MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL AULA MOVIL DE

BIOTECNOLOGÍA EN EL DESARROLLO DE TRANSFERENCIA DE

EMBRIONES

MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN EL AULA MOVIL DE

BIOTECNOLOGÍA EN EL DESARROLLO DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

El doctor ALEXANDER CAMARGO se encargó de explicarnos las funciones de todos los

materiales y equipos existentes en el aula.

ESTEROSCOPIOS

Es Importante saber qué tipo de esteroscopio se utilizara en el laboratorio, hay unos que
vienen con luz externa y luz interna, los de luz interna no son recomendables porque
calientan los embriones afectando su viabilidad.

Este modelo sirven más para ver ovocitos y algunas otras estructuras.

Estos no son ideales para trabajar con transferencia, porque se pueden observar muy
superficiales. El primero tiene dos bombillos uno en la parte de arriba u otro en la parte de
abajo.
ECOGRAFOS

Este Ecógrafo tiene impresora para colocar memoria, para grabar imágenes, pero la
resolución es muy baja este microscopio es ideal para campo se puede utilizar todo el día y
es japonés, para saber interpretar el ecógrafo debemos conocer bien los sistemas de
reproducción del macho y la hembra. Hay unos pequeñitos que la pila le dura unas 2 a 4
horas si se piensa trabajar todo el día ganadería no sirve porque se recalienta.

Es importante saber las funciones de los diferentes ecógrafos.

VAGINAS ARTIFICIALES PARA BOVINOS Y EQUINOS

TATUADOR Y TOPIZADOR
ELECTROEYACULADOR

Este electro eyaculador es automático hay que tener en cuenta la carga de corriente que se
transmite al toro, todos no reaccionan a la misma potencia porque hay toros que eyaculan
rápido, otros se pueden caer de tanto voltaje o que estaba directo en el momento de
conectarlo también pueden salir encalambrados debido a transmisión muchos impulsos,
este se puede llevar cargado utilizando encendido automático o manual que de esta ultima
forma no es aconsejable utilizarlo ya que todos los toros no reaccionan al mismo impulso,
siempre que lo prendamos tiene que estar apagado, porque cuando se conecta al meter la
bala y se prende los impulsos fuertes que transmiten tumban el toro.

MATERIALES

FUNDAS

La mejor funda para transferencia de embriones es la francesa, hay que saberla destapar, el
embrión sale por un lado donde se encuentra el orificio, para destaparlo lo ideal es retirarlo
del empaque por la parte de arriba no por la parte de abajo se coloca el embrión luego la
pistola.

PISTOLA PARA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

La forma de almacenar una pistola es con la fibra en la parte de atrás para que no se vaya a
perder el aro que es el encargado de coger la funda, tratar de no cogerla tanto ya que esta
totalmente estéril porque este irá dentro del útero. Tener bien la pistola para evitar que se
salga el embrión, luego se coloca la camisa y aplicamos gel especial. La posición de la
pistola mientras terminamos de prepararla debe ser horizontalmente por que si la ponemos
en una posición vertical el embrión se cae. Luego procedemos a pasar la pistola por la
cerviz.

La pistola es del mismo tamaño que la funda esta tiene la capacidad de llegar delante del
punto blanco, importante antes de utilizar la pistola desinfectarla con alcohol y luego la
limpiamos para evitar que el embrión se muera.

PAGILLAS DE CONSERVACIÓN DE EMBRIONES.

Se empacan en mini pajillas y pajillas, de 0.25 o pajillas o 0.5 irradiadas que viene
esterilizadas, la diferencia de la otra vale 30 mil pesos la otras que no son radiadas valen
1.000 pesos, en el laboratorio debe estar todo marcado ya que se trabajan con diferentes
soluciones, holdi, pbs, etiglicol, lidocaína que es anastasia en novillas donadoras se utiliza
5, a 6 cm su efecto es que el animal pierda el movimiento en la cola, evita que defeque, que
haga contracciones, al quedar mal aplicada el animal tiene contracciones movimiento en la
cola, lo ideal es que quede bien anestesiada y desinfectada.

ESTILETE

El estilete sirve para permitir que la sonda fole coja firmeza y pueda pasar por la cerviz a
realizar el lavado en la donante.

SONDA FOLE.

LAVADO DE EMBRIONES

Esta sonda es de veterinaria es la ideal para transferencia de embriones no se aconseja

utilizar la sonda humana el gruesor de estas es muy diferente, lo primero que se hace es
probar la sonda que este buena lo hacemos aplicando suero con una jeringa para saber que
el balón de la sonda esta bueno la capacidad de liquido en el balón es aproximadamente de
5 a 6 centímetros, en novillas si se aplica más cantidad se puede maltratar el cuerno, ideal
es sacar la misma cantidad que se aplicó. La sonda tiene dos vías una por donde entra el
suero y otra por donde recoge el embrión.

La sonda es la que recogerá los embriones necesita ir acompañada del estilete para que le
de firmeza y pueda pasar por el cerviz porque sola por su consistencia no le permite entrar,
la sonda tiene dos entradas o dos salidas también viene irradiada, para llenar balón
importante sacar el estilete, la función del balón es no dejar que salga la sonda, también se
debe lubricar el estilete con liquido para no causar lesiones.

El PBS está compuesto por suero lactato de rinyer solución de jarba x 100 cm de PBS que
es con el que se utilizara para hacer el lavado.

PARA ESTERILIZAR

Se utiliza la autoclave, papel periódico cinta, desinfectante cuaternario se lava con jabón
neutro se seca y se pasa al autoclave a una temperatura de 110º se deja aproximadamente
media hora quedando estilizadas las sondas fole.

CONDUCTOS O LLLAVES

Se ubican en el PBS para la transferencia.

FILTROS

Los filtros son los que recogen los embriones después del lavado, no se debe dejar que les
llegue luz ni rayos del sol es mejor protegerlo para que no se mueran los embriones.

Hay dos tipos de filtros y la diferencia es bastante el mejor es el filtro plano

Al dejar que el segundo filtro se llene de liquido con PBS se perderán los embriones, lo
ideal es no dejar que se seque el filtro por que se mueren los embriones.

PISTOLA MICROPIPETA

Hay pistolas de diferentes tamaños que facilitan el manejo, la clave de manejarla está en
saber coger los embriones y clasificarlos el tiempo aproximado es de 5 minutos hay que
estar observándolos por el esteroscopio
CAJAS DE PETRI O PLATOS CUADRADOS

Sirve para depositar los ovocitos clasificados

PLATO FERTLIZACION INVITRO

Se utiliza para echar los ovocitos, se clasifica cada una por letras

TRABAJO EN LABORATORIO

La idea principal de la practica en laboratorio es saber armar y coger la micropipeta para

luego coger los ovocito también trabajar con los dos esteroscopios que hay para aprender a
manipular y observar bien los ovocitos como la zona pelúcida ya que los embriones son
parecidos en tamaño y en la zona pelúcida.
 PROCESO PARA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

PROTOCOLO DE SUPEROVULACION: (SPO) es la inducción de ovulaciones

múltiples mediante el uso de gonadotropinas exógenas. Esta técnica es empleada
en el procedimiento de producción y colecta de embriones.

