Guia de Analisis de Suelos

1.
Presentación
l presente manual fue elaborado con la finalid ad de compilar algunas

E técnicas d e análisis d e suelos, necesarias para el seguimiento de la
remediación y caracterización d e sitios contaminados. Algunas han sid o
modificadas, para adaptarlas a suelos contaminados y optimizar recursos
y tiempos de análisis. Esta compilación permitirá a personal técnico, estu-
diantes e investigad ores contar con las metodologías descritas d e mane-
ra sencilla para su realización.
El contenido se encuentra dividid o en cuatro secciones: 1) Pruebas físicas

y químicas de suelos, que incluyen parámetros importantes por conside-
rar en la remed iación de suelos contaminados como pH, humedad, salini-
dad, cond uctividad eléctrica, fósforo, nitrógeno, sulfatos, potencial de
oxido-red ucción e intercambio catiónico, entre otros; 2) Análisis de hidro-
carburos del petróleo, principalmente hidrocarburos totales d e petróleo; 3)
Análisis microbiológicos que incluyen hongos y bacterias aerobias y anae-
robias; y 4) Ensayos toxicológicos para suelos contaminados, que incluyen
pruebas de germinación, crecimiento de plantas y toxicidad aguda con
lombrices de tierra.
Cad a u na de esas secciones contiene una breve introd ucción, fu ndamen-

tos, materiales, equ ipo y reactivos necesarios, proced imiento y forma d e
analizar los resultad os de la técnica, así como los criterios para su inter-
pretación.
2. Introd u cción
n México, las activid ad es ind ustriales han p rovocad o serios d años

E al m ed io am biente afectand o casi a la totalid ad d e los ecosistemas.
El su elo representa un ecosistem a d ond e, actu almente, se pu ed e encon-
trar u na gran varied ad d e compu estos tóxicos, entre los cuales se inclu-
yen los hid rocarburos d erivad os d e las activid ad es petroleras.
El suelo es u n cuerpo natural qu e conforma el hábitat d e bacterias, hon-

gos, levad uras, viru s y p lantas su periores, entre otros, que sirve para la
alimentación d e los anim ales y d el hombre a través d e los ciclos trófi-
cos. El suelo y los microorganismos mantienen los sistem as ecológicos,
ya qu e le ap ortan com ponentes qu ím icos y minerales (como resultad o
d e la biod egrad ación); y complejos orgánicos com o ácid os húm icos y
fúlvicos, enzimas, vitaminas, hormonas y antibióticos; ad emás, alber-
gan una rica reserva genética.
Por la gran importancia que representa el suelo para la vida del hombre y
de todos los seres vivos, este recurso se d ebe conservar. Sin embargo, en
la actualidad está seriamente amenazad o por la práctica de sistemas
de producción inadecuados o mal aplicados, que incluso han acelerado los
procesos de erosión y desertificación de grandes zonas. De igual forma, la
industrialización y urbanización han generado una gran cantidad de dese-
chos que son incorporados al suelo, lo cual ocasiona tanto la reducción de
su fertilidad como la modificación de sus procesos naturales. Por lo ante-
rior, es necesario estudiar las características particulares del suelo para
determinar su grad o de contaminación y, consecuentemente, aplicar algu-
na d e las tecnologías de remediación existentes.
Para elegir la tecnología ad ecu ad a es necesario consid erar u na serie

d e p rocesos y fenóm enos fisicoqu ím icos y m icrobiológicos qu e ocu -
rren en el su elo. Por esta razón, la evalu ación o d eterm inación d e las
14 Ma nua l de t écnicas de a ná lisis de suelos
d e ser ú til p ara tom ar acciones p ertinentes en el m ejoram iento d e

d ichos p rocesos.
En este manu al se recopilan técnicas p ara d eterminar los p rincipales

parám etros d e caracterización d e su elos, y p ara d ar segu im iento a un
proceso d e remed iación d e su elos contaminad os. Se realizaron m od ifi-
caciones en algunas técnicas, con el fin d e m ejorar su efectivid ad , op ti-
mización d e tiem pos y recu rsos.
3. Manejo y
alm acenam iento d el su elo
as mu estras d e suelo por analizar d eben ser recolectad as d el sitio

L contaminad o, m ed iante el d iseño d e mu estreo d e las guías y m éto-
d os estánd ares d e la ASTM (D5730-95a, 1995; E1219-98, 1998; E1391-94,
1994) y US EPA (1994a; 1994b; 540/ R-95/ 141PB96-963207, 1995; 600/ R-
92/ 128, 1992; 625/ 4-91/ 026, 1991; 160014-891034, 1991) orientad os a
suelos contaminad os con hid rocarbu ros (Profepa, 2000; API, 1996), y
conform e a la norma ambiental vigente.
Para tom ar u na m u estra rep resentativa d e suelos d e u n sitio contam i-

nad o, el p royecto d e norma N OM-138-SEMARN AT/ SS-2003 p rop one
una caracterización qu e d ebe consid erar p or lo m enos los sigu ientes
elem entos:
Descripción d el sitio.
Estrategia d e mu estreo.
Plan d e mu estreo.
Informe.
Para lo cual se deben d eterminar las características mínimas d el sitio que

permitan evaluar la d istribución del contaminante. En el caso d e d erra-
mes o fugas recientes, en los que el contaminante sea visible en superfi-
cie, se podrá realizar un muestreo d irigido tomando como mínimo el
número de puntos d e muestreo ya establecid os en d icha norma, de acuer-
do con la superficie contaminad a. Si la contaminación no es visible,
homogénea y reciente, se d ebe aplicar una estrategia de muestreo que
considere métodos estad ísticos. Cabe mencionar que la selección d e pun-
tos de muestreo debe abarcar vertical y horizontalmente la distribución
Como p arte d e la experiencia ad qu irid a en 10 años d e trabajo, se han

ad aptad o técnicas basad as en m étod os geoestad ísticos utilizad os y
aprobad os por la EPA. Para ubicar los pu ntos d e mu estreo se llevan a
cabo sond eos d e gases d el subsuelo, p or med io d e u na retícu la, qu e
variará su arreglo en d istancia d epend iend o d e la textura d el su elo. Los
resultad os d e gases se analizan med iante un programa geoestadístico,
de preferencia con mod alidad d e Krigging; a partir de este análisis d e
datos se obtienen mapas d e isovalores, los cuales de una manera rápid a
y económica permiten d e forma preliminar establecer los núcleos d e con-
taminación y los grad ientes de concentración d el contaminante.
Con base en esta información se seleccionan los mejores puntos de mues-

treo o perforación, así como las profundidades en las que se tomarán mues-
tras, dependiendo de los cambios en los horizontes del suelo. Sin embargo,
muchas veces estos cambios no están relacionados con las diferentes con-
centraciones del contaminante, por lo que con el fin de hacer un muestreo
representativo se toman muestras d e los primeros 30 cm de suelo, que
representan el estrato superficial; otra muestra se toma a una profundi-
dad media entre el manto freático y la superficie, y la última muestra se
toma inmediatamente antes del manto freático. Este arreglo de muestreo
permite delimitar la contaminación en superficie, los lixiviados y/ o perco-
lación a profundidad media y las condiciones del subsuelo directamente
relacionad o con el manto freático, el cual pudiera provocar el transpor-
te del contaminante.
Material y equipo
Frascos d e vid rio color ámbar d e 40, 450 y 990 ml.
Jeringas d e p lástico d e 20 ml acond icionad as: recortad as en la punta
hasta la parte volum étrica d e la jeringa, d ejand o libre el ém bolo.
Espátulas.
H ielera.
Tap as con una contratapa d e teflón d el mismo d iámetro qu e la tapa
d el frasco.
Tapón d e hu le estéril d el d iámetro d e la abertura d e la jeringa.
Parafilm.
H ielo.
Ma nejo y a lma cena mient o del suelo 17
Procedimiento
1) Una vez colectad o el suelo, se homogeneiza; posteriormente, las
m uestras se transfieren a d os tip os d e frascos, u no d e vid rio color
ám bar, limpio y con tapa cubierta d e teflón (450 y 990 ml), para la
d eterminación de hidrocarburos totales d el p etróleo (H TPs) e hidro-
carburos policíclicos aromáticos (H PAs), y otro de vidrio color ámbar,
estéril (40 m l) p ara las m uestras microbiológicas. Las m uestras d e
m icrobiología anaerobia se tom an con jeringas acond icionad as pu es
la pu nta es recortad a, d e tal m anera que cu and o se toman las m ues-
tras el ém bolo se emp uja hacia arriba y p osteriormente es sellad a con
u n tap ón d e hu le para vial estéril d el mismo d iám etro qu e la abertu -
ra d e la jeringa, con el fin d e conservar la anaerobiosis o, en su d efec-
to, en frasco ámbar estéril, llenand o el frasco al m áxim o p ara evitar la
p resencia d e aire.
Las m uestras se conservan d entro d e una hielera d urante el transpor-
te al laboratorio. Si la mu estra no va a ser p rocesad a d e inmed iato
d eberá alm acenarse a 4°C hasta la realización d el análisis. El tiempo
m áxim o d e almacenamiento en fu nción d el análisis p or realizar se
establece en la N OM-138-SEMARN AT/ SS-2003.
2) Segú n se ind ica en cad a u na d e las técnicas d escritas en el manu al,
algu nos análisis se llevan a cabo con muestras hú med as, tal y com o
p rovienen d el sitio, y otras requ ieren d e una m uestra seca, lo cual se
p ued e realizar colocand o la mu estra d e suelo a temp eratu ra d e 30ºC
d u rante 48 horas, consid erand o el peso inicial y el p eso final d e la
m uestra para d eterminar por d iferencia el contenid o d e hum ed ad .
Desp ués d e 48 horas, a la mu estra seca también se le d ebe realizar el
análisis d e hu med ad .
Referencias
AAPI. 1996. A guid e to the assessm ent and remed iation of und er-
grou nd p etroleum releases. API Pu blication 1628, Third ed ition.
ASTM D5730-95a. 1995. Standard guide for site characteristics for environ-
mental purposes w ith emphasis on soil, rock, the vadose zone and
ground water.
ASTM E1219-98. 1998. Stand ard guid e for accelerated site characteriza-
tion for confirmed or su spected p etroleum release.
ASTM E1391-94. 1994. Stand ard guid e for collection, storage, characte-
rization, and manipu lation of sed iments for toxicological testing.
N OM-138-SEMARN AT/ SS-2003. Lím ites m áxim os p erm isibles d e
hid rocarbu ros en su elos y las esp ecificaciones para su caracterización
y rem ed iación. Diario Oficial, 30 m arzo d e 2005.
Profep a. 2000. Disposiciones y proced imientos para la caracterización y
restau ración d e su elos contaminad os. Lista d e criterios interinos para
inorgánicos tóxicos. Prop efa, México
US EPA. 1994a. Sam p ling equ ip m ent d econtam ination. Stand ard
Operating Proced u re 2006.
US EPA. 1994b. Soil sam pling. Stand ard Op erating Proced ure 2012.
US EPA 540/ R-95/ 141PB96-963207. 1995. Su p erfu n d Program
Representative Samp ling Guid ance. OSWER d irective 9360.4-10.
US EPA 660/ 4-90/ 013. 1990. A rationale for the assessment of errors in
the sampling of soils. Las Vegas.
US EPA 600/ R-92/ 128. 1992. Preparation of soil samp ling p rotocols.
Samp ling techniques and strategies. Office of Research Developm ent.
US EPA 625/ 4-91/ 026. 1991. Sem inar pu blication. Site characterization
for su bsu rface remed iation.
US EPA 160014-891034. 1991. H and book of su ggested practices for the
d esign and installation of ground -w ater m onitoring w ells.
4. An álisis físicos
y q u ím icos en su elo
4.1 p H
Introducción
l pH es una propied ad química d el suelo que tiene un efecto imp or-
E tante en el desarrollo d e los seres vivos (incluid os microorganismos
y plantas). La lectura d e pH se refiere a la concentración d e iones hid ró-
geno activos (H +) que se d a en la interfase líquid a del suelo, por la inter-
acción d e los componentes sólid os y líquid os. La concentración d e iones
hid rógeno es fund amental en los procesos físicos, químicos y biológicos
del suelo. El grad o d e acidez o alcalinid ad de un suelo es d eterminad o
por med io d e un electrodo d e vid rio en un contenid o d e hu med ad espe-
cífico o relación d e suelo-agua, y expresad o en términos d e la escala d e
pH . El valor d e pH es el logaritmo d el recíp roco d e la concentración
de iones hid rógeno, que se expresa por números positivos d el 0 al 14.
Tres son las condiciones posibles d el pH en el suelo: la acid ez, la neutra-
lid ad y la alcalinid ad.
Método
Para la determinación del pH se utiliza el método potenciométrico (Willard
et al., 1974; Bates, 1983).
Fundamento
El métod o potenciométrico o electroquím ico para med ir pH d e un suelo
es el más utilizado. Con este método se mide el potencial d e un electrod o
sensitivo a los iones H + (electrodo d e vidrio) presentes en una solución
problema; se usa como referencia un electrod o cuya solución problema
no se modifica cuando cambia la concentración de los iones por medir,
que es generalmente un electrodo de calomelano o de Ag/ AgCl. El elec-
calibrar el instrumento y luego comparar, ya sea el potencial eléctrico o

el pH directamente d e la solu ción por evalu ar.
Interferencias
Debido a que el pH del suelo es medido en una matriz acuosa como agua
o una solución de sales diluidas, es dependiente d el grado de dilución
(relación suelo-dilución). Cuando se mide en agua es importante controlar
el agua adicionad a, ya que un aumento causará un incremento en pH ; por
ello es necesario mantener la relación constante y tan baja como sea posi-
ble. Sin embargo, la solución sobrenad ante puede no ser suficiente para
sumergir el electrodo apropiadamente, sin causar mucho estrés cuando se
inserta dentro del suelo. Los suelos con alta cantidad de materia orgánica
tienden a formar una gruesa pasta seca, por lo que una relación menor de
muestra en agua puede ser aceptable (1:5 o 1:10) (Karma A, 1993). En sue-
los contaminados con hidrocarburos la interferencia va a depender de la
concentración y tipo de hidrocarburo, se puede producir desde una sim-
ple iridiscencia sin afectar la determinación, hasta un impedimento de la
determinación por la alta concentración y viscosidad del contaminante.
Material y equipo
Muestra d e su elo.
Balanza analítica.
Vasos d e p recipitad o d e 25 ml.
Pipeta d e 10 ml.
Piceta con agua d estilad a.
Potencióm etro.
Agua d estilad a.
Solución amortigu ad ora d e p H 7 y 4.
Agitad ores magnéticos.
Procedimiento
1) Pesar 1 g d e su elo y colocarlo en u n vaso d e precipitad o d e 25 ml.
2) Agregar 10 m l d e agua d estilad a.
3) Agitar y d ejar rep osar 10 minu tos.
4) Aju star el p otenciómetro con las solu ciones amortiguad oras.
5) Pasad os los 10 m inu tos, m ed ir el pH con el potencióm etro.
Análisis físicos y químicos en suelo 21
Criterios de evaluación
Tab la 4.1 Criterios d e evalu ación d e u n su elo con resp ecto a su p H (N O M -021-REC-
N AT-2000).
Categoría Valor d e p H
Fu ertemente ácid o < 5.0

Mod erad amente ácid o 5.1 - 6.5
N eu tro 6.6 - 7.3
Med ianam ente alcalino 7.4 - 8.5
Fu ertemente alcalino 8.5
4.2 H u m ed ad
Introducción
El agu a es esencial para tod os los seres vivos p orque en forma molecu-
lar participa en varias reacciones metabólicas celu lares, actú a com o un
solvente y portad or d e nu trim entos d esd e el suelo hasta las plantas y
d entro d e ellas. Ad emás, intem periza las rocas y los m inerales, ioniza
los macro y micronu trientes que las p lantas tom an d el suelo, y permite
qu e la materia orgánica sea fácilmente biod egrad able. El contenid o d e
agu a en el su elo p ued e ser benéfico, pero en algu nos casos también p er-
ju d icial. El exceso d e agu a en los su elos favorece la lixiviación d e sales
y d e algu nos otros com pu estos; p or lo tanto, el agu a es u n regu lad or
imp ortante d e las activid ad es físicas, qu ímicas y biológicas en el su elo
(Topp , 1993).
Aunque es recomend able d eterminar la hu med ad a la capacidad d e

camp o d e los su elos, es d ecir, la cantid ad d e hu med ad qu e un suelo
retiene contra la graved ad, cu and o se d eja drenar libremente; en algunas
ocasiones, cuand o se trata d e suelos contaminados, por ejemplo con hi-
drocarbu ros del petróleo, es d ifícil llevar a cabo esta medición por la d ifi-
cultad d e rehid ratar su elos secos con estas características. Por lo que la
med ición d e hu med ad se realiza sólo en función d el porcentaje d e agua
Método
El métod o utilizad o p ara esta m ed ición es el gravimétrico, para d eter-
minar únicam ente la cantid ad d e agua d e los su elos.
Fundamento
La hu med ad d el su elo se calcu la por la d iferencia d e p eso entre una
misma mu estra húm ed a, y d espués d e haberse secad o en la estu fa hasta
obtener u n p eso constante.
Material y equipo
Muestras d e su elo.
Balanza analítica.
Espátula.
Charolas o papel alum inio a p eso constante.
Estu fa.
Procedimiento
1) Pesar 1 g d e muestra sobre u n pap el o charola d e alu minio a p eso
constante.
2) Colocar la m uestra d entro d e la estufa a 80ºC d e 12 a 24 horas.
3) Sacar la m uestra d e la estu fa y colocarla d entro d e u n d esecad or para
que se enfríe.
4) Pesar la mu estra con tod o y p apel.
5) Calcular los porcentajes d e hu med ad en el su elo p or la d iferencia d e
pesos.
% H u med ad d el su elo = (Peso inicial – Peso final)/ Peso inicial * 100
4.3 Con du ctivid ad eléctrica
Introducción
La cond uctivid ad eléctrica es la capacid ad d e u na solu ción acuosa para
transportar u na corriente eléctrica, que generalm ente se expresa en
mm hos/ cm o en mSiemens/ m; la N OM-021-RECN AT-2000 establece
d Siemens/ m a 25ºC. Es u na p ropied ad d e las solu ciones qu e se encuen-
tra m uy relacionad a con el tip o y valencia d e los iones presentes, sus
tivid ad eléctrica es por lo tanto u na form a ind irecta d e m ed ir la salini-

d ad d el agua o extractos d e suelo.
De acu erd o con los valores d e cond u ctivid ad eléctrica, p H y p orcentaje

d e sod io intercambiable, los suelos se p ued en clasificar en las sigu ien-
tes categorías:
a) Suelos salinos. Se caracterizan p orqu e su extracto d e satu ración tiene

un valor d e cond uctivid ad eléctrica igu al o sup erior qu e 4 mm hos/ cm
a 25o C y la cantid ad d e sod io intercambiable es menor d e 15%. Por lo
general tienen u na costra d e sales blancas, que pu ed en ser cloru ros, sul-
fatos y carbonatos d e calcio, m agnesio y sod io.
b) Suelos sód icos. Presentan u n color negro d ebid o a su contenid o ele-

vad o d e sod io. Su p orcentaje d e sod io intercambiable es mayor que 15,
el pH se encu entra entre 8.5 y 10.0, y la cond u ctivid ad eléctrica está por
d ebajo d e 4 mm hos/ cm a 25ºC.
c) Suelos salino-sódicos. Poseen una conductividad eléctrica de 4 mmhos/ cm

a 25ºC, una concentración de sodio intercambiable de 15% y el pH es varia-
ble, comúnmente superior a 8.5 (Muñoz et al., 2000).
La cond u ctivid ad eléctrica se pu ed e com plem entar con la d etermina-

ción d e N a + o bases intercam biables (K+ , Ca ++ , Mg ++ , N a + ).
Princip alm ente si los su elos fu eron contam inad os con aguas congénitas.
Método
El métod o d e la cond uctivid ad eléctrica se realiza por med io d e un con-
d uctímetro sobre u na m uestra d e agu a o extracto d e su elo.
Fundamento
Este m étod o se basa en la teoría d e la d isociación electrolítica. Es
ap licable a agu as o extractos d e su elo. El equ ip o p ara m ed ir la con-
d u ctivid ad eléctrica es u n condu ctímetro, qu e consiste en d os electrod os
colocad os a una d istancia fija y con líquid o entre ellos. Los electro-
dos son d e p latino y en ocasiones p u ed en llevar u n recu brim iento d e
p u ed e ser su m ergid o en el líqu id o p or m ed ir. La resisten cia eléctrica

a través d e los electrod os se registra a u na tem p eratu ra estánd ar,
gen eralm en te 25ºC.
Interferencias
La temp eratu ra afecta la cond uctivid ad y varía alred ed or d e 2% por
cad a grad o Celsius. Para esta d eterm inación no se perm ite la preserva-
ción qu ímica d e las m uestras.
Material y equipo
Muestra d e su elo seco y molid a en u n mortero.
Balanza analítica.
Frascos d e p lástico d e boca ancha d e 250 ml.
Vaso d e p recipitad o d e 100 m l.
Bureta.
Espátula.
Papel filtro.
Embu d o Bu chner.
Pipeta d e 10 ml.
Matraz Kitazato.
Piceta con agua d estilad a.
Bom ba d e vacío.
Probeta.
Cond uctímetro.
Frascos.
Agua d estilad a.
Matraz aforad o d e 100 ml.
Soluciones
Solución estánd ar d e cloruro d e potasio (KCl) 0.1 N . Disolver 0.7455 g
d e KCl en agua d estilad a y aforar a 100 ml.
Solución estánd ar d e cloru ro d e potasio (KCl) 0.01 N . Tom ar una alí-
cu ota d e 10 m l d e la solución estánd ar d e KCl 0.1 N y aforar a 100 m l.
Procedimiento
A. Preparación de la pasta de saturación.
2) Agregar agua d estilad a con la bu reta y m ezclar con la esp átu la hasta
saturación.
3) Golp ear el recipiente con cuid ad o sobre la mesa d e trabajo p ara asen-
tar el su elo.
4) La p asta estará lista cu and o se observe un brillo en su su perficie (for-
mación d e un esp ejo), esto no su ced e en el caso d e su elos con alto con-
tenid o d e arcilla.
5) Anotar el volu men d e agu a gastad o (m l).
6) Dejar reposar la pasta d u rante u na hora y comp robar a criterio su
saturación.
7) Tapar el recipiente y d ejarlo reposar p or tres horas, excep to suelos
arcillosos qu e d eben d ejarse rep osar 24 horas.
B. Obtención del extracto del suelo.

1) Colocar papel filtro sobre el embu do, humed ecerlo con agu a destila-
d a, d ejand o d renar el exceso. Conectar el sistema de filtración al vacío.
2) Mezclar nuevamente la pasta y colocarla en el embud o y aplicar vacío.
3) Obtener u n extracto d e aproximad am ente 50 ml.
C. Determinación de la conductividad eléctrica.

1) Calibrar el cond uctímetro. Antes d e u sar el med id or d e cond u ctivi-
d ad d ebe calibrarse con u na solu ción estánd ar. Para esto se requiere
d e d os solu ciones d e KCl, 0.1 N y 0.01 N , con cad a una se aju sta el
equ ip o a la cond u ctivid ad ind icad a en la tabla 4.2.
Tab la 4.2 Aju ste d e con d uctividad en fun ción de la solu ción d e KCl.
Sol. están d ar d e KCl Con d u ctivid ad eléctrica a 25º C
0.1 N 12.9 d S/ m
0.01 N 1.412 d S/ m
Cuando no se sabe la cond uctividad de la muestra se recomienda calibrar

primero con una de las dos soluciones y tomar la lectura de la muestra,
después volver a calibrar con la segunda solución y tomar nuevamente la
2) Leer la cond uctivid ad eléctrica y la temp eratu ra d el extracto. Si la lec-

tura se tom a en µmhos, transformar los resultad os a mm hos o d S d ivi-
d iend o entre 1 000.
3) Si es necesario, hacer corrección consu ltand o la tabla d e factores d e
corrección para d iferentes temperatu ras (tabla 4.3), se mu ltiplica el
resultad o d e cond uctivid ad eléctrica p or el valor correspond iente.
Tab la 4.3 Factores d e corrección d e la con du ctivid ad eléctrica en fu n ción d e la tem p e-

ratu ra d el extracto d e satu ración .
Temp eratu ra Factor d e Tem p eratu ra Factor d e

(º C) corrección (º C) corrección
8 1.499 22 1.067
10 1.421 23 1.044
12 1.350 24 1.021
14 1.284 25 1.000
16 1.224 26 0.979
18 1.168 28 0.941
19 1.142 30 0.906
20 1.128 32 0.873
21 1.092 34 0.843
Cálculos
La u nidad estánd ar de cond uctivid ad eléctrica es el siemens/ metro
(S/ m = Ohm/ m), pero para evitar la expresión d e resultad os en peque-
ñas fracciones d ecimales se usa generalmente una unid ad más pequ eña:
el m iliSiemens/ m etro (mS/ m ). Aunqu e la cond uctivid ad generalmente
es reportad a en µmhos/ cm.
1 m S/ m = 10 µm hos/ cm.
Para convertir la cond uctivid ad eléctrica en unid ades d e salinid ad (tabla

4.4), se toma el valor d e referencia d e una solución de NaCl 0.05 N con
una cond uctancia d e 604 µmhos/ cm a 25ºC como el factor, qu e al mu l-
tip licarlo p or la cond u ctivid ad exp resa la salinid ad .
En la tabla 4.4 se mu estran los criterios para evaluar la salinid ad d e un

suelo, con base en su cond uctivid ad .
Tabla 4.4 Criterios para evaluar la salinidad d e u n suelo, con base en su cond uctividad.
Categoría d el su elo Valor (m mh os/cm o d S/m )
N o salino 0 - 2.0
Poco salino 2.1 - 4.0
Mod erad amente salino 4.1 - 8.0
Mu y salino 8.1 - 16.0
Extremad amente salino > 16.0
Vazqu ez y Bau tista (1993).
4.4 Carb on o orgán ico total
El carbono orgánico es uno de los principales componentes d e los seres

vivos: ap roximadamente 50% d el peso seco d e la materia orgánica (m.o.)
es carbono. En el med io ambiente su ciclo está estrechamente ligado al
flujo de energía, d ebido a que las principales reservas d e energía d e los
organismos son compuestos d e carbono red ucidos que han d erivad o d e
la fijación d el CO 2 atmosférico, ya sea por m ed io d e la fotosíntesis o, con
menor frecuencia d e la qu imiosíntesis (Tiessen y Moir, 1993). Las plan-
tas y los animales qu e mueren son d esintegrad os por los microorganis-
mos, en particular bacterias y hongos, los cuales regresan el carbono al
med io en forma de bióxido d e carbono (Baker y H erson, 1994).
La m.o. del suelo es la fracción orgánica que incluye residuos vegetales y

animales en diferentes estados d e descomposición; tejidos y células d e
organismos que viven en el suelo; y sustancias producidas y vertidas por
esos organismos. Esta d efinición es muy amplia pues incluye tanto a los
materiales poco alterados como a aquellos que sí han experimentado
cambios de descomposición, transformación y resíntesis dentro del suelo.
Además se pueden incluir compuestos orgánicos tóxicos, provenientes
de las activid ades industriales del hombre, como la contaminación d e
Método
Para la cuantificación d e carbono orgánico total se utiliza un analizad or
de carbono con una cámara d e combustión y un detector de infrarrojo.
Fundamento
La mu estra d e suelo es colocad a d entro d e la cám ara d e combu stión a
una temp eratu ra d e 900ºC, proceso qu e provoca la liberación d e CO 2
proveniente d e tod o el carbono presente en el su elo. El CO 2 es cu antifi-
cad o con un d etector d e infrarrojo.
El límite d e d etección d e la técnica va d e 0 a 25 mg d e C. Consid erand o

que no todo el suelo es m.o., se recomienda utilizar muestras de 0.1 a 0.3 g,
pero mientras m ás m .o. se tenga, se d ebe tomar m enor cantid ad d e
suelo para realizar esta técnica.
Material y equipo
Muestra d e su elo seco y molid o en m ortero.
Cápsu las d e p orcelana especiales p ara el equipo d e carbono total.
Espátulas.
Analizad or d e carbono con d etector d e infrarrojo y accesorio para
mu estras sólid as.
Balanza analítica.
Pinzas.
Reactivos
Biftalato d e p otasio (C 6H 4(COOK)).
Procedimiento
Esta técnica p ued e realizarse con m uestras d e suelo húm ed o, p ero se
recomiend a utilizar suelo seco y molid o para homogeneizar la mu estra,
ya que se utilizan cantid ad es muy pequ eñas (menores que 0.3 g).
1) Pesar suelo seco (0.1 a 0.3g) d entro d e u na cápsu la d e p orcelana.

2) Encend er el analizad or d e carbono y esp erar a qu e la tem peratura d el
horno llegu e a 900o C. Una vez qu e el equ ip o esté estabilizad o a esta
tem peratura, se p roced e a analizar las mu estras.
d e contar con un softw are p ara la integración d e los d atos se d ebe

incluir la curva patrón, para qu e el resu ltad o d e la m ed ición se pro-
porcione con base en ésta.
4) Colocar la m uestra d entro d e la cám ara d e sólid os y p roced er a la
med ición.
5) El tiempo d e corrida de cad a muestra es aproximad amente d e cinco
minutos. Al final el softw are presenta la cantid ad de carbono (mg kg -1
suelo o en porcentaje) contenid o en el su elo.
6) El resu ltad o d ebe ser ajustad o por la hu med ad d e la m uestra, para
ind icarlo en m g d e C/ kg suelo com pletamente seco.
Curva patrón. Se realiza con biftalato de potasio (C6H 4(COOK)) en un

rango de concentraciones de 0 a 25 mg (0 a 0.025 g) de carbono contenido
en este compuesto. El biftalato d ebe secarse en la estufa durante 12 horas
a 60ºC antes de ser analizado. Pesar la cantidad necesaria del reactivo para
obtener la concentración deseada (de 0 a 25 mg de carbono en la muestra),
como se ind ica en la tabla 4.5, y hacer la med ición de carbono orgánico
total en el analizador, como se indicó para las muestras.
Tab la 4.5 Con cen tración d e b iftalato p ara la cu rva p atrón d e carbón orgán ico.
Biftalato d e p otasio (m g) m g C con ten id os en b iftalato
0 0
12.15 5
24.31 10
36.46 15
48.62 20
60.77 25
Nota: en caso d e qu e el equipo sólo prop orcione el área d el p ico obtenid o, p roce-
d er al cálculo d el carbono orgánico total com o se ind ica en el ap artad o corres-
p ond iente.
Cálculos
Calcular la cantid ad d e carbono orgánico total (COT) contenid o en el
suelo con la ecu ación lineal d e la curva estánd ar.
Dond e:
CO = carbono orgánico (m g) contenid o en el su elo.
A = área d el p ico obtenid o.
b = ord enad a al origen.
m = p end iente.
Calcular la concentración final d e COT d e la m uestra d e su elo m ed ian-

te la sigu iente ecuación:
COT (mg / kg d e su elo seco) = CO (m g) * 1 000 / P * FH
COT = carbono orgánico total (mg / kg d e suelo seco).

CO = carbono orgánico (m g).
P = cantid ad d e su elo (0.1 g a 0.5 g).
1 000 = factor d e corrección d e concentración (1 000 g = 1 kg).
FH = factor d e corrección d e hu med ad = (1-(%hu med ad / 100)).
A partir del contenid o total d e carbono orgánico se pued e estimar el con-

tenid o d e materia orgánica (tabla 4.6); suponiendo d e forma convencio-
nal que la materia orgánica contiene 58% de carbono. Así, el contenido d e
carbono orgánico se multiplica por el factor 1.724 para obtener el conte-
nid o de materia orgánica (León y Aguilar, 1987).
Tab la 4.6 In terp retación d el con ten id o d e m ateria orgán ica en su elo.
M ateria orgán ica (%)

Clase Su elos volcán icos Su elos n o volcán icos
Mu y bajo < 4.0 < 0.5

Bajo 4.1 - 6.0 0.6 - 1.5
Med io 6.1 - 10.9 1.6 - 3.5
Alto 11.0 - 16.0 3.6 - 6.0
Mu y alto > 16.1 > 6.0
4.5 Fósforo solu b le

comp uestos orgánicos y princip alm ente minerales qu e contienen fósfo-

ro. En términos generales, el fósforo d el su elo se clasifica en fósforo
orgánico e inorgánico, d ep end iend o d e la naturaleza d e los compu estos
qu e forme. La forma orgánica se encuentra en el hum us y la materia
orgánica, y su s niveles en el su elo pu ed en variar d esd e 0 hasta mayores
qu e 0.2%. La fracción inorgánica está constituid a por com pu estos d e
hierro, alu minio, calcio y flúor, entre otros, y normalmente son más
abund antes qu e los comp uestos orgánicos. Solo una pequ eña parte d el
P aparece en solu ción en su elo (< 0.01-1 m g L-1).
El P es un macronutrim ento esencial para las plantas y los microorga-

nismos, junto con el nitrógeno y el p otasio. Pu ed e ser un nu trim ento
limitante, ya qu e es un componente d e los ácid os nucleicos y d e los fos-
folípid os. Los análisis d e P sirven fund am entalmente p ara el control d e
la d osificación d e prod u ctos químicos en tratamientos d e agu a o suelos,
o como u n m ed io p ara d eterm inar que un sistema presenta contamina-
ción p or exceso d e este compu esto (Muñoz et al., 2000).
Método
Para la medición del P soluble se utiliza el métod o d e Bray (d esarrollad o
por Bray y Kurtz, 1945), el cual fue modificado en la parte d e extracción
del P. La cuantificación se lleva a cabo por colorimetría. Este método se
emplea como índice d el P aprovechable en suelos con pH neutro y ácid o
(N OM-021-RECN AT-2000). Para suelos neutros y alcalinos se utiliza el
método Olsen.
Fundamento
Este métod o se basa en la extracción d e las formas d e fósforo fácilmen-
te solubles, p rincipalm ente fosfatos d e calcio y u na fracción d e los fos-
fatos d e alu minio y fierro, con la com binación d e ácid o clorhíd rico y
fluoru ro d e amonio. El fluoru ro d e amonio d isu elve los fosfatos d ebid o
a la formación d e u n ión com plejo con estos compu estos, cu and o se
encuentran en solu ción ácid a. Este métod o ha d ad o bu enos resu ltad os
en su elos ácid os y aceptables en suelos con pH neutros.
El límite d e d etección d e la técnica va d e 1 a 10 ppm d e P y en caso d e

Interferencias
Los d etergentes qu e contienen fosfatos p u ed en interferir en la cu anti-
ficación d el P, p or lo qu e se recom iend a no u tilizarlos p ara lavar el
m aterial.
Material y equipo
Muestra d e su elo (1 g) seco y molid o en u n mortero.
Vasos d e p recipitad o.
Pipetas d e 1, 5 y 10 ml.
Matraces aforad os d e 0.5 y 1 L.
Espectrofotómetro visible.
Probeta d e 250 m l.
Botellas d e polip ropileno 1 L.
Tubos d e ensayo d e 10 ml.
Tubos d e p lástico para centrífuga d e 15 ml.
Grad illas.
Vórtex.
Centrifuga.
Matraz Erlenm eyer d e 1 y 2 L.
Frascos d e vid rio ám bar con tapa esm erilad a.
Nota: Para llevar a cabo esta determ inación d eberá utilizarse m aterial de vidrio
Pirex, y guardar el agua y los reactivos en frascos neutros o de N algene. El agua
em plead a d eberá ser libre d e fósforo, ya sea bidestilada o desm ineralizad a. Es
recom end able vaciar el agua d el garrafón a envases d e N algene neu tros.
Previam ente a la realización de esta técnica, todo el material que se utilice para
preparar los reactivos y realizar los análisis d eberá d ejarse por lo menos cinco
m inutos en m ezcla crómica y después enjuagar con agua bidestilada. N o usar nin-
gún tipo de d etergente para el lavado del m aterial de cristalería o bien utilizar
jabón libre d e fosfatos. En caso de usar este último ya no es necesario lavar el mate-
rial con mezcla cróm ica.
Soluciones y reactivos
1) Mezcla crómica: Pesar 100 g d e d icromato d e potasio (2Cr 2O 7) y
d isolver en 1 L de agua d estilada. Calentar hasta la com pleta d isolu-
ción d el reactivo. Dejar enfriar la solu ción y agregar gota a gota 100 ml
fluoru ro d e am onio, d isolver en agua d estilad a y aforar a 1 L. Gu ard ar

en u n recip iente d e p oliprop ileno.
3) Ácid o clorhíd rico (H Cl) 0.5 N : Diluir 20.2 ml H Cl concentrad o hasta
com pletar un volum en d e 500 ml con agua d estilad a.
4) Solución extractora: Agregar 460 ml d e agua d estilad a a 15 ml d e solu-
ción madre de fluoruro de amonio y 25 ml de solución de ácid o clorhí-
d rico 0.5 N. Esto nos d a una solución 0.03 N d e fluoruro d e amonio y
0.025 N de ácid o clorhíd rico. La solu ción final d ebe ser almacenada en
un recipiente d e polipropileno perfectamente tapad o, d e esta forma se
conserva hasta un año.
5) Solu ción d e ácid o clorhíd rico (H Cl) 10 N : En u n matraz aforad o d e
500 m l colocar 80 ml d e agu a d estilad a y ad icionar lentamente y por
las p ared es d el m atraz 404 ml d e ácid o clorhíd rico concentrad o (H Cl),
al final com pletar u n volum en d e 500 ml con agua d estilad a.
Nota: tener m u cho cu id ad o al p rep arar esta solución, se d ebe hacer en u na cam -
p ana d e extracción y sobre u n baño d e hielo.
6) Solución de molibdato de amonio-ácido clorhídrico: Pesar 15 g de molib-

dato de amonio tetrahidratado ((NH 4)6Mo7O 24.4H 2O) y disolver en 350
ml d e agu a d estilad a. Añad ir lentam ente y con agitación constante
300 ml d e ácid o clorhíd rico 10 N . Enfriar a tem peratura d e laborato-
rio y aforar a 1 L con agu a d estilad a. Mezclar bien y gu ard ar en fras-
co ámbar con tapón esm erilad o. Esta solu ción d ebe ser preparad a
cad a d os m eses.
7) Solu ción m ad re d e cloru ro estañoso: Pesar 5 g de cloruro estañoso dihi-
dratado (SnCl2. 2H 2O) y disolver en 12.5 ml de ácido clorhídrico concen-
trado (HCl). Calentar a baño María hasta que se d isuelva bien. Gu ard ar
en el refrigerad or en frasco ámbar con tapón esm erilad o, pues d e esta
form a se conserva seis sem anas m áxim o.
8) Solución d e cloru ro estañoso d iluid a: Agregar 33 ml d e agua d estila-
d a a 0.1 ml d e solu ción mad re d e cloruro estañoso o 0.3 p or 99 ml d e
agu a. Esta solu ción d ebe ser p rep arad a cuatro horas antes d e su u so.
9) Solución tip o d e fosfato (100 mg/ m l): Pesar 0.4389 g d e fosfato d e
potasio monobásico (KH 2PO 4), d isolver en agu a d estilad a y aforar a
1 L. Un m ililitro d e esta solu ción contiene 100 ppm d e fósforo.
Procedimiento
1) Pesar 1 g d e suelo p reviam ente seco y m olid o, y colocarlo en u n tubo
para centrífuga d e 15 m l.
2) Agregar 7 ml d e solución extractora, agitar con vórtex d e tal manera
que se mezcle bien el suelo y la solución extractora.
3) Centrifugar las mu estras d urante 10 m inu tos a 6 000 rpm .
4) Del sobrenad ante tomar 1 ml y colocarlo en un tu bo d e vid rio, agre-
gar 6 m l d e agu a d estilad a y 2 ml d e la solución d e molibd ato y m ez-
clar bien.
5) Agregar 1 ml d e solu ción d e cloru ro estañoso d ilu id o (que d ebe pre-
pararse al mom ento) y nu evamente mezclar.
6) Pasad os 10 minu tos leer la absorbancia en el esp ectrofotómetro a una
longitud d e ond a d e 640 nm . Tod as las lecturas d eberán term inarse
antes d e 20 minu tos.
N ota: En caso d e que las m u estras tengan u n alto contenid o d e fósforo d eben
hacerse las d ilu ciones ap ropiad as con el extracto (sobrenad ante), d e tal m anera
que los valores d e absorbancia estén d entro d e la cu rva d e calibración. O bien se
p ued e iniciar la extracción con 0.5 g d e suelo.
7) Cad a vez que se lea u n lote d e mu estras realizar un blanco d e la

sigu iente manera: Poner 1 ml de H 2O destilad a y 1 ml d e solución
extractora, agregar 5 ml de agua d estilada y 2 ml d e solución d e molib-
d ato d e am onio, mezclar bien y agregar 1 m l d e la solución d e cloru-
ro estañoso, finalm ente m ezclar otra vez.
8) Para construir la curva p atrón hacer las d ilu ciones correspond ientes
d e la solu ción tipo d e fosfato, llevand o el volum en a 100 m l, y consi-
d erar las prop orciones d e la tabla 4.7.
Curva patrón. Colocar 1 m l d e cad a u na d e las d ilu ciones (p pm ) d e la

solu ción tip o d e fosfato en los tu bos. Agregar 1 m l d e la solución
extractora, 5 m l d e agu a d estilad a y 2 m l d e solu ción d e m olibd ato d e
am onio. Posteriorm ente 1 m l d e solu ción d e cloru ro estañoso d ilu id o y
mezclar bien.
Finalmente hacer las lectu ras y term inarlas antes d e 20 minu tos.
Tab la 4.7 Con cen tración d e fosfato p ara realizar la cu rva p atrón d e fósforo.
Con cen tración (p p m) m l d e solu ción tip o d e fosfatos
10 10
9 9
8 8
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
En la tabla 4.8 se mu estran valores d e fósforo que d eterm inan la calid ad

d e un su elo.
Tab la 4.8 Criterios p ara d eterm in ar la calid ad d e u n su elo en cu an to a su con ten id o

d e fósforo. (N O M -021-RECN AT-2000).
Categoría Valor (m g k g-1)
Bajo < 5.5

Med io 5.5 -11
Alto > 11
4.6 N itrógen o total
Introducción
El nitrógeno es u n elem ento ind ispensable p ara la vid a, form a p arte d e
las principales biomoléculas de todos los seres vivos. Es también uno de los
elem entos m ás abund antes d e la Tierra, pues en su form a gaseosa (N 2)
constitu ye 78% d e la atmósfera. Sin embargo, la cantid ad d e nitrógeno
aportes d e m ateria orgánica y a la fijación bacteriana a partir d el aire.

