrO4 (dicromato de sodio) que tiene la ventaja
adicional de poner de manifiesto rápidamente el efecto citotóxico. Para el caso de bacterias
o parásitos que no incorporan 51Cr o que lo liberan en forma espontánea, se usan bases
nitrogenadas radiactivas, como por ejemplo la 3H-Timidina (timidina tritiada) que se
incorpora a los ácidos nucleicos o la 35S-Metionina que se incorpora a las proteínas.
La técnica más frecuentemente empleada para determinar citotoxicidad utiliza la liberación
de 51Cr debida a la lisis de la célula blanco. Las células efectoras son puestas en contacto
con las células blanco marcadas radiactivamente con 51Cr, durante 4 hs de incubación. La
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radiactividad liberada es directamente proporcional a la lisis celular producto de la
citotoxicidad.

ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Marcación de la célula blanco con dicromato de sodio (51Cr): Las células deberán
encontrarse en fase logarítmica de crecimiento.
 Centrifugar la suspensión celular y resuspender el precipitado en dicromato de sodio
marcado.
 Incubar 60 min a 37ºC con agitación suave.
 Lavar con medio de cultivo y resuspender las células marcadas a la concentración
deseada.
Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La
relación entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta.
Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y
células efectoras (por ej. 1:50).
 Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco
(no olvidar los controles).
 Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC
por 4 hs en estufa gaseada con CO2 al 5%.
 Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de
centelleo.
Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La
relación entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta.
Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y
células efectoras (por ej. 1:50).
 Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco
(no olvidar los controles).
 Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC
por 4 hs en estufa gaseada con CO2 al 5%.
 Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de
centelleo.

Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas):


En los cultivos de células blanco (sin células efectoras), se mide la liberación espontánea
del 51Cr fijado durante la marcación.
Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas):
A los co-cultivos de células efectoras + células blanco se agrega un detergente (Tritón X-
100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación
total del 51Cr fijado durante la marcación.
Cálculo del porcentaje de lisis específica:

(cpm experimentales – cpm espontáneas)


Lisis específica =
X 100
(cpm máximas - cpm espontáneas)

Las cpm espontáneas no deben superar el 20% de las cpm máximas para que la prueba
sea válida.
En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades líticas (UL),
correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o

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el 50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación células efectoras:
células blanco.

Pruebas para determinar citotoxicidad de células Natural Killer (NK)


La actividad NK se mide generalmente en ensayos de liberación de metodología
similar a la utilizada para linfocitos T citotóxicos.
Si la evaluación se realiza en seres humanos, se utiliza como células blanco una línea
celular denominada K562 que son células tumorales humanas.
Cuando se realiza la evaluación en un sistema murino, generalmente se utilizan como
células blanco las células de la línea Yac 1, que provienen de un linfoma murino inducido
por el virus Moloney. Como fuente de células efectoras se utiliza una suspensión celular de
bazo.
Para evaluar la actividad NK en perros se utiliza una línea celular de adenocarcinoma
canino, CTAC.
En todos los casos, la metodología utilizada es similar a la descripta para linfocitos T
citotóxicos.

Reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo


Clínicamente, el ensayo de CCDA es útil en la evaluación funcional de células efectoras
inmunocompetentes, por ejemplo, en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico.
Otra aplicación importante de la CCDA es la evaluación de anticuerpos contra
aloantígenos, células tumorales o virus. La CCDA se utiliza para estudiar sueros de los
pacientes que recibirán un trasplante o que padecen una infección viral.
A continuación se describe un método para medir actividad efectora de CCDA en
células mononucleares de sangre periférica, empleando células blanco marcadas
con 51Cr.

ASPECTOS METODOLÓGICOS:
1. Sensibilización y marcación de las células blanco:
 Se lavan las células tres veces con medio de cultivo. Antes del último lavado se
dividen en dos alícuotas iguales.
 A una de las alícuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido
previamente calentando a 56ºC por una hora, procedimiento que inactiva los
factores del complemento. A la otra alícuota se la toma como control sin suero.
 Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37ºC por 30 min.
 Se lavan las células tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo
radiactivo no incorporado.

2. Medición de la actividad de CCDA por un ensayo de liberación de 51Cr:


 Se prepara una suspensión de células efectoras, se hacen diluciones seriadas
(1:2, 1:4, 1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos, con los
correspondientes controles.
 Se agregan células blanco incubadas con y sin anticuerpos, marcadas con 51Cr.
 Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las células y se
incuban a 37ºC por 4 a 18 hs. en estufa gaseada con CO2 al 5%.
 Luego de la incubación, los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y
se levanta el sobrenadante, que se analiza en un contador de centelleo líquido.
Las cpm determinadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado
por la ruptura celular.

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3. Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas):
A los co-cultivos de células efectoras + células blanco recubiertas con anticuerpos y células
efectoras + células blanco sin recubrir con anticuerpos, se agrega un detergente (Tritón X-
100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación de
51
Cr.

4. Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas):


A los cultivos de células blanco recubiertas con anticuerpos y células blanco sin recubrir
con anticuerpos (ambos sin células efectoras), se mide la liberación espontánea del 51Cr
fijado durante la marcación.

Cálculo del porcentaje de lisis específica:

(cpm experimentales – cpm espontáneas)


Lisis específica = X 100
(cpm máximas - cpm espontáneas)

El porcentaje de lisis específica debe calcularse para las células blanco recubiertas por
anticuerpos y paralelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje
de CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas con
anticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir.
Si bien la liberación de 51Cr es un procedimiento ampliamente utilizado para detectar
citotoxicidad, en los últimos años se han desarrollado métodos colorimétricos, fluorímetricos
y más recientemente por quimioluminiscencia, tendientes a reemplazar el material
radiactivo y aumentar la sensibilidad.

Bibliografía

1. Bamford, A.I; Adair, B.M.; Foster, J.C. Primary cytotoxic response of bovine peripheral
blood leukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. 1995. Veterinary Iºmmunology
and Immunopathology. 45: 85-95
2. Fainboim, L; Satz, ML; Jennifer, J. 1999. Introducción a la Inmunología Humana. 387 pp.
3. Margni, R.A. 1996 Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976
pp.
4. Podack, E.R. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. 1995. Journal of
Leukocyte Biology. 57: 548-552
5. Gondolf C, Burkhardt E, Failing K, Stitz L. A new colorimetric method for measuring cell-
mediated cytotoxicity in dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1996 Dec; 55(1-3):11-22.

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

La técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es un método


analítico de mezclas de proteínas u otras sustancias que combina la velocidad de migración
por acción de un campo eléctrico (relacionado con el tamaño molecular de la sustancia) con
el tamizado molecular (relacionado con el tamaño del poro del gel soporte), para separar
los componentes de una muestra simple o compleja. Los geles de poliacrilamida pueden
ser:

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 PAGE no desnaturalizante: La muestra se analiza en su estado natural y este
método nos permite identificar el peso molecular (PM) de sus componentes.
 SDS-PAGE: La muestra se analiza luego de un proceso de disociación de la
muestra con detergentes. Este método es el más utilizado en Inmunología y nos
permite identificar antígenos o epitopes secuenciales ya que la muestra que se
analiza está desnaturalizada o disociada.
A continuación describiremos la técnica de SDS-PAGE.
Las muestras a analizar son hervidas a 100°C en presencia de un agente disociante
(dodecilsulfato de sodio o SDS), presente en exceso y un agente desnaturalizante (2-
mercaptoetanol o 2-ME). En estas condiciones, el grupo tiol del 2-mercaptoetanol rompe los
puentes disulfuro que puedan existir y hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos
constitutivos, los que fijan SDS en una relación constante (1.4g SDS/g de proteína). La
carga de la proteína o fragmento se hace insignificante ante el exceso de carga negativa
del SDS. En consecuencia, la carga de todas las moléculas será idéntica y su
desplazamiento en el campo eléctrico dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.
El SDS-PAGE permite determinar aproximadamente el PM de una proteína si se la
compara con patrones de peso molecular conocidos que se incluyan en las pruebas y se
corren simultáneamente.
El gel utilizado en esta técnica resulta de la polimerización en largas cadenas de acrilamida
monomérica y su entrecruzamiento con la NN-metilenbisacrilamida. La polimerización
necesita un iniciador del proceso, como el NNNN-Tetrametildiamina (TEMED) y el
persulfato de amonio (PSA). El TEMED cataliza la formación de radicales libres a partir del
persulfato de amonio.
La concentración de los componentes del gel (acrilamida y bis-acrilamida) utilizados en su
armado determina el diámetro de poro. Cuanto mayor es el porcentaje de acrilamida/bis-
acrilamida utilizado, más pequeño es el poro obtenido.

De acuerdo al PM que necesitemos estudiar se seleccionará un determinado poro de gel,


por ejemplo:

 15% de acrilamida permite discriminar entre PM de entre 12 a 45 kD


 10% de acrilamida permite discriminar entre PM de entre 17 a 50 kD
 5% de acrilamida permite discriminar entre PM de entre 60 a 200 kD

Las muestras se siembran en un gel de poro grueso (gel de paso rápido,


apilamiento o stacking) que permite que todos los componentes de la muestra se
concentren en una zona estrecha y comiencen la migración por el gel de separación en
forma simultánea, lo que facilita la comparación entre muestras y los patrones de PM.
Existen sistemas de geles continuos y discontinuos. En los sistemas discontinuos
(los más usados) los buffers utilizados para los geles de apilamiento y de separación
poseen diferente fuerza iónica y pH.

En forma de síntesis los pasos a seguir son:

A- Armado del gel de poliacrilamida


B- Preparación de las muestras
C- Siembra de las muestras en el gel
D- Corrida electroforética
E- Tinción del gel
F- Análisis e interpretación de los resultados

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Los geles teñidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se
observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que
componen la mezcla. La distancia que recorrió cada proteína en el gel desde el sitio de
sembrado de la muestra es proporcional a su peso molecular, por lo tanto, cuanta más
distancia recorrida menor el PM de esta proteína. Las proteínas del mismo PM corren en
forma conjunta.

Algunas de las utilidades son:

Identificar el PM de los componentes en muestras


complejas Identificar pureza en extractos purificados

Constituir el primer paso para el análisis antigénico en muestras (Inmunoblot, ver más
adelante)

Anexo

A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un gel de


poliacrilamida al 15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo
provisto por laboratorios Bio-Rad).
1. Armado del gel entre de placas de vidrio:
A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un gel de
poliacrilamida al 15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo
provisto por laboratorios Bio-Rad).
1. Armado del gel entre de placas de vidrio:
 Realizar una delicada limpieza de las placas de vidrio con alcohol etílico.
 Formar un sándwich con ambos vidrios ubicando entre ellos los espaciadores.
 Ubicar el sándwich en la abrazadera de manera que la placa más pequeña quede
hacia delante (introducir entre ambos platos la tarjeta alineadora).
 Ajustar los tornillos de la abrazadera en forma manera cruzada.
 Verificar que no existan pérdidas de líquido: colocar agua entre ambos platos con una
pipeta plástica y observar si el nivel de agua desciende.
 Si existen pérdidas, rehacer el armado.

2. Preparación de la solución de poliacrilamida-bisacrilamida

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La preparación del gel de poliacrilamida debe realizarse en un frasco limpio y
desengrasado. Debe trabajarse siempre con guantes y preferentemente con barbijo (la
acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe a través de piel y mucosas).

El oxígeno inhibe la polimerización, por lo que se recomienda desgasificar el agua y todas


las soluciones a utilizar.
 Preparar el gel de separación: Agregar al frasco las respectivas cantidades de agua,
mezcla de acrilamida: bisacrilamida (en una proporción de 30:0.8), 1.5 M Tris y SDS
10%.
 Agregar los agentes iniciadores de la polimerización: PSA y TEMED. Se debe tener en
cuenta que la mezcla comenzará a gelificarse, de manera que los pasos a seguir
deberán realizarse con la debida celeridad.
 Verter la solución con una pipeta plástica entre ambas placas hasta 2 cm por debajo del
borde superior. Agregar rápidamente unas gotitas de agua sobre la solución para evitar
el ingreso de oxígeno que retrasa la polimerización de la acrilamida.
 Preparar el gel de apilamiento o stacking. Hacer esto mientras gelifica el gel de
separación, que generalmente demora entre 20 y 30 minutos. No agregar el PSA ni el
TEMED a la solución de gel de apilamiento hasta que el gel de separación haya
gelificado.
 Una vez ocurrida la gelificación, retirar el agua, verter el gel de stacking y colocar el
peine (para generar las calles) suavemente, evitando la formación de burbujas.
 Dejar que la acrilamida polimerice durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez
gelificado, retirar el peine.

3. Armado de la cuba

Con el armado de la cuba se generan las dos cámaras entre las cuales pasará la corriente
eléctrica. Los geles de poliacrilamida quedarán comunicando las dos cámaras (una anódica
y otra catódica) y el pasaje de corriente a través del gel producirá la corrida del material a
analizar. Por lo tanto, del correcto armado dependerá el éxito del análisis de la técnica.
Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas
y su lubricación. Es fundamental que la cámara que se genera entre los dos geles no
pierda. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cámara interna fuera del tanque y
observar que no se produzcan pérdidas. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la
cuba con agar al 1%, hasta lograr el aislamiento de la cámara interior. Una vez logrado
esto, se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cámara exterior con un volumen
de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. El buffer con que se
llenan las cámaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo

4. Preparación de las muestras


El volumen máximo de muestra que puede sembrarse por cada calle es de 20 l. En
este caso, hay que considerar que la muestra está diluida en buffer muestra (preparado a
una concentración de 2X), y por lo tanto el volumen real de la muestra será de 10 l.
Una vez diluida la muestra en su buffer se debe hervir durante 10 minutos a fin de que se
produzca la desnaturalización de las proteínas a estudiar.

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Nota: La sensibilidad de la técnica depende del colorante de proteínas que se va a utilizar
para ver las bandas, pero el rango de detección se encuentra entre 1 a 10 g. En el caso de
muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100 g de proteína total.

5. Siembra de las muestras


Las muestras se siembran una por cada calle, tomando nota del orden en el que
fueron sembradas para poder identificarlas más tarde. Como control se agrega una calle
con marcadores de PM. Estos marcadores son una mezcla de proteínas con PM conocido
que permiten confirmar el tamaño de un fragmento cualquiera en el gel.

6. Corrida
La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante, 70 volts
durante 2 a 3 horas. El frente de corrida, marcado por el colorante presente en el buffer
muestra, permite determinar en qué momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del
gel. Una vez concluida la corrida, se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba.
Con guantes y una espátula se despega el gel de los vidrios. El destino de este gel puede
ser la tinción o la transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente
identificar la proteína por inmunoreactividad.

7. Coloración de las proteínas corridas


Si el destino es la coloración para proteínas, se lo sumerge en colorante Azul de
Coomassie (Coomassie Blue). Este colorante permite detectar entre 0.2 a 0.5 g de
proteínas. La solución colorante contiene ácido acético que permite fijar las proteínas a la
vez que se tiñen.
En los casos en que la sensibilidad de la tinción con Coomassie Blue no sea suficiente, se
puede utilizar la tinción argéntica (Silver stain) que permite detectar hasta 2 ng de proteínas
por banda. La tinción argéntica, además es útil para detectar polisacáridos y proteínas
altamente glicosiladas.

Bibliografía

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Laboratory. 1988. pp726.
2. Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual. Bio-Rad
3. Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed.
Interamericana.

73
74
ELISA

Engval y Perlmann en Holanda, al mismo tiempo que Van Weemen y Schuurs en


Suecia (1971) describieron una técnica inmunoenzimática para detectar antígenos o
anticuerpos en líquidos corporales, como método alternativo al uso de radioisótopos
radioinmunoensayo (RIA). Ambas (ELISA y RIA) son técnicas de interacción primaria. Esta
técnica se denomina ELISA, por el acrónimo del término en inglés Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay o Ensayo Inmuno-absorbente Ligado a Enzimas.
El ELISA es una técnica de interacción primaria que permite evidenciar la presencia de
anticuerpos (o antígenos) a través de la unión específica con su antígeno (o anticuerpo)
correspondiente que se encuentra unido a un soporte inerte. El revelado de esta interacción
Ag-Ac se realiza utilizando alguno de los dos componentes de la interacción (generalmente
un anticuerpo) marcado con una enzima (conjugado). La presencia de la enzima en la
reacción se revela a través de la transformación de un sustrato incoloro en un producto
coloreado.

Existen diversos esquemas de la técnica que comprenden generalmente tres etapas:


1. Inmovilización del inmunorreactante (antígeno o anticuerpo) en la fase sólida.
2. Reacción del inmunorreactante con su correspondiente antígeno o anticuerpo.
3. Detección del antígeno o anticuerpo mediante la utilización de un segundo anticuerpo
conjugado con una enzima.

Como toda reacción antígeno-anticuerpo, posee un equilibrio dinámico con una primera
etapa reversible seguida por una etapa irreversible. Esta cinética depende de la molaridad
del medio (soluciones tamponadas -o buffers- utilizados) y del tiempo y temperatura en que
se produce la reacción (incubación).

Enzimas utilizadas en los ensayos inmunoenzimáticos


 Las enzimas a ser utilizadas en estos ensayos deben reunir ciertos requisitos.
 Deben ser solubles en agua, incoloras, inodoras y atóxicas.
 Deben ser estables al almacenamiento y luego de la detención de la reacción
enzimática.
 No deben ser fotosensibles.
 Deben ofrecer un amplio rango de linealidad entre su concentración y la intensidad
de color que generan en el sustrato.
 Los sustratos de estas enzimas deben poseer un alto coeficiente de extinción molar,
con un máximo de absorbancia entre 400 y 600 nm.

La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas más utilizadas. Desde hace
algunos años se ha difundido el uso de ureasa, β-galactosidasa y glucosa-oxidasa.

Peroxidasa
La peroxidasa es una hemoproteína que transfiere Hidrógeno desde un donador
reducido (DH) al O del H2O 2 liberando un producto oxidado y O2. La peroxidasa más
utilizada, obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase). Para revelar la reacción
química producida se utilizan diferentes cromógenos, entre ellos:
 2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que absorbe a
405 nm. cuando se oxida vira al color verde.
 orto-fenilendiamina (OPD) o 1,2,-bencenodiamina, que absorben a 492 nm. Cuando
se oxida vira al color ocre

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 Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo
 El sustrato más utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o peróxido de
hidrógeno (H2O2): La acción de la peroxidasa sobre el peróxido de hidrógeno
degrada este compuesto dando agua y liberando oxígeno (O-). El oxígeno, a su vez,
oxida al cromógeno que pasa de incoloro en su estado reducido a coloreado en su
estado oxidado.

H2O2 (sustrato) PO H2O + O- (dador de electrones)

Cromógeno (-) incoloro Cromógeno (+) coloreado

(-) reducido, (+) oxidado

Como todas las enzimas, la peroxidasa acelera el proceso de degradación del sustrato sin
perder su funcionalidad, por lo tanto, se encuentra en condiciones de reaccionar
nuevamente una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solución de
freno o stop que modifica el pH.

Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aíslan a partir de intestino
bovino o de Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de ésteres de
fosfatos (como los de alcoholes primarios, secundarios, fenoles y aminas), tienen un pH
óptimo alcalino (por lo que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs
cercanos a 9) y requieren Mg y Zn como cofactores.
Los cromógenos más utilizados para esta enzima son:
-pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo.
-5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de
incoloro a azul.

a) Procedimiento general de la técnica de ELISA aplicada a la medición de


anticuerpos:
La muestra a evaluar puede ser un suero, un producto de secreción o de excreción.
 Entonces, para identificar anticuerpos específicos frente a Brucella sp. El Ag (ej: Brucella
abortus) se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato pH 9.6 o en buffer fosfato (PBS)

durante 16 hs a 4°C.
 El exceso de Ag se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS
(PBST).
 Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los
anticuerpos específicos (solución bloqueante), para limitar la unión inespecífica de
proteínas. Se puede utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se
incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C.
 El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.
 Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o
triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C. (El suero problema es
aquél del cual se quiere conocer si posee Acs específicos contra el Ag que se encuentra
pegado en la placa, en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de
Acs anti-B. abortus).
 Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST.
76
 Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las
inmunoglobulinas de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso, el
conjugado será un Ac anti-Ig bovina). Si el Ac específico está presente, el anticuerpo
conjugado reacciona con él y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16
hs a 4°C.
 El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
 Se agrega el sustrato de la enzima. La reacción de la enzima con el sustrato resulta en
un producto coloreado y es un indicador visual de que la reacción antígeno-anticuerpo ha
tenido lugar.
 Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del tiempo
y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimática a tiempo de reacción
determinado que se relaciona con la aparición de color en los controles negativos de
sustrato. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa ácido
sulfúrico y para fosfatasa se utiliza el hidróxido de sodio, ambos modifican el pH y la
reacción se frena.
 La reacción cromática puede ser leída a simple vista o cuantificada por
espectrofotometría. La intensidad de la reacción es proporcional a la cantidad de enzima
activa presente en cada hoyo.

Lectura:
Como primer paso y para identificar si la prueba funcionó se debe realizar la lectura
de los controles, si el control positivo cambió de color y el control negativo dio lecturas
bajas o negativas entonces podemos proceder a continuar con la interpretación de los
resultados. En caso de haber anticuerpos anti-brucella en el suero bovino problema, se
observará la aparición o cambio de color en el sustrato. En un primer paso, los anticuerpos
del suero se unen al antígeno pegado a la placa. Al agregar los anticuerpos conjugados a la
enzima, éstos reconocen y se unen a los anticuerpos del suero. La enzima queda adherida
y se produce así la reacción al agregar el sustrato.
De no haber anticuerpos específicos en el suero problema, el resto de los anticuerpos se
eliminan con el lavado. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima, éste no
reconoce ninguna molécula específica y se elimina al realizar el último lavado. Por lo tanto,
al agregar el sustrato no se producirá ninguna reacción específica. Se puede observar un
nivel bajo de señal por autodegradación del sustrato o debido a la presencia de enzima por
lavado ineficaz de la placa. Por esto es tan importante que después de cada incubación se
proceda al lavado con soluciones salinas con detergentes suaves, a fin de eliminar las
proteínas unidas de manera inespecífica a los soportes sólidos.

b) Procedimiento general de la técnica de ELISA aplicada a la medición de antígenos:


La muestra a evaluar puede ser un suero, un producto de secreción o de excreción.
 El anticuerpo específico para ese antígeno se resuspende en buffer Carbonato-
Bicarbonato pH 9.6 o en buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe a los hoyos de la placa
durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C.
 El exceso de Ac se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS
(PBST).
 Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los
anticuerpos específicos (solución bloqueante), para limitar la unión inespecífica de
proteínas. Se puede utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS.
Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C.
 El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.

77
 Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos
por duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C.
(Muestra problema es aquélla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el
que son específicos los Acs fijados a la placa)
 Los antígenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST.
 Se añade un segundo anticuerpo específico para ese antígeno, pero unido a una enzima
(conjugado). Si el Ag específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él
y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37°C o durante 16 hs a 4°C. El exceso de
conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
 Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimática observada con
la concentración del antígeno presente en la muestra.

Tipos de esquemas de ELISAs


Según la metodología utilizada en:

1- De amplificación de actividad o no competitivos.


En estos ELISAs se emplea un exceso del anticuerpo secundario o revelador con el
objeto de obtener una señal máxima debida a la presencia del compuesto a medir. Estos
ELISAs se subdividen de acuerdo a que el antígeno o anticuerpo a identificar sea
inmovilizado en la fase sólida (ELISA directo) o capturado por la molécula complementaria
(ELISA indirecto y ELISA sándwich).

ELISA DIRECTO:
La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza
sobre la fase sólida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags
conjugados, y en el caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac
conjugados. (Fig. 1A).

ELISA INDIRECTO:
En el ELISAs indirecto el antígeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa
por la molécula complementaria (Ag o Ac), según corresponda. O sea, si se desea detectar
Acs específicos en un suero, se inmoviliza el antígeno en la fase sólida y se lo hace
reaccionar con el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a
una enzima. Este sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias moléculas del
78
conjugado enzimático (Anti-Ig marcados con la enzima) pueden unirse a cada molécula de
Ac que reaccionó a su vez con el Ag inmovilizado, este efecto provoca una amplificación de
la señal. (Fig. 1B)

ELISA DE CAPTURA O SANDWICH:


Este sistema se emplea para la cuantificación de Ags o para la detección de Acs
contra el Ag capturado. En general es deseable que el conjugado enzimático y el Ac
inmovilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistema,
originadas por reacción cruzada del conjugado con el Ac de captura.
Por ejemplo: para la detección de antígenos: se inmoviliza un Ac con el que se “captura” el
Ag y se revela su presencia con un conjugado enzimático anti-Ag, (Fig. 1C).
Para la detección de anticuerpos: se inmoviliza un Ac con el que se “captura” el Ag, se
agrega el anticuerpo problema o incógnita y se revela su presencia con un conjugado
enzimático anti-Ac o anti especie.

2- De competitivos o modulación de actividad


Estos ELISAs se basan en la competición del antígeno o anticuerpo incógnita a
evaluar con un antígeno o anticuerpo conocido o patrón reactivo patrón de similar
estructura y afinidad () y se detecta el resultado de esta reacción luego de la estabilización
del sistema.
El conjugado enzimático puede ser antígeno o anticuerpo compite con el compuesto a
analizar: antígeno o anticuerpo. Cantidades pequeñas del conjugado enzimático permiten
obtener una mayor sensibilidad.
Existen dos diseños generales de ensayos competitivos:

a) De incubación simultánea: El compuesto marcado con enzima y el compuesto sin


marcar (compuesto a dosar) se incuban simultáneamente en el sistema.
b) De incubación en etapas o por saturación: El compuesto no marcado (incógnita) se
incuba en una primera etapa. En una segunda etapa se incuba el compuesto marcado
enzimáticamente, el que reaccionará con los sitios no ocupados por el compuesto que
reaccionó en la primera etapa.

Por ejemplo: en el ELISA competitivo se puede inmovilizar el anticuerpo en la fase sólida y


agregar el antígeno marcado con la enzima, aplicando cualquiera de estos dos diseños
generales. Se observará una disminución de la actividad enzimática a medida que aumenta
la cantidad de antígeno libre no marcado presente en una solución patrón o en la muestra
problema. El producto coloreado formado es inversamente proporcional a la concentración
de antígeno libre.
En la Fig 2 se muestra un ELISA de competición en etapas una de las cuales se realiza en
fase líquida. Como se observa se inmoviliza el Ag patrón conocido en la placa y se cuenta
con Acs anti-Ag específicos marcados con enzima. La muestra problema (en la cual se
quiere conocer la presencia y cantidad del antígeno) se incuba en fase líquida con el
anticuerpo marcado y luego se realiza el ELISA en placa con el antígeno patrón adsorbido
en la placa. Cuanto más antígeno problema haya reaccionado en la fase líquida menos
cantidad de anticuerpo marcado podrá reaccionar en la placa con el Ag patrón, por lo que
los resultados (cantidad de antígeno en la muestra) son inversamente proporcionales a la
densidad óptica obtenida.

79
Valor de corte

Para la interpretación del ensayo y a fin de poder diferenciar entre muestras positivas y
negativas, debe calcularse el valor de corte utilizando la siguiente fórmula.

Valor de corte = densidades ópticas (D.O.) promedio + 2 desvíos estándar de los controles
del suero negativo.

El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sean positivos o
negativos. En general existe una zona de solapamiento en la distribución de la reactividad
de sueros positivos y negativos, en la que no puede establecerse con certeza si una
muestra es positiva o negativa.
Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener más falsos positivos
o falsos negativos, según qué tipo de error produzca consecuencias menos graves en la
decisión biológica.

Figura 2: Esquema de ELISA competitivo

Controles
En todos los ensayos y diagnósticos, los controles deben permitirnos afirmar que el
cambio de color detectado corresponde a la interacción específica entre Ag y Ac y no a
reacciones inespecíficas. Si las reacciones inespecíficas se detectan estas deben ser
minimizadas y tomadas en cuenta en el momento de establecer el valor de corte.

Podemos ejemplificar los controles en un ELISA indirecto de la siguiente manera:

Controles de sueros con resultados conocidos

80
Los valores obtenidos con estos controles repetidos en todos los ELISAs a través del
tiempo nos permite calcular la repetitividad del ensayo y comparar resultados de diferentes
días o entre laboratorios.

A- Control positivo: suero de un animal convaleciente o polivacunado, con alto título de


anticuerpos específicos.
B- Control negativo: suero de un animal sano y virgen (libre de anticuerpos específicos).

Controles del conjugado

A- Control negativo del Conjugado: Se realiza para corroborar que el anticuerpo conjugado
a la enzima no interacciona con ningún otro componente del sistema que no sea el
anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno, se
bloquea, no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante), se
coloca el anticuerpo conjugado y por último el sustrato. Estos controles no deberían
reaccionar con ninguno de los componentes arrojando valores de densidad óptica bajas o
despreciables.

B- Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el
anticuerpo conjugado a la enzima interactúa correctamente con el anticuerpo primario. Se
realiza de la siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es
específico en conjugado. Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratón
se coloca en la placa suero de ratón, se bloquea, no se coloca anticuerpo primario y se
coloca el anticuerpo secundario marcado con la enzima, continuando el resto de la técnica
de la misma manera. Este control debe dar positivo, es decir debe haber color en los hoyos
indicando el correcto funcionamiento del conjugado.

Control del sustrato: Permite determinar que el sustrato de la enzima no reacciona con
ningún otro componente del sistema excepto con la enzima. Se realiza de la siguiente
manera: se pega a la placa el antígeno, se incuba con el anticuerpo 1º, es decir, el suero, y
no se coloca el anticuerpo secundario conjugado, y se coloca luego el sustrato y este no
debería modificar su color, ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reacción.

Control del bloqueante: Permite determinar que el bloqueo se realizó correctamente. Se


realizan todos los pasos del ELISA, pero en la placa no se pega el antígeno, sino que se
comienza a partir del bloqueante. Se coloca un suero positivo, el cual no debería reaccionar
ya que no hay antígeno pegado en la placa. Este permite identificar si algún componente se
pega inespecíficamente a la placa.

Sistemas alternativos de reconocimiento


Los límites de la reacción Ag-Ac están determinados por la valencia del Ac (2 para
la IgG y 5 para la IgM) y por la constante de afinidad de unión del Ac (K a =108 a 1010 M-1).
La utilización de sistemas alternativos en algunas etapas de las reacciones de ELISA
permiten amplificar los límites de las reacciones Ag-Ac y/o facilitar la técnica.

Sistema avidina-biotina / estreptavidina-biotina:


La avidina es una proteína de la clara de huevo y la estreptavidina es una proteína
producida por ciertas levaduras. Ambas se caracterizan por su elevada afinidad por la
biotina (Ka=1015M-1). Debido a que la biotina es fácilmente acoplable a distintas proteínas
(entre ellas, Ac y enzimas) por unión covalente, sin que se afecte su actividad biológica, se

81
han desarrollado métodos inmunoenzimáticos basados en la interacción avidina-biotina.
Pues estos reactivos permiten reemplazar a los antígenos o anticuerpos conjugados.

Proteína A:
Es una proteína de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta
afinidad por los fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). Tiene 4 sitios de
unión, aunque generalmente reaccionan sólo dos.

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS SEROLÓGICAS

El diseño de una técnica inmunológica está relacionado con el dato o resultado que
pretendemos obtener de su realización. Este resultado permite clasificar las técnicas en:

TÉCNICAS CUALITATIVAS
Indican la presencia o ausencia de antígenos o anticuerpos en una muestra. En
algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnóstico, como por ejemplo,
en la detección de anticuerpos contra los virus de la arteritis equina o de la anemia
infecciosa equina, o la identificación de virus rábico en una muestra de encéfalo. Los
resultados se expresan como positivo y negativo.
TÉCNICAS SEMICUANTITATIVAS
Brindan una idea de la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra. A tal fin,
la técnica se realiza sobre diluciones seriadas de la muestra para obtener el título, que es
la inversa de la última dilución que da resultado positivo.
El título es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente
proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al límite de detección de
la técnica utilizada.
Por esto, cuando tenemos un resultado expresado en título debemos indicar cuál fue la
técnica empleada. Como ejemplos, podemos mencionar la titulación de anticuerpos contra
leptospira spp. obtenido por micoaglutinación o contra parvovirus caninoobtenido por
Inhibición de la hemaglutinación.

TÉCNICAS CUANTITATIVAS
Determinan la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en una muestra, medidas
como cantidad absoluta o concentración. Estas técnicas requieren utilizar estándares de
concentraciones conocidas que se evalúan simultáneamente con la muestra y nos permiten
realizar curvas patrones, a partir de las que se calcula la cantidad de la sustancia presente
en la muestra por interpolación del resultado obtenido en la medición de la muestra
problema.

Controles internos y externos


Para que una técnica sea convalidada necesitamos incluir controles internos y externos
 Consideramos controles internos a aquéllos que se corren simultáneamente en cada
prueba que se realiza. Generalmente son históricos y deben corresponder a sueros o
muestras cuyos resultados son positivos y a otros cuyos resultados deben ser
fehacientemente negativos. Antes de realizar la lectura de las muestras problemas debe
confirmarse que los resultados de los controles internos se encuentren dentro de los rangos
esperados; de no ser así la prueba debe descartarse y repetirse para obtener un resultado
confiable.

82
 Nos referimos a controles externos a aquéllos que son evaluados en otros
laboratorios, llamados “laboratorios de referencia”, que controlan y avalan nuestros
resultados.

Método de obtención del título en las técnicas semicuantitativas


Las técnicas semicuantitativas utilizan la dilución de la muestra a fin de evaluar los
niveles de anticuerpo presentes en ella.

DILUCIONES

Una dilución es una mezcla volumen/volumen en proporciones conocidas, formada


por una cierta cantidad de la sustancia que queremos diluir, o soluto (en el ejemplo, un
suero) más una cierta cantidad de diluyente (por ejemplo solución fisiológica o medio de
cultivo).
Puede expresarse como una fracción donde el numerador representa la unidad del soluto
(S) y el denominador la suma del soluto más el diluyente (D), o sea el total de la solución.
Por ejemplo
Dilución 1/2 (factor de dilución 2): 1 parte de S+1 parte de D
Dilución 1/5 (factor de dilución 5): 1 parte de S+4 parte de D
Dilución 1/8 (factor de dilución 8): 1 parte de S+7 parte de D
Dilución 1/10 (factor de dilución 10): 1 parte de S+9 parte de D

Las diluciones pueden expresarse también en forma logarítmica,


Así, por ejemplo:
- la dilución 1/2 (log 2= 0.3) se expresa como 10 -0,3
- la dilución 1/10 (log 10=1) se expresa como 10 -1

Como se ve, S está más diluido en la dilución 1/10 (10-1) que en 1/2 (10-0,3), es decir, que la
mayor de estas cuatro diluciones es 1/10.

Para preparar una dilución 1/3, por ejemplo, se pueden usar diferentes volúmenes
según el requerimiento de la técnica a usar:

- Dilución 1/3:1 parte de S + 2 partes de D.


- 0,3 ml de volumen final: 0,1 ml de S + 0,2 ml de D - (0,1/0,3 = 1/3)
- 1,5 ml de volumen final: 0,5 ml de S + 1,0 ml de D - (0,5/1,5 = 1/3)

Una dilución seriada es aquélla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto, de
forma tal que el factor de dilución se mantiene constante y la dilución anterior se utiliza
como fuente de soluto para la dilución siguiente.

Por ejemplo:

Dilución seriada en base 2. (Factor de dilución=2)

1/2 x2 1/4 x2 1/8 x2 1/16 x2 1/32 x2 1/64

(2=1+1) 1+1 1+1 1+1 1+1 1+1

83
Dilución seriada en base 10. (Factor de dilución =10)

1/10 x10 1/100 x10 1/1000 x10 1/10000

(10=1+9) 1+9 1+9 1+9

Si deseamos mantener el volumen constante, se descarta del último tubo la misma


cantidad que tomamos de cada uno de los tubos anteriores.

El título nos da una idea de los niveles de anticuerpo presentes en una muestra.
La principal aplicación de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos específicos
(frente un antígeno dado) presente en un suero u otra muestra biológica.
Para obtener el título de anticuerpos, por ejemplo, de un suero, se hace una dilución
seriada de dicho suero y a cada dilución se la enfrenta con una cantidad fija del antígeno.
La reacción observada entre antígeno y anticuerpo dependerá de la especificidad, de la
afinidad y de la técnica que se use.
Asi, el título de anticuerpos presentes en el suero (título del suero) será la inversa de la
mayor dilución en la que se observa reacción positiva.

En el siguiente ejemplo:
Dilución 1/2: reacción positiva
Dilución 1/4: reacción positiva

Dilución 1/8: reacción positiva


Dilución 1/16: reacción positiva

Dilución 1/32: reacción positiva


Dilución 1/64: reacción negativa

El título será la inversa de la dilución 1/32, es decir, 32.

Si la dilución 1/64 hubiese dado un resultado positivo, deberíamos haber seguido diluyendo
el suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el
título de un suero debemos llegar hasta la dilución límite o final de la reacción.
El nivel o título de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular presentes en el
suero de un individuo refleja la respuesta inmune humoral de ese individuo frente a ese
antígeno.

En medicina veterinaria, el análisis serológico poblacional se emplea en estudios


epidemiológicos, para establecer diagnósticos y para desarrollar y evaluar planes sanitarios
frente a distintas enfermedades.