TIEMPO: 15 DIAS
DIA HORA DOSIS
0 DIB + 50 MG DE PROGESTRERONA
(GESTAVET) +2ML BE
4 6:00 am 3,2 ml pluset
6:00 pm 3,2 ml pluset
5 6:00 am 2.4 ml pluset
6:00 pm 2,4 ml pluset
6 6:00 am 1.6 ml pluset + 3 ml PgF2α
6:00 pm 1.6 ml pluset + 3 ml PgF2α + Retiro DIB
7 6:00 am 0,8 ml pluset
6:00 pm 0,8 ml pluset
8 6:00 am PRIMERA I.A + 2.5 GNRH
 6:00 pm SEGUNDA I.A
9 6:00 am TERCERA I.A
15 2:00 pm Colecta, evaluación y Congelación

1.2 COLECTA DE EMBRIONES

Los pasos para desarrollar esta práctica, una vez hayan sido superovuladas e
inseminadas las hembras:

 MATERIALES

 Guantes de látex
 Mangas para palpación
 Alcohol
 Jeringa y Aguja calibre 18
 Lidocaína
 Tijeras
 Yodo
 Agua
 Papel secante
 Sonda Foley
 Estilete
 Sondas de conducción de dos vías
 Filtro de colecta
 Medio de lavado (PBS o lactato de Ringer)
 Gel lubricarte

 PROCEDIMIENTO

- Procedemos a revisar los materiales y armar el sistema de lavado y

colección de embriones:
 Desinfectamos el estilete (flameamos todo el estilete)
 Lavamos el estilete con lactato de Ringer.
 Aplicamos en el estilete gel lubricante
 Procedemos a introducir el estilete en la sonda Foley sin sacarlo de su empaque,
para evitar contaminación.
- Conectar: el sistema de conducción el filtro de colecta por la vía de

Introducción de la sonda Foley por vía

- Palpación y Ecografía: mediante esta práctica podemos estimar el número de
cuerpos lúteos desarrollados en cada ovario.
- Anestesia epidural: En primer lugar, se rasura y desinfecta la región sacro-
coxígea. A continuación, se localiza el punto de punción a nivel del primer espacio
intercoxígeo mediante balanceo de la cola. Sujetando la cola, se sube y se baja. La
primera articulación que se hace obvia caudalmente al sacro será el primer espacio
intercoxígeo (Co1-Co2). La aguja empleada para esta punción es de 4 cm de
longitud y calibre 18 G. Para asegurarse de que está correctamente ubicada se
utiliza la técnica de la gota pendiente –si se halla en el lugar correcto, al poner una
gota sobre el extremo de la aguja, ésta es aspirada debido a la presión negativa
existente en el espacio epidural. La mezcla anestésica utilizada en este caso está
constituida por un anestésico local (lidocaína, 0.2 mg/kg).

- Higiene de la vulva ,zonas adyacentes y Secado

- Introducción de un brazo por vía rectal
-

- Pasamos vagina, cervix, cuerpo y llegamos al cuerno

- Retiramos un poco el estilete
- Inflamos el balón con medio de lavado (PBS o Lactato de Ringer): hay que
determinar y anotar la cantidad exacta de medio de lavado utilizado ya que esa
misma cantidad es la que debe retirarse en el momento de desinfler el balón para
realizar el lavado en el otro cuerno.

- Sacamos el estilete y conectamos con el sistema de conducción de dos vías

- Liberamos medio y lavamos el cuerno: iniciamos el lavado del cuerno abriendo
la llave para que entre el medio y al tiempo masajeando con suavidad el cuerno
para ayudar a desprender las estructuras.

después de terminar el lavado en el cuerno hay que sacar el liquido (la misma
cantidad que se deposito al inicio) de la sonda Foley (desinflar el balón) y volver a
realizar el mismo procedimiento en el otro cuerno

SIMULACIÓN DE LAVADOS UTERINOS EFECTUADOS POR LOS

APRENDICES DE TECNOLOGÍA EN REPRODUCCIÓN BOVINA.

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS

La transferencia de embriones es una técnica de recolección mediante lavados uterinos

(Donadora) para posteriormente colocarlo en el útero de la hembra (Receptora).
El proceso se inicia con la sincronía de celos tanto en la donadora como receptora, luego la
súper ovulación de la donadora con 2 dosis diarias de Gonadotrofinas durante 4 días, 2 o 3
días después de iniciado el tratamiento se aplica una prostaglandina para posteriormente
inseminar 2 o 3 veces con un intervalo de 12 horas. La supero ovulación se inicia de 9 a 10
días terminado el celo con presencia de CL y al 5 día de colocar el implante de
Progesterona.
El día 7 después de la IA se realiza el lavado del útero de la donadora, previo al lavado los
animales se deben medicar con Lidocaína al 2% a razón de 3 a 5 ml en la zona epidural,
mediante el recto se realiza una palpación para introducir al útero una sonda Folley nº 16 o
18 de 2 vías que posee un balón de 5 a 30 ml en donde los cuernos son lavados con un a
solución de 30 a 60 ml de una solución salina estéril, la cual es expulsada mediante una
jeringa de 50 ml.
Durante la recolección de embriones la solución separa los embriones para que la finalizar
una pequeña `porción de liquido concentrado y retenido en el filtro es vertido en placas de
petri (100 mm X 20 mm), para la búsqueda de los embriones se emplea una lupa
estereoscópica (40 X) en donde los embriones son seleccionados e identificados para
pasarlos a una placa de petri redonda (40 mm X 10 mm) con medio de mantenimiento. Los
embriones de buena calidad son montados en pajuelas de plástico estéril de 0.25 ml para
luego ser almacenadas en nitrógeno a -196º c.

SIMULACIÓN DE LAVADOS UTERINOS EFECTUADOS POR LOS APRENDICES

DE TECNOLOGÍA EN REPRODUCCIÓN BOVINA.

ACTIVIDAD REALIZADA:
El 25 de noviembre del 2010 nos dirigimos al corral de la finca el Remanso con el fin de
realizar el correspondiente simulación de lavado uterino a las vacas con el procedimiento,
manejo de los materiales y una correspondiente aclaración de dudas.
Cada integrante del grupo paso y realizo una previa palpación, dio un diagnostico y
posteriormente si se encontraba vacía el lavado. Con este procedimiento lo que se buscaba
era realizar un lavado a las vacas vacías con el fin de afianzar conocimientos y despejar
dudas, manejo de los materiales y aplicar el proceso tal como se debe realizar.
Los resultado fueron exitosos, el trabajo se culmino alrededor de las 5 de la tarde.
Materiales utilizados:
Sonda Folley

Estilete

Guantes

Fundas
Lactato De Ringer

Filtro
Agujas, Jeringas

Conductos

Gel no espermicida
Lidocaína 2%

El trabajo en el corral se inicio alrededor de las 3 de la tarde con el ganado de ordeño con
los siguientes resultados:

Nº VACA COLOR EDAD ESTADO OBSERVACIONES QUIEN TRABAJO

1105 Blanca 4 Años Re Chequeó Alex Camargo
7005 Parda 4 Años Vacía Alex Camargo
7003 Negra Involución Uterina Alex Camargo
9378 Parda 5 Años Vacía No Sé Trabajo Alex Camargo
9804 Parda 4 Años Vacía No Sé Trabajo Oscar Álvarez
4007 Parda 5 Años Vacía Primer Lavado Harbey Castro
6087 Amarilla4 Años Vacía No Se Pudo Martha Ángel
1095 Parda 4 Años Vacía Segundo Lavado Oscar Álvarez
2002 Negra 4 Años Vacía Tercer Lavado Martha Ángel

Pasos para un lavado uterino (donadora)

1. Sujeción del animal en el brete

2. Limpieza y desinfección de la zona epidural

3. Aplicación de Lidocaína 2%

4. Amarrado de la cola

5. Palpación rectal y desocupado del recto

6. Lavado o limpieza de la zona epidural

7. Probar los materiales que se encuentren en perfectas condiciones

8. Palpación

9. Introducción de la sonda Folley vía vaginal

10. Ubicación más cercana al ovario

11. Retiro del estilete

12. Llenado del balón

13. Llenado del cuerno con solución salina del tamaño de una gestación de 45 a 60 días

14. Salida del medio con los ovocitos.

15. Retiro de la sonda para ubicarla en el otro cuerno

16. Se repite procedimiento del lavaje

17. Retiro de la sonda

18. Ovocitos al laboratorio

19. Limpieza y desinfección de los materiales utilizados

Dudas sobre transferencia de embriones

Jairo Serrano 03/02/2015 1 Comentario

¿Qué es una transferencia de embriones?