Dentro d el suelo es aprovechad o por las plantas, animales y microorga-
nismos que lo incorporan a sus tejidos. Cuand o dichos organismos se
mueren, el nitrógeno reingresa al suelo completando el ciclo. Este ciclo es
complejo e involucra una serie de reacciones y organismos con d iferentes
metabolismos. Siempre comienza con compuestos orgánicos sencillos
(N H 4+, N O 2-, N O 3-, N 2, NH 3) y termina con compuestos orgánicos com-
plejos; que a través d e la d escomposición regresan a la etapa d e compues-
tos sencillos.
En los m icroorganism os la carencia d e nitrógeno pu ed e afectar el creci-

miento, por lo que la población m icrobiana no tend rá un desarrollo ópti-
mo. En contraste, d emasiado nitrógeno permite el crecimiento microbiano
rápido y acelera la d escomposición; pero puede crear problemas de olor
en condiciones anaerobias. Además, el exceso de nitrógeno puede ser libe-
rado como amoniaco; en tanto que el nitrógeno aprovechable escapará en
form a d e gas. Para la m ayoría d e los materiales u na relación C/ N cer-
cana a 10:1 mantend rá estos elem entos en equ ilibrio aproximad o. En los
suelos normalmente el contenid o d e nitrógeno varía d e 0.05 a 2% en sus
d iferentes formas.
Método
La d eterminación d e nitrógeno total se realiza con el métod o Micro-
Kjeld ahl (Mod ificad o por Bremner, 1965).
Fundamento
El métod o Kjeld ahl com prend e tres fases fund am entales:
1) Digestión d e la mu estra. La mu estra d e su elo se som ete a una d iges-
tión por calentamiento con ácid o su lfúrico y por u na m ezcla d e sales
que aceleran y facilitan tanto la oxid ación d e la materia orgánica como
la conversión d e tod as las form as d e nitrógeno en N +3, que en med io
ácid o se encu entran en form a d e rad ical amonio (N H 4+); es d ecir, se
llevan las form as orgánicas a form as m inerales d e nitrógeno.
2) Destilación. Una vez transform ad o el nitrógeno en N H 4+ , se exp one
a u na base fuerte com o el hid róxid o d e sod io p ara formar hid róxid o
d e am onio, qu e p or la acción d el calor se d escom p one en am oniaco
volu men conocid o d e solución valorad a d e ácid o bórico y por com pa-
ración con u n blanco se d eterm ina la cantid ad d e ácid o que reaccionó
con el N H 3.
Material y equipo
Muestra d e su elo seco y molid o con un m ortero.
Balanza analítica.
Matraces Kjeld ahl.
Vasos d e p recipitad os.
Probetas.
Digestor.
Matraz aforad o d e 1 L.
Matraces Erlenm eyer d e 1 L.
Perlas d e ebu llición.
Pipeta.
Destilad or.
Bu reta.
Soporte u niversal con pinza.
1) Solución d e ácid o bórico con ind icad or. Pesar 20 g d e ácid o bórico
(H 3BO 3) y d isolver en 750 ml d e agu a d estilad a. Calentar para la com-
pleta d isolu ción d el ácid o. Dejar enfriar y agregar 20 ml d e la sigu ien-
te mezcla d e ind icad ores: 0.099 g d e verd e d e brom ocresol y 0.066 g
d e rojo d e metilo d isu eltos en 100 m l d e alcohol etílico al 96%. El pH
d e la mezcla d ebe d e ser d e 5.0, si es más ácid o agregar algunas gotas
d e solu ción d e hid róxid o d e sod io 0.1 N , hasta que la solución ad qu ie-
ra u na coloración púrpu ra o alcance el pH ind icad o. Com pletar el
volu men a 1 L con agua d estilad a y m ezclar.
2) Solu ción d e hid róxid o d e sod io 0.1 N : Pesar 4 g d e hid róxid o d e sod io
(N aOH ), d isolver en agua d estilad a y aforar a 1 L.
3) Mezcla d e catalizad ores: pesar 62.5 g d e sulfato d e potasio (KSO 4) y
6.25 g de sulfato d e cobre pentahidratad o (CuSO 4.5H 2O). H omo-
geneizar la mezcla.
4) Solu ción d e hid róxid o d e sod io 10 N : Pesar 200 g d e hid róxid o d e
sod io (N aOH ), d isolver en agua d estilad a y aforar a 500 ml. El agua
5) Solu ción d e ácid o su lfúrico 0.01 N : Dilu ir 0.28 ml d e ácid o sulfúrico

concentrad o (H 2SO 4) hasta com pletar u n volum en d e 1 L con agua
d estilad a. La concentración d el ácid o d ebe ser estand arizad a con la
solu ción valorad a d e carbonato d e sod io.
6) Solu ción valorad a d e carbonato d e sod io: Pesar 0.25 g d e carbonato
d e sod io (N aCO 3), p reviam ente secad o en la estu fa d urante 2 horas a
105o C, d isolver en agua d estilad a y aforar a 50 m l.
7) Solu ción d e anaranjad o d e m etilo: Pesar 0.1 g d e anaranjad o d e meti-
lo, d isolver en agu a d estilad a y aforar a 100 ml.
Valoración d e la norm alid ad d el ácid o sulfú rico 0.01 N :

Tomar 3 alícuotas d e 10 m l d e la solución d e N aCO 3.
Agregar 5 o 6 gotas d e anaranjad o d e metilo com o ind icad or.
Titu lar con la solución d e ácid o sulfú rico 0.01 N .
Calcular la norm alid ad real su stitu yend o en la sigu iente fórmu la:
N orm alid ad d el H 2SO 4 = (0.050 g/ 53) X (1/ Promed io d e m l gasta-

d os en las tres alícuotas).
8) Ácid o sulfú rico concentrad o (H 2SO 4).

9) Granallas d e zinc.
Procedimiento
A. Digestión.
1) Pesar una mu estra d e su elo d e 0.25 a 1 g, qu e d ep end erá d e la m ate-
ria orgánica contenid a en el suelo, entre más materia orgánica tenga
un su elo m enos serán los gramos d e mu estra.
2) Colocar la m uestra d e suelo en un matraz Kjeld ahl seco.
3) Ad icionar 2 g d e m ezcla d e catalizad ores.
4) Agregar 5 m l d e ácid o sulfú rico concentrad o.
5) Poner a calentar en el d igestor a una temperatura media, hasta que la
muestra se torne clara. La temperatura debe ser regu lad a d e mod o que
los vapores d e ácid o su lfúrico se condensen en el tercio inferior d el
cuello d el matraz Kjeld ahl.
6) H ervir la m uestra p or u na hora a partir d e ese mom ento.
7) Una vez terminad a la d igestión, ap agar el d igestor y tapar con un
B. Destilación.
1) Añad ir al matraz Kjeld ahl frío 25 m l d e agu a d estilad a y m ezclar
vigorosamente hasta una d isolu ción com pleta.
2) Transferir el líquid o a un matraz Erlenmeyer d e 500 m l. Colocar d e 5
a 6 perlas d e ebu llición.
3) Ad icionar 3 granallas d e zinc. Añad ir 15 ml d e la solución d e hid ró-
xid o d e sod io 10 N , sosteniend o el matraz inclinad o d e m od o que se
d ep osite en el fond o.
4) Colocar en la salid a d el ap arato d e d estilación u n vaso d e p recip ita-
d os d e 50 ml, que contenga 10 m l d e la solución d e ácid o bórico más
ind icad or.
5) Conectar el flujo de agua e iniciar la destilación. Destilar hasta que el
volumen alcance la marca de 20 ml en el vaso de precipitados d e 50 ml.
Una vez alcanzado dicho volumen, retirar el matraz y apagar el aparato.
6) Titular el nitrógeno amoniacal con la solución de ácido sulfúrico 0.01 N
hasta que vire d e verd e a rosad o fuerte.
7) Realizar un blanco siguiend o los pasos d el 3 al 15.
Cálculos
Calcular la concentración d e nitrógeno, su stitu yend o en la siguiente
fórmu la:
(T - B) X N X 1.4
N itrógeno (%) =
S
Dond e:
T = m l d e ácid o sulfúrico valorad o gastad os en la mu estra.
B = m l d e ácid o su lfúrico valorad o gastad os en el blanco.
N = normalid ad exacta d el ácid o sulfú rico.
S = peso d e la muestra d e su elo.
En la tabla 4.9 se presentan valores d e nitrógeno qu e sirven para eva-

lu ar la calid ad d e u n su elo.
Tab la 4.9 Criterios p ara evalu ar u n su elo con b ase en su con ten id o d e n itrógeno total
(M oren o, 1978).
Categoría Valor (%) d e n itrógen o en su elo
Extrem ad amente pobre < 0.032

Pobre 0.032 - 0.063
Med ianam ente pobre 0.064 - 0.095
Med io 0.096 - 0.126
Med ianam ente rico 0.127 - 0.158
Rico 0.159 - 0.221
Extrem ad amente rico > 0.221
4.7 Am on io in tercam b iab le
Introducción
Los microorganismos participan d e form a im portante en el ciclo d el
nitrógeno en el suelo, d ebid o a qu e realizan la fijación d el nitrógeno,
nitrificación y d esnitrificación, así como su inm ovilización. Se reportan
como fracciones pred ominantes al am onio y nitratos (Foster, 1995;
Maynard y Kalra, 1993).
En el caso de los derrames de hidrocarburos, la relación C/ N aumenta sig-

nificativamente; la adición de nitrógeno inorgánico permite balancearla y
estimular la biodegradación al satisfacer los requerimientos d e síntesis de
aminoácidos, proteínas, purinas, ácidos nucleicos, aminoazúcares y vita-
minas que en conjunto representan el contenido de nitrógeno en alrede-
dor de 10% del peso celular seco de los microorganismos (Graham et al.,
1999; Smith et al., 1998). Sin embargo, en la literatura existen discrepancias
sobre el efecto de la estimulación, que se pueden atribuir a la variabilidad
y compleja composición de los suelos y a otros factores como altas reser-
vas de nitrógeno o adiciones excesivas (Bossert y Bartha, 1984; Leahy y
Colwell, 1990; Walworth et al., 1997). Comúnmente se evalúa al amonio
do o reducido (Gaudy y Gaudy, 1981). Adicionalmente, se recomienda

cuantificar nitratos para complementar la fracción de nitrógeno inorgáni-
co susceptible de ser empleado por los microorganismos.
El amonio intercambiable se define como el amonio que puede extraerse

con una solución neutra de ión potasio a temperatura ambiente. Las sales
de potasio utilizad as comúnmente son K2SO 4 0.05 M y KCl de 0.1 a 2 M;
la capacid ad d e extracción d epend e d el tipo de sal y su concentración.
Posteriormente se cuantifica el amonio en el extracto, para lo cual se
emplea una gran varied ad de métodos: técnicas colorimétricas manuales,
microdifusión, d estilación con arrastre de vapor, análisis de inyección d e
flujo y electrodo de ión selectivo (Maynard y Kalra, 1993).
Método
Determinación de amonio intercambiable en suelo por extracción con clo-
ruro d e potasio (KCl 1M) y d eterminación por electrod o de ión selectivo.
Fundamento
Se recu pera el amonio extraíble con KCl 1 M y se cuantifica por med io
de un electrod o d e ión selectivo, qu e consta d e u na membrana hid rofó-
bica permeable al gas, permitiend o separar la solución d e la mu estra d e
la solución interna del electrod o (el líqu id o no penetra la m embrana). El
amoniaco d e la muestra en solución se d ifund e a través de la mem bra-
na, hasta que la presión parcial d el amoniaco es la misma en ambos
lados d e la membrana. Así, p ara las muestras la presión parcial del am o-
niaco es proporcional a su concentración y ésta a su vez se encuentra en
equ ilibrio con el ión amonio.
Material y equipo
Estu fa.
Mortero.
Balanza.
Centrífu ga.
Potencióm etro con electrod o ión selectivo.
Tubos Falcon p ara centrífu ga o equ ivalente.
Vórtex.
Reactivos y soluciones
Cloru ro d e p otasio (KCl) 1M. Solu ción extractora. Pesar 74.56 g d e KCl
d isolver en agu a d estilad a y aforar a volum en d e 1 L.
H id róxid o d e sod io (N aOH ) 10N . Disolver 400 g d e N aOH en agua.
Enfriar y d ilu ir a 1 L.
Solución p atrón. 1 000 m g N H 4/ L. Secar N H 4Cl p or una hora a
100o C. Pesar 3.027 g, d isolver en agu a y d iluir a 1 L.
Procedimiento
A. Extracción.
1) Secar el su elo a tem p eratu ra am biente (25-30o C) y m oler en u n m or-
tero.
2) Pesar 10 g d el su elo m olid o, colocarlos en u n tu bo (Falcón p ara cen-
trífu ga o equ ivalente); p osteriorm ente, agregar grad u alm ente 30 m l
d e KCl 1M, m ezcland o intensam ente en vórtex d u ran te u n m inu to.
Centrifu gar a 8 000 rp m p or 10 m inu tos y recu p erar el sobrenad an-
te. Ap roxim ad am ente 25 m l serán u tilizad os p ara el an álisis d el
am onio.
Nota: La d eterm inación d e am onio intercam biable en el presente m étod o perm i-

te tam bién extraer con la solu ción extractora (KCl 1M) a los iones nitrito y nitra-
to. Con la diferencia que el am onio se cuantifica por electrod o d e ión selectivo y
los iones nitrito y nitrato por electroforesis cap ilar (EIC).
B. Cuantificación.
1) Tomar 25 ml d el sobrenad ante d e la extracción, ad icionar 0.45 ml d e
N aOH 10N ; bajo agitación llevar a cabo la m ed ición d e m V m ed iante
electrod o d e ión selectivo para amonio. Calcular d e la cu rva estánd ar
(d e elaboración reciente) la concentración mg N H 4/ L.
Curva patrón. Preparar por lo menos tres estánd ares según rango d e con-
centración esperada en muestras. Es importante preparar siempre están-
dares nuevos. Deberán prepararse estándares entre 0.1 a 100 m g N H 4/ L
en un volumen d e por lo menos 25 ml, usando la solución patrón
1 000 m g N H 4/ L y como medio d e disolución KCl 1M. Para estánd ares
de 1, 10 y 100 mg NH / L medir 0.05, 0.5 y 5 ml de solución patrón y afo-
el eje (x) logarítmico la concentración N H 4/ L y en el eje lineal (y) el

potencial d el electrod o.
Cálculos
Para convertir el resu ltad o a concentración en p eso (mg N H 4/ kg su elo),
en este caso se u tiliza la siguiente relación. Ad emás es necesario corre-
gir con la hum ed ad .
m g N H 4/ kg su elo = mg N H 4/ L * 3.
Interpretación
En la tabla 4.10 se p roporciona la clasificación d e fertilid ad d e suelos

por el contenid o d e nitrógeno inorgánico (nitrato y amonio).
Tab la 4.10 Clasificación d e fertilid ad d e su elos en fu n ción d el nitrógen o in orgán ico

(N O M -021-RECN AT-2000).
Clase N in orgán ico en el

su elo (m g k g -1)
Mu y bajo 0 - 10
Bajo 10 - 20
Med io 20 - 40
Alto 40 - 60
Mu y alto > 60
N ota: La solu ción extractora prop uesta, así com o las otras d efinid as p ara fertili-
d ad d e suelos, son representativas d e la fracción d e am onio biod isponible para
p lantas. Esta m ism a m etod ología, en cu anto a extracción y cu antificación, se
ap lica en la rem ed iación d e su elo. Sin em bargo, no se ha establecid o la solu ción
extractora que sea la m ás ad ecuad a d e la fracción biod isponible a los m icroorga-
nism os, tam poco se ha generalizad o un rango d e concentraciones óptim as para
la rem ed iación d e suelos.
4.8 N itritos y nitratos in tercam b iab les
Introducción
Las fracciones m inerales d e nitrógeno son pred ominantemente amonio
y nitratos, mientras qu e los nitritos son rara vez d etectad os en el suelo,
inclu so su d eterm inación es norm alm ente inju stificad a excepto en su e-
los neutros y alcalinos que reciben amonio o fertilizantes liberad ores d e
amonio (Foster, 1995; Maynard y Kalra, 1993).
Al igual qu e el amonio, los nitritos se pueden emplear para estimular la

biodegrad ación d e hid rocarburos contaminantes al balancear la relación
C/ N (Brook et al., 2001; Walw orth y Reynold s, 1995). Diferenciándose
por lixiviarse más fácilmente por su carga negativa, especialmente en
su elos arcillosos. Los nitratos, ad emás de ser una fuente de nutrientes,
son aceptores de electrones en condiciones limitad as d e oxígeno.
En la determ inación analítica d e nitratos en suelos, varias soluciones

extractoras se han emplead o para su separación del suelo. Entre éstas se
encuentra el agu a; KCl d e 1 a 2 M; CaCl2 0.01 M; N aHCO 3 0.5 M; solu-
ción d e CaSO 4.2H 2O al 0.35% con 0.03 M d e N H 4F y 0.015 M H 2SO 4;
CuSO 4 0.01 M; y CuSO 4 0.01 M con Ag 2SO 4. De tod as éstas la solución
más común es el KCl. Para la d eterminación de las concentraciones d e
nitritos y nitratos en el extracto se utilizan diferentes métodos qu e inclu-
yen técnicas colorimétricas, microd ifusión, vapor de d estilación, análisis
de inyección d e flujo, cromatografía d e iones y electrod o de ión selecti-
vo (Maynard y Kalra, 1993).
Método
Determ inación d e nitritos y nitratos intercam biables en su elo p or ex-
tracción con cloruro d e p otasio (KCl 1M) y d eterminación p or electrofo-
resis ión cap ilar (EIC).
Fundamento
Los nitritos y nitratos solu bles se extraen d el su elo con una solu ción d e
KCl 1 M y se cu antifican por electroforesis capilar, previa filtración d el
extracto a través d e u na m em brana d e 0.45 µm, p ara p roteger el equipo
tod os los cationes no son activos al UV. En el analizad or ión capilar se

em plea un electrolito a base d e cromato d e sod io y la d etección es por
absorción UV ind irecta (ASTM D1498-00, 2000; Krol et al., 2000; US EPA
6500, 1998; US EPA 4140, 1998).
Material y equipo
Estu fa.
Mortero.
Balanza.
Centrífu ga.
Analizad or ión capilar.
Vórtex.
Pipetas.
Matraces volu métricos.
Filtro con membrana d e 0.45 µm.
Solución extractora. Cloru ro d e potasio (KCl) 1M. Pesar 74.56 g d e KCl
d isolver en agu a d estilad a y aforar a volum en d e 1 L.
Med io d e d ilu ción d e estánd ares. Cloruro d e potasio (KCl) 0.0037M.
Med ir 0.915 m l d e la solución KCl 1M y aforar a 0.25 L.
Solución para lavad o d e colum na. H id róxid o d e sod io (N aOH ) 0.1N .
Pesar 0.4 g d e N aOH d isolver en agua d esionizad a y d iluir a 100 ml.
Solu ción patrón d e nitrato (N O 3) 1 000 mg L-1. Pesar 1.37 g d e N aN O 3,
d isolver en agu a d esionizad a en u n volum en d e 1 L.
Solu ción patrón d e nitrito (N O 2) 1 000 mg L-1. Pesar 1.5 g d e N aN O 2,
d isolver en agu a d esionizad a en u n volum en d e 1 L.
Electrolito. Base d e cromato d e sod io 0.1 M. 4.6 ml d e solución OFM
anión-BT (Water CIA-pak), 9.2 m l d e cromato d e sod io 0.1 M en 200 m l
d e agu a d esionizad a grad o MiliQ.
Procedimiento
A. Extracción.
1) Secar el suelo a temperatura ambiente (25-30o C) y moler en un mortero.
2) Pesar 10 g del suelo molido, colocarlos en un tubo (Falcón para centrífuga
8 000 rpm por 10 minutos y recuperar el sobrenadante. Aproximadamente

1 ml será utilizado para el análisis de nitrato y nitrito.
Nota: Este p roced im iento d e extracción perm ite la obtención d e sobrenad ante
p ara la d eterm inación d e am onio intercam biable, con la d iferencia d e requ erirse
25 m l para la d eterm inación del am onio con otro p rotocolo d e cuantificación (ver
sección 4.7).
B. Cuantificación.
1) Realizar una d ilución inicial 0.5/ 5 (0.5 ml de sobrenadante en 4.5 ml
d e agua desionizada); a partir de ésta hacer u na segu nda d ilución
0.2/ 5 (0.2 ml d e la primera en 4.8 ml d e agua desionizada). Esta últim a
se debe filtrar a través d e u na membrana d e 0.45 µm y, posteriormen-
te, colocar 0.5 ml del filtrado en viales para el análisis por electrofore-
sis capilar.
2) Cond iciones d el equ ip o (CIA).
Tem peratura: 25°C.
Voltaje: 15kV con fu ente d e pod er negativa.
Detección: UV ind irecta a 254 nm .
Colu mna: Cap ilar d e 75 µm (d i) x 375 µm (d e) x 60 cm (largo).
Curva patrón. Elaboración d e la curva estánd ar para nitrato (N O 3).

Deberá p rep arar estánd ares entre 5 a 80 mg N O 3/ L a partir d e la solu-
ción patrón 1 000 mg N O 3/ L y como m ed io d e d isolu ción KCl 0.0037M.
El tiemp o d e corrid a d u rante el análisis d ebe ajustarse a 4.5 minutos.
Elaboración d e la curva estánd ar p ara nitrito (N O 2). Deberá p reparar

estánd ares entre 5 y 80 m g N O 2/ L, a partir d e la solu ción patrón
1 000 m g N O 2/ L y com o med io d e d isolución KCl 0.0037M. El tiemp o
d e corrid a d urante el análisis d ebe aju starse a 4.5 minu tos.
Cálculos
Para calcu lar la concentración final en m g L-1 d eberá tom arse en cuen-
ta la relación d e d ilu ciones. Finalmente, para convertir el resultad o
mg L-1 a concentración en peso (m g kg -1), se u tiliza la sigu iente rela-
ción. Ad emás es necesario corregir con la hum ed ad .
Interpretación
La clasificación d e fertilid ad d e su elos p or el contenid o d e nitrógeno
inorgánico (nitrato y amonio) se m uestra en la tabla 4.11.
Tabla 4.11 Clasificación de fertilidad de suelos por el contenido de nitrógeno inorgánico.
Clase N in orgán ico en el

su elo m g k g -1
Muy bajo 0 - 10
Bajo 10 - 20
Med io 20 - 40
Alto 40 - 60
Muy alto > 60
Nota: Los valores d e la tabla 4.11 correspond en a fertilidad d e su elos d el nitróge-

no biod isp onible para plantas; p or lo que ju nto al am onio se d ebe interp retar el
contenid o d e nitrógeno inorgánico en función a la capacidad extractiva d e la
solu ción em plead a, y evalu ar si es u n parám etro que perm ita d efinir los requ e-
rim ientos nutricionales d e los m icroorganism os en los p rocesos d e biod egrad a-
ción d e hid rocarbu ros.
4.9 Su lfato
Introducción
El su lfato es la p rincip al forma inorgánica d e azu fre en la m ayoría d e
los suelos, aunqu e p ued en estar presentes las form as elem entales y en
su lfu ro bajo cond iciones p red om inantem ente anaerobias. Otras form as
oxid ad as com o tiosulfatos, tetrationato o su lfito tam bién p u ed en estar
presentes en el su elo, p ero sólo com o intermed iarios d u rante la oxid a-
ción o red u cción d el su lfu ro. Los sulfatos p u ed en estar p resentes en
form as solu bles, ad sorbid os en la su perficie d el suelo o com o sales
insolubles (yeso o asociad os con carbonato d e calcio). Teóricam ente el
su lfato biod isp onible en fertilid ad d e suelos es el ad sorbid o y el solu -
Diferentes solu ciones extractoras se han em p lead o en las d eterm ina-

ciones d e su lfato en su elo, entre ellos se rep ortan el agu a, acetatos, car-
bonatos, cloru ros, fosfatos, citratos y oxalatos. Para cu antificar sólo el
su lfato solu ble, la elección teórica es el agu a; sin em bargo, com ú nm en-
te se em p lea u na solu ción salina d ébil en bajas concentraciones, com o
el cloru ro d e calcio p ara flocu lar el su elo y p ara p od er d ism inu ir m ate-
ria orgánica coloread a; o el cloru ro d e litio qu e p resenta el efecto bené-
fico ad icional d e inhibir la activid ad m icrobiana. Para recu p erar tod o
el su lfato ad sorbid o se recom iend a u na alta relación extractante:
su elo, e increm entar el p H p or arriba d e 6.5 p ara neu tralizar las cargas
p ositivas qu e establecen la ad sorción d el su lfato al su elo, y a su vez
evitar u na extracción ácid a d e p orciones d e yeso o su lfato asociad o a
carbonatos. Sin em bargo, a p H altos tam bién se extrae m ateria orgáni-
ca coloread a (Kow alenko, 1993).
Se han d esarrollad o varios m étod os p ara la cuantificación d e iones:

tu rbid im étricos, volum étricos, gravim étricos o colorimétricos d esp ués
d e precip itar al su lfato com o su lfato d e bario o d esp u és d e la red u cción
ácid a a su lfu ro. Otros métod os emp lean crom atografía d e iones, p las-
ma ind u ctivamente acop lad o y flou rescencia d e rayos X.
El métod o qu e se d escribe a continuación emp lea la electroforesis ión

capilar (EIC), que es una tecnología d e separación relativamente nu eva
(1990) p ara el análisis d e iones inorgánicos y orgánicos en solución
acu osa (ASTM D6508, 2000; Krol et al., 2000; US EPA 6500, 1998; US EPA
4140, 1998b).
Método
Determ inación d e su lfatos extraíbles en su elo con bicarbon ato d e
sod io (N aH CO 3) 0.5 M y d eterm inación p or electroforesis ión cap i-
lar (EIC).
Fundamento
Se extrae al sulfato qu e se encuentra en su elo en form a soluble y ad sor-
bid o con N aH CO 3 0.5 M y se cuantifica por electroforesis capilar. La
mayoría d e los instrum entos (EIC) em plean al d etector UV com o prima-
mato d e sod io, y la d etección p or absorción UV ind irecta (ASTM D6508,

2000; Krol et al., 2000; US EPA 6500, 1998; US EPA 4140, 1998).
Material y equipo
Estu fa.
Mortero.
Balanza.
Centrífu ga.
Analizad or ión capilar.
Vórtex.
Pipetas.
Matraces volu métricos.
Filtros d e membrana d e 0.45 µm.
1) Solu ción extractora. Bicarbonato d e sod io (N aH CO 3) 0.5 M. Secar
N aH CO 3 p or u na hora a 100o C. Pesar 42 g, d isolver en agu a y d ilu ir
a 1 L.
2) Med io d e d ilu ción d e estánd ares. Bicarbonato d e sod io (N aH CO 3)
0.004 M. Med ir 8 m l d e la solución N aH CO 3 0.5 M y d iluir en 1 L.
3) Solu ción p ara lavad o d e colum na (CIA). H id róxid o d e sod io (N aOH )
0.1N . Pesar 0.4 g d e N aOH d isolver en agu a d esionizad a y d ilu ir a
100 ml.
4) Solu ción p atrón d e sulfato (SO 4) 1 000 m g L-1. Su lfato d e sod io
(N a 2SO 4). Pesar 1.479 g d e N a 2SO 4, d isolver en agua d esionizad a en
un volum en d e 1 L.
5) Electrolito. Base d e cromato d e sod io 0.1 M. 4.6 ml de solución OFM
anión-BT (Water CIA-pak), 9.2 ml d e cromato de sod io 0.1 M en 200 ml
d e agua d esionizad a grad o MiliQ.
Procedimiento
A. Extracción.
1) Secar el suelo a temperatura ambiente (25-30oC) y moler en un mortero.
2) Pesar 1g d el su elo, colocarlo en u n tu bo (Falcon para centrífuga o equi-
valente), agregar grad ualmente 3 m l d e N aH CO 0.5M, mezclando
B. Cuantificación.
1) Realizar una d ilu ción inicial 2:5 (2 ml d e sobrenad ante y 3 m l d e agua
d esionizad a), a p artir d e ésta hacer una segu nd a d ilución 0.2:5 (0.2 m l
d e la primera d ilución y 4.8 m l d e agu a d esionizad a). Esta última se
filtra a través d e una membrana 0.45. Transferir 0.5 ml en viales para
el análisis p or electroforesis cap ilar (MeEC).
2) Cond iciones d el equ ip o (CIA).
Temp eratu ra: 25o C.
Voltaje: 15kV con fuente d e p od er negativa.
Detección: UV ind irecta a 254 nm.
Colum na: Capilar d e 75 mm (d i) x 375 mm (d e) x 60 cm (largo).
Curva patrón. Deberá p reparar estándares entre 5 a 80 mg SO 4/ L a partir

de una solución patrón d e 1 000 mg SO 4/ L de H CO 3 0.004 M. Los están-
dares d eben d e filtrarse a través d e u na mem brana 0.45 µm, agua d e
purga y electrolito. El tiempo de corrid a d urante el análisis d ebe ajustar-
se a 4.5 minu tos.
Cálculos
Para calcular la concentración final en m g L-1 se d ebe consid erar la rela-
ción d e d ilu ciones. Finalm ente, p ara convertir el resu ltad o m g SO 4/ L a
concentración en peso (mg SO 4/ kg su elo), en este caso, se utiliza la
siguiente relación:
mg SO 4/ kg su elo = mg SO 4/ L * 3.
Interpretación.
Las concentraciones d e sulfato en suelos no contam inad os comú nmen-
te no son altas, se cu enta sólo con una referencia d e umbral tentativo d el
Reino Unid o d e 100 a 200 m g kg -1 (ASTM DS64, 1996). Se d ebe tener
cu id ad o esp ecial en la interpretación d e su elos contam inad os con resi-
d uos y recortes d e lod os d e p erforación imp regnad os con hid rocarbu-
ros, p or la presencia d e barita (BaSO 4).
Los métod os d e cuantificación d el su lfato, así com o otros aniones, por

lo general están asociad os a estu d ios d e fertilid ad d e su elos, relacionan-
consid erar que la fracción solu ble en agu a está biod isponible p ara los
microorganismos, poco se p ued e intuir sobre la fracción ad sorbid a y la
insolu ble, p ara pod er establecer qu é fuerza extractante es la ad ecuad a
para la extracción d el su lfato d isp onible. Algu nos estu d ios realizad os
en laboratorios d el IMP (d atos no p roporcionad os) mu estran una
mayor cuantificación en la extracción d e su lfato con N aH CO 3 0.5 M qu e
con KCl 1M y agu a d estilad a d u rante cinéticas d e biod egrad ación.
4.10 Fe +2 y Fe +3
Introducción
El hierro está p resente en la biosfera en d os estad os d e oxid ación,
Fe +2 y Fe +3, los cu ales son term od in ám icam ente estables bajo con d i-
cion es anóxicas y óxicas, resp ectivam en te. El Fe +3 se en cu entra en
u na am p lia varied ad d e form as qu ím icas, com o m inerales altam ente
cristalinos: m agnetita (Fe 3O 4), geotita (FeOOH ), hem atita (Fe 2O 3),
vivianita (Fe 3(PO 4)2.8H 2O) o ferrihid rita (Fe(OH )3), y m inerales con
p oca o ningu na estru ctu ra cristalina: oxihid róxid os am orfos (H ach er
et al., 2001).
Las bacterias redu cen preferentemente los oxihidróxidos amorfos d e

Fe+3 (Lovley y Phillips, 1987). El métod o más com únmente utilizado
para med ir la concentración d e estos compuestos am orfos d e Fe +3 en
su elos y sed imentos es la técnica d e extracción con oxalato ácido d e am o-
nio. Sin embargo este métod o pued e catalizar la d isolu ción d e las formas
cristalinas que no son biodisponibles para las bacterias redu ctoras d e Fe,
y no d istingue entre la fracción cristalina y la amorfa. Un m étod o más
selectivo p ara la extracción d e los oxihidróxidos am orfos d e Fe+3 es la
técnica de extracción con hidroxilamina hidroclorad a (Lovley y Phillips,
1987; Byong-Hu n et al., 2001).
Método
Este métod o es aplicable p ara extraer Fe+2 y Fe+3 d e muestras d e suelo
con una solu ción ácid a y su cuantificación por colorim etría.
Fundamento
med iante la cuantificación d el com plejo colorid o formad o por Fe +2 con

o-fenantrolina, que absorbe a 510 nm.
Fe (II) + 3 [(o-fenantrolina)H +] [Fe(o-fenantrolina)3]2+ + 3H + .
Para d eterminar la concentración d e Fe +3, inicialmente el Fe +3 extraíd o

d ebe ser red ucid o a Fe +2 con hid roxilam ina hid roclorad a, que pued e ser
cu antificad o com o Fe+2 con o-fenantrolina.
El lím ite d e d etección d e la técnica va d e 1 a 50 p pm d e Fe+2, y en caso

d e tener extractos m ás concentrad os se recomiend a hacer las d ilu ciones
necesarias para obtener m ed iciones d e absorbancia entre 0.1 y 0.8.
Interferencias
Valores d e p H > d e 6, p rovocan u na recu p eración ineficiente d e Fe +2.
La p resencia d e N aN O 3 a concentraciones m ayores d e 0.01M p rovoca
u na recu p eración variable y a p H 7 el Fe +2 p u ed e ser oxid ad o d e
form a abiótica p or nitratos o nitritos. La p resencia d e su lfato p rovoca
qu e sólo sea extraíble ap roxim ad am ente 15% d el Fe +2 total entre u n
p H d e 4 y 5.
Material y equipo
Probetas d e 100 m l.
Matraces volu métricos d e 1L.
Tubos d e ensayo d e vid rio con tap a d e rosca d e 20 m l.
Pipetas grad uad as d e 1 y 10 m l.
Vasos d e p recipitad os d e 25, 50 y 100 ml.
Vórtex.
Tubos d e centrífu ga d e 15 m l.
Centrífu ga.
Espectrofotómetro visible.
1) Ácid o clorhíd rico (H Cl) 0.5 M. En u n m atraz volu métrico d e 1L con
100 ml d e agu a d estilad a, ad icionar lentamente 41.82 ml d e H Cl y
finalmente aforar con agu a d estilad a.
d isolver con 100 ml d e una solución d e H Cl 0.5M y posteriormente

aforar con la mism a solución.
3) Etanol 10%. Disolver 10 m l d e etanol 98% en 90 ml d e agua d estilad a.
4) o-fenantrolina (C 12H 8N 2.H 2O) 0.25%. Pesar 0.25 g d e o-fenantrolina
y llevar a 100 ml con u na solución d e etanol al 10%.
5) Buffer de acetato (C 2H 3O 2.N a) al 10%. Pesar 10 g d e acetato d e sodio y
disolver en 100 ml de agua d estilada. Ajustar a pH 4 con ácido acético.
6) Solución estándar de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH 4)2(SO 4)2.6H 2O)
(50 ppm de Fe). Pesar 0.3512 g d e su lfato ferroso am on iacal y trans-
ferir a u n m atraz volu m étrico d e 1L, d isolver y aforar con solu ción
d e H Cl 0.5 M.
Procedimiento
A. Extracción.
1) En u n tubo d e centrífu ga d e 15 ml pesar 0.1 g d e suelo húm ed o bajo
cond iciones anaerobias y ad icionar 5 m l d e solu ción d e H Cl 0.5 M.
Agitar en forma interm itente d u rante u na hora en vórtex.
2) Centrifu gar p or 10 minu tos a 6 000 rpm.
3) Utilizar el sobrenad ante para la d eterm inación d e Fe+2 y Fe +3.
Nota: Si es necesario, d iluir la m u estra p ara pod er hacer una lectura d entro d el
rango de 0.1 a 0.8 d e absorbancia.
B. Cuantificación.
1) Para la cu antificación d e Fe+2, tomar 0.2 m l d el sobrenad ante d e la
centrifugación, ad icionar 1 ml d e solución d e o-fenantrolina, 1 m l d e
solu ción bu ffer, completar a 10 ml con agua d estilad a y agitar vigoro-
samente en vórtex. Perm itir el d esarrollo d el color (15 a 20 minu tos) y
leer la absorbancia a 510 nm .
2) Para la cuantificación d e Fe total, tomar 0.2 m l d e sobrenad ante d e la
centrifugación, ad icionar 1 m l d e solu ción d e hid roxilamina y esperar
una hora. Posteriormente, ad icionar 1 m l d e solu ción d e o-fenantroli-
na, 1 ml d e solu ción buffer, comp letar a 10 ml con agua d estilad a y
agitar vigorosamente en vórtex. Perm itir el d esarrollo d el color (15 a
20 m inutos) y leer absorbancia a 510 nm.
Tab la 4.12 Prep aración d e la cu rva p atrón p ara d eterm in ar su lfatos.
Con cen tración Fe Sol. están d ar Agu a

(µg/m l o p p m ) d e su lfato (m l) d esion izad a (m l)
0 0 1
5 0.1 0.9
10 0.2 0.8
20 0.4 0.6
30 0.6 0.4
40 0.8 0.2
50 1 0
Ad icionar 1 m l d e solución d e hid roxilam ina hid roclorad a y esperar

una hora. Posteriorm ente ad icionar 1 ml d e solución d e o-fenantrolina,
1 ml d e solución bu ffer, com pletar a 10 m l con agua d estilad a y agitar
vigorosamente en vórtex. Permitir el d esarrollo d el color (15 a 20 m inu-
tos) y leer la absorbancia a 510 nm.
Cálculos
Calcular la concentración d e Fe +2 y Fe total en el extracto, con la ecua-
ción lineal d e la cu rva estánd ar.
CE (p pm) = ((Abs – b) / m ) * (FD).
Dond e:
CE = concentración d el extracto.
b = ord enad a al origen.
m = pend iente.
FD = factor d e d ilu ción.
Calcular la concentración final d e Fe +2 y Fe total d e la mu estra d e suelo

med iante la siguiente ecuación:
CS (µg / g d e suelo seco) = (CE * V) / (P * FH ).

