Anda di halaman 1dari 12

Kepada Yth :

Rencana Baca :
Waktu/Tempat : Tutorial Imunologi

PEMERIKSAAN PENANDA LIMFOSIT DENGAN METODE


IMMUNOPHENOTYPING
Eko Putri Rahajeng, Asvin Nurulita, Uleng Bahrun
Program Studi Ilmua Patologi Klinik FK UNHAS / RSUP dr. Wahidin Sudirohusodo
Makassar

I. PENDAHULUAN
Semua sel yang berfungsi dalam respon imun diketahui berasal dari sel
induk pluripoten yang kemudian berdiferensiasi melalui dua jalur, yaitu jalur
limfoid yang akan berperan dalam pembentukan limfosit dan jalur mieloid yang
akan berperan dalam pembentukan sel-sel fagosit. Sel-sel imunologi yang utama
adalah limfosit T dan limfosit B, keduanya dapat dibedakan dari fungsi yang
berbeda dan kemampuan dalam mengekspresikan antigen permukaan yang khas
untuk masing-masing jenis sel sehingga ada keterkaitan antara antigen permukaan
dengan stadium diferensiasi (clusters of differentiation antigen/ cluster
designation = CD).1
Cluster of differentiation (CD) adalah molekul permukaan sel yang
bertindak sebagai reseptor atau ligan dan dapat diidentifikasi dengan antibodi
monoklonal spesifik untuk epitop tunggal antigen (molekul) yang terekspresi pada
permukaan sel. Penemuan antibodi monoklonal pada tahun 1980-an membuat
masing-masing subset limfosit dapat dibedakan satu dari yang lain karena
mengekspresikan petanda permukaan (Cluster of differentiation) yang berbeda,
sehingga jumlah setiap sub populasi limfosit dapat diketahui dengan menentukan
proporsi petanda permukaan yang diekspresikan oleh masing-masing sub
populasi.1,2
Cluster of differentiation 45 (CD45) adalah protein tyrosine phosphatase
yang terdapat pada permukaan semua jenis leukosit (sel limfoid maupun mieloid),
Sehingga disebut leucocyte common antigen, tetapi ekspresinya pada setiap sel
berbeda-beda, dengan ekspresi terbesar pada limfosit. CD45 diketahui merupakan
molekul yang mengendalikan rangkaian sinyal intraselular dan memegang
peranan penting pada reseptor sel T. Sel B mengekspresikan CD45 dengan berat

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 1


molekul yang paling besar, sedangan timosit mengekspresikan CD45 dengan berat
molekul terendah. Ekspresi isoform CD45 juga tergantung pada aktifitas dan
stadium diferensiasi. Limfosit T naive mengekspresikan Isoform CD45RA,
sedangkan limfosit sel T memori mengekspresikan CD45RO. CD45 berperan
dalam proses aktivasi limfosit melalui stimulasi aktivitas kinase p56lck.1,3
Cluster of differentiation dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi
sel melalui proses yang dikenal sebagai immunophenotyping, yaitu teknik
mengidentifikasi antigen sel melalui interaksi antara antibodi monoklonal (telah
dilekatkan fluorokrom) yang spesifik terhadap antigen di membran atau
sitoplasma (intra selular) dari sel tertentu. Teknik yang digunakan untuk
imunophenotyping biasanya berupa flow cytometry. Flow cytometry merupakan
teknologi yang secara bersamaan mengukur dan kemudian menganalisis
karakteristik fisik suatu partikel (biasanya sel) saat mengalir dalam cairan melalui
seberkas cahaya, karakteristik partikel yang dianalisis berdasarkan ukuran sel,
struktur intrasel atau granul dan fluoresens.2,4,5
Perkembangan teknologi mutakhir telah memungkinkan identifikasi sel
dengan menggunakan alat otomatis yang disebut flowcytometer dan cell sorting.
Prinsip flow cytometry dan cell sorting (flourescence activated cell sorter, FASC)
adalah, mengabungkan kemampuan alat untuk mengidentifikasi karakteristik
setiap permukaan sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam
suatu suspensi menurut karakteristik masing-masing secara otomatis. Selain itu
FASC juga dapat mengukur densitas antigen yang diekspresikan. 1,4
Pada pemeriksaan CD45 menggunakan flow cytometry dapat melihat
ekspresi antigen pada permukaan seluruh sel leukosit dengan tingkat intensitas
fluoresensi yang berbeda, tetapi CD45 tidak terekspresi pada eritroid atau sel non-
hematologi. Limfosit dapat dengan mudah diidentifikasi dengan intensitas
pewarnaan CD45 yang lebih tinggi dari pada monosit dan granulosit. Perbedaan
dalam intensitas fluoresensi antara sel dan side scatter properties sehingga CD45
dapat menjadi gating parameter untuk mengidentifikasi leukosit dari linage yang
berbeda dan derajat maturasi sel (Gambar 1). 5