CONVERSIÓN SEROLÓGICA O SEROCONVERSIÓN

Se dice que hay conversión serológica cuando el título de anticuerpos contra


determinado antígeno en un individuo aumenta en por lo menos dos diluciones seriadas
entre una primera y una segunda muestra de sangre obtenida esta última, por lo menos 15
a 20 días después de la primera. Una variación menor a 2 diluciones podría deberse sólo a
variaciones en el procedimiento, o sea al error experimental aceptado.
84
La seroconversión aporta datos referentes a la etapa de la infección en la que se encuentra
un individuo, sobre todo en enfermedades tales como toxoplasmosis o leptospirosis, en las
que el aumento del título de anticuerpos contra los respectivos microorganismos indica
enfermedad aguda.
Independientemente de la técnica utilizada para determinar el título podemos decir que
dado que la capacidad de respuesta es propia de cada individuo y está influenciada
genéticamente, sólo una comparación con valores propios (previos y posteriores) puede
determinar si ha aumentado o disminuido la respuesta frente al antígeno. Sin embargo para
algunas enfermedades infecciosas existen títulos orientativos de infección.

FUNDAMENTOS DE LAS TÉCNICAS SEROLÓGICAS

Las reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) pueden llevarse a cabo in vitro si se


respetan las condiciones fisiológicas en las que normalmente ocurren (pH, tonicidad,
temperatura) y pueden emplearse como una herramienta diagnóstica de rutina tanto en
laboratorios de investigación básica como en la clínica médica veterinaria.
La reacción Ag-Ac implica una unión de tipo no covalente, reversible entre ambas
moléculas. La forma complementaria de las nubes de electrones en el sitio de combinación
entre el anticuerpo (paratope) y el determinante antigénico (epitope) hace que las dos
moléculas encajen de manera ajustada, de modo que la distancia intermolecular se torna
muy pequeña y aumentan en grado considerable las fuerzas de interacción no covalentes
que participan en la unión. Cuando la complementariedad espacial no es la ideal, se
produce superposición de las nubes electrónicas y se generan fuerzas de repulsión que
determinan que la fuerza de unión (afinidad) sea diferente en distintos anticuerpos que
reconocen un mismo epitope.
La especificidad de la reacción antígeno–anticuerpo es de tal magnitud que el cambio
de un solo aminoácido de una proteína puede provocar que se anule el reconocimiento por
parte de un anticuerpo o al menos que varíe significativamente su afinidad por la proteína
modificada. En el campo de la investigación científica y el laboratorio de diagnóstico, la
especificidad de la reacción se puede emplear, por ejemplo, para diferenciar e identificar
virus, bacterias, glóbulos rojos (determinación de grupos sanguíneos) u otros antígenos en
diferentes muestras biológicas (sangre, suero, orina, tejidos, etc).
De acuerdo con el modo en que se evidencian, las técnicas inmunológicas pueden ser de
interacción primaria, secundaria o terciaria.

De Interacción PRIMARIA:
Ocurren en milisegundos y están determinadas por la afinidad del paratope del
anticuerpo por el epitope de un antígeno. La reacción no se puede reconocer a simple vista,
por lo tanto, para determinar si la misma tuvo lugar se emplean métodos en los que el
antígeno o el anticuerpo se marcan con una molécula que puede ser un radioisótopo (en la
prueba de RIA), una enzima (en las pruebas de ELISA, Inmunoblot e Inmunohistoquímica)
o un fluorocromo (en la Inmunofluorescencia o en la citometría de flujo). Estos métodos
transforman la reacción primaria en señales (radiactivas, colorimétricas o fluorescentes)
que pueden interpretarse y cuantificarse.

De Interacción SECUNDARIA:
Es la consecuencia de la unión antígeno-anticuerpo luego de ocurrida la reacción
primaria, determinada por las características del antígeno y del anticuerpo.
Para que estos fenómenos ocurran el antígeno debe ser polivalente (varios determinantes
antigénicos) y el anticuerpo debe actuar como divalente o polivalente, esta unión forma una

85
red o entramado en el que un anticuerpo está unido a por lo menos 2 partículas antigénicas
diferentes y cada partícula antigénica está unida a una o más moléculas de anticuerpo.
Estas reacciones pueden observarse a simple vista y según la solubilidad del antígeno
involucrado en la reacción (soluble o particulado) se los nombra como:

 PRECIPITACIÓN: SI EL ANTÍGENO ES SOLUBLE.


 AGLUTINACIÓN.SI EL ANTÍGENO ES PARTICULADO.

De lo que se desprende que la naturaleza del antígeno es la que define estas reacciones.
La proporción en las cantidades de antígenos y anticuerpos que interactúan definen la
estabilidad de estos complejos inmunes. El exceso de alguno de ellos puede evitar que la
interacción sea visible. La mejor proporción para que la reacción ocurra se la conoce como
zona de equivalencia.

De interacción TERCIARIA:
En los casos en que se utilice una consecuencia biológica de la unión antígeno
anticuerpo en otro sistema tanto in vivo como in vitro para revelar la formación del complejo
inmune, se habla de interacción terciaria. Como ejemplos podemos nombrar técnicas que
va a ser descritas en otros capítulos como la de Fijación del Complemento, la
seroneutralización y la inhibición de la hemaglutinación, entre otras.

Características de una prueba serológica


Existen requisitos mínimos para que las reacciones antígeno-anticuerpos se
produzcan y mantengan en el tiempo, que son de tipo cuantitativo, como la concentración
del anticuerpo y del antígeno, y cualitativo, como las propiedades de la clase de
inmunoglobulina comprometida en la reacción y las características del antígeno, además de
la concentración de sales y el pH del medio, o el tiempo y la temperatura de la reacción.

Las pruebas serológicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades infecciosas


El estado de enfermedad de un individuo se confirma por el aislamiento del agente
causal. Esta confirmación constituye el denominado estándar de oro o gold standard. En
enfermedades no infecciosas, el estándar de oro puede ser una biopsia u otro criterio que
permita diagnosticar inequívocamente la enfermedad.
Dado que no siempre es posible la identificación del agente etiológico, la detección de
anticuerpos específicos contra ese agente se puede emplear como herramienta para arribar
al diagnóstico.
Sin embargo, debemos considerar que la sola detección de anticuerpos específicos contra
un microorganismo no significa que el individuo esté o haya estado enfermo. Los
anticuerpos calostrales y los producidos por vacunaciones son reconocidos de la misma
manera que los producidos por el agente infeccioso.
No todas las pruebas serológicas tienen la misma capacidad para diferenciar los individuos
sanos de los infectados. Existen dos parámetros empleados generalmente para evaluar las
pruebas diagnósticas en general y las pruebas serológicas en particular: la sensibilidad y
la especificidad, que se obtienen al comparar los resultados obtenidos en la prueba
evaluada con los obtenidos con la prueba estándar de oro o de referencia.

 SENSIBILIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar a TODOS los animales


probadamente enfermos (verdaderos positivos).
 ESPECIFICIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO a los animales
probadamente enfermos (verdaderos positivos) y distinguir de aquéllos falsos

86
positivos. Dicho de otra manera, es la capacidad detectar como negativos a los
verdaderos negativos.

Cuando se desea calcular la sensibilidad y la especificidad de una Técnica Objeto de


Valoración, se comparan los resultados obtenidos entre esta y la Técnica de Referencia
(estándar de oro), o los datos de infección real probada.

Técnica de Referencia o
Infección Real

+ -
(enfermo) (sano)
Técnica Objeto + A B
de Valoración
- C D
S:A/A+C E:D/B+D

Los cálculos se realizan mediante las fórmulas:

SENSIBILIDAD = A / A+C

ESPECIFICIDAD = D / B+D

En las que:
(A) Positivos por ambas técnicas (Positivos Verdaderos).

(B) Positivos para la técnica objeto de valoración que en la prueba de oro arrojan
resultados negativos (Falsos Positivos).

(C) Negativos para la técnica objeto de valoración que en la prueba de oro arrojan
resultados positivos (Falsos Negativos).
(D) Negativos por ambas técnicas (Negativos Verdaderos)

Estos parámetros tienen importancia epidemiológica, como se aprecia en las


siguientes distribuciones de una población sana y una enferma.

87
El término sensibilidad posee otra acepción que se refiere al nivel de detección mínimo o
límite de detección de una técnica inmunológica. Este concepto se refiere a la cantidad
mínima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que éstos puedan ser detectados por
una determinada técnica.

En la tabla se ejemplifican los límites de detección de algunas técnicas inmunológicas.

Límite de detección
Técnica (mg/ml de Ac)
Concentración de
anticuerpos
necesarios para
que la técnica sea
positiva

RIA 0,0001

ELISA 0,0003

AGLUTINACIÓN 0,0300

INMUNOFLUORESCENCIA 0,5000

PRECIPITACIÓN (*) 1 - 4,0000

(*) Difusión doble en agar

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

Los inmunoanálisis radiométricos comprenden un conjunto de técnicas en las cuales


las moléculas utilizadas para detectar la reacción están marcadas radiactivamente.
Como guía general puede considerarse que la determinación de los antígenos se efectúa
con anticuerpos específicos marcados radiactivamente y que inversamente, la detección de
anticuerpos específicos se realiza con los correspondientes antígenos marcados.
88
Entre las ventajas que tiene esta técnica se encuentran:
 El alto límite de detección y
 la versatilidad para su utilización en pequeños volúmenes y en grandes series.

La desventaja más importante consiste en la manipulación de componentes radioactivos


que requieren de condiciones de bioseguridad estrictas tanto para la protección del
operador como del medio ambiente, por lo tanto se utilizan en casos puntuales en los que
las concentraciones del analito sean tan bajas que lo requieran. Por ejemplo, determinación
de hormonas o niveles de IgE séricas específicas. Dado que el RIA es una técnica que se
utiliza generalmente para medir sustancias que se encuentran en muy baja concentración,
los esquemas utilizados corresponden a la modalidad competitiva (ver descripción referente
a la técnica de ELISA).
Un ejemplo de la técnica es la determinación de TSH, ensayo que se realiza por el sistema
de inhibición competitiva de un antígeno marcado radiactivamente (trazador) a su
anticuerpo específico por parte del antígeno no marcado del paciente. El sistema descrito
puede esquematizarse como una interacción reversible combinada:

Ag* Ac-Ag*
Ac +

Ag Ac-Ag

Donde
Ac representa al anticuerpo específico;

Ag* es el antígeno marcado (trazador) libre;

Ag es el antígeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras


desconocidas; Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado, y

Ac-Ag es el complejo soluble con el antígeno no marcado.

La reacción obedece a la ley de acción de masas. El anticuerpo no discrimina entre


antígeno no marcado (frío) y antígeno marcado (trazador), de modo que cuanto mayor sea
la cantidad de antígeno frío presente, menor será la cantidad de trazador que se une al
anticuerpo.
Bajo este principio, se puede determinar la concentración de antígeno en muestras
complejas de fluidos biológicos con suficiente sensibilidad y especificidad, siempre que se
cumplan los siguientes requisitos:

 Que el trazador sea altamente radiactivo y por lo tanto pueda colocarse en


concentraciones infinitesimales.
 Que el anticuerpo sea altamente específico, posea muy alta afinidad y se halle en
muy baja concentración.
 Que el anticuerpo no reconozca con diferente afinidad el antígeno frío marcado

Ejemplos de aplicación de la técnica de RIA

RAST (RadioAlergoSorbent Test) o prueba de radialergoadsorción:


La batería de alérgenos que se desean analizar (dependiendo del medio ambiente
en el que viva el animal) se adsorbe a un soporte, se deja reaccionar con el suero del
89
paciente (IgE específica) y luego se agrega el reactivo marcado que es un Ac
(generalmente monoclonal) anti-IgE. La radiactividad detectada por el RIA será
directamente proporcional a la concentración de esa IgE.

PRIST (Paper RadioImmunoabSorbent Test) o prueba radioinmunoabsorbente en


papel:
Es usado para la cuantificación de niveles séricos de IgE. Se adsorbe un anticuerpo
anti-IgE de la especie a evaluar (caninos o equinos) al soporte inerte, se agrega el suero
del paciente, y luego de la incubación y el lavado se revela con la utilización de una anti-IgE
marcada radiactivamente. En esta técnica hay una relación directa entre la radiactividad
medida y la concentración de IgE.

Bibliografía

1- Margni, R. 1996 Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Panamericana.


2- Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
3- Roitt, I; Brostoff, J and Male, D. Immunology . Fifth Edition. Mosby International. LTD.
423 pp.
4- Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana. 1º edición,
septiembre de 1986.

INMUNOBLOT O WESTERN-BLOT

La transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis desde un


soporte gelificado a una membrana y su posterior identificación mediante sondas
marcadas, fue desarrollada por el Prof. Edwin Southern. En honor a su nombre, esta
técnica se denominó Southern-blot. En un juego de palabras, se denominó Northern-blot a
una prueba similar desarrollada para el estudio de ARN y Western-blot a la prueba que se
desarrolló para la identificación de proteínas. En este último caso, las proteínas se
identifican mediante anticuerpos específicos marcados con enzimas, por lo que la prueba
también puede llamarse “inmunoblot”.
El análisis de una muestra por la técnica de inmunoblot requiere de una primera etapa de
separación de los componentes de la muestra por peso molecular (PM) mediante una
electroforesis en geles de poliacriamida (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: PAGE) y una
segunda etapa de transferencia de esas proteínas ya separadas, a una membrana.
Para la transferencia, el gel de acrilamida se pone en contacto con una membrana de
nitrocelulosa, nylon o fluoruro de polivinilideno (PVDF) embebidos en una solución
tamponada de pH alto. La transferencia se acelera por la aplicación de una corriente
eléctrica; Las moléculas proteicas se movilizan y contactan con la membrana, a la que se
fijan fundamentalmente por interacciones de tipo hidrofóbico.
Las moléculas transferidas a la membrana se identifican posteriormente por interacciones
con anticuerpos específicos marcados, en general con enzimas.

Utilidades del Inmunoblot:


Mediante este método podemos identificar cuál o cuáles de las moléculas
componentes de una mezcla son reconocidas por un anticuerpo. La posibilidad de separar
los componentes biológicos de una muestra por peso molecular, sumado al reconocimiento
con anticuerpos, potencia la caracterización del antígeno.
Recuerden que los antígenos evaluados con esta metodología, si utilizamos como método
de separación previo el SDS-PAGE, se encuentran desnaturalizados (por acción del beta-
90
mercaptoetanol y del SDS sobre la muestra), por lo tanto estamos identificando antígenos
de tipo secuenciales y no conformacionales.
Otra aplicación podría ser la de evaluar la monoespecificidad de un anticuerpo como en el
caso de los anticuerpos monoclonales para lo cual se realiza el PAGE de un antígeno
complejo y la transferencia a una membrana. Cuando se hace interaccionar el anticuerpo
monoclonal con la membrana, se espera que este reconozca un único componente del
antígeno.
En líneas generales, los pasos a seguir son similares a los de la prueba de ELISA, sólo que
el antígeno en lugar de estar pegado a la placa ha sido sometido a la separación por peso
molecular y adsorbido a un papel de nitrocelulosa. Así:
 Preparación de las muestras a analizar y realización del SDS-
PAGE
 Transferencia del gel obtenido a una membrana.
 Bloqueo de los sitios libres de la membrana con una mezcla de proteínas
irrelevantes para el análisis.
 Identificación de los componentes de la muestra (o alguno de ellos) sobre la
membrana, mediante un anticuerpo primario o la Identificación de la respuesta
inmune humoral de un individuo, mediante la utilización de un anticuerpo específico
para la especie que fue origen del anticuerpo específico, conjugado con una enzima
(anticuerpo secundario)
 Revelado de la unión del Ac secundario, mediante el uso de un sustrato enzimático
y un cromógeno que precipite en el papel o que pueda ser revelado sobre una placa
fotográfica (auto-radiografía).
 Análisis e interpretación de los resultados.
Luego de la electrotransferencia, las membranas y los geles pueden teñirse para
determinar la eficiencia de la transferencia. Las membranas teñidas muestran la
complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarán todas las bandas de
proteínas que conforman cada muestra. Los colorantes más usados son azul Coomassie
para los geles, y Ponceau S o negro de Amido para las membranas.
El revelado de la electrotransferencia con un sustrato y un cromógeno para inmunoblot,
permite observar un número de bandas variable, que depende de las distintas proteínas
que componen la mezcla que sean reconocidas por el anticuerpo primario. La proteína se
identifica entonces por la especificidad del anticuerpo primario utilizado, y por el PM que se
deduce por la comparación con una mezcla estándar de proteínas de PM conocidos.

Anexo

A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un inmunoblot


utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios
Bio-Rad).

Materiales necesarios:

Guantes libres de talco


2 Esponjas finas tipo Scotch Brite
2 hojas de papel Whatman 3MM o
equivalente Membrana de nitrocelulosa
Aparato de electrotransferencia
Lapicera o lápiz de grafito, que permita marcar la membrana aunque esté humedecida.

91
1. Cuando la electroforesis ha concluido (ver SDS-PAGE), se desarma la cuba y se retiran
los geles. Se pueden equilibrar 30 minutos a temperatura ambiente en buffer de
transferencia. Esto previene el cambio de tamaño del gel durante la transferencia y
elimina el exceso de SDS que puede interferir en ella.
2. El armado del soporte lleva una secuencia de componentes que se realiza en un
contenedor lo suficientemente grande para que quepa el soporte abierto. Se llena el
contenedor con buffer para que el soporte de transferencia quede cubierto y evitar en lo
posible la formación de burbujas de aire.
3. Sobre la base negra de una mitad del soporte, se coloca la esponja, seguida por un
papel de filtro Whatman. Ambos deben ser del mismo tamaño que el gel y deben estar
embebidos en buffer de transferencia.
4. Se coloca el gel sobre el papel Whatman. Se quita cualquier burbuja de aire que haya
quedado entre el gel y el papel, utilizando una pipeta de vidrio a modo de palo de
amasar. Si quedan burbujas de aire, estas se observarán posteriormente como
manchas blanquecinas en las membranas, puesto que el aire interfiere con la
transferencia.
5. Se corta la membrana a transferir unos milímetros más grandes que los bordes del gel y
se la equilibra durante 10 a 15 minutos sumergida en el buffer de transferencia.
6. Se humedece la superficie del gel y se coloca la membrana sobre su superficie. Se
deben eliminar las burbujas de aire como en el paso 4. Se debe evitar levantar y re-
posicionar la membrana sobre el gel, ya que algunas proteínas comienzan a transferirse
tan pronto como el gel toma contacto con la membrana.
7. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se
completa el armado cerrando el soporte de transferencia.
8. Se colocan los dos soportes armados en la cuba “ad hoc”. Se debe tener la precaución
de controlar los códigos de colores que indican los electrodos. Como las proteínas están
cargadas negativamente porque están recubiertas con SDS, se mueven hacia el ánodo
(+: base roja).
9. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de
transferencia. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana, con el
objetivo de que ésta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja.
10. La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en
la cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitación refrigerada y con agitación del
buffer.
11. Cuando el tiempo se ha cumplido, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se
desarma el aparato. Los geles pueden ser teñidos con azul de Coomassie para
determinar la eficiencia de la transferencia. Si se utilizó un marcador de peso molecular
preteñido, éste se puede utilizar como control de la transferencia.
12. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego
determinar la identidad de la muestra.