P = cantid ad d e su elo húm ed o (0.1 g).

FH = factor d e corrección d e hum ed ad (1-(%hu med ad / 100)).
La concentración d e Fe +3 se calcula con la siguiente ecuación:
Fe +3 = Fe total – Fe +2.
4.11 Su lfu ro d e h id rógen o y m etan o
Introducción
La activid ad m icrobiana su lfato-red u ctora y m etanogénica d e los
m icroorganism os p resentes en u n su elo, agu a o sistem as d e cu ltivo en
laboratorio, se p u ed e d eterm inar con la p resencia d e su lfu ro (H 2S) y
m etano (CH 4) (Salm inen et al., 2004; Tiehm y Schu lze, 2003; Atteia
y Franceschi, 2002; Lors et al., 2001; Loser et al. 1998 ). Esta d eterm ina-
ción p u ed e realizarse p or crom atografía d e gases, p or ser u n m étod o
sensible a bajas concentraciones. La d eterm inación d e la activid ad
m etabólica, anaerobia o aerobia, a través d e los m etabolitos liberad os
(CH 4, H 2S, CO 2), p erm ite relacionar la p érd id a d e hid rocarbu ros con
la activid ad m icrobiana; factor esencial p rincip alm ente en el segu i-
m iento d e la atenu ación natu ral y en estu d ios d e biod egrad ación d e
hid rocarbu ros.
El d etector d e ionización d e flam a (FID) es no selectivo, em plea la com-

bu stión d e hid rógeno para la ionización d e los compu estos orgánicos.
Este tipo d e sistem as es u tilizad o p ara la separación y d etección d e com-
pu estos orgánicos en m uestras ambientales.
El d etector d e quimiolu miniscencia (SCD) es selectivo p ara compu estos

azufrad os. La operación se basa en la reacción d e ozono con monóxid o
d e su lfuro p rod ucid o p or la com bu stión d el analito. La luz p rod ucid a
por la combu stión es d etectad a con un fotom ultip licad or sensible a la
lu z azu l.
Comp uesto azu frad o SO + H 2O + otros p rod uctos.

Método
Este métod o es aplicable p ara m ed ir simu ltáneamente CH 4 y H 2S por
crom atografía d e gases con d etectores FID y SCD. El alcance d el m éto-
d o es d e 10 a 70 m g/ m 3 d e H 2S y 6 000 a 32 000 mg/ m 3 d e CH 4.
Fundamento
La pru eba se basa en la cuantificación simultánea de CH 4 y H 2S en la
atmósfera d e muestras líqu id as o sólid as por cromatografía de gases con
detectores d e ionización de flama (FID), para la d etección d e m etano,
quimioluminiscencia d e sulfuro (SCD) y sulfuro d e hid rógeno conecta-
dos en serie.
Material, equipo, reactivos y gases

Cromatógrafo d e gases con d etector FID y SCD.
Colum na para separar m etano y sulfu ro d e hid rógeno (por ejem plo:
H P-1).
Jeringa p ara mu estras gaseosas d e 100 µl.
Jeringa p ara mu estras gaseosas d e 250 µl.
H elio d e u ltra alta pu reza (99.999%).
Aire extraseco.
H id rógeno d e u ltra alta pu reza (99.999%).
Gases d e calibración, 2.5% CH 4, 50 pp m CO, 25 pp m H 2S, 12% O 2,
balance en N 2.
Procedimiento
Inyectar 100 µl d e la atmósfera d e la m uestra d e interés, y d eterminar la
concentración d e H 2S y CH 4 con base en el área bajo la curva d e cad a
pico, y a la curva d e calibración corresp ond iente a cad a comp uesto.
Para realizar las curvas d e calibración d e H 2S y CH 4, tomar alícu otas

d irectas d el tanqu e d e los gases. En la tabla 4.13 se presentan las alícuo-
tas y las concentraciones (p/ v) para cad a comp uesto.
Tab la 4.13 Volú m en es d e gases p ara realizar cu rva p atrón d e CH 4 y H 2S.
Volu m en d e Con cen tración d e Con cen tración d e

in yección (µl) CH 4 (m g/m 3) H 2S (m g/m 3)
50 6 302.8 13.39
100 12 605.7 26.78
150 18 908.5 40.17
200 25 211.4 53.56
250 31 514.2 66.95
4.12 Poten cial óxid o-red u cción . D eterm in ación

en lab oratorio y cam po
Introducción
El potencial óxid o-red ucción pued e d efinirse como una m ed id a cu anti-
tativa d e la energía d e oxid ación o d e la tend encia d el electrón d e esca-
parse o fu garse d e u n sistema reversible óxid o-red u cción (red ox). Esta
med ición refleja qué tan oxid ad o o red u cid o está el sistem a con referen-
cia a u n estánd ar. Cuand o el p otencial red ox está referid o con resp ecto
al hid rógeno, se expresa com o Eh en u nid ad es d e m ilivolts; E es la d ife-
rencia d e potencial entre el electrod o estánd ar d e hid rógeno y el siste-
ma en el cu al el p otencial red ox es med id o.
Debido a que el estado redox es una med ida cuantitativa del estado d e
oxid ación y reducción d e las sustancias en el sistema, ésta permite repre-
sentar el estado de oxid ación d e los compuestos susceptibles de ser
emplead os como principal aceptor de electrones para los microorganis-
mos. Así, los microorganismos emplean a los aceptores d e electrones más
oxid ados que les permitan obtener más energía, disminuyend o de mane-
ra secuencial d e aceptores bajo cond iciones aerobias (potencial redox
positivo) a anóxica y anaerobia (potencial redox más negativos).
Método
Determinación del potencial óxido red ucción en suelos, proced imientos
00, 2000; US GS, 1998; APH A, 1995), adecuado para suelos y lod os (ISO
11271, 2002; NRES 381, 2002; Patrick et al., 1996; Benada, 1995; Zausig,
1995; ZoBell, 1946). El método se modificó para su aplicación en muestreos
a distintas profundid ades durante la caracterización d e suelos.
Fundamento
Debid o a que las reacciones d e oxidación o reducción son movimiento de
electrones que involucran cambios en las cargas eléctricas, las intensid a-
des de las reacciones redox pued en med irse en términos de d iferencias
potenciales eléctricas (emf por sus siglas en inglés). Cuand o un electrod o
no atacable (como el platino o el oro metálico) se sumerge en un sistema
reversible redox, una diferencia de potencial se establece en el electrodo,
la cual puede medirse potenciométricamente. Esta diferencia de potencial
se crea debido a que el electrodo no participa en la reacción redox, por lo
que la concentración o tend encia de escape d e electrones en el electrod o
es diferente a la concentración en el sistema reversible de reacción red ox.
Este electrodo no atacable puede ser consid erado como un almacén d e
electrones actuando como un conductor inerte de electrones desde o para
un sistema. Así también se observa que cuanto más oxidad o está el siste-
ma, más alto será el potencial del electrodo.
Interferencias
Si el electrod o se expone a altas concentraciones d e su lfuro d e hid róge-
no p or varias horas, p ued e prod ucirse u na película en el electrod o d e
platino que interfiere con la med ición.
La materia orgánica, aceite y el sulfuro pueden causar contaminación de la

superficie del electrodo, del puente salino o del electrolito interno. Esto puede
provocar un funcionamiento errático cuando se emplean electrodos de refe-
rencia. Se debe limpiar y calibrar el equipo para verificar su funcionamiento.
Los electrod os d e red ox combinados y simp les de p latino p ued en pro-

du cir lecturas inestables en soluciones que contienen iones cromo, u ra-
nio, vanad io o titanio, y otros iones que son agentes redu ctores m ás fuer-
tes que el hidrógeno o el platino.
cipitad o azul insolu ble pued e cubrir la superficie del electrod o d ebido a
una reacción inmed iata entre los iones d e hierro y cianuro férrico en la
solución ZoBell con los iones ferrosos y férricos en la muestra d e agua,
cau sand o lectu ras erráticas.
Material y equipo
Potencióm etro con electrod os ORP.

Term ómetro.
Balanza portátil.
Muestra d e su elo (10 g mínimo).
Pipetas d e 10 ml.
Viales d e vid rio d e 40 ml.
Vasos d e p recipitad os.
Papel su ave para secad o d el electrod o.
Nota: El potencióm etro con un rango de +/ - 1 000 mV, resolución de 1 mV y preci-

sión de +/ - 1 m V es adecuado. Los arreglos d e electrodos comerciales deben estar
especificados para evaluar el potencial óxido-reducción, com únm ente compuestos
de un electrodo de un metal inerte (platino u oro) en forma de botón o anillo y un
electrodo de referencia d e calomelano (H g/ HgCl2) o Ag/ AgCl. Estos electrodos
deben tener una solución de inmersión d e referencia especificada d e KCl (3, 3.5, 3.8,
4 y 4.7 M o saturada), para permitir el cálculo de potencial referido al electrodo de
hid rógeno.
1) Agua d esionizad a.
2) Solución ZoBell (solu ción estánd ar red ox). Consiste en 0.1 M KCl con
cantid ades equimolares d e K4Fe(CN )6 y K3Fe(CN )6: Pesar d e 1.4080 g
K4Fe(CN )6.3H 2O, 1.0975 g K3Fe(CN )6 y 7.4557 g KCl, d isolver en agua
d esionizad a y aforar a 1 L. Los reactivos d eben estar secos antes d e su
uso, m antenerlos en un d esecad or u na noche. La solución final d ebe
ser almacenad a en u n recip iente d e p olietileno d e alta d ensid ad
(H DPE) oscuro qu e no p erm ita el paso d e la luz, p erfectam ente tapa-
do, refrigerad o a 4°C. Se conserva hasta seis meses. Se pueden emplear
solu ciones comerciales qu e se reconstituyen antes d e su u so.
4) Detergente libre d e fosfatos.
Nota: Algunas guías recom iend an la solu ción estánd ar red ox d e quinhid rona. Se
p refiere la ZoBell debid o a que es m ás estable a tem p eraturas m ayores a 30°C y
a que su d epend encia con la tem peratura no está tan bien d efinid a com o en la
solu ción ZoBell.
Proced imiento
A.1 Preparación de la muestra en laboratorio.
Para la d eterm inación d el p otencial red ox en p ru ebas d e biod egrad a-
ción o tratabilid ad en laboratorio, en los cu ales no sea factible la toma
d e m u estras, se p u ed e introd u cir el electrod o d irectam ente en el siste-
ma (su elo), extremand o cu id ad os d e limp ieza. En el caso d e mu estras
anaerobias, se d ebe realizar el análisis en u na cam pana anaerobia p ara
evitar la penetración d e oxígeno. Si es p osible tom ar u na m uestra d el
su elo o lod o, se recom iend a verterlo en u n vial d e 40 m l d e boca lige-
ramente más ancha qu e el electrod o, para red u cir el volu men d e la
mu estra.
Por últim o, si el poco volum en d e mu estra no permite la inmersión d el

electrod o se p ued e ad icionar agu a (recientem ente hervid a p ero enfria-
d a a temp eratu ra ambiente p ara eliminar el oxígeno) hasta d esp lazar
tod o el aire y agitar el vial para d isp ersar el su elo, con ayud a op cional
d e perlas d e vid rio (ZoBell, 1946). Las mu estras d eben estar siemp re
saturad as d e agu a, por lo qu e se recomiend a este ú ltimo p roced im ien-
to si la m uestra no está totalm ente húm ed a.
A.2 Preparación de la muestra en campo.

1) De acuerd o con el d iseño d el mu estreo se p ued en realizar las sigu ien-
tes ad ecu aciones para los d istintos tip os d e m uestreos:
a) Su perficial: Se introd uce el electrod o en el nivel d e su perficie
(Patrick, 1996).
b) In situ. Se hace un agujero en el suelo con una profund idad adecua-
da para el electrodo, dejando 2 o 3 cm d e menor profund idad para
introd ucir el electrod o (ISO, 2002).
c) Núcleo o muestra de suelo. Se submuestrean 10 g de suelo y se depo-
minar el oxígeno), hasta d esplazar tod o el aire y se agita el vial para d is-
persar el suelo. Se pueden emplear perlas de vid rio (ZoBell, 1946).
En caso d e suelos en los que se dificulta la humectación por la "repelen-

cia al agua" por hidrocarburos, por el alto contenid o de arcilla o por el
contenido de otros residuos, se recomienda pesar 10 g de suelo en el vial,
adicionar 20 ml de agua y medir el potencial red ox (N RES 381, 2002). La
preparación es semejante al procedimiento para medir pH (US EPA
9045D, 2004), se recomiend a al menos saturar el suelo (Brow n, 1934).
Este último proced imiento permite evaluar el potencial red ox en mues-

tras de suelo, a d istintas profundid ades provenientes de núcleos inaltera-
dos, para caracterizar la contaminación a través de muestreadores tipo
nucleadores, penetrómetros y tubos Shelby. Se recomiend a la d etermina-
ción en campo inmed iatamente d espués d e recuperar el núcleo y con
anterioridad a su homogeneización.
B. 1 Cuantificación.
1)Introd ucir el electrod o verificand o que esté en contacto íntimo con el
suelo. Esperar a qu e se alcance un equilibrio térm ico y registrar los
milivolts y la temp eratu ra inicial1.
2)Esperar a que se estabilice la lectu ra hasta +/ - 5 mV. La estabilización
pu ed e ocurrir hasta 30 m inutos d esp ués; tomar la lectura.
Calibración diaria. A d iferencia d e los sistemas pH , los electrod os d e

potencial d e óxid o red u cción (ORP) no pu ed en ser estand arizad os con
amortigu ad ores (buffers). Inclu so los equipos ORP son mu y sensibles a
interferencias, por lo qu e su calibración d ebe ser más continua.
1) Encend er el equ ip o y esperar a que se estabilice d e acu erd o con las

recomend aciones d el fabricante. Verificar, el contenid o d e la solución
d e inm ersión d e referencia (KCl), al m enos u na p ulgad a p or arriba d el
nivel en qu e se tom ará la lectu ra. Agitar el electrod o p ara remover
bu rbu jas y reemp lazar la solución d e ser necesario, d e acuerd o con las
especificaciones d el fabricante.
2) Enjuagar el electrod o y el termómetro con agu a d esionizad a y secar-

los con u n p apel suave.
3) Verter la solución ZoBell, introd u cir el electrod o y el termóm etro y
registrar la temperatura y el p otencial d esp ués d e 15 a 30 minutos d e
estabilización (+/ - 5 m V).
4) Enjuagar el electrod o y el termómetro con agu a d esionizad a y secar-
los con un papel suave. Se recomiend a conservar la solución ZoBell
para fu turas verificaciones.
N ota: En caso d e observar u na resp u esta d u d osa o se consid ere ad ecu ad o,

lim p iar el electrod o con d etergen te y u n cep illo d e d ien tes. Su m ergir en agu a
regia calien te (70°C) p or u n m inu to, n o m ás tiem p o p orqu e el agu a regia
d isu elve el m etal n oble y gen era resp u estas erráticas. Enju agar el electrod o
en agu a varias horas an tes d e u sarlo (verificar las recom end acion es d el fabri-
cante).
Cálculo del potencial óxido reducción con respecto al hidrógeno (Eh)
Eh = E med id o + E ref.
Eh = potencial relativo al electrod o d e hid rógeno (m V).

E m ed id o = potencial red ox med id o en milivolts.
E ref = potencial red ox d e referencia.
El p otencial red ox d e referencia (E ref) se obtiene d e acu erd o con la

tabla 4.14. Se d ebe consid erar el tip o d e electrod o d e referencia (orion,
calomelano o Ag/ AgCl); la concentración d e la solu ción d e inm ersión
d e referencia especificad a d e KCl; y la tem peratura.
En caso d e estar evalu and o el bu en fu n cion am ien to d el equ ip o y d el

electrod o con la solu ción d e referencia ZoBell, se p u ed e com p arar el
valor Eh calcu lad o con la sigu iente com p ensación d e la tem p eratu ra.
La d iferencia entre el valor observad o y el d e la tabla 4.15 no d ebe
ser m ayor qu e 5 m V; en caso contrario con sid erar la lim p ieza d el
electrod o.
Tab la 4.14 Potencial están d ar d e m ed ia celd a d e algun os electrod os d e referen cia

seleccion ados en fu n ción de la tem p eratu ra y la con cen tración d e la solu ción d e refe-
ren cia d e KCl.
T (°C) Ag/AgCl Calomelano (Hg/HgCl2) Or ión
KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl

(3M) (3.5M) (3.8M) (sat) (3M) (3.5M) (4M) (sat)
10 220 215 216 214 260 256 — 254 256
15 216 212 212 209 — — — 251 253
20 213 208 208 204 257 252 — 248 249
25 209 205 204 199 255 250 246 244 246
30 205 201 200 194 253 248 244 241 242
35 202 197 195 189 — — — 238 238
40 198 193 191 184 249 244 239 234 234
Tab la 4.15 Poten cial relativo al electrod o de h id rógen o d e la solu ción ZoBell en fu n -
ción d e la tem p eratu ra.
T (°C) Eh(mV) T (°C) Eh(mV)

10 467 26 428
12 462 28 423
14 457 30 418
16 453 32 416
18 448 34 407
20 443 36 402
22 438 38 397
24 433 40 393
Reproducibilidad
N o es posible alcanzar rep rod ucibilid ad d e m ilivolts en sistem as tan
comp lejos com o los su elos, lodos y sedimentos. La fluctuación de Eh en
los primeros 5 a 10 minutos después de la inserción de los electrodos se
debe a un fenómeno de equilibrio; sin embargo, en lodos y suelos que con-
tienen materia orgánica, organismos o enzimas, estos no permiten que se
alcance el equilibrio. Se ha observado que en 30 minutos las lectu ras son
estables, pero m ás d e 120 m inutos d espu és se p ued e registrar activid ad
bacteriana que evita que la reacción red ox sea reversible (ZoBell, 1946).
Este efecto pued e presentarse en un tiempo m ás corto en m uestras d e
reactores d e p ruebas d e biod egrad abilid ad o tratabilid ad .
Interpretación
La escala de Eh no presenta lím ites teóricos ni neutralid ad ; sin embargo,
se observa qu e el potencial red ox es cero (Eh = 0) para un electrod o d e
hid rógeno normal estánd ar (H 2, 1 atm, 25°C y pH = 0). También como
referencia se establecen los lím ites d e red ucción a - 410 mV para el caso
de hid rógeno (pH = 7) y oxidad o a +810 mV para oxígeno (pH = 7), aun-
que pued en existir sistemas con agentes más oxid antes o red uctores.
Algunos aceptores d e electrones para m icroorganismos, con respecto a
los potenciales redox, se muestran en la tabla 4.16.
Tab la 4.16 Acep tores d e electron es u tilizad os p or m icroorgan ism os en fu n ción al

p oten cial-red ox d el su elo.
Proceso Reacción ∆G° Eh

[KJ ] [mV]
Respiración aerobia CH 2 O + O 2 → CO 2 + H 2 O - >300
502,3
Desnitrificación 4 4 2 7 - >300
CH 2 O + NO 3− + H + → CO 2 + N 2 + H 2 O
5 5 5 5 476,8
Reducción de Mn CH 2 O + 2MnO 2 + 4H + → CO 2 + 2Mn 2+ + 3H 2 O - 300-100
(IV) 340,3
Reducción de Fe(III) + 2+ - 300-100
CH 2 O + 4 Fe(OH ) 3 + 4 H → CO2 + 4 Fe + 11H 2 O
115,0
2-
Reducción de SO4 1 1 1 - <100
CH 2 O + SO 24− + H + → CO 2 + HS − + H 2 O
2 2 2 104,7
En el caso de suelos contaminados con metales pesad os (Al, As, Ba Cd ,

Cr, Cu, Fe, H g, Ni, Pb, Se, V y Zn), el estado red ox altera su solubilid ad,
movilidad y por ende su efecto tóxico, variand o para cada metal. Los sol-
ventes clorad os mod ifican el potencial redox del suelo, hasta cond iciones
red uctoras que favorecen su biod egradación.
Las d eterminaciones en experimentos en laboratorio permiten d ar

seguimiento d e procesos y para el caso d e d eterminaciones en camp o,
se prefiere el p roced im iento en el sitio. Debid o a la naturaleza comp le-
ja d el suelo y a que varios sistemas biológicos no están en equ ilibrio, así
como a los cambios pu ntuales en el su elo, se recom iend a la interpreta-
ción d e los Eh ju nto con otras d eterm inaciones, com o la cu antificación
d irecta d e los princip ales aceptores d e electrones, e interpretar los resul-
tad os com paránd olos con la información d el sitio, especialmente los
controles (US EPA 600/ R-02, 2002).
4.13 D eterm in ación d e textu ra (tam añ o d e las p artícu las

d e los su elos)
Introducción
La textu ra d el su elo es la prop orción relativa por tamaños d e partícu las
d e arena, lim o y arcilla; las cuales al com binarse permiten categorizar al
suelo en u na d e las 12 clases texturales.
Método
La d eterminación d el tam año d e partícu las d el su elo pu ed e realizarse
entre otros m étod os por el p roced imiento d e la pipeta.
Interferencias
En el caso d e su elos contaminad os con hid rocarburos, si no se realiza
una buena eliminación d e la materia orgánica (qu e inclu ye a los hid ro-
carburos), ésta p ued e interferir con la d eterm inación.
Principio y aplicación
El métod o d e la pipeta es un procedimiento d e mu estreo d irecto que
determ inand o el tipo d e partícu la en función d e su velocidad d e sed i-

mentación.
La submuestra es tomada a una profundidad h y a un tiempo t, en el que

todas las partículas con diámetro mayor o igual que 0.002 mm han sedimen-
tado, teniéndose en las alícuotas únicamente partículas pertenecientes a la
fracción arcillosa. El método se basa en la Ley de Stokes.
Material y equipo
H exam etafosfato d e sod io 1 N .
Agua d estilad a.
Agua oxigenad a al 6%.
Pipeta low y.
Botellas d e 250 m l.
Tamices d e 300 mallas.
Botes d e alu minio.
Cápsu las d e p orcelana.
Estu fa d e aire forzad o.
Su elo sin materia orgánica.
Agitad or eléctrico.
Agitad or d e vid rio.
Plancha eléctrica grad u able.
Procedimiento
Pretratamiento de la muestra, digestión de la materia orgánica (m.o.).
1) Tom ar 100 g d e su elo seco, tam izarlo a través d e u na m alla d e 2 mm
y colocarlo en u n vaso d e p recipitad o d e 1 L, agregar agua d estilad a
hasta cubrir el su elo.
2) Ad icionar 10 ml d e agua oxigenad a al 6% y con el agitad or d e vid rio
revolver d urante 10 m inu tos.
3) Agregar otros 10 ml d e agua oxigenad a y observar si se d a una reac-
ción violenta con producción de espuma; si esto sucede agregar 10 ml
de agua oxigenad a cad a 15 minutos, hasta que no se produzca espuma.
4) Colocar el vaso en la p arrilla o p lancha eléctrica ubicad a d entro d e la
cam pana d e extracción, y calentar hasta 90ºC.
5) Verter 10 ml más d e agua oxigenad a y observar la intensid ad d e la
6) Despu és d e la ú ltima ad ición d e agu a oxigenad a, continuar calentan-
d o para eliminar el posible exceso d e agu a oxigenad a. Se recomiend a
un tiem po m ínimo d e 45 minutos.
7) Pasar el su elo a u n recipiente d e alum inio, usand o agu a d estilad a si
es necesario.
8) Introd ucir el recipiente a la estu fa para secar a 105°C hasta tener p eso
constante.
9) Vaciar la m uestra en u n mortero, moler y tamizar a través d e una
malla d e 2 mm.
Determinación de la textura
1) Pesar 5 g de suelo seco, sin materia orgánica, molerlo y posteriormente
tamizarlo a través de una malla de < 2 mm.
2) Colocar la m uestra en una botella d e 250 m l.
3) Agregar a la botella con su elo 10 m l d el d ispersante hexam etafosfato
d e sod io.
4) Llevar a aproxim ad am ente 50 m l con agu a d estilad a.
5) Agitar la botella con suelo, agu a y d ispersante p or 5 minutos, y d ejar
reposar por 12 horas.
6) Desp ués d el period o d el reposo agitar la susp ensión por 30 minu tos
con un agitad or eléctrico.
7) Pasar la suspensión p or el tamiz d e 300 mallas, recogiend o el filtrad o
en cáp sulas d e porcelana. Usar la menor cantid ad d e agua p ara sepa-
rar la arena qu e qu ed ará en el tam iz; la arcilla y el limo qu ed arán en
la su spensión.
8) Pasar el filtrad o a la botella d e 250 ml y agregar agu a d estilad a hasta
que se tenga u n volu men d e 200 ml.
9) Agitar la su spensión d u rante 2 m inutos y d ejar reposar por 1 hora 21
minu tos 40 segund os, d espu és se tom a u na alícuota d e 25 m l a la pro-
fu nd id ad d e 2 cm .
10) Colocar la alícu ota d e 25 ml en u n bote d e alu minio previamente
pesad o y secar en estu fa a 105°C hasta p eso constante. Poner la m ues-
tra a enfriar en el d esecad or y p esar.
11) Las arenas retenid as en el tamiz d e 300 m allas p asarlas a un reci-
piente d e alu minio previamente p esad o y poner a secar en la estufa a
105ºC hasta p eso constante.
Cálculos
% d e arena = (B/ A) x 100.
Dond e:
A = peso d e la mu estra.
B = p eso d e arenas.
% d e arcilla = (E / A) x 100.
C = peso d e arcilla + limo = (A - B).
% d e limo = (F / A) x 100.
D = peso d el su elo en la alícu ota (p artículas < 0.002 mm ).

E = peso d e arcilla = D x 8.
F = peso d el lim o = A - B – E.
Con los porcentajes d e arena, limo y arcilla y med iante el u so d el trián-

gu lo d e textu ra (figu ra 4.1) se d etermina la textura d el su elo.
10
0
90
10
80
20
70
30
60 Arcilla
40
%
Lim
la
50
ci l
50
o
Limo
Ar
arcilloso
40
Ar cillo 60
arenoso
30
70
Franco Franco arcillo
Franco arcillo arcilloso limoso
arenoso
20 80
Franco
10 90
Franco arenoso
Limoso 0
Aren a
Franco 10
arenoso
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
4.14 D eterm in ación d e la capacid ad d e in tercam b io

catiónico y b ases in tercam b iab les
Introducción
Tod as las moléculas, en mayor o m enor med id a, tienen minúsculas car-
gas eléctricas, positivas y/ o negativas. Por ello, en el suelo actúan como
pequ eños imanes, formand o entre ellas estructu ras que p ued en ser muy
simples, como la atracción entre una partícula d e arcilla cargad a negati-
vamente y una partícula d e un fertilizante cargada positivamente; o m uy
complejas, com o cu and o hay la m ateria orgánica, con infinid ad d e car-
gas eléctricas d e ambos signos.
La CIC o capacidad de intercambio catiónico es la capacidad del suelo

para retener e intercambiar diferentes elementos minerales. Esta capaci-
dad aumenta notablemente con la presencia d e materia orgánica, y podría
decirse que es la base de lo que llamamos fertilidad del suelo.
Catión, ión cargad o p ositivamente (N H 4+ , K+ , C a 2+ , Fe2+, N a +, H +,

Al3+ ) o anión, ión cargad o negativamente (N O 3-, PO 42-, SO 42-, etc...).
La CIC depend e de la textura del su elo y d el contenid o d e materia orgá-

nica. En general, entre más arcilla y materia orgánica en el suelo, la capa-
cid ad d e intercam bio es mayor. El contenido d e arcilla es importante,
debid o a que estas pequeñas partículas tienen u na relación alta d e área
su perficial a volumen. Los d iferentes tipos d e arcillas presentan diferen-
tes valores d e la CIC. Las esmectitas tienen una mayor capacid ad d e
intercambio catiónico (80-100 m iliquivalentes 100 g -1), seguida por ilitas
(15-40 meq 100 g -1) y caolinitas (3-15 meq 100 g -1).
Algu nos ejemp los d e valores d e cap acid ad d e intercambio catiónico

para d iferentes texturas d e su elo se mencionan a continu ación:
Textu ra d e su elo CIC (m eq /100 g su elo)
Arenas (color claro) 3- 5

Arenas (color oscu ro) 10 - 20
Francos 10 - 15
Franco lim oso 15 - 25
Arcilla y franco arcilloso 20 - 50
Su elos orgánicos 50 - 100
En general, en la m ayoría d e los su elos la CIC aum enta cuand o se pre-

sentan increm entos en el pH .
Método
Determ inación d e la capacid ad d e intercam bio catiónico (CIC) y bases
intercam biables (Ca 2+ , Mg 2+ , N a + y K+ ) d e los suelos, em pleand o ace-
tato d e amonio.
El método para la d eterminación consiste en la saturación de la su perfi-
cie de intercambio con un catión índice, el ión amonio; lavado del exceso d e
saturante con alcohol; d esplazamiento d el catión índ ice con potasio y
determ inación del amonio m ed iante destilación. El amonio se emplea
como catión índice debid o a su fácil d eterminación, p oca presencia en
los suelos y porque no precipita al entrar en contacto con el suelo. La
concentración normal que se usa asegura una completa saturación d e
la su perficie d e intercambio, y como está am ortiguad a a pH 7.0, se logra
mantener u n cierto valor d e pH . El lavado con alcohol pretend e d espla-
zar el exceso d e saturante y minimizar la pérd id a d el amonio ad sorbid o.
Material y equipo
Tubos d e centrífu ga d e 50 m l con fond o red ond o.
Agitad or mecánico.
Centrífu ga con cap acid ad p ara 8 o 16 tu bos.
Matraces volu métricos d e 100 ml.
Soluciones
Los reactivos qu e a continu ación se m encionan d eben ser grad o analíti-
co a m enos que se ind iqu e otra cosa. Cuand o se hable d e agu a se d ebe
entend er agu a d esionizad a o d estilad a. Las soluciones para este análisis
d eben almacenarse en recipientes d e polietileno.
1) Solución de acetato de amonio 1.0 N, pH 7.0. Diluir 57 ml de ácido acé-

tico glacial (99.5%) con agua a un volumen de aproximadamente 500 ml.
Agregar 60 ml d e hidróxido de amonio concentrado, diluir con agua a
un volumen de 990 ml, mezclar, ajustar a pH 7.0 y diluir a un volumen
final de 1 L con agua.
Una alternativa consiste en pesar y d isolver 77 g d e acetato d e amonio
(N H 4C 2H 3O 2) en 900 ml de agua y de ser necesario ajustar a pH 7.0 y
entonces completar a 1 L con agua.
2) Alcohol etílico grad o ind u strial.
3) Solución de cloruro de sodio al 10%. Pesar 100 g de cloruro de sodio
grado analítico y disolver en 1 L de agua, empleando un matraz aforado.
4) Solu ción d e cloruro d e am onio 1N . Pesar 53.50 g d e N H 4Cl y d isol-
ver en agua. Aju star a p H 7.0 con hid róxid o d e amonio y d ilu ir a 1 L
em pleand o u n m atraz aforad o.
5) Solución d e cloru ro d e amonio 0.25N . Pesar 13.38 g d e N H 4Cl y d isol-
ver en agua. Aju star a p H 7.0 con hid róxid o d e amonio y d ilu ir a 1 L
em pleand o u n m atraz aforad o.
6) Indicador mixto. Mezclar volúmenes iguales de rojo de metilo al 0.66%
y de verd e de bromocresol al 0.99%. Ambos disueltos en etanol al 95%.
7) Solu ción d e ácid o bórico. Usar H 3BO 3 al 2% en agua d estilad a qu e
contenga 10 m l d el ind icad or p or litro.
8) Acid o clorhíd rico 0.01 N , valorad o.
9) H id róxid o d e sod io al 40%. Disolver 400 g d e N aOH en agua d estila-
d a y llevar a 1 000 ml.
10) N itrato d e p lata 0.1 N . Disolver 16.98 g d e AgN O 3 en agu a d estila-
d a y llevar a 1 000 ml.
11) Solu ción d e lantano acid ificad a. Pesar 7.742 g d e La(N O 3)·6H 2O en
un matraz volu métrico d e 250 m l con agu a d estilad a añad ir 17.5 ml d e
H N O 3 concentrad o y aforar.
12) Solu ción d ilu id a d e lantano acid ificad a. Tomar 50 ml d e la solución
13) Solución d e cloruro d e cesio acid ificad a. Disolver 11.12 g d e CsCl y