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 2


Gambar 1: Plot CD45 berdasarkan lineage dan maturasi sel leukosit
(Sumber : Leach M, Drummond M, Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology
Diagnosis.2013)5

Pada tutorial ini akan diuraikan tentang pemeriksaan sel CD45


menggunakan metode FACS dengan alat Becton Dickinson FACScanto II.
Reagen BD FASC BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 digunakan untuk invitro
diagnostik dalam mengidentifikasi sel yang mengekspresikan antigen
CD3/CD8/CD45/CD4.

II. TUJUAN
Tujuan dari tes ini yaitu untuk mengidentifikasi sel yang mengekspresikan
antigen CD3/CD8/CD45/CD4 dengan metode imunofenotyping menggunakan alat
Becton Dickinson FACScanto II.

III. METODE
A. PRA ANALITIK6
1). Persiapan pasien : Pasien tidak sedang menggunakan obat
imunosupresan.
2). Persiapan sampel :
1. Sampel yang digunakan adalah darah perifer dengan antikoagulan
ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA).

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 3


2. Darah yang mengandung antikoagulan disimpan pada suhu kamar
(20°C – 25°C) dilakukan staining dalam 48 jam setelah pengambilan
dan kemudian dianalisis dalam 24 jam setelah pewarnaan.

3) Alat dan bahan :


1. Alat : a. BD Facscanto II
b. Tabung BD Trucount
c. Tabung vakutainer EDTA
d. Mikropipet & tip
e. Vortex

a b

Gambar 2. Alat yang dibutuhkan


(Sumber : Dokumen Pribadi)

2. Bahan :
a. Reagen yang trersedia dalam kit6
Komposisi reagen dalam kit :
BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 disediakan dalam 1 mL
buffer salin dengan 0.1% sodium azide. BD Multitest mengandung
Antibodi CD3 berlabel FITC, clone SK7; antibodi CD8 berlabel PE,
clone SK1; abtibodi CD45 berlabel PerCP, clone 2D1 (HLe-1); and
antibodi CD4 berlabel APC, clone SK3. Antibodi CD3, CD8, CD45,
and CD4 terdiri dari mouse IgG1 heavy chains and kappa light
chains.

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 4


Nilai konsentrasi antibodi dalam tabel di bawah ini:
Reagen Konsentrasi
CD3 FITC 2.3
CD8 PE 1.75
CD45 PerCP 7.50
CD4 APC 0.92

b. Reagen yang tidak tersedia dalam kit :


1. Reagen lysing solution (100 mL buffer yang mengandung
formaldehida <15% dan dietilen glikol <50%)

B. ANALITIK
a. Prinsip tes
Tabung reagen mengandung antibodi berlabel flourokrom terhadap
molekul yang akan dideteksi. Ketika darah ditambahkan ke dalam reagen,
antibodi berlabel flourokrom dalam reagen mengikat antigen khusus yang ada
dipermukaan sel leukosit (Gambar 3).6