 Es una biotecnología para el mejoramiento genético y repoblamiento del ganado, consiste en
provocar que una vaca o novilla “donadora”, mediante un tratamiento hormonal e inseminación con
un toro probado con un alto valor genético, produzca varios embriones que siete días después le son
extraídos para ser transferidos a otras hembras “receptoras”, que previamente fueron sincronizadas
con el calor de la “donadora”. La receptora no transmite ninguna característica genética a la cría y
sólo sirve para mantenerla hasta el parto y durante la lactancia.

¿Por qué se realiza la transferencia de embriones?

En condiciones normales, cada vaca produce una sola cría al año, lo cual significa que cuando
mucho producirá 6 a 8 becerros durante su vida. A través de la inseminación artificial se pueden
obtener miles de crías de un toro; con la transferencia de embriones se han llegado a tener más de
cien crías de una vaca durante su vida productiva, lo cual facilita el mejoramiento genético, con el
consecuente incremento de la producción de carne y/o leche.

¿Qué otras ventajas tiene la transferencia de embriones?

 Permite hacer una rigurosa selección por el lado materno logrando un progreso genético
acelerado.

 Se pueden obtener crías de novillas que aún no alcanzan la edad y peso para cargarse, ya que
será la receptora quien se encargue de mantener la preñez y parir la cría.

 Es posible obtener becerros de vacas de alta calidad que por enfermedad o edad avanzada ya no
son capaces de producir por si mismas una cría.

 Con la ayuda de la bipartición de embriones se pueden obtener partos gemelares y aumentar la

cosecha de becerros, sin el riesgo de obtener hembras estériles ya que ambas crías, por proceder
del mismo embrión, serán del mismo sexo.

 Es una excelente ayuda para evaluar la capacidad fertilizadora de los sementales, así como para
determinar si son portadores de algunos defectos hereditarios.

 A través de congelamiento de embriones y de la fertilización en el laboratorio se pueden tener

crías de donadoras que ya murieron.

¿Existen algunas desventajas en este procedimiento?

Normalmente se requiere de una fuerte inversión inicial debido al alto costo de las hormonas, equipo
y mano de obra, así como de la alimentación de donadoras y receptoras antes y después de la
transferencia.

El procedimiento está constituido por infinidad de detalles que deben realizarse a la perfección para
lograr buenos resultados, por lo que se debe contar con personal altamente capacitado para llevarlo
a cabo.
 La principal desventaja es la imposibilidad para predecir los resultados, ya que hay mucha variación
en la producción de embriones por cada donadora; además de que muy fácilmente una pequeña
falla en el proceso reduce drásticamente el porcentaje de gestación.

¿Es rentable hacer transferencia de embriones?

A pesar de los altos costos que tiene un programa de esta naturaleza, si se efectúa cuidando los
detalles se obtendrá un número de crías que permitirá recuperar la inversión y obtener buenas
ganancias, ya que los becerros son muy bien cotizados, tanto por su calidad genética, como por el
hecho de haber sido procreados a través de esta técnica.

El procedimiento de la transferencia de embriones está formado por estos puntos:

 Selección de donadoras, sementales y receptoras.

 Superovulación e inseminación de las donadoras.

 Sincronización estral donadora – receptoras.

 Recolección y evaluación embrionaria.

 Transferencia a la receptora.

 Congelación de embriones sobrantes.

¿Qué características deberá tener una donadora?

Desde el punto de vista genético, debe ser un animal sobresaliente en cuanto a producción de carne
y/o leche, evaluando esto tanto en base a su propia producción como las de sus hijos e hijas. No
debe descuidarse el aspecto del tipo del animal, ya que muchas veces es lo que da mayor valor
comercial a las crías.
Además debe ser un animal con buenos antecedentes reproductivos, presentando ciclos estrales de
duración normal, con buena fertilidad (cargándose con uno o dos servicios o en un máximo de dos
empadres), sin defectos anatómicos en el aparato reproductor.

En el aspecto sanitario, deberán estar libres de enfermedades, especialmente aquellas que afectan
la función reproductiva; según la región, deberán estar sometidas a un estricto programa de
vacunación y desparasitación para garantizar un buen estado de salud.
Deberán estar en perfectas condiciones físicas, ni gordas ni flacas, para obtener los resultados
esperados.

De preferencia deben emplearse en este programa toros probados, en producción y tipo, para
garantizar la calidad de las crías. Si se emplea un toro no probado, los becerros resultantes quizá
tengan menos valor que todo lo que se invirtió para producirlos.

¿Cómo se selecciona a una receptora?

Prácticamente seguimos los mismos puntos que en las donadoras, pero se pueden emplear animales
de cualquier raza o cruza (el cruzamiento aumenta la fertilidad), sin importar su producción, pero
teniendo en cuenta que se trate de animales jóvenes, sanos, con buen desarrollo corporal,
especialmente de la pelvis (ya que muchas veces tendrán que parir becerros muy pesados), en
perfecto estado nutricional, dóciles y fáciles de manejar y con una producción de leche suficiente
para criar hasta el destete a su becerro.
¿Qué significa superovulación?
Es el término empleado al referirnos a la producción de más de una ovulación (que es lo que sucede
normalmente), mediante la aplicación de hormonas que estimulan a los ovarios de la vaca, con la
finalidad que al inseminarla produzca un número mayor de embriones.

Para esto se usa una hormona (FSH), que hace que en ambos ovarios de la vaca se desarrollen
varios folículos, los cuales ovulan después de que la donadora sale en calor al aplicarle otra
hormona, prostaglandina, dos días después de haber empezado a inyectarle FSH; ésta se le inyecta
cada 12 horas por vía subcutánea durante 4 días.

Normalmente en estos programas se emplea la inseminación artificial de la donadora, dando un

servicio a las 12 horas y otro a las 24 horas de detectado el celo. Esta doble inseminación se debe
a que el período de ovulación puede llegar a ser de hasta 24 horas en las donadoras superovuladas.

¿Cómo se sincronizan los calores entre la donadora y la receptora?

Para sincronizar los estros entre la donadora y la receptora se pueden utilizar sincronizadores de
estro inyectados (prostaglandinas), aplicándose dos veces con intervalo de 11 días, de tal forma que
la segunda aplicación se realice un día después de haber empezado a superovular a la donadora.
También se pueden emplear sincronizadores en forma de implante, que se colocan
subcutáneamente en la oreja de cada receptora 7 días antes de iniciar la superovulación y se retiran
dos días después de haberla comenzado. Con cualquiera de estos métodos, las receptoras deben
estar en celo al mismo tiempo que la donadora o cuando mucho un día antes o uno después que
ella; si manifiestan el estro en cualquier otro día no será posible utilizarlas para la transferencia.

¿Cómo se recolectan los embriones?

Mediante un sencillo lavado de útero de la donadora, empleando para ello unos medios de lavado
que garantizan la supervivencia del embrión. Se le aplica anestesia epidural en la base de la cola
para evitar las contracciones del recto y que permita la manipulación del útero durante los 15 a 20
minutos que dura el lavado. Se introduce hasta el útero una sonda de hule látex que se fija mediante
el inflado de un globo que tiene cerca de la punta. Con ayuda de mangueras de hule se introducen
unos 100-200 mililitros de la solución al útero y por palpación se da masaje a los cuernos uterinos
para desprender los embriones y se extrae la solución hacia un filtro que retiene a los embriones,
dejando pasar sólo el líquido. El proceso se repite varias veces hasta agotar un litro de solución para
tener la seguridad de que salieron los embriones.
Sonda Foley para colecta de embriones.