250 ml d e Al(N O 3)3·9H 2O en 500 ml d e agu a en un matraz volum étri-
co d e 1 000 ml, añad ir 20 m l d e H N O 3 2 M y aforar con agua.
14) Solu ción d e ácid o nítrico 2 M. Diluir 7 ml d e H N O 3 concentrad o en
agu a, aforar a 100 m l en u n matraz volu métrico.
Procedimiento
1) Pesar 5 g d e suelo secad o al aire y tamizad o por m alla d e abertu ra d e
2 m m y transferirlo a u n tu bo d e centrífu ga d e 50 m l. Agregar 33 m l
d e solu ción d e acetato d e am onio. Tap ar y agitar en p osición hori-
zontal d u rante 10 m inu tos. Lu ego, centrifu gar hasta qu e el líqu id o
sobrenad ante esté claro. Esto se logra fácilmente centrifugand o a
2 500 rpm . Decantar el líqu id o en u n m atraz d e 100 m l y rep etir la ex-
tracción otras d os veces; aforar con acetato d e am onio y gu ard arlo
p ara la p osterior d eterm inación d e las bases intercam biables (solu-
ción A).
2) Agregar 30 m l d e la solución d e cloruro d e am onio 1 N ; agitar d uran-
te 10 minutos y luego centrifugar hasta que el líquid o sobrenad ante
esté claro y d esecharlo. Ad icionar 30 ml d e la solución d e cloruro d e
amonio 0.25 N, agitar d urante 10 minutos, centrifugar y d esechar el
sobrenad ante. Lavar la muestra con porciones de alcohol d e 30 ml agi-
tand o d urante 10 minutos, centrifugar y eliminar el sobrenad ante cada
vez. El lavado term ina cu and o la prueba d e cloruros en el d ecantad o
es negativa.
3) Pru eba d e cloruros. Pipetear 10 ml d el sobrenad ante alcohólico en un
tubo d e ensaye y agregar 4 o 5 gotas d e nitrato d e plata, si se observa
un ligero precipitad o blanco, la reacción es p ositiva y se d ebe conti-
nu ar el lavad o hasta que la p ru eba d e cloru ros sea negativa.
4) Reem p lazar el am on io ad sorbid o con tres p orciones d e 33 m l d e
cloru ro d e sod io al 10%, agitand o d u ran te 10 m inu tos y centrifu -
gand o cad a vez. Decantar cad a reem p lazo en u n m atraz volu m étri-
co d e 100 m l y com p letar al volu m en. Determ in ar el am onio a
p artir d e u na alícu ota d e 10 m l, la cu al se transfiere a u n m atraz
Kjeld ahl d e 300 m l, se le agregan ap roxim ad am en te 8 m l d e N aOH
al 40% y se con ecta al ap arato d e d estilación m icrokjeld ahl. Recoger
el p rod u cto d e la d estilación en u n m atraz Erlenm eyer qu e con ten-
Cálculos
La capacid ad d e intercambio catiónico expresad o en cmol(+) kg -1 d e
suelo (CIC) se calculará d e la form a sigu iente:
CIC = (F) (V) (N ).
En d ond e:
V = volu men (m l) d e H Cl em plead o al titu lar lo d estilad o en la solución
borad a.
N = normalid ad d el H Cl; y
100 100
F= X
Alícuota Peso d el suelo
Si la alícuota = 10 m l y peso d e suelo = 5 g, entonces F= 200.
Determinación de Ca y Mg intercambiables
1) Pipetear 0.5 m l d e la solución A en un tubo d e ensaye.
2) Añad ir 9.5 m l d e la solución d ilu id a d e lantano y m ezclar.
3) Med ir la concentración d e Ca y Mg en las series estánd ar, el blanco y
la muestra por espectrofotometría de absorción atómica a u na longitud
d e ond a d e 422.7 y 285.2 nm, respectivamente, usando u na flama d e
aire-acetileno.
Cálculos
-1 30 1 000 1 a-b
Na(cmol (+) kg ) = (a- b) x x 10 x = 1.304 x
10
100 10 w 2 w
100 1 000 2 a-b

Mg (cmol (+) kg-1) = (a - b) x x 20 x = 16 447
100 10 w 24.32 w
Dond e:
a = concentración d e Ca o Mg m ed id a en la mu estra (m g L-1).
Determinación de Na y K intercambiables
2) Añad ir 1.0 m l d e la solución d e cloru ro d e cesio acid ificad a.
3) Añad ir 8 m l d e agua y mezclar.
4) Med ir la concentración d e N a y K en las m uestras, el blanco y las
series estánd ar p or espectrofotom etría d e emisión d e flam a.
Cálculos
30 1 000 1 a-b
Na (cmol (+) kg-1) =(a - b) x x 10 x x = 1.304
1 000 10 w 23 w
3 1 000 1 a-b
K (cmol(+) kg-1) =(a-b) x x 10 x x = 0.767 x
1 000 10 w 39.1 w
Dond e:
a = concentración d e N a o K med id a en la mu estra (m g L-1).
b = concentración d e N a o K m ed id a en el blanco (mg L-1).
w = p eso d el suelo seco (g).
Comentarios
La CIC no deberá expresarse como meq/ 100 g, ya que las unidades acep-
tadas por el Sistema Internacional (SI) son cmol(+) kg -1, pero para que los
valores d e la CIC sean familiares se dividirán entre 100. Por lo tanto, la
CIC es expresad a como cmol (+) kg -1. El signo (+) es añadido para indicar
que la CIC deberá ser expresada como moles de cationes monovalentes;
por lo tanto, los iones divalentes cuentan el doble.
Interpretación de resultados de la capacidad de intercambio

catiónico (CIC)
La capacid ad d e intercambio catiónico (CIC) es una propiedad química a
partir de la cual es posible inferir acerca del tipo de arcilla presente, de la
magnitud de la reserva nutrimental y del grado de intemperismo de los
suelos. El resultado numérico de la determinación sirve además como base
minerales arcillosos presentes en los suelos hay que considerar la medi-

ción hecha por Grim (1953) en los silicatos laminares d el tipo 1:1 y 2:1,
empleando acetato d e amonio 1 N, pH 7.0.
Con resp ecto al grad o d e intemp erism o, se consid era qu e un valor d e

CIC inferior que 10 cmol (+) kg -1 d e su elo en u n horizonte B con más
d e 30 a 40% d e arcilla ind ica tanto la ausencia d e minerales prim arios
intemp erizables, com o la acum ulación d e minerales secu nd arios d el
gru po caolinítico y óxid os libres. Por lo que respecta a la reserva nutri-
mental se consid era que ésta es abund ante cu and o la CIC es m ayor qu e
25 cmol (+) kg -1 d e su elo. La fertilid ad d e los suelos se p ued e clasificar
d e acuerd o con los resu ltad os analíticos obtenid os con métod os apro-
piad os tanto en suelos ácid os como alcalinos (tabla 4.17).
Tab la 4.17 Clasificación d e la fertilid ad d e su elos d e acu erd o a la CIC.
Clase CIC (cmol(+) kg -1)
Muy alta > 40

Alta 25 - 40
Media 15 - 25
Baja 5 - 15
Muy baja >5
Los niveles d e calcio, magnesio y potasio (Ca, Mg y K) obtenid os d e los

análisis d e las bases intercambiables pued en interp retarse com o se ind i-
ca en la tabla 4.18.
Tab la 4.18 Clasificación d e los n iveles d e calcio, m agn esio y p otasio.

cmol (+) kg-1
Clase Ca Mg K
Muy baja < 2 < 0.5 < 0.2

Baja 2 – 5 0.5 – 1.3 0.2 – 0.3
4.15 D eterm in ación d e la cap acid ad d e in tercam b io catión ico

en su elos ácidos y calcáreos y bases in tercam b iab les
Método
La d eterminación d e la capacidad de intercambio catiónico en suelos áci-
dos y calcáreos y bases intercambiables se realizará a través del métod o
AS-13, con tiourea d e plata.
Métod o p ara d eterminar la capacid ad d e intercambio catiónico (CIC) y
bases intercambiables (Ca, Mg, N a y K) d e los su elos ácid os y calcáreos,
em pleand o tiourea d e plata (Ag TU) 0.01 M com o solu ción saturante. El
proced imiento consiste en equ ilibrar u na m uestra d e su elos con una
solu ción d e Ag TU 0.01M. La afinid ad d e este reactivo por las cargas
negativas d e las partícu las d el suelo p ermite u na comp leta saturación,
aun cuand o el suelo contenga relativam ente altas concentraciones d e
otras sales. Esto requ iere d e una sola etapa, o sea la extracción y centri-
fu gación para que el intercam bio sea completo. Por lo tanto, el sobrena-
d ante contend rá tod os los cationes intercambiables.
Material y equipo
Material común d e laboratorio.
Tubos d e centrífuga d e polipropileno d e 50 m l d e capacid ad con tapón
d e rosca.
Agitad or mecánico d e agitación recíproca.
Centrífu ga.
Espectrofotómetro d e absorción atóm ica.
Soluciones
Los reactivos qu e a continu ación se m encionan d eben ser grad o analíti-
co cu and o se hable d e agu a se d ebe entend er agu a d esionizad a o d esti-
lad a. Las soluciones p ara este análisis d eben alm acenarse en recip ientes
d e polietileno.
1) Solución de nitrato d e plata 0.04M. Disolver 3.4 g d e AgN O 3 en 500 ml

d e agua.
recibiend o el filtrad o d e u n frasco volum étrico d e 2 000 m l. Agregar

mientras mezcla la solu ción d e nitrato d e p lata 0.04 M y aforar con
agu a. Almacenar en la oscurid ad .
3) Solución d e tiourea 0.1 M. Disolver 7.5 g d e tiourea en u n litro d e
agu a y filtrar a través d e pap el Whatm an 42 o su equivalente.
4) Solu ción estánd ar d e Ag d e 500 mg L-1. Disolver 0.3937 g d e AgN O 3
en agu a en un matraz volumétrico d e 500 ml y aforar el volu men con
agu a. Almacenar en la oscurid ad .
5) Solu ción estánd ar diluid a d e Ag d e 100 mg L-1. Pipetear 20 ml d e la
solu ción estánd ar en u n m atraz volu métrico d e 100 ml y d iluir al volu-
men con agua. Almacenar en cond iciones d e oscurid ad .
6) Solu ción d e ácid o nítrico 1 M. Diluir 70 m l d e H N O 3 concentrad o en
agu a aforand o a 1 000 ml en un matraz volumétrico.
7) Series estándar. Pipetear en matraces volumétricos de 100 ml: 0, 2.0, 4.0,
6.0, 8.0 ml, respectivamente, de la solución diluida estándar y agregar
0.5 ml d e la solución de tiourea 0.1 M; adicionar 10 ml de la solución de
HNO 3 1 M a cada uno, y aforar el volumen con agua. La concentración
de Ag en esta serie estándar es de 0, 2, 4, 6, 8 mg L-1.
8) Solución d e lantano acid ificad a. Pesar 7.742 g d e La(N O 3)3 6H 2O en
un matraz volu métrico d e 250 ml, añad ir agua y 17.5 m l d e H N O 3
concentrad o, aforar con agua.
9) Solución estánd ar d e 1 000 mg L-1 d e Ca. Pesar 2.5 g d e CaCO 3 en un
vaso d e p recipitad o d e 250 m l, añad ir aproxim ad amente 100 ml d e
agu a y 12.5 ml d e H Cl 4 M; hervir para elim inar el CO 2 (si permane-
cen partícu las d e CaCO 3 añad ir 2 m l m ás d e H Cl 4 M). Enfriar y trans-
ferir la solu ción a u n matraz volum étrico d e u n litro y aforar con agua.
10) Solución estánd ar d e 100 mg L-1 d e Mg. Pesar 1.013 g d e MgSO 4
7H 2O en u n matraz volu métrico d e u n litro y aforar con agua.
11) Solu ción estánd ar m ezclad a, 100 mg L-1 d e Ca y 10 m g L-1 d e Mg
tomar 10 ml d e la solución estánd ar d e 1 000 m g L-1 d e Ca y 10 ml d e
la solución estánd ar d e 100 m g L-1 d e Mg en u n matraz volum étrico
d e 100 m l y aforar con agua.
12) Solución diluida de lantano acidificada. Tomar 50 ml de la solución de
lantano acidificada en un matraz volumétrico de 500 ml y aforar con agua.
13) Series estánd ar. Pipetear 0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 ml, respectivamente, d e
la solución estánd ar mezclad a en seis matraces volumétricos de 100 ml;
0.3, 0.4 y 0.5 m g L-1 d e Mg y 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mg L-1 d e Ca y Mg.

14) Solu ción d e cloruro d e cesio acid ificad a. Disolver 11.12 g d e CsCl y
250 g d e Al(N O 3)3 9H 2O en ap roxim ad amente 500 ml d e agu a en u n
m atraz volu m étrico d e 1 000 m l, añad ir 20 m l d e H N O 3 2M y aforar
con agu a.
15) Solu ción d e ácid o nítrico 2 M. Diluir 7 ml d e H N O 3 concentrad o en
agu a aforand o a 100 m l en u n matraz volu métrico.
16) Solución estándar de potasio de 1 000 mg L-1 y de sodio de 400 mg L-1.
Disolver 1.9068 g d e KCl y 1.0168 g N aCl en agua en u n matraz volu-
métrico d e 1 000 ml y aforar con agua.
17) Solu ción estánd ar d ilu id a d e p otasio d e 100 mg L-1 y d e sod io d e 40
mg L-1. Pipetear 25 m l d e la solu ción estánd ar en un matraz volum é-
trico d e 250 ml, aforar con agu a.
18) Serie estánd ar d e N a y K. Pip etear 0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 ml d e la
solu ción estánd ar d ilu id a en seis m atraces volu métricos d e 100 m l,
respectivamente, añadir un poco d e agua, 10 ml de tiourea 0.1 M y 9 ml
d e la solución d e CsCl, y aforar con agu a y m ezclar. Esta serie están-
d ar tiene concentraciones d e 0, 1, 2, 3, 4 y 5 m g L-1 d e K y 0,0.4, 0.8,
1.2, 1.6 y 2 m g L-1 d e N a.
Procedimiento para determinar CIC

1) Pesar 1 g de muestra pasad a por un tamiz d e 0.5 mm de abertura.
2) Pasarlo a un tubo de centrífuga de polietileno de 50 ml.
3) Añad ir 30 m l d e la solución d e tiou rea d e plata 0.01 M.
4) Preparar u n blanco, es d ecir, a u n tu bo d e centrífuga sin suelo, aña-
d ir 30 ml d e la solu ción d e tiourea d e plata 0.01 M.
5) Tapar y agitar en posición horizontal d u rante cuatro horas.
6) Centrifugar a 2 500 rpm d u rante 10 minu tos.
7) Filtrar a través d e p apel filtro N o. 41 o equivalente (solución A).
8) Pip etear 0.5 ml d e esta solu ción a matraces volu métricos d e 100 m l,
d ilu ir ap roxim ad amente a 50 ml con agu a, añad ir 10 m l d e H N O 3 1 M
mezclar y aforar con agu a.
9) Med ir la concentración de Ag en las series estánd ar, la muestra y el
blanco por espectrofotometría d e absorción atómica a 328.1 nm de lon-
gitud d e onda, usando una flama d e aire-acetileno.
Cálculos
30
3 1 000 1 b-a
CIC ( cmol (+) kg- ) =(b-a) x 200 x
1
x x = 5.562
1 000 10 w 107.8
107.87 w
Dond e:
a = concentración d e Ag med id a en la m uestra (mg L-1).
b = concentración d e Ag m ed id a en el blanco (mg L-1).
w = p eso d e su elo seco (g).
Determinación de Ca y Mg intercambiables
2) Añad ir 9.5 m l d e la solución d ilu id a d e lantano y m ezclar.
3) Med ir p or espectrofotom etría d e absorción atóm ica, la concentración
d e Ca y Mg en las series estánd ar, el blanco y la mu estra a u na longi-
tud d e ond a d e 422.7 y 285.2 nm , respectivamente, usand o u na flama
d e aire-acetileno.
Cálculos
30 100 2 a-b
Ca( cmol (+) kg-1) = (a - b) x x 20 x x = 2.994 x
1 000 10 w 40.08 w
3 1 000 2 a- b
Mg (cmol (+) kg-1) = (a - b) x x 20 x x = 4.934 x
1 000 10 w 24.32 w
Dond e:
a = concentración d e Ca o Mg med id a en la m uestra (mg L-1).
b = concentración d e Ca o Mg med id a en el blanco (m g L-1).
w = peso d el su elo seco (g).
Determinación de Na y K intercambiables
2) Añad ir 1.0 m l d e la solución d e cloru ro d e cesio acid ificad a.
3) Añad ir 8 m l d e agua y mezclar.
Cálculos
10 0 1000 1 a-b
Na (cmol (+) kg -1) = (a - b) x x 10 x x = 4.347 x
1000 10 w 23 w
100 1000 1 a-b

K (cmol (+) kg -1) = (a - b) x x 10 x x = 2.557 x
1000 10 w 39.1 w
Dond e:
a = concentración d e N a o K med id a en la mu estra (m g L-1).
b = concentración d e N a o K med id a en el blanco (m g L-1).
w = peso d el su elo seco (g).
Comentarios
La CIC no d eberá expresarse como meq/ 100 g, ya qu e las u nid ad es pre-
ferid as por el SI son mol kg -1, pero para qu e los valores d e la CIC sean
familiares se d ivid irá entre 100. Por lo tanto, la CIC es expresad a com o
cm ol kg -1. El signo (+) es añad id o para ind icar que la CIC d eberá ser
exp resad a como moles d e cationes monovalentes; por lo tanto, los iones
d ivalentes cu entan el d oble.
4.16 D eterm in ación d e la acid ez y el alu m in io in tercam b iables
Introducción
El término pH define la relativa cond ición básica o ácid a de una substan-
cia. La escala d el pH cubre un rango de 0 a 14. Un valor d e pH + de 7.0 es
neutro. Los valores por debajo de 7.0 son ácid os. Aquellos que están
sobre 7.0 son básicos. Cuando un suelo se satura con H + actúa como un
ácido d ébil. Mientras mayor sea el H + retenido por el complejo de inter-
cambio, mayor será la acid ez del suelo. El aluminio (Al) también actúa
como un agente acidificante y activa el H +.
El pH d el suelo mid e la activid ad d e los iones H + y se exp resa en térmi-

una m agnitud 10 veces mayor en la acid ez o alcalinid ad d el suelo. Así,

por ejemp lo, u n suelo con p H d e 6.0 tiene 10 veces más activid ad d e
iones H + qu e uno d e p H 7.0. La necesid ad d e cal se incrementa rápid a-
mente a m ed id a qu e el pH d el suelo se red u ce.
En el pH del suelo tienen influencia varios factores, entre los que se

incluyen: material d e origen y profu ndidad del suelo, p recipitación,
inund ación, vegetación natural, cu ltivos sembrad os y fertilización nitro-
genada.
En los su elos rojos tropicales los m inerales arcillosos son estables hasta
un pH tan bajo com o 5.0. El Al y el Fe se encuentran atrap ad os d entro
d e las estru ctu ras d e las arcillas; se tornan tóxicos p ara la p lanta, sola-
mente cu and o la caolinita y los óxid os e hid róxid os se d isu elven; es
d ecir, cu and o el p H llega a u n rango entre 5.0 y 5.3, liberand o Al a la
solu ción d el suelo. En estos casos la toxicid ad d el Al pu ed e corregirse
si se encala el su elo hasta llegar a u n p H d e 5.5 a 6.0, lo cu al logra la
precip itación d el Al tóxico com o hid róxid o d e alu minio Al(OH )3, y
causa al mism o tiem po u n increm ento ap reciable en la CIC (su elos d e
carga variable).
La toxicid ad d el Al es probablem ente el factor qu e m ás limita el creci-

miento d e las p lantas en su elos fu ertem ente ácid os (pH menor qu e 5.5
en la m ayoría d e los su elos). El H + solamente es tóxico a u n p H menor
qu e 4.2.
Como se m encionó anteriorm ente, el pH d el su elo es una exp resión d e

la activid ad d el H + . La principal fuente d e H + en la m ayoría d e los sue-
los d e pH menor que 5.5 es la reacción d e Al con el agua, com o se
d em uestra en la sigu iente ecu ación:
Al+3 + H 2O — Al (OH )+2 + H + .
Esta reacción libera H + (acid ifica) y a su vez increm enta la cantid ad d e

Al+3 listo para reaccionar nu evam ente.
reem plazad os p or Al+3. Este proceso incrementa la activid ad d e H + y

por lo tanto red u ce el pH d el suelo en forma constante.
El pH influye en la activid ad m icrobiana d el su elo. Las bacterias se d e-

sarrollan m ejor en p H neutro y los hongos filam entosos en p H ácid os;
así, la d egrad ación d e hid rocarburos es mejor en cond iciones d e pH
neutro y alcalino qu e en p H ácid os (Maier et al., 1999).
Método
Determ inación d e la acid ez y el alum inio intercambiables por el proce-
d im iento d e cloruro d e p otasio.
Metod ología para la d eterm inación d e la acid ez intercambiable por el
métod o d e Barnhisel y Bertsch que u tiliza cloru ro d e potasio. Ad emás
d e las bases (Ca, Mg, N a y K) también hay u na cantid ad d e acid ez qu e
pu ed e ser d esplazad a d el com plejo intercam biable d el suelo. La canti-
d ad d e acid ez está en fu nción d el p H y d e la cap acid ad d e intercam bio
catiónico d el su elo. En la mayoría d e los suelos la acid ez está com pu es-
ta por el H + , el Al3+ y los ácid os orgánicos.
Material y equipo
Material común d e laboratorio.
Tubos d e p olietileno para centrífuga (100 ml).
Agitad or mecánico d e oscilatorio.
Centrífu ga.
Soluciones
1. Cloruro d e p otasio 1 M. Pesar 74.55 g d e KCl en un matraz volumé-
trico d e u n litro, d isolverlo y aforar con agua. Finalmente ajustar el
pH a 7.0
2. H id róxid o d e sod io 0.1 M. Pesar 4 g d e N aOH y d isolverlos en 1 L d e
agu a (valorarlo con H Cl 0.1 M d e referencia certificad o).
3. Ácid o clorhíd rico 0.1 M. (valorad o).
4. Fenolftaleína a 0.5% (p / v) en etanol. Pesar 0.5 g d e fenolftaleína en un
matraz volu métrico d e 100 ml, d isolverlo con etanol y aforar.
Procedimiento
1) Pesar 5 g d e su elo en un tu bo d e polietileno.
2) Ad icionar 50 ml d e la solución d e KCl 1 M.
3) Tapar el tu bo y agitar m ecánicamente d u rante 30 m inutos.
4) Destap ar los tubos y centrifu gar d urante 10 m inutos a 2 500 rp m.
5) Filtrar el sobrenad ante a través d e p apel Whatm an nú mero 42 o su
equ ivalente, recoger el filtrad o en un vaso d e precip itad o d e 100 m l.
6) Tomar una alícu ota d e 40 ml con u na pipeta volumétrica, y transva-
sarla en un matraz Erlenm eyer d e 125 ml.
7) Agregar cinco gotas d e fenolftaleína a 0.5% y titular con hid róxid o d e
sod io 0.1 M valorad o, hasta u n p unto final d e rosa perm anente.
8) Titular un blanco (igual volumen que muestra, de cloruro de potasio 1 M)
de la misma forma.
9) Desp ués d e registrar el gasto d e N aOH , agregar 2 m l d e flu oruro d e
potasio 1 M a la m ism a solu ción problema y titu lar con H Cl 0.1 M
valorad o, hasta la d esap arición d el color rosa.
10) Desp ués d e 30 minu tos agregar H Cl 0.1 M valorad o ad icional, hasta
un p unto final claro.
Cálculos
El alu minio e hid rógeno extraíd os son calculad os como sigue:
Acidez intercambiable (c mol (+) kg -1) = (a-b) (M x 100)

s
Dond e:
a = ml d e N aOH gastad os en la mu estra.
b = m l d e N aOH gastad os en el blanco.
M = molarid ad d e la solu ción d e N aOH .
s = peso d e la mu estra, en gramos.
mL HCl x M x 100
Acidez intercambiable (c mol (+) kg -1) =
g de muestra
Acidez de H+ (c mol (+) kg-1) = acidez como KCl - Al intercambiable
Dond e:
M = mu estra.
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5. H id rocarb u ros
d el p etróleo en su elo
ás de dos mil millones de toneladas métricas de petróleo son prod u-

M cidas por año en todo el mundo; una gran cantidad de los produc-
tos petrolíferos finales contaminan ambientes marinos y terrestres. Los
grandes accidentes que se presentan en la industria del petróleo, como
derrame de tanques, rupturas de tuberías y extracción de pozos, represen-
tan 10% de estas descargas, las cuales son más evidentes por la gran can-
tidad de hidrocarburos liberados en un sitio y tiempo determinado; sin
embargo, el restante 90% es debido a descargas menores de las activida-
des industriales, que contaminan el suelo y son arrastradas por las aguas
continentales.
En México existe un gran número d e sitios contaminad os, principalmen-

te con hid rocarburos del petróleo. Este hecho ha generado, en los últimos
años, interés de las instituciones gubernamentales y privadas por la legis-
lación y remediación de estos sitios. El conocimiento del tipo de contami-
nación y su concentración es fund amental para establecer las cond iciones
del sitio, el riesgo que representa y la selección de posibles tecnologías d e
recuperación.
Los lím ites d e limpieza p ara hid rocarburos en suelos y aguas d epend e-
rá d e los criterios o normas vigentes en México. En m arzo d e 2005 se
publicó la N orm a Oficial Mexicana N OM-SEMARN AT/ SS-2003, que
establece los límites máxim os permisibles d e hid rocarburos en suelos y
las esp ecificaciones para su caracterización y remediación. En éste, se
establecen los límites en función de las fracciones ligera, media y pesa-
da, así como d el uso d el suelo (tabla 5.1 ).
Tab la 5.1 Lím ites m áxim os p erm isib les p ara fraccion es d e h id rocarb u ros en su elo
(N O M -SEM ARN AT/SS-2003).
Fracción de Uso del suelo pr edominante 1

hidr ocarburos (mg kg -1 base seca)
Agrícola 2 Residencial 3 Industrial
Ligera 200 200 500
Media 1,200 1,200 5,000
Pesada 3,000 3,000 6,000
1 Para usos d e suelos m ixtos, d eberá aplicarse la especificación al m enor d e los valo-
res d e u sos d e suelo involu crad os.
2 Inclu ye suelo forestal, recreativo y d e conservación.
3 Inclu ye com ercial.
Para la d eterm inación d e las d iferentes fracciones d e hid rocarbu ros se

d ebe consultar la norma, d ond e se prop orcionan las metod ologías. Para
la d eterm inación tanto d e los límites p erm isibles d e hid rocarburos
como d e las m etod ologías, se recom iend a estar actualizad os con la
legislación.
En este m anu al se p resentan d iferentes técnicas d e extracción y cu anti-

ficación d e hid rocarburos, qu e bu scan optimizar los recu rsos y el tiem-
po d e realización.
5.1 Prep aración de m u estras d e su elo p ara extracción
Aunque el análisis de hidrocarburos puede hacerse con muestras húmedas,

se recomienda secarlas y molerlas para obtener muestras más homogéneas.
El secado de suelo para extracción se lleva a cabo de la siguiente forma.
Material
Espátula.
Mortero.
Hidroca rburos del pet róleo en suelo 91
Procedimiento
Poner a secar la mu estra (8-15 g d e suelo) extend id a en un pap el alu -
minio a 30ºC, d u rante 48 horas, en u n cuarto d e temp eratu ra controla-
d a o a la som bra.
Moler la mu estra en u n mortero hasta obtener p artícu las finas.
Colocar la m uestra seca en un frasco seco y limp io.
Nota: Au nqu e las m uestras se ponen a secar, casi nu nca se elim ina com pletam en-
te el agua, por lo qu e hay qu e d eterm inar la hu m ed ad final d e éstas, com o se
ind ica en la sección 4.2.
5. 2 Extracción d e h id rocarb u ros
Existen d iferentes técnicas d e extracción d e hid rocarburos, en este

manu al se m encionan d os d e las más com unes:
Extracción p or reflu jo (Soxhlet).
Extracción agitación-centrifugación.
5.2.1 Extracción por reflujo (Soxhlet)
Introducción
La extracción Soxhlet es una d e las técnicas analíticas más ampliamente
usad as; es un procedimiento para la extracción d e compuestos orgánicos
no volátiles y semivolátiles d e sólidos, como suelos, lod os y residuos.
Este método asegura el contacto íntimo de la matriz de la muestra con el
solvente de extracción. La extracción de hidrocarburos del petróleo por
Soxhlet provee fracciones de C6 a C50. Para la óptima extracción de los
compuestos orgánicos, los sólidos d eben estar en partículas pequeñas;
mientras más pequeñas sean las partículas, más área d e superficie y con-
tacto y, por lo tanto, mejor extracción. Así, sólid os de mayor tamaño
deben ser red ucid os a pequeñas partículas antes de la extracción. El de-
sarrollo d el método de extracción Soxhlet incluye encontrar un solvente
o mezclas d e solventes que tengan una alta afinidad por los analitos y una
baja afinidad por la matriz de la muestra sólid a. El solvente d ebe tener
Método
Para extraer los hid rocarburos d e suelos contaminad os se utiliza el méto-
do d e reflujo con equipo Soxhlet, tomando como referencia los métodos
D5369-93 de la ASTM (2003) y 3540C y 3541 de la US EPA (1996, 1994).
Fundamento
Este m étod o consiste en extraer los hid rocarburos contenid os en el
su elo, m ed iante la acción d e u n solvente orgánico volátil ap rop iad o,
qu e es reflu jad o a través d e la m u estra varias veces d u rante u n tiem p o
d eterminad o. El solvente es evap orad o y posteriorm ente cond ensad o
en u n refrigerante, se le hace pasar p or la m u estra y se le regresa al ori-
gen p ara ser nu evam ente evap orad o. La m u estra sólid a es m ezclad a
con sulfato d e sod io anhid ro p ara elim inar el agu a resid u al, se le colo-
ca en u n d ed al o cartu cho d e p ap el o fibra d e vid rio y se u sa u n sol-
vente orgán ico ap rop iad o p ara su extracción en u n equ ip o Soxh let.
Med ian te los reflu jos d el solvente y la tem p eratu ra se p erm ite el
con tacto ín tim o d e la m u estra con el solven te d e extracción , d e esta
m an era se logra la liberación d e los hid rocarbu ros p resen tes en la
m u estra. El extracto orgánico se concentra (si es necesario) o bien se
evap ora p ara realizar el intercam bio d e solvente, acord e con el m éto-
d o d e cu antificación.
Interferencias
Los solventes, reactivos, material de cristalería y otros artículos utilizados
en los proced imientos de preparación de la muestra pued en contener
impurezas (como hidrocarburos resid uales). Por lo que se requiere con-
firmar que estos materiales estén libres d e interferencias, bajo las mismas
cond iciones de análisis, mediante la corrida de un blanco, utilizand o
reactivos puros. La limpieza rigurosa d e los materiales por utilizar es ne-
cesaria y, en ocasiones, d ependiendo del grado d e pureza de solvente, es
conveniente purificarlo por destilación.
Los plásticos en p articular d eben ser evitad os porqu e los ftalatos qu e

contienen son comú nmente usad os como plastificantes y son fácilmen-
te extraíd os d e estos materiales.
Material y equipo
Equ ip o d e reflu jo Soxhlet d e 250 ml.
Perlas d e ebu llición.
Cartuchos d e celu losa o fibra d e vid rio.
Balanza analítica.
Vaso d e p recipitad os 250 m l.
Viales.
Espátula.
Reactivos
Su lfato d e sod io anhid ro (N a 2SO 4).
Diclorom etano (cloru ro d e metileno, CH 2Cl2) grad o H PLC.
Procedimiento
1) Colocar d e 5 a 10 g d e suelo seco y finamente molid o en u n cartu cho
d e celu losa o fibra d e vid rio.
2) Ad icionar sulfato d e sod io anhid ro en una relación su elo:sulfato 1:1
y mezclar.
3) Colocar cad a cartu cho conteniend o las m uestras d entro d e la cam isa
o colum na extractora d el equ ip o Soxhlet.
4) Ad icionar 125 ± 5 ml d e d iclorometano en el matraz d e bola y colocar
suficientes perlas d e ebu llición para evitar la proyección d el solvente
al calentarse.
5) Ensam blar el equ ip o Soxhlet e iniciar calentamiento hasta alcanzar
una tem peratura d e 45o C.
6) Mantener el reflujo en estas cond iciones d urante 8 horas, d e tal mane-
ra qu e se efectúen entre 6 y 8 reflujos p or hora, lo que permitirá la libe-
ración d e los analitos.
7) Desp ués d e 8 horas, el extracto orgánico contend rá tod os los hid ro-
carbu ros solubles en d iclorometano. Pasar el m atraz bola a un roto-
evap orad or y concentrar el extracto orgánico a sequ ed ad .
8) Recu p erar el concentrad o en u n vial d e 40 m l con tap ón d e teflón
p ara su cu antificación p or algu no d e los m étod os rep ortad os en la
sección 5.4.
5.2.2 Extracción agitación-centrifu gación
Introducción
Au nqu e la extracción con Soxhlet es una d e las técnicas m ás u tilizad as
para la extracción d e hid rocarbu ros p or su eficiencia d e extracción
(m ayor a 80%), el tiem p o y nú m ero d e m u estras qu e se logran p roce-
sar son lim itad as a la cantid ad d e equ ip os d isp onibles. Por esta razón,
se han d esarrollad o otras técnicas qu e tienen com o finalid ad op tim izar
los tiem p os d e extracción y cantid ad d e solvente por u tilizar, haciénd o-
las m ás económ icas y ráp id as, con la ventaja d e pod er p rocesar m ás
mu estras en m enor tiemp o; tal es el caso d e la extracción agitación-cen-
trifu gación.
Método
La técnica para la extracción de los hidrocarburos d el petróleo d el suelo
se basa en los métodos 3500B y 3540C de la US EPA (1996) y el reportad o
por Schwab et al. (1999), con algunas mod ificaciones (Arce et al., 2004) en
cuanto a la velocid ad d e agitación y volúmenes de solvente por utilizar.
Fundamentos
Este método se basa en la extracción de hidrocarburos no volátiles y semi-
volátiles de muestras sólid as (suelo) a través del contacto íntimo d e la
muestra con el solvente, mediante la agitación en un matraz o tubo (lava-
do), produciend o un efecto d e extracciones sucesivas, y separand o poste-
riormente el solvente del suelo por centrifugación.
Interferencias
Son las mismas que para el métod o d e extracción p or Soxhlet. Aunqu e
en el caso d e los tu bos d e centrifuga d e p lástico que se u tilizan en esta
técnica hay que tom ar en cuenta qu e no contengan ftalato en su form u-
lación, los más aprop iad os son d e polip ropileno.
Material y equipo
Tubos d e centrifu ga d e p lástico Corning o Falcon d e 15 m l.
Espátulas.
Vórtex.
Pipetas d e vid rio.