En este procedimiento se logra tener las muestras (antígenos) adheridas a la membrana


y en una posición conocida y determinada por su PM.

Detección por anticuerpos de los antígenos trasferidos a una membrana


1. Una vez retirada del aparato de transferencia, la membrana se coloca en un recipiente
limpio, preferentemente de vidrio o polipropileno, o en una bolsa de nylon con cierre
hermético.
2. La membrana se bloquea con 10% de leche descremada en PBS (solución de bloqueo),
durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 16 horas a 4 C en agitación

92
constante. El objetivo del bloqueo es llenar todos los sitios libres con proteína no
reactiva.
3. La membrana se lava 4 veces con una solución de tween 20 al 0,1% en PBS (solución
de lavado) durante 10 a 15 minutos por vez, a temperatura ambiente en agitación
constante.
4. El anticuerpo primario, es decir, el anticuerpo específico para el antígeno que se quiere
detectar, se diluye en la solución de bloqueo.
5. La membrana se incuba con el anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura
ambiente en agitación constante.
6. La membrana se lava 4 veces con solución de lavado durante 10 a 15 minutos por vez,
a temperatura ambiente en agitación constante.
7. El anticuerpo secundario, es decir, conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa, se
diluye en la solución de bloqueo.
8. La membrana se incuba con el conjugado durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente
en agitación constante.
9. Se lava la membrana igual que en el punto 3.
10. El revelado se realiza dependiendo del substrato que corresponda según la enzima
utilizada. Si el anticuerpo usado está conjugado con peroxidasa, se debe agregar H2O2
como substrato y un cromógeno que cambia de color al oxidarse y precipita sobre la
membrana, como el TMB (3,3¨, 5,5¨ tetramethylbenzidine). En el caso de usar un
anticuerpo conjugado con fosfatasa, se puede usar BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-
phosphate toluidine salt) como substrato y NBT (nitroblue tetrazolium chlooride) como
cromógeno, además se pueden usar placas radiográficas.

Las bandas donde hubo reacción antígeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitación
del cromógeno sobre la membrana; el fondo del papel donde no ocurrió la unión se observa
blanca. Cuando la imagen es óptima, la reacción se frena lavando la membrana con agua
destilada. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar el
resultado mediante un scanner o una cámara fotográfica.
El poro de la membrana puede ser de 0,45 m cuando se requiere retener proteínas, pero
algunos polipétidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. En estos casos se
puede recurrir al uso de membranas de poro más pequeño, por ejemplo, de 0,1 m.
Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unión de 80 g de proteína por
cm2 de superficie. Otras membranas, como las catiónicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad),
son más resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilización se obtiene una
capacidad de unión de proteínas de hasta 500 µg/cm2. Esta característica es ventajosa,
pero por otro lado puede ser una desventaja, ya que hace que las membranas sean difíciles
de lavar y producen imágenes con mucha coloración de fondo.

INMUNOCROMATOGRAFÍA

La inmunocromatografía es una técnica inmunológica que permite visualizar la


reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación de oro coloidal en zonas específicas del
papel de nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos o antígenos de captura.
El complejo < oro coloidal – antígeno> migra sobre el papel de nitrocelulosa para
reaccionar específicamente con los anticuerpos inmovilizados en el papel, dando bandas
coloreadas. El papel de nitrocelulosa permite la migración por capilaridad de líquidos y
solutos y a la vez conserva activos los anticuerpos fijados.
El uso de anticuerpos conjugados con oro coloidal en las técnicas de diagnóstico rápido
permiten la detección de antígenos en muestras biológicas, siendo el objetivo principal de
estas técnicas alcanzar la señal específica más intensa con una mínima o nula reacción
93
inespecífica En la actualidad, esta técnica se viene utilizando para el diagnóstico rápido de
varias enfermedades, a través de la detección de antígenos en diversos líquidos biológicos,
tales como en infecciones por Streptococcus beta-hemolítico, Chlamydia, virus de la
hepatitis, malaria, virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (VIF,
VILEF) y parvovirus canino en Veterinaria.

El papel de nitrocelulosa con los anticuerpos de captura se incorporan a un casete de


plástico y al agregar el fluido biológico sospechoso como suero u orina este migra a través
del papel por cromatografía y reacciona específicamente o no en los sitios
correspondientes a los anticuerpos. Esta reacción se visualiza a través del depósito
localizado del Ac secundario marcado con oro coloidal.

Bibliografía

1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
2. Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual. Bio-Rad
3. Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed.
Interamericana.
4. Millipore A. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en
línea). 2nd edition; 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). URL disponible en:
http://www.com/oemproducts.
5. Engler KH, Efstratiou A, Norn D, Koslov RS, Selga I, Glushkevich TG, et al.
Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description
and multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. J Clin
Microbiol 2002; 4(l): 80-3.

TÉCNICAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA: PRECIPITACIÓN Y AGLUTINACIÓN

Las reacciones secundarias pueden observarse a simple vista y reciben diferente


nombre según el antígeno involucrado en la reacción sea soluble o particulado.
Si el antígeno es soluble, hablamos de una reacción de precipitación.
Si el antígeno es particulado, hablamos de una reacción de aglutinación.

94
1. PRECIPITACIÓN
Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antígeno polivalente
soluble (proteínas, virus) contra el cual el Ac es específico, se forman complejos Antígeno-
Anticuerpo (Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reacción de precipitación.
La precipitación se produce en dos etapas.

 En la etapa inicial, que se desarrolla rápidamente, es específica y muy poco influida


por la temperatura y la concentración de electrolitos. En ella se forman los
complejos Ag-Ac primarios.
 En una segunda etapa, a medida que el tiempo transcurre, esos complejos Ag-Ac
iniciales se agregan y originan micelas de diferentes tamaños. Cuando las micelas
crecen por encima de cierta masa crítica, se tornan insolubles y precipitan
espontáneamente. Las micelas precipitadas tienden a sedimentar por acción de la
gravedad y la velocidad de sedimentación del precipitado es proporcional al
volumen de las partículas y a las densidades de las partículas e inversamente
proporcional a la densidad del solvente. La temperatura acelera esta segunda
etapa, que es además electrolito–dependiente. Esta segunda etapa es más lenta
que la inicial, puede durar minutos e incluso horas para que se complete.

En los agregados de complejos Ag-Ac, cada molécula de antígeno está unida a más de una
molécula de anticuerpo y cada molécula de anticuerpo está unida a más de una molécula
de antígeno.
 Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antígenos
que poseen un solo determinante antigénico por molécula, la precipitación no se
produce.
 Los anticuerpos monoclonales, generalmente no muestran actividad precipitante.
Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos monoclonales
reconocen a un único epitope no repetido, lo que les impide formar agregados
(micelas) aunque el antígeno sea una macromolécula (figura 1).
 Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con
estas mismas macromoléculas la precipitación sí tiene lugar, pues en estos sueros
hay una mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo
antígeno, lo que posibilita la formación de complejos mixtos de Ag-Ac.

La formación de estos complejos ha sido explicada mediante la teoría del enrejado:


Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antígeno, las posibilidades de
combinación varían según sea que en la mezcla exista exceso de antígeno, exceso de
anticuerpo o equivalencia de ambos (figura 2). El precipitado se forma en la zona de
equivalencia de ambos componentes del complejo

Figura 1

95
Figura 2

La capacidad de producir una reacción de precipitación es una propiedad de la mayor


parte de los anticuerpos (a los que originalmente se llamó anticuerpos precipitantes).
Existen anticuerpos no precipitantes, llamados coprecipitantes, que pertenecen a la clase
IgG.

Los anticuerpos coprecipitantes carecen de la capacidad para precipitar el antígeno, no


activan el complemento y su poder protector es diferente al de los anticuerpos
precipitantes.

- Se ha demostrado que en los anticuerpos coprecipitantes hay un resto glucídico del tipo
“rico en manosa”, que puede ser removido mediante el empleo de enzimas. Cuando esto
ocurre, los anticuerpos coprecipitantes se convierten en precipitantes.

- La glicosilación afecta a uno solo de los fragmentos Fab y es la responsable del particular
comportamiento inmunoquímico y biológico de estos anticuerpos, convirtiendo al anticuerpo
en monovalente.

- El comportamiento biológico de los anticuerpos coprecipitantes de tipo IgG, podrá resultar


beneficioso o perjudicial para el huésped según el carácter propio o no propio de los
antígenos involucrados y de la situación particular en la que actúan los anticuerpos.

- Cuando un animal es inoculado a repetición, los anticuerpos coprecipitantes constituyen


del 10 % al 15% de la población total y están presentes a lo largo de toda la respuesta
inmune.

- La relación de IgG simétrico / asimétrico varía según el antígeno sea soluble o


particulado. Cuando el antígeno se encuentra en solución, esta relación en general es de
90 / 10, mientras que, cuando el antígeno es particulado esta relación se invierte y puede
llegar hasta 30 / 70.

- Se ha demostrado que en infecciones microbianas o parasitarias crónicas como


brucelosis o tripanosomiasis, estos anticuerpos se producen en gran cantidad y se fijan
firmemente al agente patógeno, pero no son protectores frente a la infección. Se especula
que los anticuerpos asimétricos serían capaces de bloquear antígenos o epitopes,
96
disminuyendo su concentración y como consecuencia, interviniendo en la tolerancia de baja
dosis.

- Durante la preñez hay un aumento de moléculas IgG asimétricas específicas contra


antígenos paternos. Esto, sumado al efecto bloqueante de los anticuerpos asimétricos,
sugiere que estos anticuerpos con especificidad para los antígenos de origen paterno
deben participar en la protección del feto en el útero materno.

Los anticuerpos asimétricos deben ser tenidos en cuenta en la interpretación de los


resultados de las pruebas de diagnóstico. Las pruebas que se basan en reacciones de
interacción primaria (como ELISA o IFI) miden todos los anticuerpos específicos presentes
en la muestra. Por el contrario, las pruebas que se basan en reacciones de interacción
secundaria (como precipitación, aglutinación y fijación de complemento), sólo detectan
anticuerpos funcionalmente bivalentes o polivalentes (no así los anticuerpos
monovalentes).

Las proporciones relativas de anticuerpos simétricos / asimétricos presentes en los sueros


hacen que cada prueba deba interpretarse de manera diferente, dado que una misma
muestra arrojará diferentes títulos de anticuerpos dependiendo de la técnica utilizada para
su evaluación. Estas diferencias deben tenerse en cuenta cuando se realizan estudios de
respuesta inmune humoral, correlaciones entre nivel de anticuerpos y evolución de un
proceso infeccioso o grado de protección contra el antígeno en estudio.

Según sea el medio en que se realice la prueba, la precipitación puede ser en medios
líquidos o en medios con geles.

1.a. Precipitación en medios


líquidos
Precipitación cualitativa
Si una muestra biológica sospechosa de contener un antígeno en particular se
mezcla con igual volumen de una solución que contiene los anticuerpos específicos
(antisuero) y se observa turbidez del medio de reacción, significa que la reacción Ag-Ac
tuvo lugar. La turbidez que se observa se debe a la precipitación de los complejos inmunes
formados entre el anticuerpo específico presente en el suero y el antígeno presente en la
muestra. La reacción es cualitativa, ya que sólo indica la presencia del antígeno en estudio,
pero no aporta datos sobre su concentración.

El “Método del anillo”, se basa en la reacción que se produce en la interfase entre dos
sustancias cuando en una serie de pequeños tubos se colocan sucesivamente y evitando
que se mezclen.

ASPECTOS METODOLÓGICOS:
 Se coloca en una serie de tubos 0,2 ml del suero con Ac específicos para el
antígeno en estudio

 Se añade luego por las paredes 0,2 ml de la muestra sospechosa de contener el


antígeno, en diluciones seriadas.
 Se deja en baño de María a 37 ºC durante una hora y se observa si en alguno de
los tubos aparece un precipitado anular blanco que indica reacción positiva en ese
tubo, es decir correspondencia entre Ag y Ac específicos que producen el enrejado
en el tubo que contiene las concentraciones óptimas de ambos reactantes.
97
1.b. Precipitación en medios con geles

Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles. Empleando


soportes adecuados, como agar disuelto en soluciones salinas, es posible que los
antígenos y anticuerpos migren o difundan y que al encontrarse interaccionen. En estos
casos, los precipitados que se originan se visualizan como nítidas bandas de precipitación.
Se han descrito numerosas técnicas cualitativas, semicuantiativas y cuantitativas entre las
que pueden citarse la difusión simple, la difusión doble y la difusión radial.
Difusión simple en tubo
Este método es conocido también como técnica de Oudín simple. Consiste en colocar en
un tubo de ensayo pequeño agar fundido (solución al 1%) mezclado con un volumen igual
del antisuero. Producida la solidificación, se añade la solución de antígeno. El antígeno
difunde a través del gel y crea un gradiente de concentración. En la interfase líquido-gel no
se forma precipitado debido a la alta concentración antigénica en esta zona. La
precipitación aparece en forma de bandas en la zona donde la concentración del antígeno
que ha difundido es la óptima. Si en el suero hay más de un anticuerpo y en la solución
añadida hay más de un antígeno que se correspondan, se formarán tantas bandas de
precipitación como sistemas hayan interaccionado.
Difusión bidireccional
En este caso ambos reactivos (antígeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sin
reactivos) por diferencias de concentración y forman el enrejado (precipitación visible) en la
zona en la cual se encuentran la mayor concentración de complejos inmune asociados.

ASPECTOS MÉTODOLÓGICOS:

 Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 ºC) y el


antisuero con especificidad contra el antígeno en estudio.
 Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reacción, y enfriarlo rápidamente para
que solidifique.
 Inmediatamente después, añadir 0,5 ml de agar al 0,5% fundido y enfriado a
50 ºC.
 Una vez solidificado, agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar
al 1% y antígeno. Después de la solidificación, dejar los tubos a temperatura
ambiente durante 24 a 48 horas convenientemente tapados para evitar
evaporaciones.
 Proceder a la lectura de los resultados. Los anticuerpos y las partículas
antigénicas difunden desde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0,5%. En
el punto de encuentro se forma la banda de precipitado.

Difusión simple en placa, Inmunodifusión radial o técnica de Mancini


Este método ha dado magníficos resultados para la cuantificación de antígenos.
Cuando un antígeno es colocado en un orificio practicado en una placa de agar, éste
difunde en forma radial. Si en la matriz del agar hay anticuerpos monoespecíficos, el
antígeno que difunde formará complejos inmunes con los anticuerpos disueltos en el agar.
Esta reacción se observa como un halo de precipitación.

De acuerdo a los principios básicos de la difusión, el diámetro del halo de precipitación


estará en relación directa con la concentración de antígeno. Si esta operación se repite
colocando en diferentes orificios de la placa cantidades variables y conocidas del antígeno
98
en estudio (por ejemplo, diluciones en base 2) y se incuba hasta que el halo de
precipitación no se modifique, se puede confeccionar una recta con los resultados
obtenidos, en la que se relaciona el diámetro de cada círculo de precipitación (X) con la
correspondiente concentración antigénica (Y). Esta recta permite calcular la concentración
de ese mismo antígeno en cualquier muestra desconocida, estableciendo el diámetro del
halo de precipitación de la muestra problema. La concentración de la muestra podrá
determinarse luego por simple cálculo o por interpolación a partir de la curva de calibración.
La difusión radial se utiliza con muy buenos resultados para la valoración de proteínas que
se encuentran presentes en mezclas complejas como por ejemplo los componentes del
suero.
Es indispensable disponer para ello de anticuerpos específicos contra cada uno de los
antígenos que se quiere valorar y patrones cuantificados del antígeno a valorar.

APECTOS MÉTODOLÓGICOS:

 Añadir 5-10 % del suero específico (que contiene los anticuerpos) al agar fundido y
enfriado a 50ºC procurando que la mezcla sea lo más homogénea posible.
 Cubrir inmediatamente la placa con la mezcla anterior y dejar en reposo hasta su
solidificación.
 Mediante un sacabocados, efectuar sobre el gel una serie de orificios, los que
deben estar situados a distancias convenientes entre sí para evitar interferencias.
(Se necesita un orificio para cada muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para
las distintas concentraciones del antígeno patrón que se utilizan para la
elaboración de la recta de calibración).
 En uno de los orificios de la placa, colocar 2 microlitros de la solución antigénica a
valorar (muestra problema), o una dilución conveniente de esta solución.
 En los orificios restantes, colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del
antígeno patrón de concentración conocida.
 Mantener las placas a temperatura ambiente, en cámara húmeda, hasta que el halo
de precipitación no varíe.
 Evaluar los resultados mediante la determinación del diámetro de los halos de
precipitación. Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o después de
lavar las placas (Ver método más adelante).

Difusión doble en placa, Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony


Ouchterlony describió un método interesante de difusión doble en placas, el cual
consiste en enfrentar las soluciones de antígeno y anticuerpo en perforaciones efectuadas
en el gel (agar) a distancias convenientes.
De esta manera, ambos difunden a través del agar, se ponen en contacto y producen una
banda de precipitación cuando las respectivas concentraciones están en relación óptima.
- Si las concentraciones de Ag y Ac colocados en los reservorios son las que corresponden
a la zona de equivalencia, la banda de precipitación se forma aproximadamente en la
distancia media que separa esos reservorios.
- Cuando hay exceso de antígeno, la banda de precipitación se forma próxima al reservorio
del anticuerpo
- Cuando hay exceso de anticuerpo, la banda de precipitación se forma próxima al
reservorio del antígeno.

Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de
los antígenos y anticuerpos reaccionantes, cuando se trabaja con concentraciones óptimas
de Ag y Ac.
99
- Si la banda de precipitación formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos
son muy próximos.
- Si la banda es cóncava con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso
molecular de éste es superior al del anticuerpo.
- Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso
molecular de éste es menor que el del anticuerpo

Los dos fenómenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusión,
que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con
su concentración y en relación inversa con su peso molecular.

Dependiendo de la cantidad de muestras a analizar o del tipo de estudio a realizar, se


emplean distintos esquemas reactivos, como por ejemplo:

1) 2) 3) 4)

Esta metodología permite determinar si hay más de un sistema reaccionando en forma


simultánea, pues cada uno de ellos dará una banda de precipitación específica. Además,
nos permite identificar reacciones cruzadas, pues en estos casos habrá fusión de bandas.
Originalmente Ouchterlony describió tres tipos de reacciones: de identidad, no-identidad e
identidad parcial. Estas reacciones se esquematizan en la figura 3 para el caso hipotético
de tres antígenos (a, b, ab) y dos anticuerpos (A: anti-a, AB: anti-a y anti-b).