Procedimiento de lavado.
 Si el lavado se hizo en forma adecuada es muy poco probable que quede algún embrión en el útero,
pero para mayor seguridad se aplican prostaglandinas a la donadora para provocarle un calor y evitar
que quede cargada.

Los embriones son microscópicos, por lo cual necesitamos localizarlos en el laboratorio con la ayuda
de un microscopio estereoscópico. Una vez terminado el lavado, el filtro se vacía en un recipiente de
plástico y se enjuaga con solución a presión. El recipiente se revisa a 15 aumentos y al localizar cada
embrión se va pasando con una pipeta a otro recipiente más pequeño que contiene la misma solución
con más albúmina.

Sólo sirven para transferencia aquellos embriones que están en un estado de desarrollo de mórula
o blástula, que es lo normal a los 7 días después de la fecundación. Los óvulos que no fueron
fecundados y los embriones de escaso desarrollo son desechados.

Desarrollo embrionario.
¿En base a qué se clasifican los embriones?
Los embriones transferibles son muy parecidos entre sí, pero pueden tener cierta diferencia en su
desarrollo y en sus características morfológicas. En base a esto se les clasifica de la siguiente
manera:

 CALIDAD 1: Excelente, sin ningún defecto.

 CALIDAD 2: Bueno, con defectos leves.

 CALIDAD 3: Regular, con defectos mayores, pero apto para ser transferido.

 CALIDAD 4: Dañado. No congelable ni transferible.

Los embriones de las primeras tres calidades pueden ser transferidos en “fresco” (inmediatamente)
o refrigerados (a 4°C hasta por 24-48 horas), pero sólo los de calidad 1 y 2 pueden ser congelados,
ya que los de calidad 3 no resisten la congelación.

¿Qué métodos se emplean para transferir los embriones?

Actualmente ya no es necesario operar a las receptoras para transferirles el embrión. Se emplea un
método no quirúrgico muy sencillo, parecido a una inseminación artificial. Con la receptora
anestesiada epiduralmente, se introduce el embrión en una pajilla similar a las empleadas para el
semen y se deposita con un aplicador en la parte más profunda de el cuerno uterino del mismo lado
donde se encuentra el cuerpo lúteo (palpado previamente), que es el lugar en que ovuló y será el
responsable de mantener la gestación. Normalmente se transfiere un solo embrión por receptora, ya
que si le depositan dos se corre el riesgo de que nazcan un macho y una hembra y ésta puede
resultar estéril.

¿Cómo se refrigeran y congelan los embriones?

La refrigeración nos permite tener viables los embriones hasta por 24-48 horas, colocándolos dentro
de recipientes en un refrigerador casero o de laboratorio, que nos de una temperatura de 4°C (sobre
cero).

Para la congelación, que mantiene viables a los embriones durante años, se requiere añadir 10% de
glicerol a la solución salina para que proteja al embrión durante el proceso de congelación. El
embrión se coloca en una pajilla previamente identificada con los datos de la donadora y del embrión,
y con la ayuda de un congelador manual, o una congeladora computarizada, se enfría lentamente
hasta -7°C (bajo cero), se provoca que empiece a formarse hielo en la solución, luego se enfría más
lentamente hasta -35°C; finalmente se pasan las pajillas al tanque con nitrógeno líquido a -196°C,
donde se almacenarán los embriones hasta ser descongelados y transferidos.

Congeladora de embriones.
Los embriones se descongelarán en forma parecida a la descongelación del semen, colocando la
pajilla a temperatura ambiente por 12 segundos y en baño maría a 37°C durante 10 segundos.
Posteriormente se extrae el embrión de la pajilla y, observándolo al microscopio, se pasa por varias
 soluciones con concentraciones decrecientes de un azúcar, sacarosa, para retirarle el glicerol que
se le puso antes de congelarlo, se vuelve a evaluar la calidad del embrión y se transfiere a la
receptora. Si se empleó etilén – glicol para la congelación, no es necesario retirárselo y simplemente
se descongela el embrión y se transfiere directamente a la receptora.

La bipartición embrionaria consiste en dividir los embriones de calidad 1 ó 2 por la mitad para formar
dos hemiembriones y aumentar así el número de crías de cada donadora. La bipartición se efectúa
con un aparato llamado micromanipulador, que nos permite sujetar el embrión para cortarlo por la
mitad con una micronavaja. Las dos mitades resultantes pueden transferirse una a cada receptora o
las dos a la misma, ya que ambas crías serán del mismo sexo.

¿Qué Resultados se Obtienen Normalmente de estas Técnicas?

 4 ó 5 embriones transferibles por donadora superovulada.

 33% de las donadoras superovuladas no producen embriones.

 65 a 70% de gestación con embriones frescos o refrigerados calidad 1 y 2.

 30 a 35% de preñez con embriones frescos o refrigerados calidad 3.

 50 a 60% de gestación con embriones congelados.

 50 a 65% de gestación con embriones bipartidos

 3 ó 4 superovulaciones seguidas de cada donadora (con intervalo de 60 a 90 días), antes de

cargarla para darle un año de descanso reproductivo.

En resumen, la transferencia de embriones, es una técnica reproductiva para acelerar el

mejoramiento genético y repoblamiento rápido de los hatos aprovechando los vientres de animales
de menor calidad para llevar a término gestaciones de becerros con alto potencial genético. Es una
técnica que bien aplicada puede significar un gran avance en el progreso genético de los hatos
ganaderos y que actualmente tiene la ventaja de poder realizarse completamente a nivel de campo,
sin necesidad de operar a los animales.