Centrífu ga.
Reactivos
Su lfato d e sod io anhid ro (N a 2SO 4).
Diclorometano (CH 2Cl2) grad o H PLC.
Procedimiento
1) Pesar una mu estra d e 0.5 a 2 g d e suelo seco, previamente tritu rad o en
mortero, en un tubo p ara centrifuga d e 15 ml y ad icionar 3 g d e N a 2SO 4
anhid ro, mezclar con agitación en el vórtex hasta homogeneizar.
Nota: el sulfato d e sod io anhid ro d ebe secarse previam ente en el horno por
4 horas a 120ºC.
2) Adicionar 5 ml de diclorometano y volver a agitar en el vórtex durante

45 segundos, de tal manera que se incorpore bien el solvente con el suelo.
3) Centrifugar la mu estra a 6 000 rp m d u rante 10 m inutos. Retirar el
sobrenad ante y colocarlo en un vial, matraz bola o tu bo d e vid rio.
4) Lavar el suelo dos ocasiones más sobre el residuo sólid o extraíd o, hasta
obtener aproximadamente 15 ml d e sobrenad ante (extracto orgánico).
5) Evaporar el d isolvente (d iclorometano) d el extracto orgánico en un
rotoevaporad or hasta concentrar a sequ ed ad . El resid uo obtenid o con-
tiene tod os los hid rocarbu ros solu bles en d iclorometano.
6) Recuperar el concentrad o en un vial de 40 ml con tapón de teflón para
su cuantificación por alguno d e los métodos reportad os más adelante.
Nota: Los resultados obtenidos con este método fueron comparados con el método de
extracción Soxhlet de acuerdo con el método D5369-93 del ASTM (1998 y 2003), y los
métodos 3540C y 3541 de la US EPA (1996 y 1994), para su validación (ver Anexo).
5.3 Fraccion am ien to de h id rocarb u ros
Introducción
Para caracterizar el tipo de hidrocarburos presentes en una mezcla d e
hid rocarburos proveniente de un suelo contaminado, se recomienda la
separación d e los d iferentes componentes de acuerdo con su polaridad
Método
Esta metod ología fu e ad aptad a tomand o como referencia los métod os
3600C, 3610B y 3611B d e la US EPA (1996), así como lo reportad o por
Later et al. (1981), en los qu e se d escriben los p roced im ientos para llevar
a cabo la sep aración d e cad a una d e las fracciones comp onentes d e un
extracto d e hid rocarbu ros. Los cambios fu nd am entales con resp ecto a
estas m etod ologías consistieron en m od ificar el tip o d e eluyente u tiliza-
d o (específicamente se su stitu yó benceno por tolu eno) y los volú menes
d e elu ción.
Fundamento
Esta técnica se basa en la sep aración d e los componentes (fracciones) d e
un extracto orgánico rico en hid rocarbu ros d el petróleo, p roveniente
d e un suelo contaminad o, d e acuerd o con su polarid ad , en una colu m-
na emp acad a con u n material m uy poroso y granular (alú mina) d e pH
neutro, sep arand o las fracciones d e com pu estos alifáticos (1ª fracción),
aromáticos (2ª fracción) y nitrogenad os (3ª fracción) d el p etróleo,
med iante la elu ción con d iferentes solventes. Los hid rocarbu ros se
ad sorben d iferencialm ente en la alúm ina, d e acuerd o con la polarid ad
d e los comp uestos, y son eluid os (separad os) d e m anera selectiva al
pasar un d isolvente con el cual los hid rocarbu ros tienen m ayor afini-
d ad . Un disolvente no polar logrará separar los compuestos menos adsor-
bid os en la alú mina.
Interferencias
La selectividad en la columna puede ser alterada d ebid o a la formación
ind eseable de canales o agrietamientos que se prod ucen por falta d e
disolvente o por un proceso de empacad o deficiente. La selectivid ad tam-
bién se ve afectada si se introduce agua en la columna.
La colum na d e alú mina tiene una capacid ad máxima para ad sorber los
hid rocarburos, la cu al no debe ser rebasad a. Es aconsejable que se hagan
pruebas preliminares, si se desea agregar más hid rocarburo del qu e se
señala en esta técnica.
Los reactivos por utilizar deben ser d e grad o HPLC libres d e impurezas,
Material y equipo
Colum na d e vid rio (13 mm d e d iám etro X 24 cm longitud ) con llave
d e teflón, tip o bu reta.
Probetas d e 10 y 50 ml.
Rotoevap orad or.
Lana d e vid rio (previamente lavad a con hexano).
Matraces balón d e 50 ml.
Viales d e 35 ml con tapón d e teflón.
Reactivos
Óxid o d e alu minio (alú mina) neu tra y d e activid ad 1 (malla 60-325).
Diclorom etano (CH 2Cl2) grad o H PLC.
H exano (CH 3(CH 2)4CH 3) grad o H PLC.
Tolu eno (C 6H 5CH 3) grad o H PLC.
Cloroformo (CH Cl3) grad o H PLC.
Procedimiento
1) En u n vial, colocar una muestra d e 0.8 g d e extracto d e hid rocarburo
(obtenid o com o se ind ica en la sección d e extracción 5.2) p roveniente
d el su elo contaminad o y d isolver en 0.5 m l d e cloroform o.
2) A la mezcla anterior, ad icionar 3 g d e alúm ina (óxid o d e alum inio)
(malla 60-325), homogeneizar p erfectamente hasta qu e la m uestra se
ad sorba, colocar el vial en u na cam pana d e extracción y d ejar evapo-
rar el d isolvente d u rante d os horas.
3) En u na colum na d e vid rio (13 mm d e d iámetro X 24 cm longitud ), en
la parte inferior, colocar fibra d e vid rio (d e 0.5 a 1.0 cm 3), d e tal forma
qu e imp id a la pérd id a d el m aterial d e em paque y únicam ente permi-
ta el flujo d el líqu id o.
4) Ad icionar 8 m l d e hexano en la colu mna con la llave cerrad a, antes
d e em pacarla con 3 g d e alú mina y los 3 g d e la mezcla obtenid a en el
paso 2, haciend o u n total d e 6 g d e m aterial em pacad o. Con esto, se
evitan espacios vacíos (grietas o canales) y se p erm ite que se hum ed ez-
ca el emp aqu e, d e tal m anera que sed imente p erfectam ente.
Nota: Una vez qu e se inicia el proced im iento d e fraccionam iento, evitar qu e el em p a-

que d e la colu m na se seque, lo que ocasionaría fractu ras en el soporte y u na separa-
5) Una vez sed imentada la alúmina con la muestra, adicionar 7 ml d e

hexano en la parte superior de la columna para iniciar la elución de la 1ª
fracción (A1) que contiene los compuestos alifáticos. Abrir la llave de la
columna recolectand o en la probeta los primeros 10 ml eluid os, los cua-
les se d epositan en un matraz d e bola de 50 ml.
6) Después, ad icionar en la colu mna 30 ml d e tolueno, recuperand o en la
probeta d e 50 ml los siguientes 28 ml, y verter en un matraz d e bola d e
50 ml marcad o como A2 (2ª fracción), que contiene las fracciones azu-
frad a y los hid rocarburos policíclicos aromáticos (H PA).
7) La 3ª fracción (A3) se elu ye ad icionand o 80 m l d e cloroformo en la
colu mna, recolectar el d isolvente restante en u n matraz marcad o com o
A3, el cual contiene los comp uestos nitrogenad os.
8) Evap orar el d isolvente en cad a una d e las fracciones recolectad as en
un rotoevap orad or.
9) Una vez que se tienen las fracciones separadas y concentradas a seque-
dad , se proced e a su análisis por cromatografía d e gases (ver sección
5.4.3) o por cromatografía d e gases acoplada a espectrometría de masas
(ver sección 5.5). Para la fracción azufrad a se recomiend a utilizar un cro-
matógrafo de quimioluminiscencia.
5.4 Cu antificación d e h id rocarb u ros
Despu és d e realizar la extracción y/ o fraccionamiento d e los hid rocar-

bu ros contenid os en u na mu estra d e suelo, estos se p ued en cuantificar
por varios m étod os, entre ellos:
Métodos gravimétricos:
H TPs.
Asfaltenos.
Métodos analíticos:
Espectroscop ia d e infrarrojo.
Cromatografía d e gases.
5.4.1 Métod o gravimétrico p ara la cuantificacion d e hid rocarburos

totales d el petróleo
Introducción
La técnica de gravimetría mide el peso d e los contaminantes totales ex-
traíd os con un solvente por med io de una balanza analítica. Ofrece una
cuantificación gruesa que no requiere equipo sofisticad o, es un procedi-
miento sencillo, barato y rápid o. El contenido de hid rocarburos a bajas
concentraciones no pued e ser d eterminado con mucha precisión con este
método, debido al error que se pued e presentar con pesos muy pequeños;
sin embargo, por arriba d e 50 000 mg kg -1 es recomendad a. Este método
no d a información sobre el tipo d e compuesto presente, o d e la presencia
o ausencia de compuestos tóxicos.
Método
Esta técnica es aplicable para cuantificar d e una manera gruesa a los com-
puestos totales extraíd os (HTPs y asfaltenos) contenidos en muestras d e
suelos contaminad os por med io de un balance d e pesos.
Fundamento
El método se basa en la cuantificación de los hidrocarburos que son extraí-
dos dentro de un solvente adecuado. El solvente es evaporado y el extrac-
to orgánico obtenido es pesado. Esta cuantificación es llamada HTPs y es
reportada como porcentaje de la muestra total en peso seco. Este método
es más adecuado para petróleos pesados que no se pierden en la etapa de
evaporación.
Interferencias
Algu nas veces, cuand o se realiza u n m étod o gravim étrico, se requiere
inclu ir etapas d e lim pieza con silica gel, para remover material biogéni-
co y evitar así interferencias.
Este métod o no es ad ecuad o para m ed iciones d e hid rocarburos ligeros

qu e volatilizan a temp eratu ras por d ebajo d e 70-85o C.
5.4.1.1 Hidrocarburos totales del petróleo (HTPs)
El método gravimétrico es recomendado para la medición de HTPs pro-

venientes de muestras muy aceitosas, por ejemplo que contienen hidrocar-
buros pesados o para muestras acuosas cuand o el hexano es preferido
como solvente (US EPA 821-B94-004, 1995).
Material y equipo
Matraces d e bola d e 250 ml.
Rotoevap orad or.
Viales o tu bos d e vid rio d e 25 ml.
Balanza analítica.
Pinzas.
Procedimiento
1) Poner a p eso constante el recip iente d ond e se colocará el extracto
orgánico obtenid o (m atraz d e bola para la extracción, vial o tubo d e
vid rio) (ver sección 5.2 ). Colocar el recipiente en la estufa a 120ºC d u-
rante 4 horas. Sacar este m aterial y colocarlo en un d esecad or p ara qu e
se enfríe. Pesar el recip iente, d esp ués colocarlo otra vez d entro d e la
estu fa y volver a realizar el proced im iento hasta qu e el p eso no cam-
bie. Anotar el p eso d el recip iente (RA ).
2) Una vez qu e el extracto orgánico obtenid o (ver sección 5.2 ) esté en
un matraz d e bola, tubo o vial d e vid rio a peso constante, se p roced e
a la evap oración total d el solvente (d iclorometano) en u n rotoevapo-
rad or 740 ± 50 m bar y 45ºC hasta sequ ed ad .
3) Pesar nuevamente el m atraz, vial o tubo con el extracto libre d e sol-
vente. Anotar el peso (RB).
Cálculos
La d iferencia en peso correspond e al contenid o total d e H TPs. Para
hacer el cálcu lo d e concentración d e hid rocarburos totales d el p etróleo
provenientes d e la mu estra, se d ebe consid erar la cantid ad d e suelo qu e
se pesó p ara la extracción, así como la hum ed ad d e la mu estra. El resu l-
tad o d ebe exp resarse en m g d e H TP/ kg d e suelo seco, y se calcu la d e la
siguiente manera:
Dond e:
H TPs (m g kg -1 d e s.s.) = hid rocarbu ros totales d el p etróleo en m g/ kg
d e suelo seco.
RA = p eso (m g) d el recipiente vacío a p eso constante.
RB = peso (mg) d el recip iente con el extracto orgánico concentrad o.
P = cantid ad d e su elo extraíd o (g).
FH = factor d e corrección d e hum ed ad (1-(%hum ed ad / 100)).
FC = factor d e corrección para transformar a kg d e s.s. = 1 000.
5.4.1.2 Asfaltenos insolubles en hexano
Los asfaltenos son compuestos que forman parte d e la mezcla de hidro-

carburos contenidos en los suelos contaminad os. Estos compuestos son
una mezcla compleja d e hidrocarburos de alto peso molecular (de 1 000 a
2 000 000 Da), contienen compuestos aromáticos condensad os de más d e
30 átomos d e carbono, son hetero-aromáticos con presencia d e azufre,
como el benzotiofeno; y con nitrógeno, como el carbazol, contienen molé-
culas bi o polifuncionales d e nitrógeno, aminas y amid as; y grupos con
oxígeno (cetonas, fenoles y ácidos carboxílicos). También contienen meta-
les como níquel y forman complejos de vanadio con átomos de nitrógeno.
En la naturaleza los asfaltenos se forman como resultado de la oxidación
de resinas naturales (Cervantes, 2001).
Método
Los asfaltenos pued en ser cuantificad os en forma sencilla p or el m éto-
d o gravim étrico, p revia su p recip itación con solventes orgánicos
(ASTM D6560, 2000).
Fundamento
Este métod o se basa en la propied ad de los asfaltenos de ser insolubles
en algunos solventes (hexano, por ejemplo), mientras que las otras frac-
ciones de los hidrocarburos totales d el petróleo no lo son, facilitand o con
esto la separación d e estos compuestos. Los asfaltenos, por ser insolu-
bles, precipitan formand o un sólid o negro qu e puede pesarse al eliminar
el hexano con los hid rocarburos solu bles en él.
Viales o tu bos d e vid rio d e 25 ml.

Pinzas p ara matraces d e bola viales o tubos d e vid rio.
Balanza analítica.
Pipeta d e 10 ml.
Jeringa d e vid rio d e 20 m l.
Portamembrana d e acero inoxid able.
Filtros d e fibra d e vid rio GF/ C Whatman.
Sonicad or.
Rotoevap orad or.
Reactivos
Procedimiento
1) Poner a peso constante el recipiente donde se colocará el extracto orgá-
nico obtenido (matraz de bola para la extracción, vial o tubo de vidrio)
(ver sección 5.2). Colocar el recipiente en la estufa a 120ºC durante
4 horas. Sacar este material y colocarlo en un d esecador para que se
enfríe. Pesar el recipiente, después colocarlo otra vez dentro de la estufa
y volver a realizar el procedimiento hasta que el peso no cambie. Anotar
el peso del recipiente (RA ).
2) Una vez que el extracto orgánico obtenid o (ver sección 5.2) esté en un
matraz d e bola, tu bo o vial d e vid rio a peso constante, se p roced e a la
evap oración total d el solvente (d iclorometano) en un rotoevaporad or
hasta sequed ad , y p esar.
3) La mu estra extraíd a libre d e solvente se d ebe resu sp end er con hexa-
no: 60 ml para el métod o d e extracción por reflu jo (Soxhlet) o 5 ml para
el métod o d e extracción, agitación y centrifugación. Con este solvente
precipitarán los asfaltenos insolu bles en hexano (fracción p esad a d e
los hid rocarburos).
4) Dejar rep osar la m uestra en hexano d e 12 a 24 horas o bien colocarla
en un sonicad or d e 15 a 30 m inutos p ara acelerar la precipitación d e
asfaltenos (sólid o negro).
5) Cuando los asfaltenos (insolubles en hexano) se observen en el fond o
del vial o tubo, se procede a separar el precipitado mediante filtración;
tomando el extracto orgánico con una jeringa y pasándolo a través de un
total del extracto, el filtro d e fibra d e vidrio se deja secar y se pesa (FFVS)
para la cuantificación de asfaltenos (A F) retenidos en él.
6) Pesar el recipiente (matraz d e bola, vial o tu bo) d ond e estaba el extrac-
to con hexano y asfaltenos (RB).
Cálculos
La cantid ad d e asfaltenos se calcula m ed iante u n balance d e sólid os
obtenid os tanto en el recipiente (A R) como en el filtro d e fibra d e vid rio
(A F). Para hacer el cálcu lo d e concentración d e asfaltenos provenientes
d e la m u estra se d ebe consid erar la cantid ad d e su elo qu e se p esó p ara
la extracción, así com o la hu med ad d e la mu estra. El resu ltad o se ex-
presa en mg d e asfaltenos/ kg d e su elo seco y se calcu la d e la sigu ien-
te manera:
A F (mg) = FBVS – FFV

Dond e:
A F (mg) = asfaltenos contenid os en el filtro d e fibra d e vid rio (mg).
FBVS = p eso (m g) d el filtro d e fibra d e vid rio a peso constante.
FFV = peso (mg) d el filtro d e fibra d e vid rio seco por d ond e se pasa
el extracto orgánico con hexano y asfaltenos.
A R (m g) = RB – RA .
Dond e:
A R (m g) = asfaltenos contenid os en el recip iente (m g).
RA = p eso (m g) d el recipiente vacío a p eso constante.
RB = peso (mg) d el recip iente d ond e estaba el extracto orgánico
con hexano y asfaltenos.
Asfaltenos (mg kg -1 d e s.s.) = (A F + A R) * (FC) / (P * FH ).
Dond e:
Asfaltenos (mg kg -1 d e s.s.) = Asfaltenos totales contenid os en la m ues-
tra en mg/ kg d e suelo seco.
A F = asfaltenos retenid os en el filtro d e fibra d e vid rio (mg).
A R = asfaltenos contenid os en el recip iente (m g).
5.4.2 Cuantificación d e hid rocarbu ros totales d e p etróleo

p or espectroscopia d e infrarrojo (IR)
Introducción
El análisis cuantitativo d e los hid rocarburos totales d el petróleo (HTPs)
por espectroscopia de infrarrojo es un método relativamente rápido para
determinar la cantidad aproximada presente en el suelo. La principal
ventaja de la espectroscopia IR para medir (cuantitativamente) HTPs es
que es un métod o simple, rápido y barato. Este métod o presenta en cier-
tas ocasiones limitad a exactitud y precisión, especialmente para muestras
heterogéneas, ya que no da información referente a qué tipo de hid rocar-
buros hay en la muestra, ni a la presencia o ausencia de moléculas tóxi-
cas (Weisman, 1998).
Método
La cu antificación d e los hid rocarbu ros totales d el p etróleo se realiza
u tilizand o el m étod o 8440 d e la US EPA (1996) p or esp ectroscop ia d e
infrarrojo.
Fundamento
El métod o de infrarrojo mid e la vibración (estiramientos y d oblamientos)
que ocurre cuando una molécula absorbe energía (calor) en la región d e
infrarrojo d el espectro electromagnético. Grupos funcionales y tipos
de uniones tienen d iferentes frecuencias d e absorción e intensid ades en
el IR. Para el caso d e los H TPs, mid e la absorción prod ucid a por los cam-
bios de vibración-rotación d e los enlaces C-H d e los hid rocarburos en un
rango d e longitud d e ond a d e 3 200 a 2 700 cm -1. La cu antificación se
lleva a cabo comparand o la absorción de la mu estra contra una curva d e
calibración hecha con un petróleo d e referencia.
El límite d e d etección d e la técnica va d e 10 a 600 mg kg -1 d e H TPs, y en

caso d e tener extractos m ás concentrad os se recomienda hacer las dilu-
ciones necesarias para obtener mediciones de absorbancia entre 0.1 y 0.8.
Interferencias
Los enlaces C-H provenientes d e fuentes que no sean petróleo, como lípi-
recomiend a hacer un lavad o d e la m uestra para elim inar tod o el m ate-

rial biogénico.
Material y equipo
Matraces aforad os.
Pipetas d e vid rio.
Espectrofotómetro d e infrarrojo.
Celd as d e cu arzo p ara infrarrojo d e 5 m l.
Viales o tu bos d e vid rio.
1) Tetracloroetileno (C 2Cl4) grad o espectrofotométrico o equ ivalente.
2) Reactivos p ara la curva d e calibración:
N -hexad ecano C 3(CH 2)14CH 3.
Iso- octano (CH 3)3CCH 2CH (CH 3)2.
Clorobenceno C 6H 5Cl o petróleo cru d o extraíd o d e las mu estras por
cu antificar.
3) Solu ción d e referencia. La curva d e calibración d ebe realizarse con
una solución d e referencia com pu esta por n-hexad ecano, iso-octano y
clorobenceno d e la sigu iente manera: m ezclar 15 ml d e n-hexad ecano,
15 ml d e iso-octano y 10 ml d e clorobenceno, med id os con p recisión
con una pipeta d e vid rio.
4) Solu ción m ad re. Colocar 0.5 m l d e la solu ción d e referencia en u n
m atraz aforad o d e 50 m l a p eso con stante, y p esar esta cantid ad en
u na balanza analítica. Anotar este p eso p ara obtener la concentra-
ción total d e los estánd ares, aforar con tetracloroetileno hasta 50 m l.
Esta m ezcla es la solu ción m ad re qu e servirá p ara hacer las d ilu cio-
nes necesarias para la cu rva d e calibración. Esta solu ción d e hid rocar-
bu ros tend rá aproximad am ente una concentración d e 3 810 mg L-1
d e H TPs.
Procedimiento
1) El extracto orgánico obtenid o en la sección 5.2 se resusp end e en 5 m l
d e d iclorom etano. De esta solución se toma u n volum en d e mu estra
qu e d ep end erá d e la concentración d e hid rocarburos presentes en la
misma. Se recomiend a tom ar entre 0.1 a 1 ml y colocarlos en un vial y
conocid o d e tetracloroetileno (4.9 a 4 ml) hasta alcanzar un volum en

total d e 5 ml.
Si es necesario, d e esta solu ción hacer d ilu ciones mayores para que el
valor obtenid o d e absorbancia esté d entro d e la cu rva d e calibración
(lectu ras d entro d el rango d e absorbancia d e 0.1 a 0.8).
3) Colocar la mu estra en la celd a d e cu arzo, la cu al se introd uce al espec-
trofotóm etro d e infrarrojo. Antes d e llevar a cabo la m ed ición d e las
mu estras d ebe correrse u n testigo d el solvente por u tilizar (tetracloro-
etileno), para eliminar posibles interferencias.
Cuantificación
Hacer las mediciones en absorbancia. La cuantificación d e hidrocarburos
debe hacerse alred edor d e la longitud de ond a de 2 950 cm-1. La huella
característica de los HTPs en infrarrojo produce una huella digital de 3
picos en 2 956, 2 926 y 2 855 cm-1 (figura 5.2); sin embargo, para el cálcu-
lo de la concentración de HTPs únicamente se puede consid erar el pico a
2 956 cm-1.
Curva de calibración. H acer varias d ilu ciones con la solución m ad re para

constru ir la curva d e calibración com o se m uestra en la tabla 5.2.
Tab la 5.2 D ilu cion es p ara realizar curva p atrón d e H TPs (0-609.6 m g L-1)
No. Volumen de la solución Volumen de HTP (mg l -1)

solución madr e a tomar tetracloroetileno
(ml) (ml)
1 - 10 0
2 De (8) tomar 0.2 ml 9.8 10.16
3 De (8) tomar 1 ml 9.0 50.80
4 De (8) tomar 2 ml 8.0 101.60
5 De (7) tomar 5 ml 5.0 203.20
6 De (9) tomar 5 ml 5.0 304.80
7 De sol. stock tomar1.6 ml 13.4 406.40
8 De sol stock tomar 2 ml 13.0 508.00
9 De sol stock tomar 2.4 ml 12.6 609.6
Cálculos
Para cuantificar los hidrocarburos totales del petróleo (HTPs) se debe extra-
polar el valor de absorbancia obtenido para las muestras dentro de la curva
de calibración, el valor está en mg L-1 y puede convertirse a mg kg -1 de
suelo seco, considerando la cantidad de suelo extraído, así como la canti-
dad de disolvente que se utilizó para hacer una solución, y la cantidad de
muestra que se tomó de esta solución, de la siguiente manera:
H TPs (mg l -1) = (Abs – b) / m .
Dond e:
H TPs (mg L -1) = hid rocarbu ros totales d el petróleo en mg L-1.
Abs = absorbancia d e la mu estra a 2956 cm -1.
b = ord enad a al origen d e la curva d e calibración.
m = pend iente d e la cu rva d e calibración.
HTPs (mg/ kg s.s.) = HTPs (mg L-1)*VT / FC1 ] * [VD / VE ] * [FC2 / P ].
Dond e:
H TPs (mg kg -1 s.s.) = hid rocarbu ros totales d el petróleo en mg kg -1 d e
suelo seco.
H TPs (mg L-1) = hid rocarburos totales d el petróleo en mg L-1.
VD = volu men total d el d isolvente (d iclorom etano) d ond e se pu so el
concentrad o d e hid rocarburos.
VE = volum en tomad o d el VD y que se puso a evap oración.
VT = volu men d e tetracloroetileno d ond e se d isolvió la mu estra eva-
porad a.
FC 1 = factor d e corrección para obtener los m g d e H TP en VT = 1 000.
P = p eso en g d e suelo seco extraíd o = P H * FH .
FC 2 = factor de corrección para obtener los mg de HTP/ kg de suelo seco.
P H = cantid ad d e su elo húm ed o extraíd o.
FH = factor d e corrección d e hum ed ad = (1-(%hum ed ad / 100)).
Figu ra 5.2 Esp ectro d e in frarrojo típ ico d e u n a m u estra q u e con tien e h id rocarb u ros
totales d el p etróleo.
5.4.3 Cuantificacion d e hid rocarbu ros d el p etróleo

p or cromatografía d e gases
Introducción
La cromatografía de gases (CG) es una técnica que permite observar el
perfil de contaminación d e una muestra, y es capaz de d iferenciar aque-
llos compuestos que provienen de la materia orgánica d el suelo o bien
prod uctos metabólicos generados durante un tratamiento. Para los méto-
dos basad os en CG, los HTPs son d efinidos como cualquier compuesto
extraíble mediante un solvente o gas de purga, y detectado por cromato-
grafía d e gases/ detector d e ionización de flama (CG/ FID) con un rango
específico de carbonos. La principal ventaja d e este tipo de métod o es que
provee información acerca del tipo d e petróleo en la muestra, ad emás d e
su cuantificación, aunque la identificación del tipo de producto no es
siempre sencilla (Weisman, 1998).
Método
de la US EPA (1996) utilizand o cromatografía de gases con d etector d e

ionización flama (CG/ FID).
Fundamento
En la CG u n a m u estra es sep arad a d en tro d e su s com p onentes
ind ivid u ales cu and o viaja a través d e u na colu m na. Para lograr la
sep aración d e hid rocarbu ros no volátiles y no p olares p or CG, los
com p u estos p or analizar d eben estar en fase d e vap or (lo cu al se logra
al introd u cir la m u estra en el in yector, alcanzand o la tem p eratu ra d e
ebu llición d e estos com p u estos). La sep aración se lleva a cabo p or
u na com binación d e factores, inclu yend o p u nto d e ebu llición, p olari-
d ad y d iferencias d e afin id ad entre los d iferentes com p onentes d e la
m u estra y la colu m na, y m ed iante el u so d e u n gas acarread or inerte
(H e o N 2). El tiem p o qu e u n com p u esto p asa sobre u na colu m na esp e-
cífica es llam ad o tiem p o d e retención, y es rep rod u cible y caracterís-
tico d e u n com p u esto bajo p arám etros exp erim entales establecid os y
u na colu m na esp ecífica. A m ed id a qu e los com p on entes sep arad os
flu yen a través d e la colu m na p u ed en ser d etectad os. La señal d el
d etector es p rop orcional a la cantid ad d el com p u esto p resente. En la
CG/ FID, los com p u estos son d etectad os con u n d etector d e ioniza-
ción d e flam a, el cu al resp ond e virtu alm ente a tod os los com p u estos
qu e p u ed en qu em arse. La su m a d e tod as las resp u estas con u n rango
esp ecífico es igu al a la concentración d e hid rocarbu ros p or referen cia
d e estánd ares d e concentración conocid a.
Este métod o establece las cond iciones p ara analizar mezclas d e hid ro-
carburos d e C10 a C24 y los 16 H PAs, señalad os p or la EPA en concen-
traciones d e 10 hasta 200 mg L-1 para cad a uno d e los compu estos.
Nota: Las m uestras que no están libres d e asfaltenos p rovocan que la colu m na
capilar se satu re d e estos com pu estos que son d ifíciles d e d esorber, d ebid o a su
alto peso m olecu lar y a su alto pu nto d e ebu llición, acortand o la vid a útil d e la
colu m na.
Las muestras d eben estar libres de disolventes polares, que podrían acor-
tar la vid a útil de la columna y eluir la fase de la columna. Asimismo, el
Este método no puede detectar cuantitativamente compuestos debajo de

C6, porque son altamente volátiles y puede ocurrir interferencia con el pico
del solvente. De la gasolina fresca, 25% puede estar por debajo de C6.
Este métod o también puede tener problemas de cuantificación de hidro-

carburos polares que contengan moléculas de nitrógeno, oxígeno y sulfu-
ro. Algunos hid rocarburos polares son reactivos al pasar a través d e un
cromatógrafo de gases, ad emás no alcanzan el detector para su medición.
Las gasolinas oxigenad as son algu nas veces analizad as por CG. La efi-
ciencia d e los métod os d e pu rga es m ás bajo p ara los oxigenad os tales
como éteres y alcoholes.
Material y equipo
Cromatógrafo d e gases con d etector d e ionización d e flama CG/ FID.
Colu mna cap ilar DB-1.
Viales d e 40 ml con tap a d e teflón.
Pipetas Pasteu r.
Viales especiales para el cromatógrafo con tap a d e teflón.
Jeringa d e 10 µL.
Pipeta d e vid rio 5 ml.
Engargolad ora d e viales.
Reactivos
Procedimiento
A. Preparación de la muestra.
1) Para la d eterminación d e hid rocarburos en u n su elo contam inad o, se
obtiene el extracto orgánico m ed iante los métod os d e extracción seña-
lad os en la sección 5.2. El extracto obtenid o se lleva hasta sequed ad en
un rotoevap orad or.
2) La mu estra extraíd a libre d e solvente se resu spend e en hexano: 60 m l
para el métod o d e extracción p or reflu jo (Soxhlet) (5.2.1) o 5 m l para el
métod o d e extracción, agitación-centrifugación (5.2.2).
3) Dejar rep osar d e 12 a 24 horas p ara que precip iten los asfaltenos. O
B. Cuantificación.
1) Colocar la mu estra en u n vial p ara cromatografía y sellar. El volum en
d ep end erá d e la cantid ad d e m uestra y tipo d e viales em plead os.
2) Una vez que la mu estra está envasad a, se proced e a hacer su inyec-
ción (1 µl) en el CG/ FID p ara su cu antificación.
3) Para d eterm inar la concentración d e H TPs en las mu estras, el croma-
togram a se integra consid erand o el área bajo la cu rva d e los picos
resueltos, y extrapoland o d icho valor en u na cu rva d e calibración.
Curva de calibración. La curva d e calibración es específica d el tipo d e

hid rocarburo por analizar y se prefiere tomar una muestra proveniente
del suelo contaminado. A partir del extracto orgánico obtenid o se pu ed e
conocer su peso y preparar una serie d e d iluciones e inyectarlas al cro-
matógrafo d e gases, con el fin d e obtener una curva d e concentración
conocid a contra área d e picos resu eltos. Lo anterior permitirá extrapolar
el área d e la muestra problema en la curva de calibración y conocer la
concentración d e la misma.
Cálculos
Para obtener la concentración d e hid rocarburos en la m uestra, se consi-
d era la cu rva d e calibración qu e tiene u na corresp ond encia lineal entre
el área bajo la curva y la concentración d el extracto d e acuerd o con la
ecuación obtenid a:
C (m g L-1)= (A – b) / m .
Dond e:
C = concentración d e H TPs (mg L -1).
A = área bajo la cu rva.
m = pend iente d e la ecuación obtenid a.
b = ord enad a al origen d e la ecuación obtenid a.
Con la ecu ación anterior y conociend o el área d e los p icos resueltos para
cad a m uestra, se pu ed e obtener la concentración d e hid rocarburos pre-
sentes en ella, en m g L-1. Para tener el valor en mg kg -1 d e suelo hay qu e
consid erar la cantid ad d e su elo qu e se u tiliza p ara la extracción, y el
H TPs (m g / kg s.s.) = (C )* (V/ FC 1) * FC 2 / (P * FH ).
H TPs (mg / kg s.s.) = H id rocarburos totales d el p etróleo en m g kg -1

d e su elo seco
C = hid rocarbu ros totales d el petróleo en mg L-1.
V = volumen de hexano donde está resuspendida la muestra (5 ml o 60 ml).
FH = factor d e corrección d e hum ed ad d el suelo (1-(%hum ed ad / 100)).
FC1 = factor d e corrección p ara obtener los H TPs contenid os en el hexa-
no = 1 000.
FC2 = factor de corrección para convertir los H TPs contenidos en la mues-
tra en m g kg -1 s.s.= 1 000
5.5. Iden tificacion d e h id rocarb u ros p or crom atografía

d e gases-espectrom etría de m asas (CG / EM )
Introducción
Cu and o se requ iere u n análisis a d etalle d el tip o d e com p u estos p re-
sentes en u na mu estra d e su elo contaminad o, se recom iend a u tilizar
crom atografía d e gases acoplad a a esp ectrometría d e m asas p ara id en-
tificar d ichos comp u estos. La cromatografía d e gases acop lad a a la
esp ectrom etría d e m asas (CG/ EM) es u na técnica analítica instru m en-
tal d e alta sensibilid ad capaz d e id entificar cu alitativa y cu antitativa-
mente cu alqu ier tip o d e m ezclas d e su stancias, m ed iante el análisis d e
su p atrón d e fragmentación. Asim ism o, esta técnica p erm ite tam bién
d eterminar la m asa m olecu lar d e u n com pu esto. El sistem a d e CG/ EM
es u sad o p ara m ed ir concentraciones d e constitu yentes volátiles y
sem ivolátiles d el petróleo, pero no es típicam ente u sad o p ara m ed ir
H TPs. La ventaja d e la CG/ EM es su alta selectivid ad o habilid ad para
confirm ar la id entificación d e compuestos a través d el tiem po d e reten-
ción y la vía espectral única. Debido a la comp lejid ad d e su operación y
a la interpretación d e sus resultad os, las técnicas d e CG/ EM tienden a
ser más costosas que otras técnicas d e crom atografía d e gases, por ejem-
plo CG/ FID. (Weism an, 1998).
les los lím ites d e d etección están p or d ebajo d e 5 µg L-1 p ara agu a y
50 µg kg -1 p ara su elo.
Método
El m étod o (US EPA 8270DC, 1996) es u tilizad o p ara d eterm inar la con-
centración d e com p u estos orgánicos sem ivolátiles en extractos p rep a-
rad os d e m u chos tip os d e m atrices sólid as resid u ales, su elos, m ed ios
m u estread os d e aire y m u estras d e agu a. Esta m etod ología contiene
los criterios p ara verificar el m étod o global d el d esarrollo d el sistem a
d e CG/ EM.
Las muestras son preparadas para su análisis por CG/ EM y si es necesario

se realiza hasta una limpieza de la muestra. El extracto de la muestra es
introducido en el cromatógrafo de gases/ espectrómetro de masas por
inyección del extracto de la muestra dentro del CG. La columna del CG es
programada a cierta temperatura para separar los analitos, los cuales son
entonces detectados con una interfase del EM al CG. Los analitos eluidos
en la columna capilar son introducidos en el EM. La identificación de los
analitos es alcanzada por comparación de su espectro de masas con el
espectro de electrones de estándares o base de datos disponibles.
Fundamento
Los sistemas de espectrometría de masas están diseñados para compuestos
ionizados y exploración de iones de masa específica. Cada compuesto se
fragmenta en iones reconocibles. La cromatografía de gases (CG) acoplada
con la espectrometría de masas (EM) permite separar una mezcla dentro de
sus constituyentes, ioniza cada constituyente e identifica los compuestos
constituyentes por la vía de su fragmentación. El método de CGEM identi-
fica compuestos por el tiempo de retención y su espectro de masas.
Interferencias
Los espectrómetros d e masas están entre los d etectores más selectivos,
pero son aú n su sceptibles a interferencias:
Los isóm eros tienen espectros id énticos, m ientras m uchos otros com-
pu estos tienen espectros d e masas sim ilares. Prod uctos pesad os d el
tos m últip les están sim ultáneam ente d entro d el espectro d e masas.
Diferentes comp uestos pu ed en com partir m uchos d e los mism os
iones, confund iend o el proceso d e id entificación.
La probabilid ad d e una incorrecta id entificación es alta en m ezclas
com plejas, como prod u ctos d el petróleo.
Algu n as veces la id entificación d e com p u estos está acom p añad a
p or u n p rogram a d e biblioteca d e investigación . Debid o a qu e la
biblioteca com p u tarizad a n o p u ed e con tener tod os los p osibles isó-
m eros d el p etróleo y frecu entem ente contiene p esticid as, p lásticos y
otros com p u estos no encontrad os en el p etróleo, ellos frecu entem en-
te realizan u na id entificación incorrecta d e los com p u estos. La id en-
tificación d e biblioteca com p u tarizad a d ebe ser u sad a con extrem a
p recau ción.
La CG/ EM no es u na técnica cap az d e cuantificar H TPs. La respu esta
d e u n FID es p roporcional a la m asa d e los hid rocarbu ros presentes
y es insensible a los tipos d e hid rocarbu ros. (e.g. aromáticos, n-alca-
nos y olefinas). Un espectro d e m asas, sin em bargo, puede tener muy
d iferentes respuestas para d os d iferentes compuestos hid rocarburos.
Puesto qu e los produ ctos d el petróleo son mezclas com plejas de hid ro-
carburos, la misma m asa d e d os diferentes prod uctos pu ed e tener d os
d iferentes respuestas en un espectro d e masas.
Material y equipo
Viales especiales para el cromatógrafo.
Pipetas.
Cromatógrafo d e gases - Espectrómetro d e masas.
Reactivos
H exano grad o H PLC.
Procedimiento
1) Una vez qu e la mu estra es extraíd a con alguno d e los métod os d e la
sección 5.2, y teniend o la m uestra evaporad a a sequ ed ad , se ad iciona
un volu men conocid o d e hexano. Se d eja reposar d e 12 a 24 horas para
permitir que los asfaltenos presentes precip iten.
2) Se toma u na cantid ad conocid a d e la mu estra y se colocan en un vial
3) Una vez qu e la mu estra esté envasad a se proced e a hacer su med ición

en crom atografía d e gases-espectrom etría d e m asas.
4) Para d eterm inar la concentración d e los componentes d e hid rocarbu-
ros en las mu estras el crom atograma se integra, consid erand o el área
bajo la curva d e los p icos resueltos, y extrap oland o d icho valor en una
curva d e calibración. Ad emás, se pued e hacer uso d e la biblioteca qu e
está inclu id a en el softw are d el equipo p ara id entificar los com pu estos
presentes en la m uestra.
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Division.
6. An álisis m icrob iológicos
l suelo es un ecosistema que contiene una gran varied ad de poblacio-