Figura 3

-En el caso I, los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una única
banda de precipitación (reacción de identidad).
- En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y
cada uno produce una banda de precipitación que se cruzan (reacción de no-identidad)
evidenciando la presencia de reacciones Ag.-Ac diferentes.
- En el caso III, uno de los antígenos tiene un epitope que no existe en el otro. Por lo
tanto ambas bandas de precipitación se unen y funden parcialmente en una banda,
100
apareciendo una prolongación o espolón en la banda correspondiente al antígeno que
contiene los dos epitopes. Este espolón indica que en este antígeno “ab” hay
componentes antigénicos no compartidos con el antígeno “b” (reacción de identidad
parcial).
La difusión doble en placa es un excelente método para el estudio de la homogeneidad de
antígenos y anticuerpos purificados. Resulta muy útil también para la búsqueda de
impurezas, lo que está limitado por la concentración en que éstas se encuentren presentes,
ya que la precipitación se hace visible cuando los reactivos exceden valores mínimos. Para
obviar este inconveniente, se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac, lo
que permite aumentar la concentración de las impurezas y asegurar su precipitación.
La inmunodifusión doble es utilizada ampliamente en el diagnóstico serológico de varias
enfermedades en Medicina Veterinaria, por ejemplo para el diagnóstico serológico de la
Anemia Infecciosa Equina, método denominado “Test de Coggins” (figura 4). En esta
prueba, en una perforación central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia
infecciosa equina y en seis perforaciones equidistantes del antígeno y entre sí, se
intercalan sueros de animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que
se desea investigar (sueros problema: S1, S2 y S3).

- Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitación de los dos sueros
positivos adyacentes se introducen en la perforación.
- Si el suero problema es positivo (S2), se forma una banda de precipitación entre el suero
problema y el antígeno que se fusiona con las bandas de precipitación de los dos sueros
positivos adyacentes (reacción de identidad).
- Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa,
el suero problema es considerado positivo débil (S1).
En cualquiera de estos dos últimos casos el animal se considera infectado.
Este esquema también se emplea para el diagnóstico serológico de otras enfermedades
como Fiebre Aftosa en bovinos, Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella
ovis) o la Enfermedad de Marek en aves.

Figura 4

Ag: antígeno
S1
+: suero control
positivo
+ +
S 1: suero positivo
Ag débil
S3 S2 S 2: suero positivo
+
S3: suero negativo

APECTOS MÉTODOLÓGICOS:

 En una placa de Petri o un portabojetos se vierte el agar fundido y enfriado a 50ºC.


Se deja solidificar y se confeccionan los orificios con un sacabocados.
 Para las pruebas diagnósticas de rutina en Medicina Veterinaria, se coloca el
antígeno en el orificio central y en los orificios exteriores se intercalan el suero
control positivo y cada uno de los distintos sueros problema.

101
 Las placas o portaobjetos se mantienen en cámara húmeda. La lectura de los
resultados se efectúa a las 48 - 72 horas.
Si interesa conservar los resultados, el agar puede colorearse, previa desecación.
- En este caso, el agar debe lavarse previamente por inmersión en solución salina durante
un total de 24 a 48 horas, efectuando el recambio de la solución salina cada 12 horas.
Este lavado es necesario para eliminar las proteínas no precipitadas.
- Luego del lavado, el agar se cubre con un trozo de papel de filtro húmedo y se deja
secar a temperatura ambiente.
- Una vez seco, se retira el papel y se lo sumerge en la solución colorante Azul de
Coomasie durante aproximadamente 1½ hora. El exceso de colorante se elimina por
inmersión en solución decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 ºC.

2. AGLUTINACIÓN
Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antígeno para
el cual es específico, si este antígeno es polivalente y se encuentra en estado particulado
(hematíes, bacterias, células), se forman complejos Ag - Ac que dan lugar a una reacción
de aglutinación.
Esta reacción puede observarse micro o macroscópicamente como agregados o grumos de
número y tamaño variable.
Los principios que regulan la aglutinación son los mismos que regulan la precipitación; la
ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de que el antígeno sea particulado (se
encuentre en suspensión) o soluble (en solución).
La aglutinación se lleva a cabo en medio salino. La concentración óptima de electrolitos es
de 0,15 M. Se cree que el mecanismo de aglutinación se debe a que los iones neutralizan
en parte las cargas superficiales de las partículas antigénicas, evitando el rechazo entre
ellas y asegurando la aproximación indispensable para que una molécula de anticuerpo
reaccione con al menos dos partículas antigénicas. De esta manera se inicia la formación
de los complejos inmunes que llevan a la aglutinación.

2.a. Aglutinación cualitativa


Los métodos de aglutinación cualitativa son muy utilizados en serología diagnóstica
con el objeto de identificar bacterias, tipificar grupos sanguíneos, etc. En estos casos es
indispensable disponer de anticuerpos monoespecíficos.
Estas reacciones se efectúan en portaobjetos mezclando las suspensiones de bacterias o
hematíes a identificar, con una batería de anticuerpos con diferente especificidad. La
presencia de aglutinación indica la especificidad del sistema reaccionante.

APECTOS MÉTODOLÓGICOS:

 Se suspende el cultivo microbiano en estudio en solución salina, procurando que la


suspensión sea lo más densa posible (no menos de 2 x 1010 bacterias/ ml).
 En un portaobjetos se coloca una gota de cada uno de los anticuerpos específicos
(por ejemplo, suero anti Escherichia coli K88, suero anti E. coli K99 y suero anti E.
coli F41) y otra de solución salina (control negativo), de modo que estén a una
distancia tal que se evite su mezcla accidental.
 A cada una de estas gotas, se añade un volumen igual de la suspensión bacteriana
y se mezcla para homogeneizar. El portaobjetos se agita suavemente por rotación
manual.
 Se incuba durante unos minutos a temperatura ambiente y se observa. La aparición
de grumos o agregados en alguna de las mezclas indica la identidad de la bacteria

102
en estudio. Estos grumos son de tamaño variable. A veces son visibles a simple
vista pero otras veces es necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos.

2.b. Aglutinación semicuantitativa:

Los métodos semicuantitativos consisten en determinar cuál es la máxima dilución


del suero analizado que es capaz de producir aglutinación. Las diluciones se hacen
generalmente en base dos y el título se expresa por la inversa de la máxima dilución
aglutinante. Por ejemplo, si la dilución 1/1024 aglutina y no lo hace la dilución 1/2048, el
título será 1024. Los valores obtenidos son groseros y pueden aproximarse efectuando
diluciones intermedias.
El estudio de la cinética del título de anticuerpos específicos permite seguir la evolución de
una infección bacteriana o de una iso-sensibilización, por ejemplo, por antígenos
hemáticos.
La determinación de anticuerpos por aglutinación puede hacerse mediante reacciones de
lectura lenta o rápida.
En el primer caso (lectura lenta) se emplean suspensiones diluidas y estandarizadas de un
antígeno, que se mezclan con volúmenes iguales de diferentes diluciones del suero a
valorar, empleando como diluyente una solución salina. Antígeno y anticuerpo se incuban
en tubos de ensayo a 37ºC durante tiempo variable según el estudio. El título se determina
buscando cuál es el tubo con la máxima dilución del suero que presenta aglutinación.
Tal es el caso de la prueba de Wright para el diagnóstico de brucelosis y de la prueba de
Microaglutinación de Martin y Petit para el diagnóstico de leptospirosis
En la prueba de Wright la reacción se realiza en tubos, en los que se enfrentan diluciones
1/25, 1/50, 1/100 y 1/200 del suero problema con una cantidad estandarizada de bacterias
(Brucella abortus cepa 19).
Las mezclas (de aspecto turbio blanquecino debido a las células bacterianas) se incuban a
37ºC durante 48 horas y luego se observan con luz tangencial sobre fondo oscuro.
La aglutinación se manifiesta como formación de grumos grandes que sedimentan en el
fondo del tubo. Paralelamente se observa la clarificación del medio líquido, dado que las
bacterias que le daban turbidez se encuentran en los grumos.

La aglutinación rápida es muy usada en serología diagnóstica. Por ejemplo para el


diagnóstico de brucelosis (por Brucella abortus, mellitensis y suis) se emplea la Reacción
de B.P.A. (Buffered Plate Antigen). En este caso, la reacción se efectúa en placas de
vidrio. El antígeno que se emplea está 20 veces más concentrado que el usado en la
aglutinación lenta y la lectura de los resultados se hace a los 8 minutos.
En la práctica diaria el uso de las pruebas de aglutinación se encuentra muy estandarizado,
al punto que son las pruebas oficiales para el diagnóstico de la brucelosis bovina. El “Plan
Nacional de Erradicación de la Brucelosis Bovina” se basa en la vacunación obligatoria de
las terneras entre los 3 y 8 meses de edad y en la posterior identificación y segregación de
los animales infectados. La identificación de los animales infectados se realiza a través de
la detección de anticuerpos específicos contra Brucella abortus.
En el caso particular de la cepa 19 de B. Abortus, la vacunación desencadena en el
animal una respuesta inmune primaria, con niveles de IgM que se mantienen en el tiempo y
niveles bajos de anticuerpos de tipo IgG. Las técnicas serológicas de aglutinación rápida y
lenta se emplean para diferenciar los animales que presentan anticuerpos de tipo IgM a
consecuencia de la vacunación de aquellos que presentan anticuerpos de tipo IgG
inducidos por una infección activa con la cepa de campo.

103
Los sueros problema son analizados por la prueba de B.P.A, que permite la identificación
de los animales que presentan anticuerpos específicos contra Brucella abortus. Esta
prueba es muy sensible pero poco específica y además no permite discriminar si los
anticuerpos que reaccionan son de tipo IgG o IgM. Por lo tanto, las muestras que resultan
positivas a B.P.A. son analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-
mercaptoetanol. En ambos casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con
una suspensión estandarizada de Brucella abortus cepa 19. Los sueros son tratados
previamente con una solución de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM, por lo
que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante. De esta manera, si se observa
aglutinación aún en los tubos tratados con 2-ME, significa que la aglutinación es debida a la
presencia de anticuerpos de tipo IgG. Los animales que resultan positivos a esta prueba
son considerados como infectados y deben ser segregados del rodeo.

Otra aplicación de la técnica de aglutinación es la determinación cualitativa y cuantitativa


de anticuerpos antitoxoplasma.

ASPECTOS METODOLÓGICOS:
 Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo número 1 de una placa de
microaglutinación con pocillos de fondo cónico.
 Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo número 2
al número 8.
 Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor, descartar el excedente
del pocillo número 8).
 Colocar una gota de antígeno de toxoplasma comercial en todos los pocillos.
 Agitar las placas enérgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se
derrame el contenido de los pocillos.
 Colocar un film plástico a fin de evitar la desecación e incubar 24 horas a
temperatura ambiente.

La lectura se facilita si se efectúa sobre un fondo oscuro o mediante iluminación oblicua. La


ausencia de aglutinación se traduce por la aparición de un pequeño botón netamente
destacado. En caso de aglutinación positiva, se observa un tapiz homogéneo de células o
un botón de mayor tamaño que el anterior y con contornos irregulares.
El título del suero corresponde a la dilución más elevada que muestre una aglutinación total
o parcial del pocillo. En este último caso, el diámetro del tapiz debe ser superior a la mitad
del diámetro del pocillo. El control del antígeno debe ser totalmente negativo.
También en este caso, para diferenciar si el anticuerpo que actúa es de isotipo IgM o IgG
se utiliza la prueba del 2-ME.
Los valores límite de esta técnica son 1/128 para el perro y 1/256 para el gato.

2.c. Aglutinación pasiva

Los anticuerpos específicos contra un antígeno soluble no pueden detectarse por


precipitación si su concentración es inferior a los 20 ug/ml. Teniendo en cuenta que la
aglutinación es más sensible, se ha procurado fijar antígenos solubles a partículas de modo
de transformar la reacción de precipitación en una reacción de aglutinación. Esto se ha
logrado con magníficos resultados mediante la fijación de antígenos solubles a hematíes o
partículas inertes como el poliestireno, el látex y la bentonita.
A la reacción que resulta del empleo de glóbulos rojos como soporte se la
llama

104
Hemoaglutinación pasiva, y simplemente Aglutinación pasiva cuando se utilizan otros
soportes.
Generalmente las uniones de los antígenos a los soportes son no covalentes y la fijación se
obtiene por mezcla directa. En el caso de los hematíes, la fijación de hidratos de carbono
no necesita intermediarios; en cambio para la fijación de proteínas es necesario el
tratamiento previo de los glóbulos rojos con aldehídos simples como el fórmico o pirúvico.
La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que, al igual que la aglutinación,
permite determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima
dilución aglutinante. Es cuatro veces más sensible que la aglutinación y mucho más aún
que la precipitación. Esto es consecuencia del tamaño de las partículas antigénicas que
intervienen en la reacción. En la precipitación, el antígeno es pequeño y se necesitan
muchos complejos Ag-Ac agregados para que la reacción se visualice, en tanto que en la
aglutinación pasiva se ha transformado al antígeno en una partícula de gran tamaño, capaz
de dar aglutinados visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. Por lo tanto esta técnica
posee mayor sensibilidad y bajo límite de detección.
La reacción se efectúa colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un
volumen determinado del antígeno fijado al soporte. Anticuerpo y antígeno se mezclan
mediante agitación suave y se incuban durante un tiempo determinado, en general a
temperatura ambiente. Los tubos se observan sin centrifugar, por la parte inferior, para
determinar si ha habido aglutinación.
Esta técnica se emplea para investigar hormonas y antígenos solubles en sangre, orina y
otros fluidos.

Fenómeno de Prozona:

Cuando se valora un antisuero, la disminución de la concentración de los anticuerpos por el


efecto de la dilución del suero hace que la reacción de aglutinación decrezca hasta hacerse
nula. No obstante ello, en algunos sueros se observa un comportamiento particular que
está caracterizado por la ausencia de aglutinación en los primeros tubos de la serie, en los
que la concentración de anticuerpos es máxima, y aglutinación positiva a diluciones
mayores del suero. A este fenómeno se lo llama prozona.
Mediante el empleo de anticuerpos marcados se ha podido demostrar que en estos tubos,
aún en ausencia de aglutinación, el anticuerpo está unido al antígeno. Puesto que existe un
marcado exceso de anticuerpos respecto a los determinantes antigénicos, estadísticamente
es muy poco probable que los dos fragmentos Fab del anticuerpo puedan unirse a dos
epitopes ubicados en partículas diferentes. Este fenómeno además está relacionado con
los anticuerpos asimétricos o monovalentes mencionados anteriormente. La reacción de
Coombs permite identificar estas reacciones incompletas. (Ver capítulo de grupos
sanguíneos y reacciones post-transfusionales).
Todo esto indica la necesidad de evaluar los sueros a más de una dilución para descartar
los falsos negativos debidos al fenómeno de prozona.

Bibliografía

1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana.1º edición,


septiembre de 1986.Capítulo 6.
2. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial medica
Panamericana 5º edición septiembre de 1996. Capítulo I.
3. Inmunología básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.
5. Guerrero R.; Gonzalez C.L.; Medina E.L.; Epidemiología.E.A.U.: Editorial: Addison-
Wesley Iberoamericana.1° edición, 1981. Edición consultada, 1986. Capítulo 14.
105
6. Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de la Brucelosis Bovina. Departamento
de Brucelosis. DILACOT – SENASA. 2000

Grupos sanguíneos en caninos y reacciones post-transfusionales

Los antígenos de grupos sanguíneos son glucolípidos y glucoproteínas localizados


en la superficie de la membrana celular de los glóbulos rojos. Son heredados en forma
independiente entre ellos y por herencia mendeliana de dominancia autosómica.
La denominación internacional de grupos sanguíneos caninos y sus características de
muestra en la Tabla 1.

TABLA 1: Grupos sanguíneos del canino

Grupo Incidencia en Presencia de


sanguíneo la población anticuerpos Importancia en la transfusión
(DEA) (1) (%) (2) naturales (3)
1.1 42 No Reacción hemolítica aguda.
1.2 20 No Reacción hemolítica aguda.
3 6 Sí Retardada, secuestro de células, no hemólisis.
4 98 No Ninguna.
5 23 Sí Retardada, secuestro de células, no hemólisis.
6 98-99 No Desconocida.
7 45 Sí Retardada, secuestro de células, no hemólisis.
8 40 No Ninguna.

(1) DEA = Dog erythrocyte antigen. (antígeno eritrocitario canino)


(2) La incidencia en la población está basada en una compilación de estudios
internacionales.
(3) Los anticuerpos naturales son anticuerpos específicos contra los antígenos de grupo
sanguíneo que el individuo no posee. Están presentes en la sangre sin que haya habido
exposición previa a dichos Ags. Se sintetizarían por estímulos antigénicos provocados
por sustancias que están en la naturaleza, especialmente en plantas y bacterias, que
son de estructura muy similar a los Ags eritrocitarios.

La importancia de los diferentes Ags de grupos sanguíneos en las reacciones post-


transfusionales se relaciona con su inmunogenicidad, su frecuencia en la población y la
presencia de anticuerpos naturales.
El grupo sanguíneo DEA1.1 es el más inmunogénico (siguiéndole el DEA1.2) y es capaz de
provocar reacciones agudas de fuerte hemólisis intravascular por activación de la vía
clásica del complemento. Sin embargo, debido a que no hay anticuerpos naturales contra
este Ag, la reacción post-transfusional aguda no tiene lugar en una primera transfusión a un
receptor DEA1.1 negativo. El resto de los grupos sanguíneos (a excepción de DEA4), están
constituidos por Ags débiles, que no provocan hemólisis intravascular sino una reacción de
secuestro y destrucción extravascular de los eritrocitos incompatibles por parte del
sistema mononuclear-fagocítico. El carácter retardado y no agudo de este tipo de respuesta
determina que aún con presencia de anticuerpos naturales en los animales negativos,
como es el caso de los grupos DEA 3, 5 y 7, tampoco resulte crítica una primera transfusión
de sangre incompatible.

106
No se han identificado reacciones post-transfusionales relacionadas con el grupo
sanguíneo DEA4. Por esta razón, los animales portadores de este grupo sanguíneo son
considerados dadores universales.
Las características de los grupos sanguíneos caninos en lo que respecta a su
inmunogenicidad (y consecuentemente, al tipo de reacción que provocan) y la presencia o
ausencia de anticuerpos naturales en la población, determinan que una primera transfusión
de sangre incompatible, cualquiera sea el grupo sanguíneo al que pertenezcan los
eritrocitos transfundidos, no produzca una rápida destrucción masiva, sino las siguientes
consecuencias:
- Estimulación de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los
eritrocitos transfundidos, pues son destruidos progresivamente a medida que la
respuesta inmune se desarrolla.
- Vida media más breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a
antígenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales.
- Sensibilización del animal receptor a los Ags del grupo sanguíneo incompatible
transfundido. De este modo, en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual
grupo que la primera se producirá una respuesta inmune secundaria. Este efecto es
importante para grupos que provocan reacción fuertemente hemolítica (DEA1.1 y en
menor medida DEA1.2).
- Posible sensibilización de la madre DEA1.1 negativa a los eritrocitos DEA1.1 del feto
durante la preñez (25 % de incidencia). Esta situación es equivalente a la
sensibilización por transfusión. En cuanto al recién nacido, éste puede llegar a tener
problemas de hemólisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos
maternos contra su grupo eritrocitario (ver isoeritrólisis neonatal).
Para prevenir las situaciones mencionadas, se recomienda tipificar previamente la sangre
de donante y receptor o, en su defecto, realizar la “prueba cruzada (cross-match)”.
La mayor eficacia en la transfusión se logra cuando los eritrocitos del donante pertenecen a
igual grupo sanguíneo que los del receptor, o cuando se transfunden eritrocitos del grupo
DEA-4.