RECOLECCION DE LOS EMBRIONES BOVINOS

Gustavo A Palma
Introducción
Los embriones bovinos, destinados a un programa de TE pueden ser obtenidos del
útero por medios no quirúrgicos. Su recolección y transferencia con éxito dependen de
varios
factores. En primer lugar de la vitalidad de éstos para sobrevivir y llegar a término después
de ser recolectados del tracto genital, evaluados in vitro y transferidos a un genital receptor,
con cambios de medio y temperatura. En segundo lugar, depende de que la técnica de
obtención no ponga en peligro la integridad del tracto genital, a fin de poder repetirla tantas
veces como sea deseable y conveniente. La primera técnica de recolección de embriones
bovinos usada hace aproximadamente dos décadas, fue quirúrgica. La misma requería
anestesia general, inducida por medio de barbitúricos y mantenida por medio de inhalación
(halotano). Por medio de una incisión de 15 cm de longitud en la línea media, por delante
de
la glándula mamaria, se extraían los cuernos uterinos con los ovarios. El lavaje de los
cuernos y oviductos se llevaba a cabo el día 5-7 introduciendo catéteres de goma a través de
la pared dorsal del cuerno uterino y en la ampolla del oviducto. Cada cuerno era lavado con
volúmenes variables de 40-60 ml de una solución buffer (M 199). La manipulación
quirúrgica
del útero y de los ovarios conduce a lesiones que provocan formación de fibrina y
adherencias. Para minimizar ese efecto fue necesario trabajar con buenas condiciones de
asepsia, lavando el útero y los órganos adyacentes con solución fisiológica estéril,
conteniendo heparina. Con estas precauciones era posible llevar a cabo el lavaje a una vaca
sólo 3 veces como máximo, lo que constituyó una seria limitante en el uso repetido de esta
técnica. La tasa de éxito varió entre 50 y 70% de embriones y ovocitos obtenidos, en
función
del número de cuerpos lúteos presentes. Otra variante de la recolección quirúrgica fue el
by-
pass propuesto por Testart y Godard-Siour (1975), colocando la sonda a través de la pared
uterina por medio de vaginotomía (Fig. 1) bajo anestesia epidural. Después de la
colocación,
el catéter de goma era fijado por medio de un balón inflable. El útero fue lavado con 50-70
ml
de medio.
Fig 1. Método transvaginal (Testard y Godard-Siour, 1975)
Esta técnica permitió obtener 40-50% de embriones. Las infecciones y adherencias en
los cuernos uterinos y oviductos constituyeron las desventajas que limitaron, como en el
caso
anterior, la repetibilidad de la recolección e impidieron su difusión en la práctica. Ello
provocó
110 Palma
uno de los mayores cambios en la técnica de transferencia de embriones de la década del
`70. Aunque las primeras experiencias con la recolección no quirúrgica de embriones se
remontan a la década del cuarenta (Rowson y Dowling, 1949), recién a partir del trabajo de
Sugie y col. (1972) se obtuvieron resultados satisfactorios y repetibles (Seidel y col., 1977).
Métodos no quirúrgicos de recolección
La posibilidad de colocar en la especie bovina la sonda a través de la cérvix abrió
nuevas posibilidades a la recolección de embriones, simplificando el procedimiento y
disminuyendo el trauma uterino. Para ello se crearon diferentes modelos de catéteres:
rígidos (Sugie y col., 1972), semirígidos (Rasbech, 1976) y flexibles (Drost, 1976;
Newcomb y
col., 1978; Hahn, 1978). Los mismos podían tener 2 vías, una para insuflar el balón de
goma
e inmovilizar el catéter y la segunda para inyectar y recolectar el medio. Rasbech desarrolló
en 1976 un sistema semirígido de recolección, a partir de una sonda Folley de 2 vías. El
volumen de aire a insuflar oscilaba entre 12-15 ml. La inyección de medio se llevaba a cabo
con una jeringa de 60 ml. La sonda Folley era introducida en un tubo rígido, quedando libre
el
extremo anterior, a partir del balón para el aire y el extremo posterior. Los resultados
obtenidos por el autor (tabla 1) indican el éxito de la técnica propuesta, que constituyó el
punto de partida de los catéteres flexibles de 2 vías, empleados actualmente. Las
experiencias y recomendaciones de Rasbech siguen aún vigentes.
Tabla 1. Resultados obtenidos con la recolección no quirúrgica de embriones con el catéter
semirígido de Rasbech (1976)
Vaca
CL
(n)
Ovocitos/embriones
recolectados (n)
Medio
recolectado (%)
Nr. izq. der. izq. der. izq. der.
1 7 6 7 4 86 96
2 2 3 2 3 100 100
3 9 7 7 4 100 100
4 6 3-4 5 3 100 100
Izq.: izquierdo; der.: derecho
Los catéteres de 3 vías permiten inyectar el medio por la segunda vía mientras la
tercera conduce el líquido fuera del útero. En la actualidad se emplean catéteres rígidos y
flexibles, de 2 y 3 vías, y 3 métodos de recolección (Palma y col., 1991):
- Circuito cerrado con flujo continuo
- Circuito cerrado con flujo discontinuo
- Circuito abierto con flujo discontinuo
Recolección de embriones 111
Circuito cerrado con flujo continuo
Con este método (Elsden, 1976; Greve y col. 1977) se emplearon catéteres de 3
vías, rígidos (Cassou, 1984, Foto 1) o flexibles (Brand y col., 1978). Una vía, destinada a
la inyección del medio de lavaje, se conecta al frasco que contiene la solución por medio
de una tubuladura de goma látex o silicona. La solución puede inyectarse por gravedad,
colocando el frasco con el medio a aproximadamente 1 m por encima del frasco recolector
o con una jeringa, con el mismo procedimiento que el método de flujo discontinuo (Fig 2 y
3 ). Por la segunda vía se inyecta aire o medio para llenar el balón y por medio de una
tercera vía se recolecta la solución de lavaje, sin interrumpir la descarga.
Fig 2. Esquema del circuito cerrado con flujo continuo adaptado de Elsden (1976)
Circuito cerrado con flujo discontinuo
Con este método se usa el catéter de 2 vías (Foto 3, Fig 3a), una jeringa de 50-60
ml (Fig 3b), una válvula automática o manual (Fig 3c), una unión de vidrio o plástico en
forma de T o Y (Fig 3d) y las tubuladuras (Fig 3 I y II).
La válvula, que se coloca a la salida del frasco (Fig 3 c), permite extraer el medio e
inyectarlo en el interior del cuerno uterino. Luego de la inyección de un volumen variable
de medio (30-50 ml) se interrumpe el flujo de llenado para proceder a la segunda
maniobra; el cuerno es vaciado por la misma vía. Al ocluir la tubuladura de inyección (Fig
3 I) la unión de vidrio en Y desvía el medio a la segunda tubuladura (Fig 3 II) que lo
conduce al frasco recolector.
112 Palma
Fig 3. Esquema de circuito cerrado con flujo discontinuo (adaptado de Brand y
Hoogekamp, 1986). (a) catéter flexible de 2 vías, (b) jeringa, (c) válvula manual, (d)
unión de vidrio en Y, I vía de inyección del medio, II vía de recolección del medio.
Circuito abierto con flujo discontinuo
Inyección y recolección con una jeringa.
Esta técnica se emplea con los catéteres flexibles de 2 vías (Fotos 3,4,5 y 7) y no
requiere de tubuladuras (Fig 4). El medio se inyecta y recolecta por la misma vía y con la
misma jeringa (50 ml). Con ésta se descarga un volumen de medio fijado por el operador
(Fotos 1 y 2) quien, como en el caso anterior, debe palpar el cuerno uterino determinando
y controlando su llenado a fin de evitar lesiones de la pared uterina por exceso de medio.
Las maniobras siguientes variarán de acuerdo al tipo de técnica de lavaje que se aplique.
Algunos operadores fijan y masajean el útero durante la inyección del medio. Esta
operación es particularmente importante cuando el animal no está fijado con una
elevación del tren anterior, que facilite el retorno del líquido de lavaje. Las dimensiones y
peso del útero requieren que éste sea elevado por el operador.
Cuando la donante es fijada con una elevación anterior algunos operadores no
manipulan los cuernos uterinos, sólo verifican una vez el llenado. Luego retiran el brazo
del recto y continúan con la inyección de medio hasta completar el volumen
preestablecido de líquido. La recolección de los embriones en esta posición facilita el
lavaje en animales con pariciones múltiples, aun cuando se emplee además el masaje de
útero. Esta forma es aplicada en los Centros de TE donde ya se cuenta con la