E nes microbianas cuyos miembros representan muchos tip os fisioló-
gicos. Las características qu ímicas, físicas y biológicas de un suelo p ar-
ticu lar, así como la presencia d e crecimiento d e p lantas influirán en el
número y actividad es de sus diversos componentes microbianos. Ad e-
más, a causa de la naturaleza heterogénea d el suelo varios tipos fisioló-
gicos d e organismos serán encontrad os en las p roximid ades cercanas d e
uno a otro. La comu nidad microbiana en su elos es im portante por su
relación con la fertilidad d el suelo y con los ciclos biogeoquímicos d e los
elem entos, ad emás d el uso potencial d e los miembros específicos para
aplicaciones ambientales e ind ustriales. Por lo qu e existe la necesid ad d e
conocer, enu merar y aislar los miembros p rincipales y menores de la
comu nidad microbiana en suelos.
La cuenta viable d e m icroorganism os d el su elo p ued e realizarse por la

técnica d e cuenta en placa o la técnica d el número más probable (N MP).
Los princip ios fund am entales d e estas técnicas son (1) d ispersión d e
una m uestra en un d iluyente ap ropiad o (solución fisiológica), (2) distri-
bución d e una alícuota a u n med io apropiad o de crecimiento, (3) incuba-
ción bajo cond iciones óptim as, y (4) conteo d e las colonias d esarrollad as
o lectura de tu bos N MP (Germida, 1993).
La composición del med io de crecimiento usad o para contar poblaciones

microbianas es importante, ya que afectará el resultado final. El med io d e
crecimiento puede ser selectivo o no selectivo. Los medios selectivos con-
tienen componentes que permiten o favorecen el crecimiento de un gru-
po determinado de organismos. Los med ios no selectivos pued en ser
suficientes para el crecimiento de muchos grupos d e organismos como
sea posible. Para contar un tipo fisiológico específico d e microorganismos
generalmente es necesario diseñar un med io d e cultivo, el cual, cuand o es
Aunque la cuenta en placa y la técnica d el nú mero más probable (N MP)

son m étod os simples de d esarrollar, su utilid ad está limitada p or un nú-
mero d e factores clave, como la elección del med io, problemas con la d is-
persión, y aún adsorción d e microorganism os a la pared d e la pipeta, ya
que pued en interferir con la estand arización de estos procedimientos. La
consistencia y ad ecu ad o uso d e muestras rép lica ayud an a minimizar
algunos d e estos problemas.
Esta sección provee princip ios básicos y referencias sobre los proced i-
mientos d e conteo y med ios d e cultivo para algunos tip os representati-
vos d e microorganismos d el su elo.
6.1. M icroorgan ism os aerob ios
6.1.1. Cu enta d e m icroorganism os viables por d ilu ción en placa
Introducción
Existen d iferentes técnicas p ara d eterminar el nú mero d e m icroorga-
nismos en su elos o agu as, tanto d irectas com o ind irectas, Para la d eter-
minación d e m icroorganism os heterótrofos totales e hid rocarbonoclas-
tas aerobios, se seleccionó la cu enta microbiana por d ilución en placa. Es
una técnica ind irecta d e cuantificación; sin em bargo, provee una m ed i-
ción d e la viabilid ad microbiana, perm ite d eterminar ind irectamente el
potencial d e biod egrad ación en u n suelo contam inad o, es la m ás ad e-
cu ad a para med ios con hid rocarburos como substrato, es rápid a d e
efectu ar y no requ iere d e mu cho m aterial (Lorch et al., 1995; Bossert y
Kosson, 1997).
Método
El conteo d e p oblaciones microbianas por d ilu ción en placa es u n
métod o simp le y rápid o p ara la cuenta viable d e célu las microbianas
en el su elo. Sin embargo, la cuenta obtenid a es generalmente 10 a 100
veces m enos qu e aqu ella d eterminad a p or cuenta d irecta p or m icrosco-
pia. Las razones para esta d iscrepancia inclu yen la exclu sión d e la
cu enta no viable d irectamente en el suelo y la inhabilid ad para p roveer
Aná lisis microbiológicos 119
Fundamento
El m étod o d e d ilu ción en p laca se fu nd am enta en qu e cu alqu ier célu -
la viable inocu lad a en u n m ed io d e cu ltivo se m u ltip lica y p rod u ce
d atos d e fácil id entificación, com o la form ación d e colonias en p lacas
d e agar. Este m étod o consiste en la p rep aración d e u na serie d e d ilu -
ciones d e u na m u estra d e su elo en u n d ilu yente ap rop iad o, esp arcien-
d o u na alícu ota d e u na d ilu ción sobre la su p erficie d e u n m ed io d e
cu ltivo sólid o e incu band o la p laca d e agar bajo cond iciones am bien-
tales aprop iad as. La d ilu ción d ebe permitir generar colonias separad as,
cad a colonia pued e p roced er d e u na sola célu la o d e una agru pación
(u nid ad viable), la cu al se contará com o u na bacteria. Bajo este fu n d a-
m en to, estas p lacas p u ed en ser u sad as no sólo p ara el conteo d e
p oblaciones m icrobianas, sino tam bién p ara el aislam iento d e organis-
m os. Un m ed io selectivo o no selectivo p u ed e ser u sad o d ep end iend o
d e la natu raleza d el m icroorganism o qu e se d esea contar o aislar
(Ram írez et al., 1992).
Interferencias
Los errores más frecu entes en este métod o son:
a) Qu e d urante la realización d e las d iluciones no se logre separar per-
fectamente los agregad os bacterianos y m ás d e u na bacteria form e
una colonia.
b) Cu an d o el d ilu yen te se esteriliza en tu bos tap ad os con toru n d as
d e algod ón el volu m en inicial generalm ente se altera, p or lo qu e se
recom iend a el u so d e tu bos con tap ón d e rosca o la esterilización
sep arad a d el d ilu yente y tu bos, a fin d e p ip etear en cad a tu bo el
volu m en exacto d el d ilu yen te al qu e se agrega el volu m en exacto
d e la m u estra.
c) Debe evitarse el choqu e osmótico cu and o se hacen las d ilu ciones; se
recomiend a el em pleo d e agu a peptonad a, solu ción salina isotónica;
el m ed io d e cultivo u tilizad o para su crecimiento o d iferentes solucio-
nes am ortiguad oras.
d ) La tem peratura d e la varilla para extend er el inóculo en la placa.
Cu and o la varilla qu ed a m uy caliente d esp ués d e ser esterilizad a con
alcohol y flamead a, p ued e quemar el inóculo.
e) Du rante el recuento se p ued en prod ucir d ificu ltad es ocasionad as por
Material y equipo
Tu bos d e vid rio d e 15 ml para cu ltivo con 9 m l d e solu ción salina
0.85% estéril.
Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 m l d e solución salina 0.85% estéril.
Pipetas d e 1 ml y d e 0.2 m l, estériles.
Vórtex.
Balanza.
Espátulas.
Camp ana d e flu jo laminar o área estéril.
Cajas d e Petri con med io d e cultivo-agar.
Varilla d e vid rio.
Muestra d e su elo o agu a.
Incubad ora.
Papel alum inio estéril.
1) Solu ción salina 0.85% estéril. Ad icionar 8.5 g d e cloru ro d e sod io
(N aCl) en 1 L d e agu a d estilad a.
2) Cajas d e Petri con med io d e cultivo ad ecuad o para el crecimiento.
3) Etanol (CH 3-CH 2-OH ).
Procedimiento
1) En cond iciones estériles (trabajar en cam p ana d e flu jo lam inar), ad i-
cionar 1 g d el su elo a u na botella d e d ilu ción o m atraz con tap a d e
rosca con 99 m l d e solu ción salin a isotón ica estéril (d ilu ción 10-2 ).
Disp er sar el su elo y h om ogen eizar con agitación vigorosa en
vór tex.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml d e solución salina esté-
ril (d ilu ción 10-3). De ahí se hacen d iluciones sucesivas hasta com ple-
tar d iluciones d ecimales hasta 10-10 o las ad ecu ad as, aseguránd ose d e
utilizar una pu nta o p ip eta estéril d iferente en cad a paso. Agitar
d e forma constante con vórtex en cad a p aso.
3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la
superficie d el medio de cultivo seleccionado para el crecimiento.
Realizar esto por triplicado y con tres diluciones próximas (ej. 10-3, 10-4
y 10-5) para asegurar la cuenta.
la flam a d el m echero permitiend o su enfriam iento). Asegu rar una d is-

tribución homogénea por tod a la su perficie d el med io.
5) Incubar las p lacas d e forma invertid a a 30ºC en au sencia d e lu z.
6) Despu és d e u n period o d e incu bación (d e 3 a 7 d ías, d epend iend o d el
tip o d e microorganismo), contar el núm ero d e colonias y reportar co-
mo unid ad es formad oras d e colonias (UFC)/ g d e su elo seco.
Cálculos
1) Contar sólo aqu ellas cajas (d iluciones) qu e contengan d e 30 a 300
colonias.
2) Con la siguiente ecuación calcu lar las UFC/ g s.s.
UFC/ g s.s. = (N C * 1/ FD * 1/ V) / (P * FH ).
Dond e:
UFC/ g s. s. = u nid ad es form ad oras d e colonias / g d e su elo seco.
N C = número d e colonias en u na caja.
FD = factor d e d ilución que correspond e a la d ilución d e d ond e se tom ó
la mu estra con la qu e se inocu la la caja (10-2 a 10-10).
V= volu men inoculad o en la caja = 0.1 ml.
P = peso d e la mu estra hú med a = 1 g.
FH = factor d e corrección d e hu med ad (1-(%hu med ad / 100)).
6.1.2 Bacterias totales p or d ilu ción en p laca
Introducción
La cu enta d e bacterias totales d e u n sistem a se refiere a las bacterias
heterótrofas p resentes en el su elo, es d ecir, aqu ellas qu e obtienen su
fu ente d e carbono a p artir d e com p u estos orgánicos. En este gru p o d e
bacterias se p u ed e encontrar la gran m ayoría d e la p oblación m icro-
biana d el am biente. Los m ed ios u sad os p ara la cu enta d e u n am p lio
nú m ero d e bacterias en el su elo, sed im ento, agu a, agu as resid u ales
o com p osta p u ed en ser com p lejos en su form u lación (inclu yend o p ep -
tona o extractos d e carne o d e levad u ra), p ero relativam ente escasos
en su com p osición. Uno d e los m ed ios d e cu ltivo recom end ad o p ara
su d esarrollo es el agar nu tritivo o cald o nu tritivo, ya qu e es u n m ed io
fas y en corto tiem p o (en m enos d e 3 d ías a 30°C) (Lorch et al., 1995;
Mad igan et al, 1998).
Método
Para el conteo de bacterias heterótrofas del suelo se utiliza la técnica de
cuenta por dilución en placa (sección 6.1.1) con agar nutritivo como medio
de crecimiento.
Fundamento
Este métod o se basa en el fund amento d e la dilución en placa (6.1.1) y en
este caso el crecimiento se debe a la capacid ad de los microorganismos
heterótrofos de crecer bien en agar nu tritivo, d ebido a qu e contiene:
Extracto d e carne. Extracto acuoso d e carne m agra d e res concentrad o
en pasta, que contiene las sustancias solu bles en agu a d e tejid os ani-
males, entre ellas carbohid ratos, comp uestos orgánicos nitrogenad os,
vitam inas solu bles en agu a y sales.
Peptona. Producto que resulta de la d igestión d e materiales proteínicos,
por ejemplo carne, caseína y gelatina. Es la fuente principal d e nitróge-
no orgánico; puede contener también algunas vitaminas y algunas veces
carbohidratos (Pelczar et al., 1982).
Interferencias
Aunque muchos de los heterótrofos se desarrollan bien en agar nutritivo o
medio rico, algunos tienen requerimientos nutricionales específicos (hete-
rótrofos exigentes), por ejemplo, vitaminas y sustancias promotoras del
crecimiento, cosubstratos, etcétera, y no existen medios que puedan pro-
porcionar todos los nutrimentos necesarios y, por ende, permitir el creci-
miento de todos los microorganismos heterótrofos.
Material y equipo
Cajas d e Petri.
Matraces o botellas d e cu ltivo 1 L.
Espátula.
Balanza analítica.
Material y equipo d e la sección 6.1.1.
Agitad or magnético.
Reactivos y medios de cultivo

1) Agua d estilad a.
2) Agar nu tritivo. Disolver 15 g d e agar nu tritivo o lo que ind iqu e el
envase d el med io d e cu ltivo en 1 L d e agua d estilad a.
3) Reactivos y soluciones d e la sección 6.1.1.
Procedimiento
1) Prep arar m ed io d e cu ltivo con agar nu tritivo en u n m atraz
Erlenmeyer o botella d e cultivo.
2) Calentar hasta d isolu ción total.
3) Esterilizar el med io d e cu ltivo a 15 lb, 121°C d u rante 15 minu tos.
4) Una vez esterilizad o el med io d e cu ltivo d ejarlo enfriar a 50°C ap ro-
xim ad amente.
5) Vaciar el med io en cajas Petri en cond iciones estériles en una cam pa-
na d e flujo lam inar.
6) Dejar enfriar y gelificar el med io.
7) Preparar la mu estra d e suelo y d iluciones, e inocular cad a caja com o
se ind ica en la sección 6.1.1.
8) Despu és d e tres d ías d e incubación p roced er al conteo d e colonias.
9) Para el cálculo final de unidad es formadoras de colonias (UFC) se debe
considerar la dilución con que se inoculó la caja, la cantidad de inóculo
(0.1 ml) y la humedad de la muestra (Cálculos en 6.1.1).
6.1.3 H ongos totales p or d ilución en p laca
Introducción
Los hongos tienen hábitats mu y d iversos; sin em bargo, la mayoría son
terrestres y habitan en el su elo, d esemp eñand o una activid ad im portan-
te en la m ineralización d el carbono orgánico. Cu and o se com para a los
hongos con las bacterias, en general, estos tienen requ erimientos nutri-
cionales m uy sim ples, pero su d esarrollo es m ás lento, p or lo qu e
requ ieren mayor tiem po d e incu bación para su cu ltivo. En el aislam ien-
to, cultivo y cu enta d e la m ayoría d e los hongos se aprovechan ciertas
características esp eciales d e ellos, com o su tolerancia a pH ácid o y su
preferencia por m ed ios d e cultivo con gran cantid ad d e azú car fácil-
mente d egrad able. Ad em ás, su resistencia a la penicilina y estreptomi-
En la preparación d e los med ios d e cu ltivo para hongos con frecu encia
se p refiere usar mezclas d e vegetales (agar-p apa, agar-harina d e maíz,
etcétera) y otras su stancias natu rales (Ramírez et al., 1992).
Método
El métod o p ara el conteo d e hongos d el suelo es p or la técnica d e cuen-
ta p or d ilución en p laca (sección 6.1.1). El med io recomend ad o para la
d etección y enum eración d e hongos y levad uras es el d e papa-d extrosa-
agar (PDA) ad icionad o con rosa d e Bengala para permitir el conteo d e
hongos, así como la ad ición d e u n antibiótico (estrep tom icina) p ara evi-
tar el crecim iento d e bacterias.
Fundamento
Este método se basa en el fundamento de la dilución en placa (6.1.1); sin
embargo, en este caso una célula no da origen a una colonia, sino a una
espora o una parte del hongo, basánd ose en la habilidad de estos microor-
ganismos para crecer en medios vegetales (papa), así como en las propie-
dades tanto del rosa de Bengala, de limitar el crecimiento de los hongos
permitiendo su conteo, como de la estreptomicina, de evitar el crecimien-
to indeseable de bacterias.
Interferencias
Las p rincipales interferencias en este tipo d e cultivos están d ad as por el
pH d el med io d e cu ltivo, p refiriénd ose p H ácid os p ara el crecimiento
d e hongos, ya que p H neu tros o alcalinos favorecen el crecimiento d e
bacterias; ad emás, si no se evita el crecim iento bacteriano con el p H , el
no incluir un antibiótico tam bién favorece la contam inación bacteriana.
Material y equipo
Cajas d e Petri.
Espátula.
Varilla p ara expand ir mu estra.
Balanza analítica.

2) Med io d e cultivo Agar papa-d extrosa (PDA). Disolver 39 g d e PDA
en 1 L d e agu a d estilad a.
3) Rosa d e Bengala.
4) Estrep tom icina.
Procedimiento
1) Preparar med io d e cultivo para hongos totales utilizando PDA
(39 g L-1 o lo indicad o en el frasco) y rosa d e Bengala (50 mg L-1). Llevar
a ebullición hasta disolución completa.
2) Esterilizar el med io en autoclave a 121°C (15lb) / 15 minutos.
3) Una vez qu e el med io esté aproxim ad am ente a 50°C, en cond iciones
estériles (en campana d e flu jo laminar) ajustar su p H a 4.9 con ácid o
láctico estéril al 10% y ad icionar estrep tom icina (48 mg L-1).
Nota: Para su prim ir el crecim iento bacteriano algu nas veces es d eseable acid ifi-
car el m edio a p H 3.5. Esto se pu ed e consegu ir ad icionand o 1 m l d e ácid o lácti-
co al 10% p or cad a 100 m l d el m ed io estéril y a 50°C. El m ed io no d ebe de ser
calentado d esp ués d e la ad ición d el ácid o, ya qu e esto pod ría hid rolizar el agar
alterand o su propied ad gelificante. Si no se requiere m ed io selectivo se sugiere
el em p leo d e PDA sin la ad ición d e ácid o o u tilizar algú n antibiótico com o
estrep tom icina (Oxoid , 1995).
4) Mezclar bien antes d e vaciar el med io en cajas d e Petri, una vez vacia-
d o en cajas esp erar a que gelifiqu e.
5) Prep arar la mu estra d e su elo y d iluciones e inocular cad a caja com o
se ind ica en la sección 6.1.1.
6) Incubar las cajas invertid as a 30°C.
7) Despu és d e cinco d ías d e incu bación proced er al conteo d e colonias.
(0.1 ml) y la humedad d e la muestra, reportand o finalmente UFC/ g
suelo seco.
Cálculos
6.1.4. Bacterias hid rocarbonoclastas por d ilución en p laca
Introducción
Las bacterias hid rocarbonoclastas son aqu ellas cap aces d e crecer en
presencia d e hid rocarbu ros como ú nica fu ente d e carbono y energía.
En su elos contam inad os, la biod egrad ación es u n p roceso d ond e la
activid ad metabólica d e organismos vivos, principalmente microorga-
nismos, d egrad a a los contaminantes orgánicos en comp uestos más
sim ples y/ o m enos tóxicos, y en el m ejor d e los casos los m ineraliza
(transforma en CO 2 y H 2O). La cu enta microbiana provee evid encia d e
la presencia d e gru pos d eterm inad os d e m icroorganismos cu and o se
u tiliza u n m ed io d e cu ltivo específico, y es u sad o com o ind icad or d el
potencial d e biod egrad ación d e u n su elo en p articu lar (Bossert y
Bartha, 1984).
La presencia d e petróleo en el suelo enriquece selectivamente la com u-

nid ad microbiana cap az d e ad ap tarse y utilizar el nuevo su strato, y crea
una situación selectiva. Sin embargo, los comp onentes tóxicos d el
petróleo pu ed en inhibir a algu nos miem bros d e la com unid ad micro-
biana, prod u ciend o tanto una d ism inu ción en el tamaño d e la pobla-
ción, com o en la d iversid ad d e esp ecies. Es d ifícil generalizar acerca d e
la resp uesta microbiana d e los suelos sujetos a contaminación por
petróleo; sin embargo, las bacterias y hongos son los princip ales respon-
sables d e la biod egrad ación d e hid rocarbu ros en su elo, au nque la rela-
tiva contribu ción d e cad a u no d e estos gru pos no es clara. Es por esto
qu e d esd e el pu nto d e vista d e la biorremed iación d e su elos (procesos
biológicos d e elim inación d e contaminantes) es im portante d eterminar
las bacterias y hongos capaces d e u tilizar al petróleo com o substrato, es
d ecir, d eterminar a las bacterias y hongos hid rocarbonoclastas (Bossert
y Kosson, 1996).
Método
El m étod o p ara el aislam iento y cu enta d e las bacterias hid rocarbono-
clastas d el su elo es p or la técnica d e cu enta p or d ilu ción en p laca (ver
sección 6.1.1), u tilizand o u n m ed io m ineral basal (tabla 6.1) (Mejía y
Molina, 2000) qu e contenga p etróleo cru d o o u n hid rocarbu ro esp ecí-
Tab la 6.1 M ed io m in eral b asal.
Componente Cantidad
Agua destilada 1L
Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 0.4 g
Fosfato de potasio dibásico K2HPO4 1.6 g
Cloruro de amonio NH4Cl 1.5 g
Cloruro de magnesio MgCl 2.6H2O 0.17 g
sextahidratado
Sulfato de sodio heptahidra tado NaSO4 7H2O 1.5 g
Cloruro de calcio dihidratado CaCl 2 2H2O 0.045 g
Solución mineral* 1.0 ml
*La solu ción m ineral se agrega d esp u és d e esterilizar.
Fundamento
El fundamento es el d e d ilución en placa (6.1.1), basado en la capacidad
de los microorganismos hidrocarbonoclastas de poder utilizar a los hidro-
carburos como fuente de carbono y energía, cuando crecen en un medio
con estas características de selección. El petróleo ligero que se impregna en
un papel filtro permite que las bacterias hidrocarbonoclastas se alimenten
de los hidrocarburos volátiles, o la ad ición de un hidrocarburo en solu-
ción asperjand o la superficie de la caja ya inoculada.
Interferencias
El agar noble para preparar el medio d e cultivo sólid o d ebe ser un agar
puro, libre d e cualquier contaminante; de lo contrario puede haber creci-
miento de bacterias por las impurezas que pueda contener, permitiendo
el crecimiento de bacterias no hidrocarbonoclastas. Se recomienda inocu-
lar cajas d e med io mineral sin hidrocarburo para tener un control negati-
vo y asegurar la pureza del agar.
El p etróleo cru d o o hid rocarburo utilizad o para este métod o d ebe ser
ligero (volátil), ya qu e el acceso d e esta fu ente d e carbono y energía es
Material y equipo
Cajas d e Petri.
Espátula.
Balanza analítica.
Papel filtro estéril.
Au toclave.
Camp ana d e flu jo laminar.
Reactivos y medios
2) Agar noble (libre d e imp urezas).
3) Med io mineral basal (tabla 6.1).
4) Reactivos y soluciones d e la sección 6.1.1.
5) Solución m ineral (tabla 6.2). Disolver en u n litro d e agu a d estilad a
cad a u no d e los comp onentes d e la tabla 6.2 y esterilizar p or filtración.
6) Petróleo crud o ligero estéril. Esterilizar el petróleo crudo tres veces a
110o C d urante una hora, dejand o entre cada esterilización un d ía a tem-
peratura am biente.
7) Solución d e hid rocarbu ros pu ros: hacer una solución d el hid rocarbu-
ro d e interés (fenantreno, d ibenzotiofeno, eicosano, antraceno, etcéte-
ra) en hexano, en u na concentración d e 1 g L-1.
Procedimiento
1) Preparar el med io d e cultivo con los com ponentes d e la tabla 6.1,
d isolviénd olas en el ord en señalad o en un litro d e agu a d estilad a.
2) Aju star el pH a 7.0, d espu és ad icionar 15 g d e agar pu ro (agar noble).
3) Esterilizar a 15 lb/ 15 m in. Dejar enfriar, cu and o el med io se encuen-
tre a 50o C aproximad am ente, añad ir la solu ción m ineral estéril pre-
viamente preparad a (1 ml p or L d e m ed io) (tabla 6.2).
4) Vaciar el m ed io en cajas d e Petri en cond iciones estériles, esperar a
que gelifiqu e.
5) En un disco d e papel filtro estéril impregnar el petróleo crudo ligero
Tab la 6.2 Solu ción m in eral.
Componente Cantidad
Agua destilada 1L
Cloruro de calcio dihidratado MgCl2H2O 5.1 g
.
Cloruro de manganeso MnCl2 H2O 0.66 g
monohidratado
Cloruro de sodio NaCl 1.0 g
.
Cloruro férrico sextahidratado FeCl3 6H2O 1.0 g
.
Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.1 g
Cloruro de cobre CuCl2 0.01 g
Cloruro de zinc ZnCl2 0.08 g
Cloruro de aluminio AlCl3 0.05 g
Acido bórico H3BO3 0.01 g
Molibdato de sodio dihidratado Na2MoO4.2H2O 0.04 g
Si se quiere trabajar con un hid rocarburo p uro, en lugar del paso 5

primero inocular como se ind ica en 6.1.1 y, posteriormente, asperjar la
solu ción d e hid rocarburo con un frasco provisto d e atomizador y d ejar
evaporar el solvente en la campana d e flujo laminar.
6) Preparar la muestra de suelo y d iluciones e inocu lar cada caja como se
ind ica en la sección 6.1.1. Incubar las cajas d e forma invertid a a la tem-
peratura que se consid ere óptima en función d el suelo y la localización
d el sitio.
7) Despu és d e cinco d ías d e incu bación, proced er al conteo d e colonias.
(0.1 ml) y la humedad de la muestra.
Cálculos
Para realizar los cálculos d e UFC/ g s.s. seguir el mismo p roced im ien-
to d e la sección 6.1.1
6.1.5 H ongos hid rocarbonoclastas p or d ilu ción en p laca
Método
tas (6.1.4), con la d iferencia de qu e al med io se le adiciona rosa d e

Bengala y estreptomicina y se aju sta el pH a 4.9.
Material y equipo
Cajas d e Petri.
Espátula.
Balanza analítica.
Potencióm etro.
Camp ana d e flu jo laminar.
Au toclave.
Papel filtro estéril.

Los mismos qu e p ara 6.1.4, ad em ás d e rosa d e Bengala, estrep tom icina
y ácid o láctico al 10% (sección 6.1.3).
Procedimiento
1) Preparar el med io d e cultivo con los com ponentes d e la tabla 6.1,
d isolviénd olos en el ord en señalad o en u n litro d e agua d estilad a, ad i-
cionar rosa d e Bengala (50 mg / L).
2) Esterilizar a 15 lb/ 15 minu tos.
3) Despu és d e la esterilización, cuand o el m ed io se encuentre a 50°C
aproximad am ente, aju star su p H a 4.9 con ácid o láctico estéril al 10%
(en cond iciones estériles en campana d e flujo laminar), añad ir 1 m l d e
la solu ción mineral estéril previam ente prep arad a y la estrep tom icina
(48 mg L-1).
4) Mezclar bien y vaciar el med io en cajas d e Petri en cond iciones esté-
riles y esp erar a que gelifiqu e.
5) En u n d isco d e p ap el filtro estéril im p regnar el p etróleo cru d o lige-
ro estéril y colocarlo en la p arte interna d e la tap a d e la caja d e Petri.
El hid rocarbu ro qu e se volatilice servirá com o fu ente d e carbono y
energía.
asperjar la solu ción d e hid rocarburo con un frasco provisto d e atom i-

zad or y d ejar evaporar el solvente en la camp ana d e flu jo laminar.
6) Preparar la mu estra d e suelo y d iluciones, e inocular cad a caja com o
se ind ica en la sección 6.1.1. Incu bar las cajas d e form a invertid a a la
tem peratura qu e se consid ere óptim a en fu nción d el su elo y la locali-
zación d el sitio.
7) Despu és d e cinco d ías d e incu bación proced er al conteo d e colonias.
(0.1 ml) y la humedad de la muestra.
Cálculos
Para realizar los cálculos d e UFC/ g s.s. seguir el mismo p roced im ien-
to d e la sección 6.1.1.
6.2 M icroorgan ism os an aerob ios
6.2.1 Fu nd am entos d e la técnica d el nú m ero m ás p robable
Introducción
Existen d iversos métodos para cuantificar el número de microorganis-
mos presentes en muestras líquid as y sólidas. Dentro d e las técnicas más
comunes se encuentra el recuento d irecto por microscopia de fluorescen-
cia, así como los proced imientos basad os en diluciones en serie, haciend o
crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólid os o líqui-
dos, como el recuento en placa d e Unid ades Formadoras de Colonias
(UFC) o la estimación por el métod o d el Número Más Probable (NMP).
Este último es muy adecuado para determinar bacterias anaerobias, por-
que permite mantener un ambiente anaerobio dentro d e los tubos, sin
necesitar d e sistemas anaerobios más complejos como cámaras o jarras
anaerobias.
El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y
actualmente sigue siend o ampliamente utilizado (Hurley y Roscoe, 1983).
En un principio este métod o fue empleado para estimar el número
de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se
suelos contaminados (Wrenn y Venosa, 1996; Vester y Ingvorsen, 1998;

Kuai et al., 2001).
Método
Este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en
muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
Fundamento
El métod o consiste en la estimación del número de microorganismos via-
bles a partir de diluciones sucesivas (1/ 10) partiend o d e 1 g d e suelo o
sed imento en base húmed a o 1 ml d e agua; posteriormente, d e tres o más
de las d iluciones se inoculan tubos con med io d e cultivo con sustratos y
aceptores de electrones específicos. En este métod o se asume que en las
series de d iluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al
azar y que al menos un microorganismo generará crecimiento, produ-
ciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio d e color del med io,
prod ucción d e algún metabolito esp ecífico). Esta técnica se basa en la
estimación d e la d ensid ad bacteriana por el m étod o estad ístico d e máxi-
ma probabilidad , utilizand o la teoría d e las d iluciones.
Para realizar la estim ación microbiana se u tiliza un m ínimo d e tres d ilu -

ciones y u n intervalo d e 3 a 10 rép licas (“n” tubos d e med io p ara creci-
miento) p or d ilu ción; el nú m ero d e d ilu ciones y rép licas u tilizad as
estará en función d e la precisión requerid a. Actu alm ente, existen tablas
estánd ar como las publicad as por la FDA o N ACE para estimar el núme-
ro d e microorganismos más probable. Estas tablas están limitadas a tres
diluciones y a 3, 5 y 10 réplicas por d ilución; sin embargo, también exis-
ten programas d e computad ora (MPN Calculator TM , “Chem SW”) para
obtener la estimación microbiana empleand o más d e tres diluciones y un
número mayor de réplicas.
6.2.2 Métod o d e N MP p ara la cu antificación

d e microorganismos anaerobios en su elos
A continuación se presenta la metod ología general para la determinación

de bacterias anaerobias por N MP, proporcionándose posteriormente el
Interferencias
La presencia de oxígeno es el principal factor d e interferencia, por lo qu e
se d eben conservar las cond iciones anaerobias du rante tod a la técnica.
Material y equipo
Matraz Erlenmeyer d e 1 L.
Matraz volum étrico d e 1 L.
Jeringas hip od érm icas d e 1 m l (0.1/ 1.0 ml).
Papel alum inio.
Grad illas.
Espátula.
Tubos p ara cultivo anaerobio tip o H u ngate, con sep to d e hule y tapa
horad ad a.
Au toclave.
Cámara d e anaerobiosis.
1) N itrógeno (N 2), d e preferencia d e u ltra alta pu reza (99.999%), como
gas red uctor.
2) Agua destilada anóxica. Adicionar agua destilada necesaria para la pre-
paración de las soluciones estándar en un matraz Erlenmeyer. Marcar el
nivel del líquido con una línea en el matraz para indicar el volumen de
solución deseado y adicionar de 15 a 25% más de agua destilada. Tapar
el matraz con papel aluminio haciendo dos pequeños orificios para per-
mitir la salida del vapor y colocarlo en una parrilla hasta ebullición.
Retirar el matraz de la parrilla un poco antes de que el nivel de la solu-
ción llegue hasta la marca y enfriar con un burbujeo de N 2 para mante-
ner las condiciones anóxicas. Una vez frío el nivel del medio debe estar
en la marca.
3) H id róxid o d e potasio (KOH ) 1N . Disolver 56.09 g d e KOH en 200 m l
d e agua d estilad a y posteriormente aforar a 1L.
4) Resarzurina al 0.1%. Disolver 0.1 g d e resarzu rina en 100 m l d e agua
d estilad a y esterilizar por filtración.
Procedimiento
A) Preparación de tubos con medio de crecimiento.
B) Adición de sustratos y aceptores de electrones.

Los sustratos y aceptores de electrones son adicionados a los tubos d e cre-
cimiento con med io base anaerobio, previamente esterilizad os. El tipo d e
sustratos y aceptores adicionados d ependerán del grupo d e microorga-
nismos que se está evaluando (secciones de 6.2.4 a 6.2.8).
C) Preparación de tubos con solución salina para diluciones 1/10.

1) Agregar 8.5 g d e N aCl, 0.5 g d e cisteína-H Cl y 1.0 m l d e solu ción
d e resarzu rin a en u n m atraz Erlenm eyer y d isolver en 1 L d e agu a
d estilad a.
2) Aju star el pH a 7 a la solu ción salina con un potenciómetro a temp e-
ratura ambiente, agregand o aproximad amente 0.4 m l d e KOH 1N ; la
tonalid ad d e la solución se tornará d e color azu l oscu ro a gu ind a.
Marcar con u na línea el nivel d el líqu id o en el matraz Erlenmeyer y
ad icionar entre 15 y 25% más d e agua d estilad a. Tapar el matraz con
papel alum inio haciend o d os p equeños orificios p ara p erm itir la sali-
d a d el vap or, y colocarlo en u na p arrilla p ara su calentam iento hasta
ebu llición.
Nota: El cam bio d e coloración d e la solución d e rosa a transp arente es ind icativo
d e la p érd id a d e oxígeno y d e las cond iciones anóxicas.
3) Retirar el m atraz d e la p arrilla un poco antes d e qu e el nivel d e la

solu ción llegu e hasta la marca y enfriar con N 2 p ara mantener las con-
d iciones anóxicas.
4) Una vez qu e la solu ción salina se encu entre a tem p eratu ra am bien-
te, continu ar bu rbu jeand o con N 2 hasta qu e term ine la d osificación
(d istribu ción en cad a tu bo). Colocar los tu bos d e cu ltivo p erfecta-
m ente lim p ios en grad illas e introd u cir u na m an gu era con flu jo d e
N 2 en cad a u n o d e ellos. Para d osificar la solu ción se u tiliza u n a
p ip eta d e 10 m l con u na p erilla d e tres vías o u n d osificad or d e
engranes. Antes d e iniciar la d osificación p u rgar la p ip eta tres veces
con N 2.
5) En cad a tu bo ad icionar 9.0 ml d e solu ción fisiológica salina anóxica,
tap ar el tubo con el sep to d e hule, extrayend o la m angu era d e N 2 len-
tam ente, y posteriorm ente colocar la tap a d e rosca horad ad a. Esterili-
D) Inoculación.
1) Preparación d el inóculo. Pesar d entro d e la cámara anaerobia 1 g d e
mu estra d e suelo en base húm ed a y ad icionarla a un tubo con 9 m l
d e solución salina estéril. Tapar nuevamente con el sep to d e hule y la
tapa horad ad a, agitar p erfectamente hasta obtener una susp ensión
homogénea (d esaparición d e los agregad os d el su elo). Bajo cond icio-
nes estériles y anóxicas (pu rga con nitrógeno), tomar (con jeringa esté-
ril) 1 m l d e la su spensión d e suelo y ad icionarlo en u n tubo nuevo con
solu ción salina estéril, agitar perfectamente. Realizar las d ilu ciones
sucesivas, necesarias para la inocu lación.
Nota: El núm ero d e d ilu ciones d ep end erá d e la d ensid ad m icrobiana d e cad a
m u estra d e suelo.
2) Inoculación. Utilizando como inóculo las últimas tres diluciones prepa-

radas, adicionar 1 ml de la dilución correspondiente a cada una de las “n”
réplicas o tubos con 9 ml de medio de cultivo por dilución. Realizar la
inoculación bajo condiciones estériles y anóxicas (purga con nitrógeno).
Nota: El nú m ero d e réplicas o tu bos inoculad os por d ilución d ependerá d e la

p recisión requerid a. Su poniend o u n m ínim o d e tres tubos p or d ilu ción, se ten-
d rán qu e inocular tres tu bos d e m ed io d e cultivo p or cad a dilución, p ara obte-
ner un total d e nu eve tubos inoculad os.
3) Mantener los tubos inocu lad os en oscurid ad . La temp eratu ra y el

tiemp o d e incu bación estarán en fu nción d e las cond iciones d e creci-
miento específicas d e los microorganismos por evaluar.
E) Análisis de resultados, indicador de crecimiento

Después del tiempo de incubación analizar los tubos de crecimiento. De-
pendiendo del tipo de respuesta producida por los microorganismos,
puede ser la evaluación del crecimiento (turbidez), cambio de coloración
del medio de cultivo o la detección de algún metabolito específico.
Cálculos
Depend iend o d e las resp uestas obtenid as se utiliza el siguiente proce-
1) Ord enar los resultad os negativos y positivos por d ilución.