Tipificación de los antígenos de grupos sanguíneos:


La tipificación consiste en incubar una suspensión de eritrocitos del individuo con antisuero
o Acs monoclonales específicos para cada antígeno eritrocitario. La presencia de
aglutinación indica que se ha producido reacción antígeno-anticuerpo y en consecuencia,
hay certeza de que esos eritrocitos tienen el antígeno de grupo sanguíneo para el cual es
específico el antisuero o los Acs monoclonales utilizados. Dada la alta probabilidad de
reacciones falsas negativas, debe confirmarse el resultado mediante la prueba de Coombs
(ver más adelante).
Es frecuente que sólo se tipifique el grupo sanguíneo DEA1.1. De este modo, si bien no se
evita la disminución de la vida media de los eritrocitos transfundidos debido a la posible
incompatibilidad con otros grupos sanguíneos, se elimina la posibilidad de reacciones
hemolíticas agudas graves.
Prueba cruzada:
En el caso de que no sea posible realizar la tipificación, se impone la realización de una
prueba cruzada. Esta prueba se subdivide en prueba mayor y prueba menor.
En la prueba mayor se incuban los eritrocitos del donante con el suero o plasma del
receptor.
En la prueba menor se incuban los eritrocitos del receptor con el suero o plasma del
donante.

107
La reacción positiva, que consiste en la presencia de aglutinación en el sedimento y/o de
hemólisis en el sobrenadante, indica que el plasma tiene Acs contra los Ags eritrocitarios.
En el caso de la prueba mayor, el resultado positivo hace contraindicada la transfusión. Una
reacción positiva en la prueba menor resulta significativa cuando se van a transfundir
volúmenes grandes de sangre y nos indica la conveniencia de transfundir sólo eritrocitos y
no sangre entera.
El resultado de la prueba cruzada no indica identidad de grupos sanguíneos entre dador y
receptor; sólo manifiesta la presencia o ausencia de Acs contra los Ags eritrocitarios en el
plasma. Es una medida indirecta y parcial de compatibilidad sanguínea, debido a que un
resultado negativo sólo indica que la transfusión no provocará reacciones post-
transfusionales inmediatas, pero no garantiza que se eviten las consecuencias a mediano y
largo plazo descriptas en el primer apartado.

PRUEBA DE COOMBS
La aglutinación es la manifestación visible de una reacción Ag-Ac en la cual el Ag es
particulado, como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos.
Sin embargo, en algunos casos, si bien tiene lugar la reacción Ag-Ac no se produce la
esperada manifestación visible, o sea, la formación de lo que se denomina “enrejado” y que
se visualiza en forma de aglutinación.
Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto:
a- Exceso de Acs: En este caso, cada molécula de Ac se uniría con la totalidad de sus
valencias a una misma partícula antigénica. Así, sería imposible la formación del
enrejado pues no se producirían puentes de Acs entre las moléculas de Ag.
b- Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas características de
glicosilación se comportan como monovalentes, imposibilitando la formación del
enrejado. Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayoría a este grupo.
c- Defecto de Acs: La cantidad de Acs específicos contra el Ag es muy escasa, y no
alcanza para formar un enrejado del tamaño suficiente como para que resulte visible.
La prueba de Coombs, también llamada de la antiglobulina, permite evidenciar estas
reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. Las anti-Igs
agregadas (también llamadas suero de Coombs), harán de puente entre las regiones Fc de
los Acs unidos a las partículas antigénicas, formando de este modo el enrejado que se ve
en forma de aglutinación. La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta.
La técnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensión de
partículas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. El diagnóstico de la
anemia hemolítica autoinmune, caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los
eritrocitos propios, constituye un ejemplo de uso de esta técnica directa y consiste en el
agregado del suero de Coombs a una suspensión de eritrocitos de un animal sospechoso
de sufrir la enfermedad.
La técnica de Coombs indirecta, Implica dos pasos: una primera incubación de la
suspensión de Ag particulado con el suero del paciente y una segunda incubación luego del
agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los resultados falsos
negativos, cualquiera sea la causa que los provoque, de los resultados negativos reales
debidos a la ausencia de Acs específicos. La prueba de Coombs indirecta resulta de suma
utilidad para evidenciar los fenómenos de prozona y para la tipificación de grupos
sanguíneos. La reacción de Coombs directa se esquematiza en la figura 1.

108
Figura 1

Por lo tanto, en la prueba de Coombs directa el complejo inmune proviene del paciente y en
la prueba de Coombs indirecta el suero del paciente debe contactarse con el antígeno
particulado utilizado como reactivo diagnóstico.

ISOERITRÓLISIS NEONATAL
Esta enfermedad, también denominada ictericia hemolítica del recién nacido, se produce
cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a través del
calostro, provocando en el cachorro una reacción de hemólisis intravascular aguda. Puede
producirse cuando una madre DEA1.1 negativa, previamente sensibilizada al Ag
eritrocitario DEA1.1, tiene un cachorro DEA1.1 positivo. El resto de los Ags de grupos
sanguíneos carecen de relevancia en lo que respecta a esta enfermedad, debido a que son
Ags débiles y no provocan reacciones de hemólisis intravascular.
La sensibilización de la madre puede suceder por dos circunstancias:
a- Que alguna vez haya recibido una transfusión de sangre DEA1.1.
b- Que en una anterior preñez de un cachorro DEA1.1 positivo, los eritrocitos del feto
hayan pasado a la circulación sanguínea materna y estimulan la producción de una
respuesta inmune específica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta da lugar a una
muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1 al momento de la producción de calostro, por
lo que no hay riesgo de isoeritrólisis neonatal en esta primera preñez. No obstante, la
madre queda sensibilizada para futuras gestaciones.
En una posterior gestación de un cachorro DEA1.1 y en el caso de que los eritrocitos del
feto pasen a la circulación materna, la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de
la sensibilización) responderá a este estímulo antigénico con una respuesta de tipo
secundaria. Esta respuesta dará lugar a una rápida síntesis de una elevada tasa de Acs
que serán transmitidos al recién nacido mediante el calostro. Los Acs anti-DEA1.1 al unirse
a los eritrocitos del neonato, provocarán la activación de la vía clásica del complemento con
la consecuente hemólisis intravascular aguda.
La isoeritrólisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recién nacido mame calostro,
pero dado que el calostro es un alimento fundamental, no conviene privar de él al cachorro
a menos que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos.
La realización de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos
del recién nacido, es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisión: Un resultado
positivo hace contraindicado el mamado de calostro. Es posible realizar esta prueba antes
del parto utilizando los eritrocitos del padre; de este modo obtenemos el dato con
anticipación para poder preparar el manejo adecuado del recién nacido en caso de que la
109
prueba arroje resultado positivo (administración de calostro artificial, búsqueda de nodriza,
etc)
APENDICE

Grupos sanguíneos del felino

Grupo Genotipo Frecuencia de expresión Anticuerpos naturales


sanguíneo (1) (2) (3)
Puede haber una mínima reacción anti-
A A/A - A/B El más común (74-100%)
B
Altos títulos de anticuerpos naturales
B B/B Menos común (0-26 %)
anti-A
AB A/B Menos común (0,1-9,7%) Ninguno

(1) El alelo A es dominante. El fenotipo AB es el resultado de un tercer alelo que permite


la expresión codominante de A y B.
(2) Estos datos están basados en una compilación de estudios internacionales.
(3) Hay peligro de reacción post-transfusional entre receptor de grupo B y donante de
grupo A, aún en la primera transfusión.

Grupos sanguíneos del equino


La determinación de grupo sanguíneo en el equino se puede utilizar para la determinación
de paternidad. También es una técnica corriente en esta especie debido a la incidencia de
anemia hemolítica del recién nacido.

Sistemas Alelos o factores Grupos sanguíneos (1)


A1 - A` - H - A1A` - A1H - A`H - A1A`H -
A A1 - A` - H - A - H - a
(-)
D D-J–d D - J - DJ - (-)
P P1 - P` - p P1 - P` - P1P` - (-)
Q Q - R - S - QR - RS - q Q - R - S - QR - QS - RS - QRS - (-)
C C–c C - (-)
K K–k K - (-)
T T–t T - (-)
U U–u U - (-)

(1): Los complejos antigénicos se heredan en bloques, es decir, en asociaciones definidas


de factores sanguíneos que constituyen los grupos sanguíneos, no heredándose los
factores componentes por separado.

Bibliografía:
1. Halle A. Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and
medicine. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Vol. 25, Number
6, Nov. 1995, 1323-1332.
2. Giger U et al. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte
antigen 1.1 incompatibility in a previously sensitized dog. JAVMA, Vol. 206, May 1,
1995, 1358-1362.

110
3. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial Médica
Panamericana. 5º edición, septiembre de 1996.
4. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana. M.C.Graw – Hill. 4° Edición,
1995.

Técnica de Seroneutralización

Se define como seroneutralización (SN) a la prueba in vitro que detecta la capacidad que
poseen los anticuerpos específicos presentes en el suero, de impedir la replicación viral y
provocar la pérdida de infectividad de un virus. Debido a la importancia que tiene la
aplicación de esta técnica en virología, se explicará la prueba de seroneutralización viral,
aunque la prueba puede utilizarse también para estudiar la capacidad de un suero para
producir la inactivación de una toxina por acción de los anticuerpos de un suero (antitoxina).

Fundamentos

En general (y en un sentido estrecho), la neutralización se asocia al fenómeno por el cual


los anticuerpos impiden la replicación viral debido a que envuelven a las partículas virales e
impiden el contacto de estas con las células susceptibles.
Sin embargo, el proceso de replicación viral involucra numerosos pasos o eventos
posteriores a la adhesión celular, como la penetración o fusión con las membranas, el
desnudamiento del virión y la transcripción del ácido nucleico. De la misma manera, el
fenómeno de neutralización comprende todos los mecanismos por los que los anticuerpos
pueden interrumpir la replicación viral en alguno de estos pasos.

Reacción de seroneutralización

La reacción consiste en mezclar una cantidad conocida de virus con un suero que se
intenta evaluar y determinar si la capacidad infectante del virus disminuye luego de un
determinado tiempo de incubación. Como los sueros están inactivados por calor para
eliminar proteínas termolábiles como las del complemento, esta disminución de la
capacidad infectiva del virus se atribuye a la presencia de anticuerpos neutralizantes.

La presencia del virus no neutralizado se detecta a través de diferentes sistemas como


cultivos celulares (cultivos primarios o líneas celulares establecidas), embriones de pollo
(huevos embrionados), o animales de laboratorio (ratones, hámster, etc.).
Los resultados de las pruebas de seroneutralización varían según:
- la especie y la edad del individuo del cual provienen los anticuerpos,
- el sistema de detección,
- la vía de inoculación (si se utilizan animales susceptibles),
- la estabilidad del virus a los cambios de temperatura, el pH y otros factores físicos y
químicos.

En un primer estadio la reacción puede ser reversible: si se somete la mezcla (virus-suero)


a ciertas condiciones como vibración iónica, centrifugación, variaciones de pH o
simplemente dilución, los complejos inmunes pueden separarse y las partículas virales
pueden volver a ser infecciosas. La reversibilidad de la reacción virus-anticuerpo es
inversamente proporcional al tiempo y a la temperatura de incubación.

La temperatura y el tiempo establecidos en la reacción de seroneutralización dependen del


tipo de virus y del huésped con que se trabaja. Generalmente se utiliza 1 hora a 37 ºC pero
los protocolos pueden variar, aunque se estandarizan para poder comparar resultados. El
aumento de la temperatura o el tiempo de incubación pueden originar la pérdida de
infectividad del virus, de modo de producir un aumento aparente del título neutralizante que
no se debe a la capacidad neutralizante del suero. Por esta razón, en cada prueba es
importante incluir sueros testigos positivos (con una concentración conocida de anticuerpos
neutralizantes) y negativos (no inmunes, es decir, sin anticuerpos neutralizantes).

111
Aplicaciones de la técnica

- La seroneutralización puede ser utilizada para detectar la presencia de anticuerpos


neutralizantes en animales que han superado la infección o han sido vacunados. En
estos casos, la SN:
Puede ser utilizada para evaluar la eficacia de una vacuna comercial o en desarrollo.
Permite inferir el grado de protección inmunológica en individuos.
Permite seleccionar animales vírgenes en una determinada infección (que carecen de
anticuerpos neutralizantes en su suero), que deben ser incluidos en las pruebas de
potencia de vacunas.
Permite determinar la inmunidad poblacional frente a un virus en particular.
- La seroneutralización puede ser utilizada también para detectar y tipificar virus en
muestras biológicas, por ejemplo, provenientes de animales infectados, mediante la
utilización de sueros de referencia.

Seroneutralización como método de identificación de anticuerpos neutralizantes:

En muchas infecciones virales, la presencia o el título de anticuerpos neutralizantes en el


suero de un individuo puede asociarse con un estado de protección frente a la infección
que es conferido por los anticuerpos. Sin embargo, debemos recordar que la prueba de
seroneutralización no revela el estado inmunitario del animal en su conjunto, ya que evalúa
únicamente la inmunidad humoral, y no permite evaluar la actividad inmunitaria de base
celular.

Los sueros se deben inactivar durante 30 minutos a 56ºC para destruir los factores
termosensibles del complemento.

La prueba de seroneutralización puede realizarse de dos maneras:


- Realizando la titulación de los anticuerpos mientras se mantiene fija la dosis infectiva del
virus (Suero variable–virus fijo: SV - VF)
- Realizando la titulación del virus mientras se mantiene fija la dilución del suero (Suero
fijo–virus variable: SF - VV)

En todos los casos se debe contar con sueros de referencia positivos y negativos. Los
sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el
virus (convalecientes o poli-vacunados), mientras que los sueros negativos provienen de
animales que no han tenido contacto alguno con el mismo.

Las reacciones se incuban por un período variable que depende del sistema de detección
(células o animales) y del tipo de virus, pero que en general es de 3 a 10 días. Las lecturas
se realizan diariamente buscando el efecto de la infección viral.

Se pueden utilizar cultivos celulares en microplacas; en estos casos la SN se puede medir


de distintas formas.
- Se puede observar el efecto citopático en un microscopio óptico, que se pone de
manifiesto como la muerte celular o la modificación de la morfología celular por acción
de la infección viral (Figura a).
- También se pueden utilizar colorantes sensibles al pH en el medio de cultivo, como por
ejemplo rojo fenol, que permiten determinar a simple vista el estado metabólico de las
células: el color será amarillo en los hoyos donde las células mantienen su viabilidad y
será rojo en los hoyos donde las células están muertas por la infección viral.
- En aquellos virus que producen placas de lisis, las células pueden fijarse y teñirse, y las
placas de lisis pueden contarse luego a simple vista. En estos casos el virus se
cuantifica como unidades formadoras de placas de lisis (Figura b).
- En aquellos virus que no producen efecto citopático, la replicación viral puede detectarse
por inmunofluorescencia en un microscopio óptico de fluorescencia. En estos casos el
virus se cuantifica como unidades formadoras de focos fluorescentes (Figura c).
112
a b c

Alternativamente, se pueden utilizar huevos embrionados: en este caso se observará la


aparición de pústulas, vesículas o placas sobre la membrana carioalantoidea, la muerte del
embrión, etc.

Por último, se puede recurrir a los animales de laboratorio, solo cuando no se pueden
utilizar cultivos celulares o embriones de pollo. En este caso, se observará si los animales
sobreviven o no, o si manifiestan determinada sintomatología característica.

Seroneutralización como método de tipificación de un virus:

Cuando los virus tienen una constitución antigénica única (como el virus del moquillo
canino), todas las cepas de ese virus pueden ser neutralizadas con un mismo suero.
Por el contrario, cuando un virus presenta diferencias antigénicas entre sus distintas cepas,
cada una de ellas deberá ser neutralizada con un suero específico que permita distinguir
serotipos o serovariedades virales. Entre estos virus, que constituyen el grupo más
numeroso, se encuentran el virus de la fiebre aftosa, y adenovirus como el de la hepatitis
canina.

En estos casos, para realizar la prueba se seroneutralización, es necesario disponer de


tantos sueros neutralizantes específicos como tipos serológicos (serotipos) de virus existen.
Esta operación de neutralización se denomina “tipaje o tipificación”. La reacción consiste en
mezclar volúmenes iguales de virus purificado (ya sea por filtración o centrifugación) con
cada uno de los sueros hiperinmunes monoespecíficos, (anticuerpos monoclonales o
anticuerpos policlonales absorbidos), que incluyano los controles de virus y sueros. Las
mezclas se incuban 1 hora a 37ºC, después de lo cual cada una de ellas se siembra en
cultivos celulares o se inocula en animales de laboratorio.

En esta reacción, el antisuero que neutraliza indica qué cepa o virus es el que está
presente en la muestra. La verificación de la presencia eventual de dos o más tipos de virus
en una muestra se facilita si la neutralización se hace con todos los anticuerpos existentes.
Por ejemplo, en el caso de parvovirus canino, la seroneutralización se lleva a cabo con los
anticuerpos específicos para las tres cepas conocidas: CPV2, CPV2a y CPV2b, por
separado y en forma combinada, para poder identificar cuál es la cepa de virus responsable
de una infección.

Bibliografía
 Guía de trabajos prácticos. Inmunología. Año 1980
 Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press.
1964.
 Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of
immunity to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509.
 Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in
cattle of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19:
74-77. 1958.

113
Anexo:
Cálculo de Reed y Muench: Método de los totales acumulativos

a) Cálculo del título viral:

En la titulación del virus, el punto final se toma como la dilución en la cual cierto porcentaje
de cultivos celulares o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadísticamente
que el valor más apropiado es aquél en el que la mitad de los cultivos o animales muestran
el efecto producido por la infección viral y la otra mitad no. Esta región es la que ofrece
mínimo error en lo que atañe a la variación individual en la sensibilidad al virus. La
obtención de resultados estadísticos requiere inocular el mayor número posible de réplicas
y hacer diluciones poco espaciadas.

El método de Reed y Muench se basa en considerar que los cultivos celulares o animales
que recibieron menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado
las mismas lesiones con más dosis de virus infectante.

Para cada diución de virus se inoculan entre 4 y 8 réplicas (hoyos de cultivo celular o
animales de laboratorio). El objetivo de este método es conocer la dilución del virus que
corresponde al 50% de infección.

Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el cálculo del
punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las flechas,
como se esquematiza en el siguiente cuadro.