infraestructura necesaria. Presenta la ventaja que la manipulación no irrita al animal y
facilita la operación. Mientras se descarga la jeringa en el frasco recolector el catéter es
ocluido con una pinza hemostática o un clamp.
a) Catéter flexible de 2 vías
b) Jeringa
c) Vávula manual
d) Unión de vidrio Y
I Inyección del medio
II Vía de recolección del medio
BR Botella recolectora
BM Botella con Medio
a
c
I II
d
BR BM
Recolección de embriones 113
Ventajas y desventajas de 3 métodos de recolección
Todas las técnicas, con sus diferentes modificaciones, como así también los
catéteres mencionados se emplean en la práctica con el mismo éxito. Por lo tanto, las
diferencias entre ellos, como así también las ventajas y desventajas observadas, no
constituyen elementos de juicio excluyentes de uno u otro. El operador será el que
determine, en función de su experiencia, medios e infraestructura disponible, qué técnica
Foto 2.
La recolección del medio inyectado
se lleva a cabo aspirando el medio
con ligera presión negativa y
elevando simultáneamente el cuerno
uterino por su pared ventral
Foto 1.
Recolección por medio del sistema
abierto. El operador inyecta el medio
de lavaje regulando el volumen de
inyección y masajeando
suavemente el cuerno uterino en
forma simultánea
Fig 4.
Esquema del circuito abierto con flujo
discontinuo. Inyección y recolección con
una jeringa
114 Palma
es la más adecuada para su modus operandi. Independientemente de esos factores, su
destreza es el factor más importante en la tarea de obtener los embriones.
El sistema de circuito cerrado con flujo continuo permite, en su concepción teórica,
un lavaje más aséptico frente al método de inyección y extracción con jeringa, ya que el
medio es conducido desde el útero hasta el filtro o el frasco de recolección sin solución de
continuidad. Ello es particularmente importante cuando los lavajes se llevan a cabo en
lugares abiertos. Sin embargo la tubuladura no es fácil de lavar y secar, lo que puede
provocar en la práctica, contaminaciones bacterianas, como consecuencia de un lavado
insuficiente o químicas, provocadas por un mal enjuagado o por la deposición de
sustancias esterilizantes (dióxido de etileno) en los restos de humedad.
El sistema de circuito abierto con jeringa no emplea tubuladuras y las jeringas son
descartables o de fácil lavado y esterilización, razón por la cual el riesgo de falta de
limpieza e insuficiente secado es mínimo. Con este sistema se debe tener siempre la
precaución de obturar el catéter a fin de no perder el líquido que pueda quedar en el útero
mientras la jeringa con el medio recolectado es descargada en el frasco recolector. Esta
maniobra es sencilla y rápida si la donante es un animal manso y/o está bien preparado
(anestesia epidural, tranquilizante etc.). Sin embargo debe repetirse entre 14 y 20 veces
por animal, de acuerdo al volumen de lavaje empleado. Ello, en una vaca indócil o
intranquila puede conducir a complicaciones con pérdida de medio. Los programas de TE
ambulantes constituyen una limitante adicional para este método, dado que la
infraestructura disponible en condiciones extensivas es muy variable y en muchos casos
inadecuada para la recolección de los embriones.
El sistema de circuito cerrado con flujo continuo, como ya fue mencionado, facilita el
lavaje por que la entrada y salida del medio se realiza en forma automática y continua,
disminuyendo el tiempo de lavaje. El riesgo de pérdida de medio como consecuencia de
movimientos bruscos de la donante es considerablemente menor. El sistema de circuito
cerrado con catéteres rígidos (3 vías) es tan costoso que no se emplea uno por animal
sino el mismo para varios lavajes sucesivos. Ello aumenta el riesgo de contaminación
bacteriana siendo esa, posiblemente, la razón por la cual su uso no está extendido. Por
otra parte el catéter es de acero y permanece en el cuerno uterino durante el lavaje. Su
empleo es especialmente riesgoso en animales indóciles o intranquilos por peligro de
lesiones de la pared uterina. La vía destinada al retorno del medio posee orificios de
reducida dimensión. Para evitar que ésta pueda taparse con el mucus cervical se
recomienda inyectar 10-20 ml de medio cuando el catéter atravesó la cérvix. Otra forma
que además evita el pasaje del mucus cervical al útero es aspirando el mucus con una
pipeta de inseminación por medio de una jeringa antes de introducir el catéter de
recolección. La sonda puede también taparse con coágulos de sangre o restos de
mucosa, como consecuencia de la laceración del endometrio, lo que impide el retorno del
medio. En ese caso se deberá conectar una jeringa a la tubuladura de esa vía para
destaparla mediante la inyección del líquido de lavaje. El circuito cerrado con flujo
discontinuo tiene menos riesgos de taparse al disponer de una vía común de inyección y
recolección. El catéter de doble vía que se emplea para ello dispone además de orificios
considerablemente mayores. Si éstos se taparan con mucus o coágulos, la siguiente
inyección de medio los liberará.
Los catéteres, disponibles en el mercado, constituyen también un tema per se en
cuanto a sus precios. El catéter de 3 vías de acero es el más costoso. Su precio pone en
duda su empleo si el profesional destina un catéter por donante como lo dispone la
Recolección de embriones 115
Asociación Internacional de Transferencia de Embriones. Los catéteres flexibles de 2 vías,
que se ofrecen específicamente para TE (Foto 3), son más accesibles que los primeros,
pero constituyen una inversión de importancia de acuerdo a la cantidad que se disponga.
El catéter armado a partir de una sonda Folley (Foto 4) reduce los costos sensiblemente
sin disminuir el éxito de recolección con respecto a los anteriores.
Preparación de la donante, anestesia epidural
La preparación del animal dependerá de varios factores, entre los que se
encuentran la infraestructura disponible de acuerdo al tipo de establecimiento ganadero
(producción intensiva o extensiva), la docilidad del animal como así también la destreza y
experiencia del operador.
Foto 3.
Catéteres flexibles de 2 vías, 16 y
18G Minitüb, Alemania
Foto 4
.
Catéter flexible de 2 vías, armado
con una sonda Folley (Lampeter,
1977)
Foto 5.
Punta metálica (según Lampeter)
de un catéter flexible. Antes del
lavaje debe controlarse la
integridad del balón
116 Palma
Antes de la operación de lavaje es necesario vaciar el contenido rectal, precisar la
posición y dimensiones del útero y la respuesta ovárica al tratamiento superovulatorio (N
o
de cuerpos lúteos, presencia de folículos). El vaciado del recto y la toilette de la región
perianal son las primeras maniobras. Usualmente se continúa con la tranquilización y
anestesia local de la donante (Peters y Ball, 1986; Mapletoft, 1986).
A fin de contar con una buena relajación del recto se puede aplicar anestesia
epidural baja (Hall, 1974; Lumb y Jones, 1979), administrando 4-6 ml de Lidocaina (2%),
en el espacio comprendido entre la primera y segunda vértebras coccígeas. La cánula se
coloca en una posición de 90
o
para atravesar la piel. Luego en un ángulo de 45
o
desde la
piel hacia craneoventral. Cuando la aguja ingresa al canal medular circula aire en su
interior, que provoca, en algunos casos, un ligero zumbido. Una prueba más segura es la
aplicación de unas gotas de anestésico en la entrada de la aguja, que serán aspiradas al
interior del canal vertebral, si ésta está bien colocada. Si la aguja llegase a topar una
superficie ósea significa que llegó al piso de la 1
o
vértebra coccígea. En ese caso, retirar
la aguja aproximadamente 0,5 cm (Westhues y Fritsch, 1960).
La inyección debe aplicarse lentamente y sin resistencia alguna.
El inicio del bloqueo sensitivo y motor se hace evidente por la flaccidez de la cola,
por la falta de respuesta del esfínter anal y de la vulva al pellizco. A pesar que la relajación
de la cola es inmediata, la acción anestésica sobre el recto y el esfínter del ano requiere
10 minutos aproximadamente. Por otra parte puede producirse un efecto anestésico
