2.

8 Tahapan Kloning Gen

2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan

Sintesis dan amplifikasi DNA sisipan yang akan diklon kan menggunakan teknik PCR
(Polymerase Chain Reaction), Prosedur ini digunakan untuk proses amplifikasi enzimatik secara
invitro dari DNA sisipan dengan cara mensintesis DNA tersebut sehingga menghasilkan jumlah
salinan dari fragmen DNA dengan jumlah banyak dan spesifik (Ausubel et al, 1995). Proses PCR
dibutuhkan sampel DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan (template) dan reagen-reagen seperti
Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O juga primer forward dan reverse (Huang et al.,
2006).

Reaksi amplifikasi suatu fragmen DNA diawali dengan denaturasi DNA cetakan sehingga yang
awalnya DNA dalam bentuk untai ganda (double stranded) akan mengalami denaturasi menjadi untai
tunggal (single stranded). Berikutnya adalah proses annealing pada suhu sekitar 55 °C. Primer akan
menempel pada cetakan yang telah terpisah menjadi untai tunggal. Proses dilakukan selama 1-2
menit, kemudian pada proses sintesis DNA, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72 °C selama 90 detik
agar terjadi proses polimerisasi untai DNA yang baru berdasarkan informasi dari DNA cetakan. DNA
untai ganda yang terbentuk selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi
menjadi 95 °C untuk tahap siklus berikutnya (Brown, 2010).

2.8.2 Proses Restriksi DNA Insert dan DNA plasmid

Dalam kloning gen tahap yang paling penting adalah proses restriksi molekul DNA dan vektor
dengan ukuran yang tepat. Tiap vektor harus dipotong pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran
sehingga molekul DNA baru dapat diinsersikan. Fitur yang paling penting dari sebuah enzim restriksi
adalah bahwa enzim restriksi mampu membelah molekul untai ganda DNA pada suatu pasangan
sekuen nukleotida tertentu yang disebut situs restriksi (Russell, 1994).

Enzim restriksi dibagi menjadi 3 tipe yaitu berdasarkan komposisi subunit, posisi
pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan (Sasnauskas, 2006). Ada dua jenis
utama dari enzim restriksi: enzim restriksi tipe I, yang mengenali sekuen tertentu namun memotong
di tempat lain, dan enzim restriksi tipe II, dapat memotong hanya dalam situs pengenalan. enzim tipe
II adalah kelas yang paling penting. enzim restriksi di semua kelas ini membuat dua potongan untai
tunggal, satu potong di masing-masing untai. ada dua pengaturan pemotongan:

(1) potongan di pusat simetri (menghasilkan ujung tumpul) atau

(2) potongan yang simetris, ditempatkan di sekitar garis simetri (menghasilkan ujungujung
kohesif atau ujung lengket) (Freifelder, 1987).

Pada proses kloning gen, enzim restriksi endonuklease yang digunakan umumnya adalah
tipe II karena dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan pola potongan spesifik. Sisi
pengenalan enzim restriksi endonuklease tipe II berupa inverted repeats, yaitu sekuen dapat dibaca
sama dari arah manapun, atau disebut palindrome (Brown, 2010).

2.8.3 Ligasi antara DNA Insert dengan Plasmid

 DNA vektor dan DNA target yang telah dipotong dengan menggunakan enzim restriksi,
kemudian digabungkan untuk membentuk DNA rekombinan (Snustad and Simmons, 2006). Proses
tersebut dinamakan proses ligasi, sebab dilakukan dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA
ligase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5' fosfat dan 3'-hidroksil terminal
dalam DNA dupleks (Ausubel et al, 1995). Nama enzim biasanya yang di gunakan adalah T4 ligase.

T4 ligase ini adalah nama enzim DNA ligase yang lain yang efisien bergabung ujung tumpul
Terminal di bawah kondisi reaksi normal. Ligasi ujung lengket yang pada umumnya dilakukan pada
suhu 12oC sampai 15oC, sedangkan ligasi ujung tumpul biasanya dilakukan pada suhu kamar ( 150
mM. (Ausubel et al, 1995)

2.8.4 Transformasi DNA Rekombinan

Transformasi DNA rekombinan adalah proses transfer DNA plasmid rekombinan ke dalam sel
inang (Mulis, 1990). Syarat utama dalam transformasi DNA rekombinan adalah sel inang harus dibuat
kompeten terlebih dahulu. Sel kompeten tersebut yang kemudian dicampur dengan plasmid
rekombinan untuk proses transformasi ke dalam sel inang, proses ini yang disebut elektroporasi yaitu
mendorong DNA ke dalam sel dengan dialiri arus listrik (Mulis, 1990). Elektroporasi merupakan
metode transformasi paling cepat, mudah dan efisien. Efisiensi transformasi diperoleh dapat
mencapai 1010 transforman/µg DNA (Sambrook, 1989).

Metode transformasi dilakukan dengan kejutan panas (heat shock) yang diawali dengan
pemberian CaCl2 untuk menghasilkan sel bakteri yang kompeten, molekul DNA, misalnya plasmid,
dimasukkan ke dalam sel kemudian akan bereplikasi di dalam sel. Sel kemudian diinkubasi dalam
medium pertumbuhan non-selektif untuk memulihkan kondisi sel (membran sel kembali utuh). Sel
bakteri yang umum digunakan dalam proses transformasi DNA rekombinan adalah Escherichia coli
(Sambrook &Russell, 2001).