No Acumulados
Infectados o Valores Valores
Dilución Número de infectados o positivos / %
muertos acumulados acumulados
de virus réplicas vivos Total de (1)
(positivos) positivos negativos
(negativos) acumulados
10-1 4 4 0 19 0 19 / 19 100
10-2 4 4 0 15 0 15 / 15 100
10-3 4 4 0 11 0 11 / 11 100
-4
10 4 4 0 7 0 7/7 100
10-5 4 3 1 3 1 3/4 75
10-6 4 0 4 0 5 0/5 0
-7
10 4 0 4 0 9 0/9 0
(1) [Acumulados positivos / Total de acumulados] x 100

Se observa que el punto final al 50% está entre el 75% y 0%, que corresponden a las
diluciones 10-5 y 10-6, respectivamente. Por lo tanto la dilución que representa el 50% de
infectividad debe estar comprendida entre estas: debe ser mayor a 10-5 pero menor de 10-6.

Para estimar cuál es este valor se calcula la distancia proporcional (DP) entre dichas
diluciones, utilizando la siguiente fórmula:

DP = [% de positivos superior a 50] – 50 .


[% de positivos superior a 50] - [% de positivos inferior a 50]

En este ejemplo,

DP = 75 - 50 = 0.33
75 - 0

Luego, el producto (DP x log. del factor de dilución) se suma en valor absoluto al exponente
de la dilución superior a 50.

En este ejemplo,
El factor de dilución es 10 y el logaritmo de 10 es 1.
114
La dilución que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10-5
Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor de la dilución que representa el 50% de
infectividad es 10-5.33

El título se expresa con exponente positivo y su valor corresponde a 1 ml de inóculo.

En este ejemplo,
El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml.
El título viral, por lo tanto, será: 105.33 x 10 = 106.33 TCID50/ml.
TCID50: Dosis infectivas al 50% en cultivos de tejidos, del inglés Tissue Culture Infective
Doses.

b) Preparación del inóculo viral:

Para preparar el inóculo que se utilizará en la prueba de seroneutralización (103 TCID50/ml),


se debe conocer el título del virus, en nuestro ejemplo 106.33 TCID50/ml.

Para calcular qué dilución del virus stock hay que efectuar para tener esa dosis, se realiza
el siguiente cálculo:
 1 TCID50/ml se obtendría en una dilución 10-6.33
 103 = 1000 TCID50/ml se obtiene en una dilución 1000 veces más concentrada:
10-6.33 x 103 = 10-3.33 (Es decir, que en una dilución 10–3.33 de este virus habrá 1000
TCID50/ ml).
 El antilogaritmo de 3,33 es 2138: esto significa que una dilución 10-3.33 equivale a 1/2138
y contiene 1000 TCID50/ml.
 A partir de esta dilución se realizan tres diluciones más en base 10, para titular el inóculo
viral en simultaneidad con la prueba (control de título viral).

c) Prueba de Seroneutralización a Suero Variable – Virus Fijo (SV-VF):

Para realizar esta técnica es necesario tener el virus que se va a utilizar previamente
titulado, fraccionado y congelado a muy bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196ºC,
o en freezers ultrafríos a -80ºC).

En esta técnica se preparan diluciones de los sueros problemas y controles (generalmente


en base 2), con el siguiente criterio:
- Si los animales son vacunados se usará generalmente una dilución entre 1/4 y 1/32 o
más, dependiendo del virus y el tipo de vacuna involucrados.
- Si se trata de animales vírgenes se usarán diluciones de 1/4 a 1/8.
Los sueros se utilizan siempre diluidos ya que la mayoría posee efecto tóxico cuando se
utilizan puros o en dilución al medio.

Simultáneamente se realiza la dilución del virus, de manera de obtener un inóculo con el


que se enfrentarán los sueros, que contenga las dosis infectantes deseadas. Generalmente
para esta prueba se utilizan 1000 TCID50/ml.

El inóculo, que contiene 1000 TCID50/ml, se mezcla en volúmenes iguales con cada dilución
de los sueros problema y con los sueros de referencia.

Dichas mezclas se incuban 1 hora a 37 ºC y luego se siembran (sobre cultivos celulares) o


se inoculan (en ratones o embriones de pollo).

Los resultados se pueden expresar como Títulos Seroneutralizantes, obtenidos por el


cálculo de Reed y Muench, o como Índice de seroneutralización (IS), que indica el efecto
que produce el suero neutralizante sobre la capacidad infectiva del virus.

Debe incluirse siempre la titulación del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que
las dosis infectantes utilizadas fueron las correctas.
115
Ejemplo de análisis de resultados:

Dilución Valores Valores Acumulados


No acumulados acumulados
del suero Infectados no infectados/ % Acumulados
infectados
(Log. de la o muertos infectados o no infectados Total de no infectados
o vivos
dilución) muertos o vivos acumulados

1 / 4 (0,6) 0 4 0 12 12/12 100


1 / 8 (0,9) 0 4 0 8 8/8 100
1 /16 (1,2) 1 3 1 4 4/5 80
1 / 32 (1,5) 3 1 4 1 1/5 20
1 / 64 (1,8) 4 0 8 0 0/8 0

Nuevamente, se debe calcular la distancia proporcional (DP).

DP = [% de no infectados superior a 50] - 50 .


[% de no infectados superior a 50] - [% de no infectados inferior a 50]

DP = 80 - 50 = 0,5
80 – 20

La cifra obtenida de multiplicar [DP x log. del factor de dilución] se suma al log. de la
dilución que presenta un porcentaje de no infectados superior al 50%, con el fin de obtener
el Índice de Seroneutralización.
 La dilución con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (el logaritmo de
16 es 1,2)
 El factor de dilución es 2 (el logaritmo de 2 es 0,3). Por lo tanto,
 IS = 1,2 + [0,5 x 0,3] = 1,35.
 El antilogaritmo de 1,35 es 22,4.
Podemos decir, entonces, que el índice de seroneutralización es 1,35 y que 1/22,4 es la
dilución del suero que protege al 50% de los animales.

En este caso se calcula el porcentaje de cultivos celulares, huevos embrionados o animales


de laboratorio que permanecen no infectados, ya que se desea conocer el poder de
protección del suero.

d) Prueba de Seroneutralización a Suero Fijo - Virus Variable (SF–VV):

El rango de diluciones de virus que se utiliza en esta prueba es arbitrario, pero para
definirlo debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar:
- En el caso de ser animales libres de infección, se emplea un número bajo de dosis
infectivas ya que al tener el suero niveles mínimos o nulos de anticuerpos, se necesita
poca cantidad de virus para que éste supere el efecto neutralizante del suero y produzca
efecto citopático.
- En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un número más
alto de dosis infectivas, ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores.

El suero problema y los sueros de referencia se preparan en una única dilución (establecida
entre 1/2,5 y generalmente no más de 1/10, dependiendo del virus con que se trabaje).
Simultáneamente se procede a la dilución del virus en base 10.
Las diluciones de los sueros y el virus se mezclan en partes iguales y se incuban 1 hora a
37ºC.

116
Luego de la incubación se siembran (sobre cultivos celulares) o se inoculan (en ratones o
embriones de pollo).
Los resultados se pueden expresar como Títulos Seroneutralizantes, obtenidos por el
cálculo de Reed y Muench, o como Índice de seroneutralización (IS), que indica el efecto
que produce el suero neutralizante sobre la capacidad infectiva del virus.

El Índice de seroneutralización (IS) se puede obtener a partir de diferentes cálculos, como


por ej:
- Título del virus incubado sin suero - Título del virus incubado con suero problema, o
- Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero
problema

Por ejemplo,
Título de virus incubado sin suero = 106.33
Título del virus incubado con suero problema = 103.40
IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93
10 2.93 expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema

Debe incluirse siempre la titulación del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que
las dosis infectantes utilizadas fueron las correctas.

INHIBICIÓN DE LA HEMAGUTINACIÓN

Introducción: Hemoaglutinación

Algunos virus de las familias Paramixoviridae, Ortomixoviridae y Parvoviridae poseen la


capacidad de aglutinar glóbulos rojos de ciertas especies animales (Hemoaglutinación o
HA). Las proteínas virales responsables de esta propiedad se conocen como
“hemaglutininas”. Estas son proteínas de superficie de los viriones que se unen con
receptores de la membrana de los hematíes que poseen ácido acetil neuramínico en su
composición. Esta interacción entre los viriones y los hematíes resulta en la producción de
un cuerpo compacto. La HA se produce cuando la proporción entre la hemaglutinina viral y
los eritrocitos es óptima, permitiendo la unión de varios eritrocitos adyacentes a una unidad
de hemaglutinina. Esta característica viral nos permite identificar y clasificar virus
hemaglutinantes, aislados a partir de individuos infectados. Además, se puede titular virus
por su efecto hemaglutinante, así como evaluar la capacidad de un suero de inhibir esta
hemaglutinación.
La técnica, que evalúa la capacidad de un suero de bloquear el efecto hemaglutinante del
virus se conoce como Inhibición de la Hemoaglutinación (IH).

ASPECTOS METODOLÓGICOS:
Ambas pruebas (HA - IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V.
La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilución 1:2; los
glóbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentración final de
0.5% o 1%. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solución salina buffereada (PBS) con
0.1% de seroalbúmina bovina (BSA).
PROTOCOLO DE TITULACIÓN VIRAL POR HA:

 Colocar 50 μl de diluyente para el virus en cada uno de los 12 hoyos de la fila A de


la microplaca.
 Agregar 50 μl de virus puro (obtenido del cultivo en huevos embrionados o en
cultivos celulares) en el primer pozo de la fila A.

117
 Utilizando una micropipeta de 50 μl, efectuar diluciones seriadas en base 2 del Ag
(de 1:2 a 1:2048), dejando el último hoyo de la fila sin Ag para que sirva como
control de eritrocitos.
 Agregar 50 μl de la suspensión de eritrocitos al 0,5 o 1% a cada hoyo, agitar
levemente para mezclar los reactivos.
 Cubrir la microplaca e incubar a 4 ºC durante 16 hs.
 Leer una vez que esté bien delimitado un “botón” en el fondo de cada pozo control
de eritrocitos.

Lectura:
Con la ayuda de un espejo se observa el fondo de cada pocillo. Primero se realiza la
lectura de los hoyos control.
La lectura puede realizarse a ojo desnudo
Interpretación de los resultados:

HA negativa: se observa la formación de un botón de hematíes de borde liso, ocasionado


por la sedimentación de los GR (Ej, en el control de GR).
HA positiva: se observa la formación de un halo de hematíes de mayor diámetro, color claro
y borde irregular, ocasionado por la aglutinación de los GR por acción del virus.

El título HA corresponde a la dilución más alta del virus en la que se observe 100% de HA.
Se considera que en esta dilución existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA).
En la siguiente figura se esquematiza la titulación por Hemoaglutinación de ocho
muestras de virus (filas A - H). Los títulos obtenidos figuran a la derecha de la placa.

118
Inhibición de la hemaglutinación

La técnica de IH, descripta originalmente por Hirst (1942) y modificada posteriormente


por Salh (1944) nos permite detectar y cuantificar anticuerpos (Ac) que poseen la propiedad de
bloquear la actividad hemaglutinante de ciertos virus, uniéndose a las hemaglutininas virales e
impidiendo de este modo su unión con los receptores eritrocitarios.
Por lo tanto, esta técnica nos permite identificar en un suero problema el nivel de anticuerpos
capaces de inhibir la hemoaglutinación. Hay que tener en cuenta que los resultados pueden
verse afectados por la presencia en los sueros de inhibidores inespecíficos (por ej. enzimas) y
hemaglutininas naturales, por lo que es necesario evaluar simultáneamente la capacidad
hemaglutinante del suero. Cuando el nivel de hemaglutininas de los sueros es muy alto,
algunos autores sugieren el tratamiento previo de los sueros con Kaolín o glóbulos rojos para
eliminar estas aglutininas. Debe considerarse que dichos tratamientos resultan en detrimento
de la detección de bajos niveles de anticuerpos.

ASPECTOS METODOLÓGICOS:

 Distribuir 25 μl de solución PBS 1X en los hoyos 1 a 11 de las filas que vayan a


utilizarse de una placa de microtitulación (utilizar placas con pocillos de fondo en V o en
U) y 50 μl a los hoyos 12 de las mismas hileras.
 Colocar 25 μl de cada suero en el primer pocillo de cada dos hileras. Por cada suero se
utilizan dos hileras.
 Utilizar una micropipeta para hacer diluciones 1:2 del suero en toda la placa (en general
se comienza con una dilución final de 1/10 para el primer hoyo (Nº 1) y se continúa
diluyendo en base 2 hasta el hoyo correspondiente a la columna 11 (1/10; 1/20; 1/40;...
1/1024). Descartar los 25 μl excedentes del hoyo 11. De esta manera se obtiene una
dilución seriada (en base 2) del suero y un volumen homogéneo de 25 μl.
 Agregar 25 μl de antígeno (virus) que contenga 4 a 8 unidades hemoaglutinantes, en los
hoyos 1 a 11 de la primera hilera correspondiente a cada suero. Agregar 25 μl de PBS
en los hoyos 1 a 11 de la segunda hilera correspondiente a cada suero (para completar
el volumen a 50 μl).
 Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente
durante 60 minutos.
 Añadir 50 μl de suspensión de hematíes al 1% o al 0,5% a todos los hoyos utilizados. La
segunda hilera de cada suero no contiene virus, sólo suero y glóbulos rojos y nos
permite realizar un control sobre la capacidad hemaglutinante del suero per se. Por su
parte, el hoyo 12 de cada hilera contiene glóbulos rojos y el diluyente del virus (PBS),
como control para descartar una posible hemoaglutinación inespecífica.
 Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubarla a 4°C durante 16 hs.
 Leer las placas cuando se hayan sedimentado los hematíes de control (columna 12). La
lectura se efectuará inclinando las placas y observando la presencia o ausencia de un
botón bien definido similar al de los hoyos de control.
 El título de Inhibición de la Hemoaglutinación será la mayor dilución del suero que
produzca una inhibición completa de 4 u 8 unidades hemaglutinantes de virus.
 En todas las pruebas deberá incluirse una titulación simultánea del virus para confirmar
la presencia de las unidades de hemoaglutinación requeridas y la hemaglutinación
natural del suero a evaluar.

119
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO

Las características del sistema de complemento han permitido idear una reacción
serológica denominada “Fijación de Complemento”, la que mediante un sistema indicador
permite determinar la activación del C a un complejo antígeno-anticuerpo, esté el antígeno en
solución o en suspensión. Como sistema revelador se emplea el denominado “sistema
hemolítico”, que consiste en una suspensión de complejos antígeno-anticuerpo formados por
glóbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hematíes (hemolisina).
Esta técnica es muy empleada para la identificación cuantitativa de anticuerpos contra un
antígeno en particular y es la técnica de referencia (“gold estándar”) para muchas
enfermedades infecciosas. Por ejemplo, en el diagnóstico de brucelosis mediante este método,
el suero en estudio se incuba con una suspensión estandarizada de Brucella abortus y una
cantidad conocida y estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). En un paso
posterior se agrega el sistema hemolítico. (Figura 1)

Figura 1 Suero problema Suspensión de antígeno

Complemento Sistema hemolítico

Si la muestra no posee anticuerpos específicos contra Brucella abortus (figura 2 A), no se


forman complejos antígeno-anticuerpo que activen el C. Por lo tanto, al agregar el sistema
hemolítico, el C se fija a las membranas de los glóbulos rojos sensibilizados y produce su lisis
(figura 2 B).

Si la muestra en estudio contiene anticuerpos específicos contra Brucella abortus, éstos se fijan
a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la vía clásica, que produce su lisis.
Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemolítico, ya no hay complemento
disponible y los glóbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).

120
El consumo de C por los complejos inmunes se manifiesta indirectamente por la ausencia de
hemólisis al agregar el sistema hemolítico. El C no “fijado” indica la ausencia de reacción
antígeno-anticuerpo durante la primera etapa de la prueba y se mide en unidades CH50 .
Se realizan diluciones del suero en base 2 que se incuban con cantidades fijas y conocidas del
resto de los reactivos.
El título se determina como la máxima dilución de suero que produce la hemólisis del 50% de
los glóbulos rojos del sistema hemolítico.
Para medir la hemólisis se centrifugan los tubos (para que sedimenten los glóbulos rojos que
no se hemolizaron). La hemoglobina presente en el sobrenadante se lee en unidades de
densidad óptica en un espectrofotómetro a 542 nm de longitud de onda.
Para llevar a cabo esta prueba deben tenerse una serie de consideraciones:
Las muestras de suero, libres de hematíes, deben ser inactivadas a 56°C durante 30 minutos
paradesnaturalizar los factores del complemento del suero y evitar que interfieran en la prueba.
El antígeno debe poseer Brucella abortus cepa 19, inactivada, a una concentración
standard de 0,00018% v/v.
Como fuente de complemento (C) se utiliza suero normal de cobayo. Éste se conserva
congelado y debe titularse cada vez que se usa. Para la prueba diagnóstico se emplean 5
unidades CH50.
La hemolisina corresponde a un suero hiperinmune contra hematíes de oveja y se utiliza a la
concentración que produce como resultado en ese sistema 12 unidades de CH50.
Los hematíes de oveja se obtienen por punción de la vena yugular en condiciones de asepsia y
con anticoagulante. Posteriormente se lavan por centrifugación y reemplazo del suero por
solución buffer. Se utilizan en una suspensión al 6% v/v.
La Fijación de Complemento es una técnica muy laboriosa y que depende de parámetros muy
estrictos en lo que refiere a la estandarización y titulación de los reactivos. Su aplicación está
limitada a los laboratorios de referencia nacional e internacional y se utiliza generalmente para
confirmar la positividad de otras técnicas. No es de práctica rutinaria, aunque como se
mencionó es la prueba de referencia para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas
determinadas por la OIE.
Este método también se emplea para identificar, tipificar y/o semicuantificar antígenos: en estos
casos se emplean sueros específicos conocidos y a concentración fija y diluciones de la
muestra en estudio (en la cual se sospecha la presencia de un antígeno). La ausencia de
hemólisis indica la formación de complejos antígeno-anticuerpo debido a la presencia del
antígeno en la muestra, e inversamente, la observación de hemólisis indica que la muestra
carece de antígeno.

121
Bibliografía

1. Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed.


Interamericana. 976 pp.
2. Day, MJ. 1999. Clinical Immunology of the Dog and the Cat. Iowa State
University Press.