incompleto, con una buena anestesia de la cola (flaccidez) pero insuficiente anestesia de
los órganos de interés, causado por lo general por una incorrecta administración. En ese
caso deberá suplementarse o repetirse la dosis. Es importante destacar que una
insuficiente anestesia epidural puede ocasionar el fracaso del lavaje en animales
indóciles.
Al levantar la cola para inmovilizarla, después de la administración del anestésico,
ocurre -en algunos casos- el ingreso de aire al recto. Ello constituye una seria
complicación por que el mismo pierde sensibilidad y capacidad de expulsar el aire. Si este
fuera el caso se recomienda hacer caminar al animal a fin de que la prensa abdominal
ejerza presión sobre el recto y expulse el aire retenido. Otra alternativa es eliminar el aire
por medio de aspiración con un tubo flexible (Rubin, 1991), para lo cual se emplean una
bomba aspirante de pequeño poder. Levantar y fijar la cola sólo después que el operador
introdujo el brazo en el recto. La vulva y la región que la rodea deberán ser lavadas,
desinfectadas (iodo povidona, alcohol 70%) y secadas.
Cuando se trabaja con hembras indóciles es conveniente emplear una combinación
tranquilizante y relajante de 100-200 mg de clorhidrato de ketamina y 0,5-1,5 ml de
xilazina (0,1%) totales, según el peso del animal. También es posible la administración de
sólo uno de ambos productos. Después de su aplicación es importante dejar a la vaca
tranquila durante 10-20 minutos, a fin de que los ruidos y el contacto con el animal no
perjudiquen el efecto de los medicamentos. Por esta razón el tranquilizante se aplica en
general después del exámen rectal y antes del resto de los preparativos (toilette perianal,
anestesia epidural, materiales etc.)
Previo a la introducción del catéter de lavaje se puede aspirar el mucus cervical con
una pipeta de inseminación y una jeringa de 20 ml y aumentar la luz cervical con ayuda de
un dilatador de acero inoxidable (foto 6). Este instrumento es, además, de utilidad para
determinar el diámetro de la luz cervical a través del grado de dificultad para atravesar la
cérvix. Los operadores, que adecuan diferentes modelos y/o tamaños de catéteres según
Recolección de embriones 117
el diámetro del cuello del útero, podrán determinar con ayuda del dilatador cual será el
instrumento más adecuado para el lavaje. Si la cérvix presentó resistencia al pasaje, el
dilatador se deja colocado en la luz cervical -no en el cuerpo del útero - durante 2-5
minutos. Mientras tanto se puede llevar a cabo la palpación diagnóstica del útero y los
ovarios, a fin de determinar dimensión, forma, y respuesta superovulatoria (N
o
de cuerpos
lúteos y folículos), datos de importancia para el protocolo de cada donante.
Algunos operadores no emplean el dilatador y otros lo hacen cuando el grado de
oclusión cervical es tal que no permite la introducción del catéter de lavaje. La desventaja
de esta forma de trabajo es la extracción del catéter de la vagina con el riesgo de arrastrar
impurezas en el segundo intento. No es necesario esterilizar el dilatador ni el mandril,
bastará con un buen lavado y posterior tratamiento con un desinfectante de superficie
(alcohol etílico 70%, isopropílico 70%, etc.).
Foto 6. Dilatador cervical
Colocación del catéter y lavaje del útero
Antes de colocar el instrumento, éste debe ser enjuagado con la misma solución
destinada el lavaje (PBS + 1% SFB). Ello contribuirá a lubricar y eliminar las impurezas
que pudieran haber quedado después de una esterilización con gas (óxido de etileno).
El catéter es introducido en el vestíbulo de la vulva, separando sus labios. Los
catéteres de goma o silicona, a diferencia de los de acero, requieren para ello un mandril.
Para atravesar la cérvix el operador debe fijarlo por delante de la punta del catéter
modificando su posición hacia arriba y abajo como así también en forma lateral
sucesivamente, empujando suavemente el instrumento hacia craneal simultáneamente. Al
llegar al último anillo se deberá presentar el cuerno uterino, ligeramente elevado, frente a
la punta del catéter. En este momento es imprescindible tener especial precaución de
controlar la fuerza que se ejerce sobre el catéter, a fin de no atravesar bruscamente la
cérvix y perforar la pared uterina. Cuando el instrumento alcanzó el cuerno del útero, éste
último se endereza levantándolo de su cara ventral mientras se avanza el catéter muy
suavemente hasta el 1/3 medio del órgano.
No deberá existir resistencia alguna, si así ocurriera se debe retroceder el
instrumento, presentar el cuerno uterino (estirarlo suavemente) y avanzar nuevamente.
El ligamento intercornual, la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno deben
ser puntos de referencia permanente del grado de avance del catéter. Una vez alcanzada
la posición próxima a la deseada (por ejemplo borde del ligamento intecornual) se libera el
catéter del mandril, se desplaza este último unos centímetros hacia caudal y se deslizan
ambos suavemente hacia craneal, unos 5 cm. Repetir la operación un par de veces hasta
comprobar una óptima colocación del catéter en el cuerno uterino. De esta forma es
posible colocar el catéter sin manipular excesivamente los cuernos. Después de esta
maniobra se procede a inyectar con aire el balón del catéter. El volumen de inyección
varía en función del diámetro de esa porción del útero y esto depende de la edad y
tamaño del animal, como así también de las pariciones previas. En general el volumen
varía entre 15 y 20 ml. El operador es el que determinará, por medio de la palpación, el
118 Palma
volumen a inyectar. Se debe tener en cuenta que su exceso produce aplastamiento de la
mucosa endometrial con hemorragias, y en casos más graves, desgarro de la pared
uterina.
Con el catéter ya fijado, el operador deberá comprobar la correcta posición del
instrumento. Si fuera necesario se retirará el aire del balón de goma y se avanzará más
hacia craneal. Suele ocurrir que el operador inexperto cree fijar el catéter en un cuerno y
no recolecta medio con las sucesivas inyecciones de medio. Ello ocurre cuando el
instrumento fue fijado en el cuerpo del útero y el líquido fluye a ambos cuernos o si el
balón desgarró la pared uterina. En ambos casos se podrá comprobar por palpación la
ubicación del balón de goma o de la punta del catéter (si ésta es de acero, modelo
Lampeter, 1977a y b). Si el balón se encuentra en el extremo anterior del cuerno uterino y
éste no se ingurgita al inyectar la solución significa que el exceso de aire del balón
desgarró la pared uterina o que ésta fue perforada con la punta del catéter. El medio es
expulsado en dirección a la cavidad abdominal, en algunos casos sólo un reducido
volumen sanguinolento es recuperado.
La presencia de la herida no significa que se deba renunciar al lavaje del cuerno,
particularmente si se trata de embriones de gran valor. Resolver este problema requiere,
sin embargo, destreza y sobre todo mucha delicadeza para trabajar con el útero perforado
y no agravar la lesión. Ello constituye una seria limitante sobre todo si se tiene en cuenta
que esos problemas son producto de la inexperiencia. El operador deberá decidir de
acuerdo a su criterio cual será la actitud a tomar. El catéter debe ser colocado delante de
la lesión, si es que su ubicación lo permite. Ello requiere buena sincronización entre el
operador y su asistente.
Dado que la lesión sólo puede ser determinada por crepitación en el momento de la
inyección del medio de lavaje, junto con la baja o nula recuperación del líquido ya
mencionadas, no es posible fijar su posición después que el balón fue desinflado. En
consecuencia el operador deberá estar preparado para avanzar con el catéter cuando el
asistente vacíe el balón. El instrumento deberá ser colocado por lo menos 5 cm por
delante de la lesión (de acuerdo al tipo de catéter), para evitar el aumento de la lesión de
la pared del útero al inflar el balón. En los casos en que el catéter no pueda avanzar más
(genital muy largo o posición anterior de la lesión provocada por el extremo anterior del