2.8.5 Sekuensing DNA

Sekuensing DNA adalaah suatu metode yang digunakan untuk membaca urutan basa
nukleotida yang terdapat dalam suatu molekul gen. dalam dunia kedokteran manfaat dari sekuensing
DNA adalah dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan
pengobatan penyakit genetik. Dalam sekuensing DNA terdapat dua metode yang sering digunakan,
yaitu metode secara enzimatik oleh Fredrick Sanger dan metode Metode kimiawi oleh Maxam -
Gilbert (Brown, 2010; Devor, 2005).

1. Metode kimiawi oleh Maxam - Gilbert Metode yang dikembangkan adalah untuk
sekuensing DNA untai tunggal dengan mengambil keuntungan dari proses dua langkah katalitik yang
melibatkan Piperidina dan dua bahan kimia yang selektif menyerang purin dan pirimidin (Devon,
2005). Selain itu sulfat, dimetil dan piperidina secara selektif akan membelah nukleotida guanin
namun dimetil sulfat dan Piperidina di asam formiat akan membelah baik nukleotida guanin maupun
adenin. Fragmen DNA untai ganda yang akan ditentukan urutannya mulamula dilabel menggunakan
gugus fosfor radioaktif pada ujung 5’ tiap untai. reaksi-reaksi akan di muat pada gel poliakrilamida
dengan persentase tinggi dan fragmen diselesaikan oleh elektroforesis. 2. Metode enzimatik oleh
Frederick Sanger Rantai pemutusan sekuensing DNA yang didasarkan pada prinsip bahwa molekul
DNA untai tunggal yang berbeda panjang dengan hanya satu nukleotida tunggal dapat dipisahkan
dari satu lain oleh elektroforesis gel poliakrilamida. Bahan awal untuk percobaan sekuensing
terminasi rantai merupakan persiapan molekul DNA untai tunggal yang identik. Langkah pertama
adalah untuk penempelan oligonukleotida pendek ke posisi yang sama pada setiap molekul. Langkah
kedua adalah sintesis untai reaksi, yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase dan membutuhkan
empat trifosfat deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) sebagai substrat. (Brown, 2010).
Untuk mengetahui urutan DNA hasil analisis, adalah mengidentifikasi dideoksinukleotida diakhir
setiap rantai molekulterminasi.

DAFTAR PUSTAKA

Ahsan, M. M., Kimura, T., Karita, S., Sakka, K., and Ohmiya, K. 1996. Cloning, DNA
Sequencing, and Expression of the Gene Encoding Clostridium thermocellum Cellulase CelJ, the
Largest Catalytic Component of the Cellulosome. Journal of Bacteriology 178, p. 5732-5740.

An Yingfeng, Wu, W,. Lv, A., 2010 A PCR-after-ligation method for cloning of multiple DNA
inserts. Analytical Biochemistry 402, p. 203–205

Ausubel, Frederick, M., Brent, Roger., Kingston, Robert, E,. Moore, David, D,. Seidman, J, G,.
Smith, John, A,. and Struhl, Kevin,. 1995, Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, John
Wiley & Sons Inc., Canada.

Brown, T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. 6th Ed., Weley-
Blackwell Publishing, United Kingdom

Canakci, S., Kacagan, M., Inan, K., Belduz, A. O., and Saha, B. C., 2008, Cloning, purification,
and characterization of a thermostable α-Larabinofuranosidase from Anoxybacillus kestanbolensis
AC26Sari, J Appl Microbiol Biotechno, Vol. 81, p. 61-68.

Clowes, R, C., 1972, Molecular Structure of Bacterial Plasmids, Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 36(3):361

Devor, E.J., 2005, IDTutorial: DNA Sequencing, Integrated DNA technologies

Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., and Dveksler, G. S., 1993, General Concepts for PCR primer
Design, Genome Res., Vol. 3, p. S30-S37

Dwijayanthi, I., 2010, Amplifikasi dan Sekuensing Gen Penyandi Endo-1,4-βXilanase Asal
Bacillus subtillis PC-01, Skripsi-S1 UNAIR Surabaya.

Erlich, H, A, 1992, PCR Technology Principles and Aplications for DNA Amplification, W., H.,
Freeman and Company, United States of America, Page 13-14

Freifelder, David, 1987, Molecular Biology: Second Edition, Jones and Bartlett publishers,
Boston.

Gupta, S., Bhushan, B., and Hoondal, G. S. 2000. Isolation, Purification and Characterization
of Xylanase from Staphylococcus sp. SG-13 and its Application in Biobleaching of Kraft Pulp. Journal
of Applied Microbiology 88 (2, February) : 325–334.
Secara umum kloning fragmen DNA mencakup lima langkah strategi kloning :

1. Isolasi
Isolasi dan pemurnian DNA sel sampel
2. Fragmentasi
Fragmentasi dengan menggunakan enzim restriksi yang memisahkan untaian DNA
3. Ligasi
Ligasi untuk meletakkan potongan-potongan DNA dalm sekuens yang di inginkan.
Fragmen DNA dicampukan dengan plasmid yang telah dipotong dengan enzim restriksi
yang sama. DNA ligase ditambahkan untuk mengikat fragmen DNA ke plasmid
4. Transfeksi
Transfeksi untuk menyisipkan potongan baru DNA kedalam sel
5. Seleksi
Skrinning/seleksi: seleksi sel-sel yang berhasil ditransfeksi dengan DNA baru.