POLARIZACIÓN FLUORESCENTE

La técnica de polarización fluorescente (FPA) detecta la unión de pequeñas moléculas


marcadas con fluoresceína (por Ej. antígenos) a grandes moléculas (anticuerpos) cuando la
muestra es incidida con un haz de luz polarizada.
Este ensayo ha mostrado tener buena utilidad en la detección de ciertas enfermedades
infecciosas. Es utilizada para identificar anticuerpos frente al Ag O-polisacárido de bacterias
gram negativas (Brucella sp., Salmonera sp.) en muestras de suero, leche y sangre entera.
También está descripto su uso para la identificación de antígenos como proteínas o péptidos
de Mycobacterium bovis y virus de la Anemia Infecciosa Equina.
Fundamento:
Todas las moléculas en solución rotan al azar. La velocidad de rotación depende del tamaño y
es inversamente proporcional, por lo tanto las moléculas pequeñas rotan a mayor velocidad
que las moléculas grandes.
Para realizar este ensayo se requiere de la emisión de una luz (onda electromagnética) (a partir
de una lámpara de tungsteno) que al atravesar un polarizador de cristal líquido produce un
rayo de luz polarizada plana azul (481-489 nm).
Al incidir la luz polarizada plana sobre el trazador (fluorocromo ligado al antígeno), lo eleva a un
estado de excitación, tras el cual dicho trazador vuelve al estado de equilibrio emitiendo un haz
de luz verde (525-550 nm) que es captado y analizado por el equipo.
En el caso de que el antígeno marcado estuviese unido a una molécula de anticuerpo de gran
tamaño, su velocidad de rotación disminuye y permite que la emisión de luz verde se detecte
en el mismo plano de polarización que la radiación recibida, manteniéndose la polarización. Por
lo contrario, si dicho trazador está unido solo al antígeno (de pequeño tamaño) la rotación es
rápida y la luz verde emitida se ubicará en otro plano distinto al de la luz polarizada. De esta
manera, se pierde el grado o valor de polarización.

122
Durante el tiempo que la molécula conjugada con fluoresceína permanece excitada, rota a una
determinada velocidad, produciendo una diferencia entre plano de polarización que la
excita (plano de excitación) y el plano de polarización que emite (plano de emisión), ésta
diferencia se cuantifica y se determina utilizando una fórmula.
Expresión de los resultados: unidades de milipolarización (mp) del suero frente al
antígeno. Cálculo de las unidades de mp de cada muestra.

mP = ( Iv – (Ih x G) / (Ih x G) x 1000

Iv = intensidad vertical de la luz


Ih = intensidad horizontal de la luz

G = Factor de polarización

Ejemplos de los antígenos más utilizados:

El polisacárido O-: Extraído a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Estos
antígenos son específicos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificación del LPS.
Ej.: Brucella sp. Salmonella sp.
Estructura de LPS

123
Péptidos: Sólo puede utilizarse péptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20
kDa), para que no interfiera su tamaño en una menor rotación del antígeno-trazador libre.

Equipamiento

* El SENTRY (Diachemic corporation) es un instrumento computabilizado para determinar las


unidades de milipolarización (mp) del suero problema. Presenta una ranura para el
acoplamiento del tubo de ensayo. Este aparato lee una muestra por vez en tubos de 10mm x
75mm. Es transportable al campo y puede funcionar una hora sin fuente externa de energía.

* El POLARION (Tecan) También es un lector de polarización pero adaptado para la lectura de


microplacas de 96. Puede leer hasta 1500 muestras por hora.

ASPECTOS METODOLÓGICOS
Protocolo FPA

 Agregar 10µl de la muestra (generalmente suero del animal a evaluar) a 1 ml de buffer.


 Leer el blanco
 Agregar 10 µl de antígeno marcado
 Incubar no menos de 2 minutos
 Realizar la lectura de las muestras ya sea en tubos o en multiplacas.
 Como dato orientativo, las muestras con lecturas de 10 mp mayores al control negativo son
consideradas positivas

Esquema de la técnica. Utiliza como ejemplo el Ag O de Brucella sp.

124
Ventajas:

 Es fácil de realizar y los resultados se obtienen rápidamente.


 Implica solamente 2 pasos.
 Es una técnica de alta sensibilidad y especificidad.
 Permite el procesamiento de varias muestras a la vez.
 Suspensiones turbias tales como leche, sueros lipémicos y yemas de huevo o
soluciones coloreadas como sueros hemolizados o sangre entera, no interfieren en la
lectura de las muestras.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS MATERNALES

Una adecuada protección contra enfermedades infecciosas que pueden comprometer la


vida del neonato depende de la transferencia pasiva de anticuerpos de la madre a la cría. En
bovinos y equinos, especies en las cuales la transferencia transplacentaria de Acs se ve
impedida por el tipo de placentación (completa), la ingestión de calostro durante las primeras
horas de vida favorece la supervivencia del neonato. En el caso de los potrillos, se considera
adecuada la presencia en suero de 400–800 mg/dl de Igs. Valores de 200 a 400 mg/dl indican
falla parcial en la transferencia y menores a 200 mg/dl son indicativos de falla total en la
transferencia pasiva de la inmunidad materna. En el caso de los terneros, se consideran
hipogammaglobulinémicos aquéllos con niveles de IgG sérica inferiores a 10 mg/ml.
Es importante destacar que el éxito de la transferencia pasiva no puede evaluarse sino
hasta aproximadamente 18 horas después del nacimiento, cuando se alcanza el pico de
concentración en suero de las Igs absorbidas por la vía intestinal. Es fundamental, entonces,
asegurar al neonato la ingesta de calostro de buena calidad y en cantidad suficiente durante las
primeras horas de vida, o si fuera necesario, elegir un método de suplementación de
anticuerpos adecuado (por ejemplo, administración endovenosa de suero compatible).
Existen diferentes métodos que nos permiten detectar la falla de transferencia calostral
y son empleados con frecuencia en potrillos y terneros. Estas pruebas evalúan proteínas
(totales, gammaglobulinas o IgG según la prueba) en el suero del neonato y pueden clasificarse
en dos grandes grupos: las rápidas, que pueden realizarse “al pie del animal” y las que
requieren de un procesamiento en el laboratorio.

Pruebas “al pie del animal”

a) Prueba de glutaraldehído

Esta prueba se basa en la coagulación de las gammaglobulinas por el agregado de


glutaraldehído. Consiste en colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero y agregar una gota
de una solución de glutaraldehído al 10%, agitar y controlar la gelificación cada 10 minutos
durante el término de una hora. El tiempo se toma desde la adición del reactivo (minuto o
tiempo cero). La reacción es positiva cuando se forma un”gel sólido” (coágulo) luego de la
adición del reactivo. Esto se visualiza inclinando el tubo 45º, verificando que el contenido no se
vuelque, es decir, que el suero se haya gelificado.
Esta prueba es utilizada con frecuencia para el diagnóstico rápido en equinos. Para esta
especie se ha estudiado la correlación entre los valores de concentración de IgG sérica y la
velocidad de reacción:

125
Concentración
Tiempo de reacción aproximada de IgG Interpretación
(mg/dl)

Valor normal. Buena trasferencia


calostral
Entre 0 y 10 minutos Mayor de 800

Falla parcial de trasferencia calostral.


Entre 10 y 60 minutos De 400 a 800
Animal en riesgo potencial.

Falla total de trasferencia calostral.


Mayor de 60 minutos Menor de 400
Animal en alto riesgo.

Al realizar esta prueba, se deben tener algunas consideraciones:


- el suero no debe estar hemolisado, ya que la hemólisis puede ocasionar resultados falsos
positivos, al aumentar la reacción de coagulación.
- la prueba debe realizarse a temperatura ambiente (20-25ºC).

b) Prueba de sulfato de zinc

La técnica se basa en la capacidad de los iones pesados de dicha sal de unirse a la porción Fc
de las Igs y hacerlas precipitar. Es un procedimiento rápido y económico, ya que sólo utiliza
una solución de sulfato de zinc que se mezcla con el suero del animal.
Para realizar la prueba, se agrega 0,1mL del suero problema a 6 mL de una solución de Sulfato
de Zinc (de concentración entre 250-400 mg/ml según el protocolo) y se incuba a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Various solution.
El resultado puede evaluarse a simple vista (cualitativamente) comparando la turbidez
existente en el tubo de ensayo que contiene el suero del neonato con el tubo que contiene el
suero de su madre. Una menor turbidez en el tubo del neonato indica falla en la transferencia
pasiva de anticuerpos. Esta prueba podría ser también cuantitativa, si la muestra se llevara al
laboratorio para la lectura en espectrofotómetro a 620 nm, previa realización de una curva de
calibración con sueros patrones de concentraciones conocidas.

c) Prueba de sulfito de sodio

Es una técnica similar a la prueba de precipitación con sulfato de zinc. La turbidez producida
por el sulfito de sodio al precipitar las proteínas de gran peso molecular (principalmente las Igs)
se determina a ojo desnudo.
Clásicamente, esta prueba se realizaba empleando 3 soluciones de sulfito de sodio de
concentración creciente: al 14, 16 y 18 % de reactivo. La presencia (+), la ausencia (-) o la
ligera turbidez (+/-), son los parámetros para estimar el rango de concentración de Igs en el
suero, según la información volcada en la siguiente tabla:

126
Solución de sulfito
Concentración de Igs de sodio
(mg/ml)
14% 16% 18%

0a1 - - -

Menos de 5 - - +

4a5 - +/- +

6 a 12 - + +

12 a 18 +/- + +

Más de 15 + + +

En bovinos, esta técnica se emplea con frecuencia para el diagnóstico de fallas en la


transferencia calostral. Sin embargo, en esta especie se ha demostrado que la prueba resulta
más confiable cuando se utiliza una única solución de sulfito de sodio al 18%. Para realizar la
evaluación, se agrega 0,1 mL de suero problema (muestra) a 1,9 mL de la solución de reactivo
y se incuba 15 minutos a 23ºC. Luego se evalúa la turbidez.

d) Refractometría
La medición de proteínas séricas totales por refractometría es una buena evaluación indirecta
de la concentración de IgG, principalmente empleada en bovinos. En equinos, en cambio, no
resulta de elección, debido al amlpio rango de valores de proteinemia normales en potrillos
neonatos.
Se utiliza un refractómetro que permite medir el índice de refracción de la luz al incidir sobre
una gota de suero. Es importante tener en cuenta que en los animales clínicamente afectados,
la deshidratación puede causar falsos positivos. Valores de 5.2 g/dl o mayores se asocian en
terneros con una transferencia pasiva adecuada en terneros clínicamente sanos. Si se evalúa
terneros con mal estado general, el valor de corte debiera corregirse a 5,5 g/dL.

d) Inmunocromatografía
En la actualidad existen kit comerciales basados en esta técnica para detectar o incluso
semicuantificar los niveles de IgG séricos, para la especie equina. Su alto costo es la limitante
para su uso. (Ver capítulo correspondiente en esta guía)

Pruebas en laboratorio

a) Inmunodifusión radial
Es la prueba de referencia. Permite conocer la concentración de Igs y a la vez reconocer
clases y subclases de Igs. La desventaja es el tiempo de lectura, de 18 a 24 horas (Ver capítulo
sobre técnicas de interacción secundaria en esta guía).

c) Electroforesis

127
La electroforesis clásica de proteínas séricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es
una técnica rápida y relativamente sencilla, que permite la posterior cuantificación de las
proteínas por densitometría (Ver capítulo correspondiente en esta guía).

d) ELISA

Esta es una técnica de interacción primaria, altamente sensible y específica. (Ver capítulo
correspondiente en esta guía).

e) Prueba de látex o aglutinación pasiva


Es una técnica confiable y rápida. Las partículas de látex se cubren con anticuerpos anti–
IgG de la especie en estudio. Al mezclarse con el suero problema, si éste tiene IgG calostrales,
los anticuerpos anti-IgG adheridas a las partículas de látex se unen a las IgGs del suero y
determinan que las partículas de látex aglutinen. Esta prueba se efectúa en 10 minutos
aproximadamente.
El tiempo que tarda en producirse la aglutinación es indicativo del estado de protección, ya que
la concentración de Igs es proporcional al tiempo de lectura; cuanto más rápido aparece la
aglutinación, mayor es la concentración de Igs en el suero. A modo de ejemplo, si aglutina en 2
minutos, indica buen estado de protección.

f) Dosaje de proteínas totales


En forma indirecta pueden ofrecernos datos de valor sobre el nivel de gammaglobulinas totales,
teniendo en cuenta que éstas constituyen del 18 al 22% de las proteínas totales y que del 90 al
97% de las gammaglobulinas plasmáticas corresponden a las Igs.
Las técnicas de dosaje de proteínas son de uso más común en el laboratorio de diagnóstico
clínico son:
- Técnica de Biuret

- Técnica de Lowry

- Técnica de Bradford

Bibliografía

1. Bovine Alliance on Management and Nutrition. 1995. A guide to colostrum and colostrum
management for dairy calves. American Feed Industry Association, Arlington, VA.
2. McGuire TC, Crawford TB, Hallowell AL, Macomber LE. 1977. Failure of colostral
immunoglobulin transfer as an explanation for most infections and deaths of neonatal foals. J
Am Vet Med Assoc 170(11):1302-4.
3. Beetson SA, Hilbert BJ, Mills JN. 1985. The use of the glutaraldehyde coagulation test for
detection of hypogammaglobulinaemia in neonatal foals. Aust Vet J 62(8):279-81.
4. Weaver DM, Tyler JW, VanMetre DC, Hostetler DE, Barrington GM. 2000. Passive transfer of
colostral immunoglobulins in calves. J Vet Intern Med 14(6):569-77. Review.
5. House AM, Irsik M, Shearer JK. 2008. Sepsis, Failure of Passive Transfer, and Fluid Therapy
in Calves. Veterinary Medicine-Large Animal Clinical Sciences Department, Florida Cooperative
Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida.
6. TIZARD, I. “Inmunología Veterinaria”. 8va. Edic. 2009. Editorial Harcourt Grade de España
SA. 592PP.
7. Margni, R. Inmunología e inmunoquímica. 5º Edición. Panamericana – 1996.
8. Blum, J.W., Hammon, H. Livestock Production Science 66 (2000) 151- 159.

128
INMUNOELECTROFORESIS

La técnica de inmunoelectroforesis combina la electroforesis y la inmunodifusión en gel


de agar. El primer paso es la separación de los componentes de la mezcla antigénica por
electroforesis en gel de agar. Si se usa una solución amortiguadora alcalina, la mayoría de las
proteínas se cargarán negativamente y migrarán hacia el ánodo (polo positivo). Algunas
moléculas como las gammaglobulinas, que poseen un punto isoeléctrico (PI) muy cercano al
pH de la solución amortiguadora utilizada, migran hacia el cátodo (polo negativo) debido al
fenómeno conocido como movimiento electroendosmótico. Este efecto es producido porque el
agar en un medio alcalino tiene carga negativa, lo que hace que el agua se cargue
positivamente y migre hacia el cátodo arrastrando las moléculas que se encuentran en
solución, sobre todo las que no tienen carga o poseen carga baja.
Una vez terminada la separación electroforética, se coloca el antisuero en un canal cortado en
el agar, paralelo a la dirección de la migración electroforética.
Durante el período de incubación, los antígenos que fueron separados electroforéticamente y
los anticuerpos del antisuero se desplazan en el gel de agar hasta encontrarse (al igual que en
la inmunodifusión doble), para producir una banda o línea de precipitación. Cada línea de
precipitación representa la reacción de un antígeno con su respectivo anticuerpo.

Materiales necesarios:-

 Cuba de electroforesis
 Portaobjetos limpios y desengrasados
 Cámara húmeda
 Agar noble
 Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
 Soluciones de antígenos y de anticuerpos a valorar

ASPECTOS METODOLÓGICOS:
 Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada
capa de impregnación, contiene una solución de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de
solución amortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solución, se cubre el
portaobjetos tratando de formar una delgada capa y luego se deja secar.
 Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnación seca) se colocan en posición
horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solución de agar al 1% caliente. Se deja
gelificar a temperatura ambiente.
 Se efectúan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y
otra estrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar sólo de la perforación
circular.
 En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria de
solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado
se colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solución
utilizando tiras de papel de filtro previamente humedecidas con la solución
amortiguadora (uno de los extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se
sumerge en la solución amortiguadora).
 Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razón de 10
voltios/cm. de gel ó 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.
 Se desconecta el aparato. Las soluciones de antígeno se colocan en las perforaciones
circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur. Una de las muestras de

129
antígeno deberá estar teñida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento
(frente de corrida).
 Se asegura que las tiras de papel de filtro estén bien colocadas y se conecta
nuevamente el aparato, cuidando que la corriente sea correcta.
 Cuando se observa que la muestra teñida ha migrado lo suficiente hacia el ánodo para
una correcta separación, se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la
cuba. Se remueve el agar del canal para colocar el anticuerpo específico. Esto debe
hacerse con rapidez para evitar la difusión excesiva del antígeno.
 Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda durante 24 a 48 horas. Para una
correcta interpretación de los resultados, la capa de agar puede teñirse de manera
similar a la descripta para la técnica de inmunodifusión doble. (Ver capítulo sobre
técnicas de interacción secundaria)

Aplicaciones de la inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antígenos o anticuerpos en una mezcla
antigénica debido a su diferente movilidad electroforética, observándose el resultado por medio
de la tinción de las bandas de precipitación que se producen luego de la incubación con el
antisuero.
Es una técnica cualitativa y semicuantitativa, pues se puede estimar la concentración de
antígenos según sean las características de las bandas de precipitación respecto de la muestra
testigo normal. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar, a mayor intensidad,
longitud y cercanía de las bandas al lugar de siembra del anticuerpo, mayor es la concentración
inicial del antígeno.
En el diagnóstico de laboratorio de las paraproteinemias, los resultados de la electroforesis de
zona y de la inmunoelectroforesis deberán ser combinados. Así, por ejemplo:
La presencia de un aumento franco o de una espiga en la región gamma en una electroforesis
sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. No obstante, es
necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de cadena pesada y
de cadena liviana de la inmunoglobulina.
La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es
policlonal o monoclonal.
La disminución o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o
deficiencias inmunológicas, pueden ser analizados mediante esta técnica.
La inmunoelectroforesis permite la identificación de cadenas livianas en la orina de enfermos
con discracias de células plasmáticas o trastornos autoinmunitarios, mediante anticuerpos anti–
kappa o anti–lambda específicos. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal
de la proteína de Bence–Jones en el mieloma.
Finalmente, la inmunoelectroforesis es útil para identificar las proteínas presentes en
cantidades elevadas en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con diversas enfermedades
nerviosas.

130
Comparación de un proteinograma con una inmunoelectroforesis.

131
Técnica de inmunoelectroforesis:

A) Gel de agar vertido y solidificado sobre un


portaobjetos.
Se han excavado una ranura para el antisuero
y un pozo para el antígeno.

B) El pozo para el antígeno se ha llenado con


el suero en estudio.

C) Los componentes del suero son separados


por electroforesis.

D) La ranura se llena con antisuero.

E) El suero y el antisuero difunden a través del


agar.

F) Se forman líneas de precipitación. Cada


línea corresponde a un único componente del
suero.

Bibliografía

1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana 1º edición,


septiembre de 1986. Capítulo 6.
2. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Bs. As. : Editorial Médica
Panamericana 1º edición, octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de
1996. Capítulo I.
3. Inmunología Básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.
4. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunología Básica y Clínica. Editorial El Manual Moderno
S.A. de C. V. México D.F. 7° edición. 1993 Sección II. Capítulo 18.

132