catéter) se recomienda renunciar a ese cuerno para evitar complicaciones de gravedad.
Si la rápida evaluación indica que el catéter está bien colocado se procede a
inyectar el medio de lavaje. El volumen de líquido a inyectar varía de acuerdo a la
dimensión del cuerno y en función con la proximidad del catéter a la unión útero-tubárica.
En consecuencia, la cantidad de medio debe ser regulada cuidadosamente por el
operador, a fin de inyectar la suficiente cantidad para producir en el interior del cuerno
uterino, la presión de retorno sin que su exceso provoque dolor, que intranquiliza al
animal, o lesiones. El volumen a inyectar varía entonces entre 30-50 ml. El volumen total
empleado para cada cuerno uterino variará según el criterio del operador entre 500, 700
(Munar y col., 1989) y 1000 ml (König y Rommel, 1987). Este puede ser recolectado en
diferentes tipos de recipientes y filtrado durante o después de la recolección. La
recuperación óptima no es inferior al 90% del volumen inyectado. Algunos autores
sostienen que la mayor parte de los embriones y ovocitos se obtienen después de haber
recuperado 200 ml. La temperatura del medio de lavaje debe ser de 37-39
o
C, los frascos
a tal fin deben mantenerse en baño de María (foto 11). Una vez terminado el lavaje se
repite la misma operación en el otro cuerno uterino.
Recolección de embriones 119
De acuerdo al grado de flexibilidad del catéter es posible cambiarlo de cuerno
uterino sin sacarlo del tracto genital. Para ello es conveniente retirar el catéter flexible
hasta la cérvix e introducir lentamente el mandril. El modelo Lampeter (1977, foto 4 y 7),
con punta metálica (foto 5), se adecua muy bien a esta operación, por que cuando el
mandril llega a la punta se produce un chasquido (Lampeter, 1978). Catéteres muy
flexibles (goma látex) son deformados por los anillos de la cérvix, lo que impide la
colocación del mandril, razón por la cual es necesario sacarlos del tracto genital, al menos
hasta el segundo anillo de la cérvix, para introducirles el mandril.
Una exitosa maniobra de lavaje no garantiza siempre la recolección del número
esperado de embriones/ovocitos en función de la cantidad de CL palpados. Las razones
que motivan estas diferencias cuantitativas pueden ser variadas y no se conocen con
exactitud. No siempre es posible explicarse este fenómeno a través de un mayor número
de ovocitos no fertilizados, embriones retardados o degenerados que pueden quedar
atrapados en el oviducto o ser reabsorbidos. La falta de experiencia puede ser una razón
válida, como así también problemas de lavaje aún en grupos experimentados. La
repetición del lavaje el mismo día (6-12h después) o al día siguiente (Landsverk y col.,
1991) ha dado, en algunos casos, buenos resultados para aumentar la tasa de
recolección, razón por la cual debe tenerse en cuenta un segundo lavado.
Formas de obtención y búsqueda de los embriones
Luego del lavaje por medio de las técnicas no quirúrgicas, la aislación de los
embriones de los grandes volúmenes de medio se puede hacer por medio de
sedimentación o filtración del medio recuperado. Para la sedimentación de los embriones
se emplean recipientes con forma de embudo y un cierre hermético en su fondo, probetas
o frascos de 0,5-1,0 l. Los recipientes deben estar a una temperatura constante de 37°C ó
20°C (baño de María, foto 11, o temperatura ambiente) y protegidos de la luz solar directa.
La sedimentación de los embriones requiere 20-30 minutos. Cumplido este tiempo se
elimina el sobrenadante por medio de un tubo flexible (tipo sondas pediátricas
nasogástricas) que, por capilaridad elimina lenta y progresivamente (de arriba hacia
abajo) el volumen recolectado, a fin de evitar turbulencias que hagan ascender a los
embriones. El tiempo necesario para eliminar el sobrenadante varía, en función de su
volumen y del tamaño de la sonda, entre 15-25 minutos. La forma y velocidad de
eliminación del medio de lavaje es por goteo rápido.
Foto 7.
Catéter de 2 vías con punta metálica
según Lampeter, Mintüb
120 Palma
Para acortar el tiempo que demandan las 2 operaciones mencionadas se emplean
actualmente filtros estériles con malla de acero inoxidable o plástico de 60-90 µm de
diámetro de poro. Estos se pueden presentar en recipientes con forma de embudo (foto 8)
donde se vuelca el medio recolectado del frasco (después del lavaje) o directamente del
catéter (durante el lavaje). Por medio de este último procedimiento el filtro se va vaciando
por su parte inferior a medida que se llena con el medio recolectado, ahorrando de esta
forma el tiempo de sedimentación, dado que los embriones quedan contenidos en el
recipiente filtrante. Otros dispositivos de filtración están unidos a un tubo de silicona, se
colocan en el recipiente con el medio recuperado (probetas) y eliminan el sobrenadante
por medio de capilaridad (foto 9). Los embriones quedan, de esta forma, retenidos en la
probeta por medio de su malla filtrante intercambiable. La firma que los comercializa
(Minitüb) recomienda sin embargo un tiempo de sedimentación de 20 minutos. Otro filtro
(Minitüb, foto 10) tiene forma de placa de Petri, separado por una membrana filtrante. Su
base plana y transparente permite retirar los embriones bajo observación microscópica
con el ahorro consecuente de tiempo.
El volumen de solución conteniendo los embriones (40-50 ml) se vuelca en 4-5
vidrios de reloj o en 2-3 placas de Petri (de 130 mm de diámetro) con divisiones. Para
garantizar una completa observación visual de la superficie total de la placa, la búsqueda
deberá hacerse en forma de guarda griega, tanto en el sentido de las abcisas como de las
ordenadas (orientándose de acuerdo a la disposición de los cuadrados, Fig 5). Para ello
existen en el mercado placas cuadriculadas como la de la figura. El cuadriculado puede
trazarse, además, en las placas plásticas con un marcador fino indeleble o una aguja
hipodérmica, en la parte externa del piso como también en la tapa, colocando ésta bajo la
placa durante la búsqueda.
Fig 5. Procedimiento de búsqueda de los embriones
Foto 8
.
Filtro Em-Com (USA)
Recolección de embriones 121
Los embriones encontrados deberán ser transportados a una placa de Petri más
pequeña (
φ
35 mm) o a una placa con cuatro celdas, que contenga medio enriquecido con
suero. Esta operación deberá repetirse a fin de "lavar" los embriones antes de la
transferencia o de la congelación, según lo establecido en el reglamento de la IETS.
El pasaje de los embriones entre las placas se realiza con distintos tipos de tubos v
capilares. Algunos microcapilares (50 µl, Unopette®) se emplean con jeringas de 1 ml
(Foto 11), otros (5-20 µl) con micropipetas especiales (Transferpettor®, Foto 12) o
simplemente tubos de vidrio estirados con el fuego de un mechero Bunsen. En todos los
casos se deberá tomar la precaución de redondear, con la llama de un mechero, los
bordes del tubo que toman contacto con el embrión, a fin de evitar lesiones de la zona
pelúcida o de su masa celular. Una vez que los embriones fueron lavados se puede llevar
a cabo la evaluación morfológica de los mismos. Si los embriones son transferidos en un
lugar distante y la temperatura es baja es necesario el empleo de pequeños termos de
transporte (foro 13).
Foto 9
.
Filtro plástico con malla
intercambiable (Minitüb, Alemania),
combinado con una probeta para la
filtración después de la decantación
Foto 10. Filtro Miniflush® en forma de placa de Petri, Minitüb, Alemania
122 Palma
Foto 13. Kit de Transporte de embriones y baño de María transportable, Minitüb,
Alemania
Material necesario para efectuar 1 lavado y 6 transferencias
Lavaje
Dilatador cervical 1
Catéteres de recolección 2
Mandriles 2
Jeringa 60 ml 2
20 ml 2
Clamps 2
Botella para el medio de recolección 3
Tubo de recolección del medio, con peso y adaptador 2
Filtro 2
Recipiente de vidrio 500 ml 3
Lubricante

(PDF) Recolección de embriones RECOLECCION DE.... Available from:

https://www.researchgate.net/publication/323289371_Recoleccion_de_embriones_RECOL
ECCION_DE_LOS_EMBRIONES_BOVINOS [accessed Aug 14 2018].