2) Determinar, d e acuerd o con el número d e tubos positivos en cada
d ilución, el número más probable d e microorganismos, empleand o las
tablas d e valores reportadas por (N ACE, 1990).
3) De acuerd o con estas tablas, mu ltiplicar el núm ero d e m icroorganis-
mos por la d ilu ción m ás baja inocu lad a.
N MP/ g suelo hú med o = Vt * FD.
N MP/ g suelo hú med o = nú mero m ás probable d e m icroorganism os

p or g d e suelo hú med o.
Vt = valor d e tablas (N ACE, 1990).
FD = factor d e la p rim era d ilu ción.
4) Corregir la cu enta d e m icroorganism os p or la hum ed ad d e la mues-

tra para obtener los resultad os en base seca.
N MP/ g su elo seco = N MP x (100/ (100-h)).
h = hum ed ad d el suelo con respecto al peso hú med o (%).
Nota: Ejem p lo con tres diluciones y tres réplicas por dilución:
Dilución 104 105 106

Respuesta + + + + - + - - +
Valor 3 2 1
Buscar el valor d e tablas:

3, 2, 1 = 15.
Mu ltiplicar por la d ilu ción m ás baja:
N MP/ g d e suelo hú med o = 15 x 104.
Su poniend o u na hum ed ad d e 30%:

6.2.3 Prep aración d e tubos con m ed io base

para el cu ltivo d e bacterias anaerobias
Introducción
En cond iciones d e laboratorio, los medios d e cultivo proveen las carac-
terísticas físicas y químicas d el ambiente para el crecimiento d e los
microorganismos, existiend o una gran diferencia en los requerimientos
nutricionales entre las d iferentes especies. Grad ualmente se han ido per-
feccionand o los medios de cultivo para hacerlos específicos; para las bac-
terias anaerobias los medios d e cu ltivo son más delicad os que los m ed ios
para bacterias aerobias, y la especificid ad va aunad a a ind icadores y
secuestrad ores de oxígeno, los cuales garantizan la efectivid ad de un
med io anóxico.
La preparación d e los med ios d e cultivo anaerobios se basa en la ap li-

cación d e d os p rincipios fund am entales: 1) exclu sión total d e trazas d e
oxígeno en la preparación y almacenam iento d e los med ios d e cultivo;
y 2) mantenim iento d e cond iciones red uctoras estrictas.
Los medios de cultivo específicos para cada grupo de bacterias anaerobias

(fermentativas, sulfato reductoras, nitrato reductoras, hierro reductoras,
metanogénicas, etcétera), están constituidos por un medio de cultivo base
en condiciones anóxicas, el cual se d escribe a continuación.
Fundamento
El presente m étod o se basa en la prep aración d e tubos con med io d e
cu ltivo base en cond iciones anóxicas, al cual sólo hay que ad icionar los
aceptores d e electrones esp ecíficos para cad a tipo d e m icroorganism o
qu e se quiere crecer. Dichos tu bos son utilizad os en la cuantificación d e
microorganismos por la técnica d el nú mero más probable.
Interferencias
La p resencia d e oxígeno es el p rincipal factor d e interferencia, p or lo
qu e se d eben conservar las cond iciones anaerobias d urante tod o el pro-
ced im iento.
Potencióm etro.
Papel alum inio.
Balanza analítica.
Espátula.
Parrilla d e calentamiento.
Matraz Erlenm eyer d e 2 L.
Pipeta d e 10 ml (1/ 10 ml).
Grad illas.
Tubos p ara cultivo anaerobio tip o H u ngate.
Perilla d e tres vías o d osificad or d e engrane.
Au toclave.
1) N itrógeno (N 2), d e preferencia d e u ltra alta pu reza (99.999%), com o
gas red uctor.
2) Mezcla d e gas N 2/ CO 2, 80/ 20%.
3) Resarzu rina al 0.1% (ver sección 6.2.2).
4) Agua d estilad a anóxica (ver sección 6.2.2).
5) Bicarbonato d e sod io (N aH CO 3) al 10%. Preparar la solu ción están-
d ar d e N aH CO 3 en cond iciones anóxicas (flu jo d e N 2) en u n frasco
Wheaton d e 125 m l, pesar 10 g d e N aH CO 3 por cad a 100 ml d e agua
d estilad a anóxica (agua previam ente hervid a y enfriad a con N 2) y
d isolver. Tapar el frasco con un septo d e hule y sellar con u n casqu i-
llo d e alu minio, agitar hasta d isolver el reactivo y finalm ente esterili-
zar en autoclave p or 20 minu tos a 121°C (15 lb/ p ulg 2).
6) H id róxid o d e p otasio (KOH ) 1M. Disolver 56.09 g d e KOH en 200 m l
d e agua d estilad a y posteriormente aforar a 1L.
7) Solu ción d e oligoelementos (Balch et al., 1977). En u n frasco d e capa-
cid ad ad ecu ad a d isolver 1.5 g d e ácid o nitrilotriacético en 100 m l d e
agu a d estilad a, aju star el p H a 6.5 con KOH 10N ; en otro frasco d isol-
ver en 100 ml d e agua d estilad a los reactivos listad os en la tabla 6.3,
agregar esta solu ción lentam ente a la solución d e ácid o nitrilotriacéti-
co p reviam ente p rep arad o, y llevar a 1 L con agu a d estilad a en un
matraz volu métrico. Mantener esta solución en refrigeración.
Tab la 6.3 Com pu estos d e la solu ción d e oligoelem en tos.
Compuesto Fór mula Cantidad

Cloruro de magnesio MgCl2.⋅6H2O 2.5 g
hexahidratado
Cloruro de manganeso MnCl2.⋅4H2O 0.6 g

tetrahidratado
Cloruro ferroso FeCl2⋅.4H2O 0.1 g

tetrahidratado
Cloruro de cobalto CoCl2.⋅6H2O 0.1 g

hexahidratado
Cloruro de aluminio AlCl3 0.01 g
Acido bórico H3BO3 0.01 g
Molibdato de sodio Na2MoO4.⋅2H2O 0.01 g

dihidratado
Cloruro cúprico CuCl2⋅.2H2O 0.01 g

dihidratado
Cloruro de calcio CaCl2.⋅2H2O 0.1 g

dihidratado
Cloruro de zinc ZnCl2. 0.1 g
Agua destilada 1.0 L
Procedimiento
1) En u n m atraz Erlenm eyer d isolver en 1L d e agu a d estilad a los reac-
tivos listad os en la tabla 6.4 y agitar hasta d isolver. Una vez d isu el-
tos tod os los com p u estos se obtiene u na solu ción con tonalid ad rosa
Tab la 6.4 M ed io de cu ltivo p ara el cu ltivo d e m icroorgan ism os an aerob ios

(Ravot et a l., 1995).
Compuesto Fór mula Cantidad

Agua destilada 1L
Cloruro de amonio NH4Cl 1.0 g
Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 0.3 g
Fosfato de potasio dibásico K2HPO4 0.3 g
Cloruro de magnesio sexta hidratado MgCl2⋅6H2O 0.2 g
Cloruro de calcio dihidratado CaCl2⋅2H2O 0.1 g
Cloruro de potasio KCl 0.1 g
Extracto de levadura 1.0 g
Triptona peptona 1.0 g
Solución de o ligoelementos 10 ml
Cisteína-HCl 0.5 g
Resarzurina 0.1% 1 ml
2) Ajustar el pH a 7 con un potenciómetro a temperatura ambiente, agre-

gand o aproximadamente 0.4 ml de KOH 1N , la tonalidad de la solución
se torna azul oscuro o guinda.
3) Marcar el nivel de la solución con una línea en el matraz, adicionar d e
15 a 25% d e agua d estilada. Tapar el matraz con papel aluminio hacien-
do dos pequeños orificios para permitir la salida d el vapor y colocarlo
en una parrilla para su calentamiento hasta ebullición. Retirar el matraz
de la parrilla de calentamiento un poco antes d e que el nivel d e la solu-
ción llegue hasta la marca, y enfriar con un burbujeo de N 2 para mante-
ner las cond iciones anóxicas. Una vez frío el nivel d el med io d ebe estar
en la marca.
4) Una vez que el medio se encuentra a temperatura ambiente, continuar

burbujeand o con N 2. Colocar los tubos d e cultivo perfectamente limpios
en gradillas e introducir una manguera con flujo d e N 2 en cad a uno d e
ellos. Para dosificar el medio se utiliza una pipeta de 10 ml con una peri-
lla de tres vías o un d osificador d e engranes. Antes d e iniciar la d osifi-
cación del medio, purgar la pipeta tres veces con N 2.
5) Ad icionar en cad a tu bo 9 m l d e m ed io d e cu ltivo anóxico, tapar con
los septos d e hu le extrayend o la m angu era d e N 2, y finalmente colocar
el tap ón d e rosca horad ad o.
6) Cam biar la atmósfera a N 2/ CO 2 (80/ 20) en tod os los tu bos p rep ara-
d os. En el sep to d e cad a tu bo insertar u na agu ja conectad a con la
mangu era d e la m ezcla d e gases y otra agu ja libre p ara perm itir el
intercambio d e gases d urante 30 segu nd os. Finalm ente, esterilizar los
tu bos d e cu ltivo en au toclave d u rante 20 m inu tos, a una temp eratu ra
d e 121°C a 15 lb/ p u lg 2 d e p resión.
7) Una vez estériles y fríos los tu bos con medio d e cultivo, ad icionar con
una jeringa estéril d e 1 ml y bajo cond iciones anóxicas (pu rga con nitró-
geno) y estériles, 0.2 ml d e la solución estéril d e NaH CO 2 a cad a tubo
para obtener un pH final de 7.
6.2.4 Bacterias ferm entativas
Introducción
Las bacterias ferm entativas (por ejem plo Clostridium) en au sencia d e un
aceptad or d e electrones externo pu ed en catabolizar los com pu estos or-
gánicos med iante fermentación. En la ferm entación los compu estos
orgánicos sirven com o aceptor y d onad or d e electrones. Estas bacterias
pu ed en fermentar una amp lia varied ad d e comp uestos como azúcares,
celu losa, proteínas, aminoácid os y pu rinas. En suelos contam inad os con
hid rocarbu ros, bajo cond iciones lim itad as d e oxígeno o anóxicas, las
bacterias anaerobias estrictas y facu ltativas son las que metabolizan los
hid rocarbu ros, u tilizánd olos com o acep tor d e electrones o como su bs-
trato. Si el m etabolismo no es ferm entativo, las bacterias anaerobias u ti-
lizan com pu estos oxid ad os como su lfatos, nitratos, Fe+3 u otros, como
aceptores d e electrones.
C 6H 12O 6 2CO 2 + 2 CH 3-CH 2-OH .
C 6H 12O 6 CO 2 + CH 3 -COOH + H 2.
Método
Este métod o es aplicable para el cu ltivo y cu antificación d e bacterias
anaerobias ferm entativas, p rovenientes d e m uestras d e suelo p or la téc-
nica N MP.
Fundamento
La cuantificación se basa en el crecimiento específico d e bacterias fermen-
tativas d e muestras de suelo, en un medio d e cultivo anaerobio utilizan-
do glucosa como única fuente d e carbono y aceptor d e electrones. La
cuantificación se realiza por el método d e número más probable (NMP),
utilizando como indicad or positivo el cambio del color del medio d e cul-
tivo de azul a transparente. El ind icador azul d e bromotimol, presente en
el medio, funciona como un ind icador d e acid ez; varía a incoloro cuan-
do el medio se acidifica como resultado de la presencia d e ácidos orgáni-
cos, producidos por el metabolismo fermentativo.
Material y equipo
Jeringas hip od érmicas d e 1 m l (0.1/ 1.0 m l).
Frascos Wheaton (serológicos) d e 125 ml.
Matraz volu métrico d e 1 L.
Espátula.
Cámara d e anaerobiosis.
Tubos anaerobios con 9 ml d e m ed io d e cu ltivo base, preparad os d e
acuerd o con la técnica 6.2.3 y azul d e brom otimol.
Au toclave.
1) N itrógeno (N 2), d e preferencia d e u ltra alta pu reza (99.999%), com o
gas red uctor.
2) Agua d estilad a anóxica (ver sección 6.2.2).
3) Glucosa (C 6H 12O 6) 1M. Preparar la solu ción en cond iciones anóxicas
(flujo d e N ) en frascos Wheaton d e 125 ml, pesar 18 g d e glu cosa por
tivo y finalm ente esterilizar en autoclave p or 20 minu tos a 121°C

(15 lb/ pu lg 2).
4) Hidróxido de sodio (NaOH ) 1N. Pesar 40 g de NaOH y ad icionarlos
cuidadosamente a un matraz volumétrico de 1 L con 500 ml de agua des-
tilada, d isolver las lentejas conforme se vayan adicionando. Finalmente
aforar con agua destilada.
5) Azu l d e brom otimol 1% en N aOH 1N . Pesar 1 g d e azu l d e brom oti-
mol y d isolver en 100 m l d e una solu ción d e N aOH 1N . Almacenar en
frasco ámbar.
Procedimiento
Este p roced im iento com prend e la ad ición d e su stratos y aceptores d e
electrones a tu bos con m ed io d e cu ltivo base, p reviam ente prep arad os
d e acuerd o con la técnica d escrita en la sección 6.2.3, y el análisis d e
los resu ltad os p ara cu antificar el nú m ero d e microorganism o por la
técnica N MP, la cu al se d etalla en la sección 6.2.2.
Nota: Para este tipo d e bacterias se recom iend a probar hasta una d ilución 10-6.
A) Adición de sustratos y aceptores de electrones.

1) Para este grupo d e microorganismos es necesario ad icionar el indicador
azul d e bromotimol al momento de preparar el medio d e cultivo base,
de acuerdo con la técnica descrita en sección 6.2.3. Adicionar 1 ml de la
solución de azul de bromotimol por cada litro de medio preparado.
2) Posteriormente, la fuente de carbono se adiciona a los tubos con 9 ml de
medio de cultivo base y azul de bromotimol previamente esterilizados.
3) Agregar a cada tubo 0.2 ml d e la solución estéril d e glucosa a través d e
una jeringa hipodérmica, bajo condiciones estériles y anóxicas (purga
con nitrógeno).
B) Condiciones de cultivo.
1) Mantener los tubos inoculados a una temperatura controlad a d e 30°C
du rante 30 días.
C) Análisis de resultados, indicativo de fermentación.

1) Después de los 30 días de incubación, determinar los tubos positivos por
6.2.5 Bacterias anaerobias su lfato red uctoras
Introducción
Los microorganismos d efinid os como sulfato red uctores abarcan u na
diversidad de bacterias que incluyen el d ominio Archaea y Bacteria. Las
bacterias su lfato redu ctoras son versátiles y capaces d e crecer utilizand o
su lfato u oxianiones de sulfuro como aceptor d e electrones y acetato, lac-
tato y glucosa como d onad ores d e electrones. El proceso general d e sul-
fato red ucción y d e oxid ación d e benceno con su lfato como aceptor d e
electrones se muestra a continuación (Suthersan, 1999):
SO 4 SO 3 S H 2S.
C 6H 6 + 3.75 SO 42- + 7.5H + 6CO 2 + 3.75 H 2S + 3 H 2O .
En suelos contaminad os con hid rocarbu ros existen tanto bacterias aero-
bias como anaerobias que llevan a cabo la d egradación d e hid rocarbu-
ros. Es importante consid erar ambos metabolismos, especialmente cu an-
do se quiere segu ir la atenu ación natural o conocer la microflora d e los
sitios. En fosas d e residu os d e perforación existen grand es concentracio-
nes d e su lfatos y condiciones d e baja concentración de oxígeno, p or las
arcillas y barita presentes; características que favorecen la presencia d e
bacterias sulfato red uctoras (IMP, 2004).
Método
Este m étod o es ap licable p ara el cu ltivo y la cuantificación d e bacterias
anaerobias su lfato red uctoras en mu estras d e su elo por la técnica N MP.
Fundamento
Este m étod o se basa en el cu ltivo d e bacterias su lfato red u ctoras p re-
sentes en m u estras d e su elo, en u n m ed io d e cu ltivo anaerobio u tili-
zand o acetato com o fuente d e carbono y su lfato d e sod io como acep tor
d e electrones. La cu antificación se realiza p or la técnica d el nú m ero
más p robable, u tilizand o com o ind icad or positivo d e la su lfato red u c-
ción la formación d e un precip itad o negro d e su lfuro de fierro resultad o
d e la reacción d e sulfu ro d e hid rógeno p rod ucid o por la red ucción
Material y equipo
El mismo material requ erid o en la técnica d escrita en la sección 6.2.4.
1) Agua d estilad a anóxica. Ver la técnica d escrita en la sección 6.2.2.
2) Acetato d e sod io (C 2H 3O 2N a) 0.15 g/ m l. Prep arar la solución están-
d ar en cond iciones anóxicas en frascos Wheaton d e 125 ml, p esar 15 g
d e acetato d e sod io por cad a 100 ml d e agu a d estilad a anóxica y d isol-
ver. Tap ar el frasco con un sep to d e hule y sellar con un casquillo d e
alu minio, agitar hasta d isolver el reactivo y finalm ente esterilizar en
au toclave por 20 m inutos a 121°C (15 lb/ pu lg 2).
3) Sulfato de sodio (Na2SO4) 1M. Preparar la solución en condiciones anóxi-
cas en frascos Wheaton de 125 ml, pesar 14.2 g de Na2SO4 por cada 100 ml
de agua destilada anóxica, tapar el frasco con un septo de hule y sellar
con un casquillo de aluminio, agitar hasta disolver el reactivo y finalmen-
te esterilizar en autoclave por 20 minutos a 121°C (15 lb/ pulg 2).
4) Cloru ro ferroso (FeCl2.4H 2O) 1.8 mg/ ml. Preparar la solución en con-
d iciones anóxicas en frascos Wheaton de 125 ml, pesar 180 mg de clo-
ruro férrico por cad a 100 ml d e agua destilada anóxica, tapar el frasco
con un septo de hule y sellar con un casquillo d e alu minio, agitar hasta
d isolver el reactivo y finalmente esterilizar en autoclave por 20 m inu-
tos a 121°C (15 lb/ p ulg 2).
Procedimiento
El proced im iento comprend e la ad ición d e sustratos y aceptores d e elec-
trones a tu bos con med io d e cu ltivo base, previamente preparad os d e
acuerd o con la técnica d escrita en la sección 6.2.3, y el análisis d e los
resultad os p ara cu antificar el núm ero d e microorganismos por la técni-
ca N MP, la cual se d etalla en la sección 6.2.2.
N ota: Para las bacterias su lfato red u ctoras se recom iend a probar hasta una d ilu -
ción 10-6.

Agregar, con una jeringa hipodérmica, a cad a tubo con 9 ml medio d e cul-
tivo base 0.2 ml de la solución estéril de acetato de sodio, 0.2 ml de so-
Mantener los tubos inocu lad os a una temperatu ra controlad a d e 30°C
d urante 30 d ías.
C) Análisis de resultados, indicativo de sulfato reducción.

Al térm ino d el tiem po d e incu bación d eterminar los tu bos positivos por
la form ación d e u n p recip itad o negro en el m ed io d e cultivo y calcu lar
el núm ero d e bacterias d e acu erd o con la sección 6.2.2.
6.2.6 Bacterias an aerob ias red u ctoras d e fierro
Introducción
Las bacterias hierro red uctoras son u na clase especial d e m icroorganis-
mos qu e u tilizan óxid os e hid róxid os d e Fe como acep tores d e electro-
nes, obtienen energía d e la red u cción d e Fe 3+ a Fe2+ acop lad a a la oxid a-
ción d e contaminantes orgánicos y otros m etabolitos para formar CO 2
(Lovley, 1991).
Estud ios moleculares d el DN A ribosomal (DN Ar) 16S, en bacterias ais-

lad as d e sistem as líquid os, ind ican qu e los m iembros d e la fam ilia
Geobacteraceae son los m icroorganism os red uctores d e Fe3+ pred om i-
nantes (Lovley et al., 1993).
La reducción d e Fe3+ acoplada a la oxid ación d e acetato y benceno se pre-

senta en las siguientes ecuaciones (Lovley et al., 1991; Suthersan, 1999):
CH 3COO- + 8Fe 3+ + 4H 2O 8Fe2+ + 2H 2CO 3- + 9H + .
C 6H 6 + 30Fe3+ +12 H 2O 6CO 2 + 30H + + 30Fe 2+.
Método
Este m étod o es ap licable p ara el cu ltivo y la cuantificación d e bacterias
anaerobias hierro red u ctoras en m uestras d e suelo por la técnica N MP.
Fundamento
La cu antificación se basa en el crecimiento específico d e las bacterias
aceptor d e electrones. La cuantificación se realiza por el método del

número más probable, utilizand o como indicad or positivo el cambio d e
color del med io de cu ltivo, d e amarillo a transparente. El color amarillo
del medio se debe a la presencia d e citrato d e hierro y el cambio a trans-
parente indica la red ucción d e Fe 3+ a Fe 2+ .
Material y equipo
Se emp lea el m ismo m aterial qu e se reporta en la técnica d escrita en la
sección 6.2.4.
1) Agua d estilad a anóxica. Ver técnica en la sección 6.2.2.
2) Acetato d e sod io (C 2H 3O 2N a) 0.15 g/ m l. Prep arar la solución están-
d ar en cond iciones anóxicas en frascos Wheaton d e 125 m l, pesar 15 g
ver. Tap ar el frasco con u n septo d e hu le y sellar con u n casquillo d e
autoclave p or 20 minu tos a 121°C (15 lb/ pu lg 2).
3) Citrato d e fierro (FeC 6H 5O 7) 0.1 g/ ml. Preparar la solu ción estánd ar
en cond iciones anóxicas (flu jo d e N 2) en frascos Wheaton d e 125 m l,
pesar 10 g d e citrato d e hierro p or cad a 100 m l d e agua d estilad a anó-
xica y d isolver. Tap ar el frasco con u n septo d e hu le y sellar con un
casqu illo d e alu minio, agitar hasta d isolver el reactivo y finalmente
esterilizar en au toclave p or 20 minu tos a 121°C (15 lb/ p ulg 2).
Procedimiento
El procedimiento comprende la adición d e sustratos y aceptores de elec-
trones a tubos con medio de cultivo base, previamente preparad os d e
acuerd o con la técnica d escrita en la sección 6.2.3, y el análisis de los resul-
tad os para cuantificar el número d e microorganismos por la técnica
NMP, la cual se d etalla en la sección 6.2.2.
N ota: Para las bacterias hierro red uctoras se recom iend a probar hasta u na d ilu -
ción 10-5.

0.2 ml acetato d e sod io; bajo cond iciones estériles y anóxicas (pu rga d e
la jeringa con nitrógeno).
Mantener los tubos a una temperatura controlada de 30°C durante 30 días.
C) Análisis de resultados, indicativo de fierro reducción.

Al térm ino d el tiem po d e incu bación d eterminar los tu bos positivos por
el cambio d e color d el med io d e cu ltivo d e amarillo a incoloro, y calcu-
lar el nú mero d e bacterias d e acuerd o con la sección 6.2.2.
Nota: La p resencia d e su lfatos en las m u estras d e su elo p od ría estim ular, a bajas
d iluciones, la prod u cción d e H 2S p or bacterias su lfato red u ctoras. La p rod u c-
ción d e este m etabolito prom u eve la form ación de un p recipitado negro d e sul-
furo de fierro, qu e dism inuye la d isponibilid ad d el fierro para las bacterias fierro
reductoras e interfiere en la cuantificación de estos m icroorganismos. Sin em bar-
go, se ha dem ostrad o que las bacterias hierro red uctoras tienen la capacid ad
m etabólica de red ucir sulfatos, bajo ciertas cond iciones d e cu ltivo com o altas
concentraciones d e este acep tor d e electrones, form and o tam bién el p recip ita-
d o negro. Esto d ificu lta d eterm inar con exactitu d qu é tip o d e bacterias son las
qu e realm ente están p articip and o en el sistem a cu and o hay su lfato p resente en
el m ed io.
Es recomend able tener controles estériles d e su elo p ara evitar la forma-

ción d e otro tipo d e p recip itad os abióticos, resultad o d e la presencia d e
comp uestos en el suelo como: Fe(OH )3, Mn(OH )2, etcétera.
6.2.7 Bacterias nitrato red u ctoras
Introducción
La d esnitrificación es u n proceso llevad o a cabo p or u na gran varied ad
d e bacterias, la mayoría d e ellas anaerobias facu ltativas, representantes
d e casi tod os los taxas d el d ominio Bacteria. Estos organism os son cons-
tituyentes com unes d e las comu nid ad es microbianas, su d istribu ción no
necesariam ente es afectad a por una exposición previa a la contamina-
ción (Cunhingam et al., 1998). La oxid ación d e benceno hasta CO en
C 6H 6 + 6H + + 6N O 3- 6 CO 2 + 3 N 2 + 6 H 2O.
Método
Este métod o es aplicable p ara el cu ltivo y la cuantificación d e bacterias
nitrato red uctoras en m uestras d e su elo p or la técnica N MP.
Fundamento
La cu antificación se basa en el crecim iento esp ecífico d e bacterias
nitrato red u ctoras p resentes en m u estras d e su elo, en u n m ed io d e cu l-
tivo anaerobio p or la red u cción d e nitratos, em p leand o acetato com o
fu ente d e carbono. El nú m ero d e bacterias se d eterm ina p or el m éto-
d o d el nú m ero m ás p robable, analizand o la ap arición d e nitritos p or
la ad ición d e los reactivos d e Griess Llosvay y p olvo d e zinc (Drysd ale
et al., 2001).
La reacción d e Griess Llosvay se basa en la ad ición d e una solución d e

ácid o su lfanílico y u na solu ción ácid a d e alfa naftilam ina, las cu ales al
reaccionar con los nitritos forman un comp lejo color rojo d e d iazonio,
p-su lfobenceno-azo-α-naftilam ina.
El d esarrollo del color rojo d espués de la adición de los reactivos repre-

senta una reacción positiva para la reducción d e nitratos. La ausencia d e
color d espués de agregar los reactivos representa una reacción negativa,
lo cual significa la ausencia d e nitritos en el med io. Esta reacción tiene dos
explicaciones: (i) que los nitratos no han sido red ucidos o (ii) que los
nitratos han sid o reducidos hasta amonio, óxido nítrico (N O), óxido
nitroso (N 2O) o nitrógeno molecular (N 2). Para distinguir entre una reac-
ción negativa falsa o verd adera es necesario añadir una pequeña cantidad
de polvo de zinc a todas las reacciones negativas. Los iones d e zinc redu-
cen los nitratos a nitritos; el d esarrollo de un color rojo después d e agre-
gar el polvo d e zinc indica la presencia de nitratos y confirma la reacción
negativa verd adera. Si después de agregar el polvo d e zinc el tubo per-
manece incoloro, significa que los nitratos fueron reducidos hasta óxidos
de nitrógeno por la actividad red uctora d e las bacterias, por lo que la
prueba es positiva (Drysdale et al., 2001).
1) Agua d estilad a anóxica. Ver técnica d escrita en la sección 6.2.2.
2) Acetato d e sod io (C 2H 3O 2N a) 0.15 g/ ml. Prep arar la solución están-
d ar en cond iciones anóxicas en frascos Wheaton d e 125 ml, p esar 15 g
ver. Tapar el frasco con un sep to d e hule y sellar con u n casquillo d e
autoclave por 20 minutos a 121°C (15 lb/ pu lg 2).
3) N itrato d e p otasio (KN O 3) 50 g L-1. Prep arar la solución en cond icio-
nes anóxicas en frascos Wheaton d e 125 ml, pesar 5 g d e nitrato d e
potasio por cad a 100 m l d e agua d estilad a anóxica, tap ar el frasco con
un septo d e hule y sellar con u n casqu illo d e alu minio, agitar hasta
d isolver el reactivo y esterilizar en au toclave p or 20 minutos a 121°C
(15 lb/ pu lg 2).
4) Ácid o acético (CH 3-COOH ) 5N . Para preparar 250 m l d e solución,
med ir en u na probeta 71 ml d e ácid o acético pu ro, vaciar en u n matraz
aforad o d e 250 ml y aforar con agu a d estilad a.
5) Ácido sulfanílico (C 6H 7N O 3S) 8g L-1. Pesar 0.8 g d e ácido su lfanílico,
agregarlos a u n m atraz aforad o de 100 ml y aforar con ácido acético 5N.
Almacenar la solución en un frasco d e vidrio y cu brirlo con pap el alu-
minio.
6) Solu ción ácid a d e alfa-naftilamina (C 10H 9N ) 5g L-1. Pesar 0.5 g d e
α-naftilamina, agregarlos en un m atraz aforad o d e 100 m l y aforar con
ácid o acético 5N . Almacenar la solu ción en un frasco d e vid rio y cu brir-
lo con pap el alum inio.
Procedimiento
trones a tubos con medio de cultivo base, previamente preparados de
acuerdo con la técnica d escrita en la sección 6.2.3, y el análisis de los resul-
tados para cuantificar el número de microorganismos por la técnica NMP,
la cual se detalla en la sección 6.2.2.
Nota: Para las bacterias nitrato red uctoras se recom iend a p robar hasta u na d ilu -
ción 10-5.
d e cu ltivo base 0.2 m l d e la solu ción estánd ar estéril d e nitrato d e pota-

sio y 0.2 ml d e solu ción d e acetato d e sod io, bajo cond iciones estériles y
anóxicas (p urga con nitrógeno).
Mantener los tu bos a u na temp eratu ra d e 30°C d u rante 30 d ías.
C) Análisis de resultados, indicativo de nitrato reducción.

Al término d el tiemp o d e incu bación realizar la d eterminación d e nitri-
tos en cad a tu bo.
1) Adicionar a cada tubo 0.2 ml de la solución de ácido sulfanílico y 0.2 ml

de la solución ácida de naftilamina, agitar vigorosamente y esperar 30
segundos para evaluar la aparición de color. Si aparece un color rojo
entonces se considera una reacción positiva (+).
2) Si la reacción es negativa (tubos transparentes), entonces agregar una
pequeña cantidad de polvo de zinc, agitar vigorosamente y esperar 30
segundos para evaluar la aparición de color. Si aparece un color rojo
entonces se considera una reacción negativa (-). Si no aparece ninguna
tonalidad se considera una reacción positiva (+).
Contar los tu bos con reacción positiva, calcu lar el nú mero d e bacterias
d e acu erd o con la sección 6.2.2.
6.2.8 Bacterias anaerobias metanogénicas
Introducción
Todos los microorganismos metanógenos conocidos (por ejemplo: Methano
coccus, Methanobacterium) se encuentran dentro de la familia Euryarchaeota
del dominio Archaea. Estos organismos son anaerobios estrictos que produ-
cen metano por fermentación de acetato, o utilizando el CO 2 como aceptor
de electrones y como donadores de electrones pueden utilizar hidrógeno,
acetato, formato, compuestos de metilo y alcoholes. Viven en asociación
íntima con bacterias acetogénicas recicland o el H 2 y CO 2 liberado
(Suthersan, 1999; Zwolinski et al., 2000).
CO 2 + 4 H 2 CH 4 + 2 H 2O.
CH 3-COOH CH 4 + CO 2.
El metabolismo metanogénico en su elos contaminad os se asocia a la

d egrad ación d e hid rocarburos.
Método
Este métod o es aplicable para el cu ltivo y cu antificación d e bacterias
metanogénicas en mu estras d e su elo por la técnica N MP.
Fundamento
La cuantificación se basa en el crecimiento específico d e bacterias meta-
nogénicas de muestras d e suelo, en un medio de cultivo base anaerobio
empleando acetato como fuente de carbono. La cuantificación se realiza
por el método del número más probable, utilizando como ind icador posi-
tivo de la metanogénesis la producción de metano, el cual se d etecta por
cromatografía d e gases.
Material y equipo
Se em plea el mismo m aterial qu e se reporta en la técnica d escrita en la
sección 6.2.4.
Mezcla d e gases H 2:CO 2 (20:80).
1) Agua d estilad a anóxica. Ver técnica d escrita en la sección 6.2.2.
2) Acetato d e sod io (C 2H 3O 2Na) 0.15 g/ ml. Preparar la solución estánd ar
en condiciones anóxicas en frascos Wheaton d e 125 ml, pesar 15 g d e
acetato de sodio por cada 100 ml d e agua d estilad a anóxica y d isolver.
Tapar el frasco con un septo d e hule y sellar con un casquillo de alumi-
nio, agitar hasta d isolver el reactivo y finalmente esterilizar en autocla-
ve por 20 minutos a 121°C (15 lb/ pulg 2).
Procedimiento
trones a tubos con medio d e cultivo base, previamente preparad os d e
NMP, la cual se d etalla en la sección 6.2.2. Para estos microorganismos es

necesario realizar el cambio de atmósfera d e los tubos de crecimiento en
la etapa d e inoculación.
Nota: Para las bacterias m etanogénicas se recom iend a probar hasta u na d ilu ción
10-4.

Agregar, con u na jeringa hip od érmica, a cad a tu bo con 9 ml d e med io
d e cu ltivo base, 0.2 ml d e solu ción estéril d e acetato d e sod io. Despu és
d e la etapa d e inoculación, p resu rizar los tubos con u n flu jo d e H 2:CO 2
(20:80) d urante 30 segu nd os, conservand o las cond iciones estériles.
Nota: Tom ar la precau ción de no m anip ular los sistem as cerca d e u na flam a d ebi-
d o a la exp losivid ad d el gas H 2.
Mantener los tubos inocu lad os a una temperatu ra controlad a d e 30°C
d urante 60 d ías.
C) Análisis de resultados, indicativo de metanogénesis.

Al finalizar la incubación, determinar la producción de metano en los tubos
de cultivo. La detección de metano se puede realizar por varias técnicas:
desplazamiento de medio por el gas, utilizando un tubo pequeño (campa-
na) invertido dentro del tubo de cultivo, por cromatógrafo de gases con
detector de ionización de flama o conductividad térmica. Los sistemas
con formación de gas son considerados positivos; calcular el número de
bacterias de acuerdo con la sección 6.2.2.
6.3 Cu antificacion de la p rodu ccion d e CO 2 en su elo
Introducción
Los suelos son sistemas que cuentan con una flora microbiana propia, la
cual dependiendo de su actividad metabólica puede contribuir a la reme-
diación de los sitios contaminados. La actividad metabólica de los microor-
ganismos aerobios y de algunos anaerobios del suelo puede ser cuantificada
chamente relacionad o con la degrad ación de los contaminantes (Alef,

1995; Bossert y Kosson, 1997).
En la respiración, que es la oxid ación de la materia orgánica por microor-

ganismos aerobios, el oxígeno funciona como el aceptor final d e electro-
nes. El prod ucto final d el proceso son CO 2 y agua, por lo que la actividad
metabólica d e los microorganismos d el suelo puede ser cuantificada por
la med ición de la prod ucción d e CO 2 o consum o d e O 2. (N annip ieri et
al., 1990). Como otras activid ad es m etabólicas, ésta d epend e d el estad o
fisiológico d e las célu las y está influ id a p or d iferentes factores en el
suelo como la hum ed ad , temp eratu ra, d isponibilid ad d e nutrimentos y
estru ctu ra d el su elo.
La p rod u cción m icrobiológica d e CO 2 en el su elo p u ed e ser d eterm i-

nad a incu band o el su elo en jarras, cajas d e Petri cerrad as o en d iferen-
tes tip os d e m atraces o recip ientes. Una d e las técnicas m ás sencillas
p ara la cu antificación d e CO 2 es ad sorbiénd olo en N aOH y BaCl y
d eterm inánd olo p or titu lación con H Cl. Otros m étod os p ara la d eter-
m inación d e CO 2 se basan en los cam bios d e cond u ctivid ad eléctrica
d e la solu ción d e N aOH o u so d e crom atografía d e gases (Brookes y
Pau l, 1987) o esp ectroscop ia d e infrarrojo. El consu m o d e O 2 tam bién
p u ed e ser estim ad o p or m ed io d e u n electrorresp iróm etro o crom ato-
grafía d e gases p ara d eterm inar la activid ad m etabólica d e los m icro-
organism os en el su elo (Trevors, 1985).
Método
En esta técnica la med ición d e CO 2 prod u cid o p or microorganismos
d urante la incu bación d e su elo en u n sistema cerrad o y a d eterm inad as
cond iciones, se cuantifica por crom atografía d e gases con u n d etector d e
cond u ctivid ad térm ica.
Fundamento
Este método es aplicable para med ir el CO 2 prod ucid o por el metabolis-
mo aerobio y/ o anaerobio d e microorganismos presentes en muestras d e
suelo incubadas en sistemas cerrad os, med iante cromatografía d e gases.
De la atmósfera de los sistemas se toma una muestra con una jeringa que
acarread os con el helio (gas inerte), los cuales son d etectados con un sis-
tema d e conductivid ad térmica. Los detectores de cond uctividad térmica
(DCT) para CG consisten en un filamento calentad o térmicamente o ter-
mistor. La temperatura d el elemento sensible d epende d e la cond uctivi-
dad térmica del gas que se pasa sobre éste. Los cambios en conductividad
térmica, que ocurren cuando las moléculas d esplazan el gas acarread or,
causan un incremento d e temperatura, el cual es d etectado como un cam-
bio d e resistencia.
El DCT es capaz d e d etectar concentraciones d esd e 100% y bajas hasta

100 mg kg -1. Sin embargo, los límites d e d etección d e este m étod o van
d e 0.1 a 15% d e CO 2 p rod ucid o en el sistem a.
Interferencias
Si en la atm ósfera d e los sistem as por monitorear CO 2 hay evaporación
d e agua, ésta p ued e cap turarse ju nto con la mu estra e introd ucirse al
crom atógrafo, lo que p rod uce problemas d e contaminación en el equ i-
po y lectu ras erróneas.
La p resencia d e carbonatos en los sistemas es una fu ente potencial abió-

tica d e CO 2. Fu gas en el sistem a p or m onitorear pu ed en prod u cir pér-
d id as d e CO 2.
Material y equipo
Botellas serológicas d e 125 ml.
Tapones d e hule para botellas serológicas.
Sellos d e alu minio para los tapones d e hu le.
Jeringa p ara gases d e 5 ml.
Cromatógrafo d e gases con d etector d e cond u ctivid ad térm ica.
Reactivos
1) H elio grad o cromatográfico d e alta p ureza.
Procedimiento
1) Sistema d e d egrad ación: colocar una muestra d e suelo en un recipien-
te (botella serológica) sellad o con u n tapón d e hule y arillo d e aluminio
establecidas. Las cond iciones d epend erán d el sistema d e monitoreo d el

su elo qu e se desee evaluar.
Nota: La m ed ición d e CO 2 p rod u cid o tam bién se p ued e realizar en sistem as

abiertos con flu jo d e aire constante, m onitoreand o en línea (conectand o d irecta-
m ente al crom atógrafo).
2) A través d el tap ón d e hule introd u cir la jeringa para obtener la m ues-

tra d e gas.
3) Tomar con la jeringa d e 0.5 a 2.0 m l d e mu estra d e la atmósfera d e los
sistem as p or m onitorear.
Nota: El volu m en d e m u estra d epend erá d el tipo d e sistem a que se tenga, m ien-
tras m ás activid ad m icrobiana presente el sistem a (su elo) m enor será el volu m en
d e m uestra gaseosa qu e se requiera; por el contrario, m ientras m enor activid ad
m icrobiana se observe, m ayor será el volum en necesario d e m u estra gaseosa
p ara la cu antificación d e CO 2 p rod ucid o.
4) Antes d e inyectar la m uestra gaseosa, el crom atógrafo d e gases d ebe

estar a las cond iciones señalad as en la tabla 6.5.
Tab la 6.5 Con d icion es d e op eración d el crom atógrafo d e gases.
Condición
Columna CTR 1 Temperatura ambiente (25 oC)
Inyector 40oC
Detector 100 oC
Gas acarreador: helio Flujo de 55 ml/min
Corriente 125 mAmp
Tiempo de corrida 5 min
5) Inyectar el volumen total d e la mu estra d e gas tom ad a en la jeringa

en el crom atógrafo d e gases.
primer pico qu e sale es d e inyección, el segu nd o correspond e a CO 2,

el tercero a O 2, el cu arto a N 2 y el qu into a CH 4 (Fig. 6.3). Cu and o se
hace la integración d e los d atos, elim inar el p rimer p ico d e d icha inte-
gración, p orque el resu ltad o d el área d e cad a p ico se tom a en p orcen-
taje. Tom ar la lectu ra d el área d el p ico d e CO 2 en porcentaje.
7) Una vez tomad as las áreas d e los picos en porcentaje, se p roced e a
calcu lar la concentración d e CO 2 p resente en los sistemas, u tilizand o
la ecuación d e los gases:
Figu ra 6.3 Crom atogram a d on d e se m u estran los gases q u e p u ed en ser cu an tificad os

p or CG -D CT.
Cálculos
Para calcu lar la concentración d e CO 2 se emp lea la ecuación d e los gases
id eales:
PV = nRT.
Despejand o n = PV / RT.
El resu ltad o en mol CO 2 / g d e su elo seco o material seco en el sistema,

se calcu la d e la sigu ente form a:
P V * (%CO 2/ 100))
Dond e:
%CO 2 = área d el pico d e CO 2 en porcentaje.
P = presión atm osférica (atm ).
V = volu men d e la atmósfera d e los sistem as a med ir (L).
R = constante d e los gases (0.082205 L * atm / mol * K).
T = temp eratu ra d el sistema (° K).
g s.s. = gramos d e su elo seco.
La gráfica d e CO 2 vs el tiemp o d eberá construirse d e form a acum ulati-

va (sum and o las p rod u cciones d e CO 2).
Nota: Con este m ism o m étod o o cu antificación se p u ed e d eterm inar al m ism o

tiem p o el O 2 y N 2 d el sistem a. Esto p erm ite conocer la cantid ad d e oxígeno
consu m id o en los sistem as, d ato qu e se u tiliza p ara calcu lar su coeficiente res-
p iratorio (QR). Este p arám etro biológico d eterm ina la activid ad biológica
(estad o fisiológico) qu e ocu rre en u n sistem a y refleja la relación entre el CO 2
p rod u cid o y el O 2 consu m id o.
QR = moles CO 2 p rod u cid o / m oles O 2 consum id o.
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7. An álisis toxicológicos
d e m u estras d e su elos
a toxicid ad es el grad o de efectivid ad d e u na sustancia tóxica en

L hum anos, animales, plantas o microorganismos. Este efecto ad verso
pued e tomar varias formas, com o enfermedad , d eformid ad , mod ifica-
ciones d el comp ortamiento, cambios en la reprodu cción, daño genético
o m uerte.
La toxicidad se evalúa mediante bioensayos que consisten en exponer

organismos vivos (algas, bacterias, vegetales y fauna en general) a sustan-
cias tóxicas a d iferentes concentraciones y registrar los efectos sobre los
mismos. Finalmente, se determina para cada concentración el número d e
organismos afectados, dato con el que se pueden establecer varios pará-
metros:
CL50 (Concentración letal media). Concentración d e tóxico qu e m ata 50%

d e los organism os ensayad os.
CE50 (concentración efectiva media). Concentración d e tóxico qu e p rod uce

50% d el efecto tom ad o como ind icad or d e toxicid ad .
Concentración inhibitoria. Concentración d e tóxico qu e inhibe un proceso

biológico, tal como la reprod u cción en u n d eterminad o porcentaje.
NOEC (No observed effect concentratio, concentración a la que ningún efecto

es observado). Máxim a concentración d e tóxico p ara la cu al no se obser-
van efectos sobre los organismos ensayad os.
LOEC (Low observed effect concentration, concentración más baja en la que un

Para tod os los p arám etros d efinid os anteriorm ente, cu anto m enor sea
el valor d e CL50 para u n d eterminad o p rod u cto, más elevad a será su
toxicid ad .
Conocer los efectos fitotóxicos qu e p rovoca u n com pu esto perm ite valo-
rar y d eterm inar los factores de riesgo asociados a su exposición, así
como el grado de tolerancia o sensibilid ad d e la planta examinada.
En conjunto, esto puede aportar mayor certeza, aunque no contund ente,
para vislumbrar el impacto ambiental y pod er tam bién atribu ir a una
esp ecie el pap el d e bioind icad or am biental para u n contam inante o con-
junto d e ellos.
La fitotoxicid ad d e un contaminante, p or tanto, se evalú a p or med io d el

análisis cu alitativo y cu antitativo d el efecto p rovocad o en u no o más
parám etros fisiológicos qu e se consid eran relevantes o representativos.
En este sentid o, es com ún qu e las pru ebas d e fitotoxicid ad estén orien-
tad as a la valoración d e: 1) la m ortalid ad (toxicid ad agud a), 2) el índ ice
d e germ inación, 3) la elongación rad icular, 4) el crecim iento o prod u c-
ción d e biomasa, 5) el contenid o d e clorofila y 6) la tasa fotosintética,
entre otras.
7.1 Pru eb a d e germ in ación d e sem illas
Introducción
La contaminación d el suelo p or hid rocarburos d el petróleo tiene un
efecto ad verso sobre las com unid ad es vegetales. Despu és d e u n d erra-
me, los hid rocarburos d el p etróleo d e bajo pu nto d e ebullición exhiben
alto grad o d e toxicid ad d e contacto en las porciones frágiles o jóvenes
d e raíces y brotes; sin embargo, tienen poco efecto sobre las partes leño-
sas d e arbu stos y d e árboles (Ad am y Du ncan, 2002).
Una d e las etap as m ás im portantes d el d esarrollo d e una p lanta es la

germ inación d e las sem illas al em erger el p rim er cotiled ón. En la ger-
minación ocu rren cuatro procesos: a) la im bibición o tom a física d e
agu a, b) la form ación d e los sistem as enzim áticos e inicio d e la síntesis
Aná lisis t oxicológicos de muest ra s de suelos 163
La activación de la semilla es inhibida ante la presencia de sustancias

tóxicas, que afectan su germinación. La división celular d e los meriste-
mos radiculares puede afectarse, ya sea por retard o en el proceso d e
mitosis o alteración en el proceso d e alargamiento rad icular, por lo
que la fitotoxicid ad d e un compuesto pued e ser d eterminad a a través d e
la medición d e la germinación d e semillas.
Método
Este métod o es aplicable p ara evaluar la fitotoxicid ad d e hid rocarburos
por la pru eba d e germinación d e semillas (Allium cepa, Glycine max).
El métod o d e referencia u tilizad o p ara este bioensayo d e toxicid ad es el

d e la EPA-Ecological Effects Test Gu id elines. OPPTS 850.4200 (1996),
Seed Germination / Root Elongation Toxicity Test.
El métod o fu e mod ificad o d e la sigu iente form a: el solvente u tilizad o

para el extracto d e hid rocarbu ros fu e d iclorometano y el solvente usa-
d o com o cosolvente, ju nto con el agu a para la exp osición, fu e el d im e-
til su lfóxid o (DMSO) al 0.5%.
Fundamento
En las pruebas d e germinación se observa el efecto que cau sa el tóxico
en la promoción o inhibición d el surgimiento rad icular en la semilla a
d iferentes concentraciones, se registra la frecuencia d el evento y cu an-
d o se ap recia al m enos 50% d e la germinación en el testigo, entonces se
consid era el tiemp o final d e la pru eba y se comp aran los tratamientos.
Material, equipo y reactivos

Diclorom etano grad o H PLC.
Agua d estilad a.
Papel filtro Whatman N o. 1 o 40.
Frascos d e vid rio d e 250 ml.
Cajas d e Petri d e 210 mm.
Papel alum inio.
Parafilm.
Regla o vernier.
Camp ana d e extracción.
Cámara ambiental / incu bad ora.
H igrómetro.
Tim er.
Balanza sem ianalítica.
Material biológico
Semillas certificad as d e Allium cepa, Glycine max.
Soluciones
1) H ip oclorito d e sod io al 5% (cloro). Mezclar 25 m l d e hipoclorito d e
sod io con 475 m l d e agua d estilad a.
2) Dim etil su lfóxid o 0.5%. Prep arar con 2.5 ml d e d imetil sulfóxid o d e
sod io con 475 ml d e agu a d estilad a.
Procedimiento
Esta metod ología requ iere d e algu nas pruebas p reliminares o d e tam iz
con el extracto d e hid rocarburo d el su elo contaminad o. Las pruebas se
d eben realizar por triplicad o para cad a tratamiento y llevand o a cabo el
siguiente proced imiento:
1) Extraer el hid rocarburo d el suelo contaminad o con d iclorometano
med iante el m étod o d e extracción Soxhlet o m étod o d e agitación-cen-
trifugación, d escritos en la sección 5.2.
2) Seleccionar y escarificar (acción d e retirar la cu bierta d e la sem illa) las
sem illas p or utilizar con cloro al 5% d urante 15 minu tos, enjuagar con
agu a d e la llave y al final con agua d estilad a.
3) Colocar d iscos d e p apel filtro Whatman N o. 1 o 40 d e celu losa d en-
tro d e la caja d e Petri d e 110 mm, prop orcionales al d iám etro d e la caja
(aprox. 9 cm).
4) Ad icionar 2 ml d e cad a una d e las d isolu ciones que son preparad as
con d iclorom etano a p artir d el extracto d e hid rocarburo original, en un
intervalo d e por lo menos cinco concentraciones (en serie logarítm ica,
ejem. 0.1, 1.0, 10, 100, 1 000), d istribuyend o d e forma homogénea sobre
papel filtro.
5) Como testigo positivo utilizar una caja de Petri agregando 2 ml de d iclo-
6) Dejar evap orar el d isolvente, d urante 10 minutos, d entro d e la cam-

pana d e extracción.
7) Colocar 10 semillas p or cad a caja d e Petri, d istribuyend o d e tal forma
qu e se permita un ad ecu ad o crecim iento. Se hacen tres réplicas por
tratam iento.
8) Incubar las semillas d entro d e u na cámara am biental controlad a a
temp eratu ra d e 22+2ºC y en total oscu rid ad hasta qu e 65% d e las semi-
llas d el testigo negativo haya germinad o.
9) Agregar 1 ml d e la solución d e DMSO al 0.5 %, p or caja d e Petri cad a
24 o 72 horas segú n se requ iera en fu nción d e la hu med ad d el p apel
filtro, el cual d ebe observarse hú med o.
10) Registrar el núm ero d e semillas germ inad as, siguiend o el criterio d e
germinación con rad ícula m ayor que 5 mm .
11) Posteriormente, realizar las pruebas d efinitivas utilizando un interva-
lo d e concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionan-
do aquellos tratamientos en los que se observe un efecto ad verso, para
insertar entre alguno d e ellos este nuevo intervalo d e concentraciones
(ejemplos:100, 50, 25, 12. 5, 6.25, 3.125%).
12) Elaborar la cu rva d osis-resp uesta d e las d iferentes concentraciones
en un intervalo red u cid o y calcular los valores d e CL50, p or m ed io d el
métod o Probit.
Cálculo de la CL50
La CL50 se calcula utilizando el métod o d e regresión Probit, también
conocid o como método d e unid ad es probabilísticas, que es usado para
evaluar la relación de dosis-respuesta d e un contaminante sobre un orga-
nismo, medid a en términos d e la concentración letal med ia (CL50) y su
precisión o intervalo d e confianza. Se asigna el valor Probit de tablas res-
pecto del porcentaje de mortalid ad obtenid o para cada concentración o
tratamiento, incluyendo los valores d e cad a una d e las réplicas en el
análisis d e regresión. Los valores Probit se p ued en consu ltar en el tra-
bajo d e Finney (1971) sobre el análisis Probit o en libros d e estad ística
en los que se abord en mod elos d e regresión (Rosner, 1990).
Efectuar el análisis d e regresión lineal entre la concentración y la res-

pu esta tóxica, med iante el m étod o m ínimos cuad rad os. Utilizand o los
cad a lote o tratam iento (valor d e Y). Calcu lar el intervalo d e confianza
a 95% p or med io d e la d esviación estánd ar y el valor d e tablas d el esta-
d ístico d e “t” d e Stud ent.
Interpretación de resultados
El resu ltad o es u n valor virtual obtenid o estad ísticamente, en térm inos
d e concentración, ya sea en m g d e H TP kg -1 d e suelo o d e µg d e algún
comp uesto (ejemp lo: H AP); en base seca, este valor se relaciona d e
form a inversa con el potencial d e toxicid ad ; es d ecir, una sustancia es
más tóxica si requiere d e u na menor concentración p ara prod u cir la
letalid ad o algún otro d año su bletal. Para tal efecto se ha establecid o
una clasificación para asignar categorías d e toxicid ad en función d e la
concentración (tabla 7.1).
Tab la. 7.1 Clasificación d e la toxicid ad en fu nción d e la con cen tración .
Categor ías de toxicidad en función Valor

de la concentr ación
Extremadamente tóxico <1 mg kg -1
Altamente tóxico 1 a 50 mg kg -1
Moderadamente tóxico 50 a 500 mg kg -1
Ligeramente tóxico 0.5 a 5 g kg -1
Prácticamente atóxico 5-15 g kg -1
Relativamente i nocuo Más de 15 g kg -1
Este valor se u tiliza d e form a com p arativa con los valores obtenid os
d e otras su stancias o m ezclas y no se m aneja com o u na constante bio-
lógica, esp erand o u na resp u esta p arecid a bajo las m ism as cond iciones
d e p ru eba.
7.2. Pru eb a d e crecim iento d e p lan tas terrestres

y de alargam ien to rad icu lar
Introducción
tad o d e la exposición (por una o varias vías) a una su stancia tóxica o

mezcla d e ellas (Kap ustka, 1998).
Comp arad o con los árboles y arbustos, las plantas herbáceas, especial-
mente los p astos, tienen características d e ráp id o crecim iento, cualid ad
qu e las hace excelentes organism os d e pru eba p ara la evaluación d e los
parám etros biométricos, asimism o pu ed en ser utilizad os como puntos
finales d e respu esta tóxica (ISO 11269-1, 1994).
Método
Este método es aplicable para evaluar la fitotoxicidad d e hidrocarburos
por la prueba de crecimiento en plantas terrestres (principalmente de tipo
herbáceas y hortalizas) y alargamiento rad icular.
Esta pru eba se realiza con la combinación d e los m étod os OECD-208

(1984): Terrestrial p lants, grow th test y US EPA-OPPTS 850.4200 (1996):
Seed germ ination/ root elongation. Toxicity Test.
Fundamento
En algunas plantas los hidrocarburos forman una película hidrofóbica alre-
dedor de la raíz, que impide la entrada de agua; esto provoca un estrés
hídrico que afecta algunas etapas de su crecimiento; además son vulnera-
bles a las sustancias tóxicas con efectos negativos en los parámetros
biométricos ya mencionados. Los efectos adversos en el crecimiento se pue-
den reflejar en la biomasa del tejido vegetal, ya sea del ejemplar completo
o de alguna estructura de interés.
Material, equipo y reactivos

Agrolita.
Diclorom etano.
Agua d estilad a.
Frascos d e vid rio d e 250 ml d e boca ancha.
Lu xómetro.
Tim er.
Parafilm.

H igrómetro.
Balanza analítica.
Material biológico
Semillas certificad as d e Allium cepa y Glycine max.
Soluciones
Son las m ism as qu e las reportad as en la sección 7.1.
Procedimiento
1)Para realizar esta pru eba se d ebe partir d el intervalo d e concentracio-
nes obtenid as d e la p rueba d e toxicid ad agud a (CL50) d e germ inación
d e semillas (ver técnica d escrita en la sección 7.1) y aplicar concentra-
ciones similares o ligeramente p or abajo d e CL50.
2) Seleccionar y escarificar las semillas (acción d e retirar la cu bierta d e
la sem illa) con cloro al 5% (ver técnica d escrita en la sección 7.1),
d urante 15 minu tos; enjuagar con agua d e la llave, 10 minu tos, y al
final con agua d estilad a.
3) Colocar 10 g de material inerte (agrolita) en un frasco de vidrio de 250 ml
y hu med ecer con 30 ml d e agua d estilad a, alcanzand o aproximad a-
mente 40% d e hum ed ad .
4) Adicionar 2 ml d e cada una d e las disoluciones prep aradas d el extrac-
to original preparad o con d iclorometano, en u n intervalo de concen-
traciones amp lio (en serie logarítmica, ejemplo 0.1, 1.0, 10, 100, 1 000),
d istribu yend o d e form a hom ogénea sobre la agrolita en tod a la base
d el frasco.
5) Como testigo positivo utilizar un frasco agregando 2 ml d e d iclorome-
tano o del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negati-
vo ad icionar agua destilad a.
6) Colocar 10 semillas por cad a frasco d e 250 ml, d istribuyend o d e tal
form a que se p ermita un ad ecuad o crecimiento. H acer tres rép licas
por tratamiento.
7) Incubar las semillas d entro d e u na cámara am biental controlad a a
tem peratura d e 22+2ºC y en total oscu rid ad hasta qu e 65% d e las
semillas d el testigo negativo hayan germ inad o.
9) Ad icionar a las plantas d iariam ente 1 m l d e agua d estilad a contenien-

d o d imetil sulfóxid o al 0.5 %.
10) Realizar observación d iaria de las plantas y registrar anomalías (deco-
loración, necrosis de hojas, etcétera).
11) Desp ués d e 14 d ías a p artir d e la germinación se d a por term inad a
la p rueba y se m id en los parámetros d e crecimiento: biomasa, longi-
tud d e tallo y raíz. Para d eterminar el p eso d e la biomasa en peso seco,
se d ebe secar el tejid o en una estu fa a 70°C p or 24 horas y efectu ar el
pesad o en una balanza analítica.
12) De ser necesario, realizar las pru ebas d efinitivas en un intervalo d e
concentraciones más red ucid o.
13) Elaborar la cu rva d osis-resp uesta d e las d iferentes concentraciones
en u n intervalo red u cid o y calcular los valores d e CE50 (concentración
efectiva med ia), p or el métod o Probit.
Cálculo de la CE50
Se utiliza el m étod o Probit, tam bién conocid o como m étod o d e unid a-
d es p robabilísticas, qu e es usad o para evaluar la relación d osis-resp ues-
ta d e un contam inante sobre un organismo, med id a en térm inos d e la
concentración efectiva med ia (CE50) y su precisión o intervalo d e con-
fianza.
Efectuar el cálcu lo d e la m ism a m anera qu e para la CL50, d e acu erd o

con la técnica d escrita en la sección 7.1
La interpretación d e resultad os d e la CE50 se maneja en los mismos tér-
minos que la CL50, es un valor virtual obtenid o estadísticamente, en
términos d e concentración, ya sea en m g d e HTP kg -1 d e suelo o d e µg
de algún compuesto (ejemplo: H AP); en base seca, este valor se relacio-
na d e forma inversa con el potencial d e toxicid ad, es decir una sustancia
es m ás tóxica si requiere d e una menor concentración para prod ucir la
letalid ad o algún otro d año subletal.
No se m anejan valores d e referencia por no ser una constante biológica

y sólo se pu ed e interpretar en términos d e comparación. Es d e gran valía
pend iente de la recta se pu ed e estim ar el margen de segu rid ad para el

tóxico o contaminante en cuestión.
7.3 Prueb a de toxicidad agu d a con lom b riz d e tierra

(Eisenia foet ida)
Introducción
La contaminación d el suelo p or hid rocarburos d el petróleo tiene un
efecto ad verso sobre las comu nid ad es d e invertebrad os d el suelo, com o
las lombrices d e tierra, nemátod os, otros p oliquetos y microartróp od os.
En p articular la lom briz d e tierra ha sid o u tilizad a en estud ios en d ond e
se evalú a la sobrevivencia, crecimiento y reprod u cción.
Estos organismos son cosmop olitas en ambientes en d ond e se provee

suficiente hu med ad y ad ecuad a tem peratura, son vu lnerables a la ma-
yoría d e los factores que afectan este m icroecosistema, esp ecialmente
aqu ellos asociad os con la aplicación d e químicos agrícolas y resid u os
d isp uestos inad ecu ad amente (ISO 11268-1, 1993).
Método
Este métod o es ap licable p ara evaluar la toxicid ad agu d a d e hid rocar-
bu ros en la lom briz d e tierra (Eisenia foetida).
El bioensayo se realiza aplicand o los métod os EPA 712-C-96-167-1996:

Earthw orm su bchronic toxicity test, y OECD-207-1984: Earthw orm acute
toxicity test.
Fundamento
La exposición de estos organismos a suelos y sedimentos contaminad os
produce el contacto directo con su epidermis, lo que ocasiona un daño
dérmico o la absorción de tóxicos por esta vía, al grado de provocar la
muerte. La mortalidad en estos organismos es d eterminada por la falta de
movimiento en respuesta a estímulos táctiles definidos en su porción final.
Otro aspecto con el que se determina la condición de muerte es la tenden-
cia a la desintegración rápida, queda como remanente del organismo una
mancha amarillenta. Los síntomas patológicos previos son las lesiones
Materiales, equipo y reactivos

Papel filtro Whatman N o. 1 o 40.
Diclorom etano grad o H PLC.
Agua d estilad a.
Frascos d e vid rio d e 250 ml.
Cajas d e Petri d e 210 mm.
Balanza analítica.
Papel alum inio.
Parafilm.
Micropipetas (10-1 000 µl).
Pipetas serológicas d e 1, 5 y 10 m l.
Regla o vernier.
H igrómetro.
Material biológico
Organism os ad u ltos d e la lombriz d e tierra Eisenia foetida.
Soluciones
Ver técnica d escrita en la sección 7.1.
Procedimiento
Realizar p ruebas p reliminares o d e tamiz con el extracto d el su elo con-
tam inad o com o se ind ica a continu ación:
1) Colocar discos de papel filtro Whatman números 1 o 40 d e celulosa den-
tro d e cajas de Petri proporcionales al diámetro de la caja d e 210 mm d e
d iám etro.
2) Colocar u n control positivo agregand o 1 ml d e d iclorometano grad o
H PLC en u na caja d e Petri. Y u n control negativo en el qu e se ad icio-
na agu a d estilad a en otra caja d e Petri (ASTM E1976, 1997).
3) Ad icionar 2 ml de cada una d e las d isoluciones qu e son p reparad as
con diclorometano, a partir d el extracto original, en u n intervalo d e
por lo menos cinco concentraciones en serie logarítm ica, (ejem. 0.1, 1.0,
10, 100, 1 000), d istribuyend o d e forma homogénea sobre papel filtro.
5) Posteriormente agregar en la caja d e Petri 1 ml d e agua d estilad a y 0.5

d e d imetil su lfóxid o al 0.5%, como vehículo p ara d isolver el tóxico
ad ecuad am ente para el organismo.
6) Colocar cinco lombrices en cad a caja, los organismos d eben estar pre-
viamente pesad os y aclimatad os por 24 horas, las cajas se incuban en
la oscu rid ad a 22± 2°C y hu med ad relativa 50±5 %.
Nota: La esp ecie Eisenia foetida que se selecciona para la prueba d ebe perm anecer
d entro d el rango d e 300-450 m g y d ebe tener m ás d e seis sem anas d e ed ad .
7) Registrar los cam bios morfológicos observad os, así como la mortali-
d ad d espués d e siete d ías (consid erand o como mu erto al organism o
que no respond a a ningú n estím ulo m ecánico).
8) Ad icionar 0.5 m l d e agu a d estilad a conteniend o DMSO al 0.5%, cad a
48 horas, p ara evitar la d esecación d el organismo.
9) Realizar las p ru ebas d efinitivas u tilizand o un intervalo d e concentra-
ciones más red u cid o (en serie geométrica), seleccionand o aqu ellos
tratamientos en los qu e se observe u n efecto ad verso, p ara insertar
entre alguno d e ellos este nu evo intervalo d e concentraciones (ejem-
plo: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125%).
10) Elaborar la cu rva d osis-respuesta d e las d iferentes concentraciones
en un intervalo red u cid o y calcu lar los valores d e CL50, p or med io d el
métod o Probit.
Cálculo de la CL50
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toxicity test. Ecological effects test guid elines. Washington DC.
Anexo
Comparación de la eficiencia de extracción de hidrocarburos:

Métodos Soxhlet / agitación-centrifugación
Debid o a que los hid rocarburos que se encu entran en u na m atriz tan
comp leja como el suelo no siemp re pu ed en ser rem ovid os fácilmente
d urante los p rocesos d e extracción, es necesario evalu ar su eficiencia d e
extracción, p ara lo cual se usa generalm ente un estánd ar interno.
Con base en el nú mero d e extracciones su cesivas qu e se realizan d u ran-

te el proceso d e extracción Soxhlet (sección 5.2.1), se pu ed e consid erar
como u no d e los métod os d e extracción con mayor eficiencia d e recup e-
ración. Sin embargo, al u tilizar este m étod o se restringe el núm ero d e
mu estras que se p ued en analizar, tom and o en cu enta el tiem po d e aná-
lisis, el nú mero d e plazas d isp onibles por equ ip o ad emás d e la cantid ad
d e d isolvente p or u tilizar. Por lo anterior, es im portante analizar otro
tipo d e extracciones basad o en los p osibles equilibrios d e partición qu e
se pu ed en establecer al agitar una mu estra d e su elo finam ente d ivid id a
en u n d isolvente con alta turbulencia, como es el m étod o d e extracción
agitación-centrifugación propu esto en la sección 5.2.2.
Se comp aró la eficiencia d e extracción d e los d os métod os señalad os:

Soxhlet y agitación-centrifu gación, u tilizand o como estánd ar interno
2-fluorobifenilo, d e acu erd o con el sigu iente p roced im iento.
Para evalu ar la eficiencia d e extracción por el métod o Soxhlet se traba-

jó con 5 g d e u na muestra d e suelo sin contaminar, secad a previamente
y hom ogeneizad a, a la cu al se le ad icionaron 158 µL d e un estánd ar d e
2-fluorobifenilo con u na concentración d e 2 000 m g kg -1, alcanzand o
una concentración d e 63 mg kg -1.
previamente y homogeneizada, se le ad icionaron 63 µL d el estánd ar d e

2-fluorobifenilo con u na concentración d e 2 000 mg kg -1. Alcanzand o la
misma concentración que en el caso anterior (63 mg kg -1).
Para cad a caso se proced ió a realizar la m etod ología d escrita en las

secciones 5.2.1 y 5.2.2.
Se realizó un análisis cuantitativo de hidrocarburos en suelo por cromato-

grafía de gases (sección 5.4.3) y espectroscopia de infrarrojo (sección 5.4.2).
Los resultad os se p resentan en la tabla A1, d ond e se observa qu e la efi-

ciencia d e extracción d el estánd ar 2-flu orobifenilo ad icionad o al suelo,
aun cu and o no alcanza 100% d e recup eración, p ara el m étod o Soxhlet
es d e 88.6% mientras que para el métod o d e agitación-centrifugación es
d e 87.87%.
Tab la A1 Eficien cia d e extracción d el están d ar 2-flu orob ifen ilo.
Extr acción Suelo sin Suelo con Estándar Eficiencia de

estándar estándar en el extracción
(mg kg -1 ) (mg kg -1 ) extracto (% )
(mg kg -1 )
Soxhlet 0 63.0 55.82 88.60
Agitación
centrifugación 0 63.0 54.92 87.87
Con los resu ltad os obtenid os se pu ed e conclu ir que el métod o d e agita-

ción-centrifu gación p ued e utilizarse al igu al qu e el m étod o Soxhlet, con
la ventaja d e manejar un mayor núm ero d e mu estras, en menor tiemp o
y utilizand o una menor cantid ad d e d isolvente.
También se comp araron los métod os d e cuantificación d e hid rocarbu-

ros: espectroscopia infrarroja y crom atografía d e gases-FID. En la tabla
A2 se mu estran los resultad os corresp ond ientes al prom ed io d e cinco
extractos d e u n suelo contaminad o con hid rocarburos obtenid os por
Anexo 177
Tabla A2 Com p aración de las con cen traciones prom ed io obtenid as para el su elo conta-
m in ado.
Tipo de extracción Concentración promedio mg kg -1 de suelo seco

CG-FID E IR
Extracción Soxhlet 141 438 ± 40 948 110 336 ± 59 458
Extracción agitación - 140 909 ± 23 667 139 521 ± 32 841

centrifugación
La concentración de hidrocarburos promed io de los cinco extractos d el

suelo obtenidos por el método d e extracción Soxhlet cuantificad a por CG-
FID fue 141 438 ± 40 948 y por espectroscopia infrarroja 110 336 ± 59 458,
mientras qu e p or el métod o d e extracción agitación-centrifu gación
cu antificad a por CG-FID fu e 140 909 ± 23 667 y p or esp ectroscop ia infra-
rroja 139 521 ± 32 841 (tabla A2). Es imp ortante d estacar que la concen-
tración obtenid a p or el m étod o d e agitación-centrifu gación ad emás d e
ser m uy similar a la obtenid a por extracción Soxhlet, presenta u na d es-
viación estánd ar menor. Se d ebe señalar qu e el m étod o d e cuantifica-
ción p or esp ectroscop ia infrarroja p resentó una d esviación estánd ar
más elevad a que la obtenid a por el métod o d e CG-FID.
La eficiencia d e extracción d el métod o agitación-centrifugación cu anti-

ficad a por crom atografía d e gases es d e 99.63%. Lo qu e ind ica que este
métod o es excelente, ya qu e nos red u ce el gasto en solventes, así como
el tiem po d e extracción, p ermitiend o el m anejo d e más mu estras.
Siglas y abreviatu ras
APH A American Pu blic H ealth Association

API Analytical Profile Ind ex
ARN Ácid o ribonu cleico
ASTM American Society for Testing and Materials
CE Concentración d el extracto (F)
CE50 Concentración efectiva 50
CG Crom atografía d e gases
CG/ EM Crom atografía d e gases acoplad a a la esp ectrometría d e
masas
CG/ FID Crom atografía d e gases/ d etector d e ionización d e flam a
CIA Analizad or Capilar d e Iones
CIC Cap acid ad d e intercam bio catiónico
CL50 Concentración letal 50
CO Carbono orgánico
COT Carbono orgánico total
CS Concentración d e Fe en su elo
DCT Detectores d e cond uctivid ad térmica
DMSO Dimetil sulfóxid o
DOF Diario Oficial
E m ed id o Potencial red ox m ed id o en milivolts (F)
E ref Potencial red ox d e referencia (F)
Eh Potencial relativo al electrod o d e hid rógeno (m V) (F)
EIC Electroforesis ión cap ilar
EIR Esp ectroscopia d e infrarroja
EPA Environm ental Protection Agency
FD Factor d e d ilución (F)
FDA Food and Dru g Ad ministration
FH Factor d e corrección d e hu med ad (F)
FID Detector d e ionización d e flam a
H PLC Crom atografía d e Líquid os d e Alta Resolu ción

H TPs H id rocarburos totales d el p etróleo
IN IA Institu to N acional d e Investigaciones Agrícolas
ISO International Organization for Stand ard ization
LOEC Low observed effect concentration
m.o. Materia orgánica
N ACE N ational Association of Corrosion Engineers
N MP N ú mero m ás p robable
N OEC N o observed effect concentration
N RES N atural Resou rces and Environm ental Sciences
OSWER Office of Solid Waste and Emergency Response
PDA Papa-d extrosa-agar
Profep a Procu rad uría Fed eral d e Protección al Ambiente
SARH Secretaría d e Agricultura y Recursos H id ráu licos
SCD Detector d e qu imiolu miniscencia
Semarnat Secretaría d e Med io Am biente y Recu rsos N aturales
SI Sistema Internacional d e Unid ad es
UFC Unid ad es form ad oras d e colonias
US EPA U. S. Environmental Protection Agency
US GS U. S. Geological Su rvey
Manual de técnicas de an álisis de suelos aplicadas
a la remediación de sitios contaminados se term in ó d e im p rim ir
d u r an te el m es d e octu br e d e 2006 en los taller es gráficos
d e la em p r esa Ed itor ial d el Dep orte M exican o,
Van Dy ck 105, col. San ta Mar ía N on oalco, Mixcoac, M éxico, D.F.
Par a su com p osición se u saron los t ip os
Ar ial, Book An tiqu a, Er as, Fu tu r a y Sy m bol
Se tir ar on 500 ejem p lar es

m ás sobr an tes p ar a r ep osición .

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1.

l presente manual fue elaborado con la finalid ad de compilar algunas

El contenido se encuentra dividid o en cuatro secciones: 1) Pruebas físicas

Cad a u na de esas secciones contiene una breve introd ucción, fu ndamen-

n México, las activid ad es ind ustriales han p rovocad o serios d años

El suelo es u n cuerpo natural qu e conforma el hábitat d e bacterias, hon-

Para elegir la tecnología ad ecu ad a es necesario consid erar u na serie

d e ser ú til p ara tom ar acciones p ertinentes en el m ejoram iento d e

En este manu al se recopilan técnicas p ara d eterminar los p rincipales

as mu estras d e suelo por analizar d eben ser recolectad as d el sitio

Para tom ar u na m u estra rep resentativa d e suelos d e u n sitio contam i-

Para lo cual se deben d eterminar las características mínimas d el sitio que

Como p arte d e la experiencia ad qu irid a en 10 años d e trabajo, se han

Con base en esta información se seleccionan los mejores puntos de mues-

calibrar el instrumento y luego comparar, ya sea el potencial eléctrico o

Fu ertemente ácid o < 5.0

Aunque es recomend able d eterminar la hu med ad a la capacidad d e

% H u med ad d el su elo = (Peso inicial – Peso final)/ Peso inicial * 100

4.3 Con du ctivid ad eléctrica

tivid ad eléctrica es por lo tanto u na form a ind irecta d e m ed ir la salini-

De acu erd o con los valores d e cond u ctivid ad eléctrica, p H y p orcentaje

a) Suelos salinos. Se caracterizan p orqu e su extracto d e satu ración tiene

b) Suelos sód icos. Presentan u n color negro d ebid o a su contenid o ele-

c) Suelos salino-sódicos. Poseen una conductividad eléctrica de 4 mmhos/ cm

La cond u ctivid ad eléctrica se pu ed e com plem entar con la d etermina-

p u ed e ser su m ergid o en el líqu id o p or m ed ir. La resisten cia eléctrica

B. Obtención del extracto del suelo.

C. Determinación de la conductividad eléctrica.

Sol. están d ar d e KCl Con d u ctivid ad eléctrica a 25º C

Cuando no se sabe la cond uctividad de la muestra se recomienda calibrar

2) Leer la cond uctivid ad eléctrica y la temp eratu ra d el extracto. Si la lec-

Tab la 4.3 Factores d e corrección d e la con du ctivid ad eléctrica en fu n ción d e la tem p e-

Temp eratu ra Factor d e Tem p eratu ra Factor d e

Para convertir la cond uctivid ad eléctrica en unid ades d e salinid ad (tabla

En la tabla 4.4 se mu estran los criterios para evaluar la salinid ad d e un

Categoría d el su elo Valor (m mh os/cm o d S/m )

4.4 Carb on o orgán ico total

El carbono orgánico es uno de los principales componentes d e los seres

La m.o. del suelo es la fracción orgánica que incluye residuos vegetales y

El límite d e d etección d e la técnica va d e 0 a 25 mg d e C. Consid erand o

1) Pesar suelo seco (0.1 a 0.3g) d entro d e u na cápsu la d e p orcelana.

d e contar con un softw are p ara la integración d e los d atos se d ebe

Curva patrón. Se realiza con biftalato de potasio (C6H 4(COOK)) en un

Biftalato d e p otasio (m g) m g C con ten id os en b iftalato

Calcular la concentración final d e COT d e la m uestra d e su elo m ed ian-

COT (mg / kg d e su elo seco) = CO (m g) * 1 000 / P * FH

COT = carbono orgánico total (mg / kg d e suelo seco).

A partir del contenid o total d e carbono orgánico se pued e estimar el con-

M ateria orgán ica (%)

Mu y bajo < 4.0 < 0.5

4.5 Fósforo solu b le

comp uestos orgánicos y princip alm ente minerales qu e contienen fósfo-

El P es un macronutrim ento esencial para las plantas y los microorga-

El límite d e d etección d e la técnica va d e 1 a 10 ppm d e P y en caso d e

fluoru ro d e am onio, d isolver en agua d estilad a y aforar a 1 L. Gu ard ar

6) Solución de molibdato de amonio-ácido clorhídrico: Pesar 15 g de molib-

7) Cad a vez que se lea u n lote d e mu estras realizar un blanco d e la

Curva patrón. Colocar 1 m l d e cad a u na d e las d ilu ciones (p pm ) d e la

Con cen tración (p p m) m l d e solu ción tip o d e fosfatos

En la tabla 4.8 se mu estran valores d e fósforo que d eterm inan la calid ad

Tab la 4.8 Criterios p ara d eterm in ar la calid ad d e u n su elo en cu an to a su con ten id o

Categoría Valor (m g k g-1)

Bajo < 5.5