CD 45+, CD 3-

CD 45

CD 45-, CD 3 +

CD 3

Gambar 3. Prisinp Kerja Reagen


(Sumber : Fibriantoi Y, BD FASCanto II)7

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 5


Saat melewati sinar laser flurokrom menyerap sinar dan akan
memancarkan cahaya, cahaya diteruskan melewati suatu filter dan ditangkap
oleh detektor (Gambar 4). Sinyal yang ditangkap (memberikan informasi tentang
ukuran sel, kompleksitas internal, dan intensitas fluoresensi) akan dianalisis oleh
komputer dengan menggunakan software sehingga data dapat divisualisasikan
dalam bentuk histogram maupun dot plot. Setiap sel yang melewati berkas sinar
laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai
karakteristik sel yang bersangkutan (Gambar 5).6,8

Gambar 4. Mekanisme Deteksi Ukuran, Kompleksitas Sel dan Fluoresens Pada FACS
(Sumber : BD FACS Calibur)9

Pemisahan populasi sel yang heterogen menjadi beberapa sub populasi


atas dasar seleksi molekul penanda khusus yang telah terkonjugasi dengan
fluorokrom. Pemisahan didasarkan pada jenis muatan sel. Sel yang memiliki
kesaman dari kriteria yang diinginkan akan diberikan muatan positif dan demikian
sebaliknya. Pemberian muatan listrik pada droplet sel dilakukan sebelum sel
tunggal melewati elektroda tersebut. Sel bermuatan positif akan mengalir ke
chamber negatif, sedangkan sel bermuatan negatif akan mengalir ke chamber
positif sehingga akan menghasilkan tiga sub populasi sel, yaitu sel bermuatan
positif, negatif, dan tidak bermuatan (gambar 5).8

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 6


Gambar 5. Prinsip Kerja FACS
(Sumber : Fibriantoi Y, BD FASCanto II)10

b. Cara kerja
a). Persiapan Sampel6,11
1. Reagen BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 dimasukan 20 μL ke
dalam tabung BD Trucount.
2. Darah yang mengandung antikoagulan EDTA ditambahkan 50 µL
ke dalam tabung BD Trucount yang mengandung reagen BD
Multitest.
3. Tabung ditutup dan vorteks tabung dengan lembut untuk
mencampur.
4. Tabung diinkubasi selama 15 menit dalam ruang gelap pada suhu
kamar (20°C – 25°C).
5. 450 μL larutan BD FACS lysing solution ditambahkan ke dalam
tabung, tutup tabung dan vorteks dengan lembut untuk mencampur.
6. Tabung diinkubasi selama 15 menit dalam ruang gelap pada suhu
kamar (20°C – 25°C).

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 7


7. Sampel dianalisa menggunakan alat Facscanto II menggunakan
sofwer BD FACSC anto II.

Gambar 6. Persiapan Sampel


(Sumber Ruiz P dkk. Productivity and Efficiency of 6-Color BD Multitest and BD
Trucount Technologies for Enumeration of Lymphocyte Subsets)11

b). Analisis Flow Cytometry


1. Jika sampel tidak segera dianalisis setelah persiapan, simpan dalam
ruang gelap pada suhu kamar (20°C – 25°C).
2. Vortex sampel secara menyeluruh (kecepatan rendah) untuk
mengurangi agregasi sebelum sampel diperiksa pada flow
cytometer.

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 8


Gambar 7. Data Representatif Sampel Hematologi Normal Mengunakan
BD Multitest CD3 / CD8 / CD45 / CD4
(Sumber : Insert kit BD Multitest™ )7

C. PASCA ANALITIK
Hasilnya dilaporkan sebagai persentase sel positif per populasi limfosit
atau sebagai jumlah sel positif per mikroliter darah (hitungan absolut).7

Jumlah Normal sel :


CD4% : 31–65%
CD4 absolut : 475–1616 sel /μL
CD8% : 13–42%
CD8 absolut : 209–924 sel/μL

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 9


Persentase atau jumlah dari limfosit CD4 T helper berguna dalam
memantau individu yang terinfeksi human immunodeficiency virus (HIV).
Individu dengan HIV biasanya menunjukkan penurunan stabil jumlah limfosit T
helper yang menandakan progresifitas infeksi sedang berlangsung. Persentase dari
CD8+ meningkat pada banyak pasien dengan defisiensi imun bawaan atau didapat
seperti severe combined immunodeficiency (SCID) atau acquired immune
deficiency syndrome (AIDS).7

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 10


DAFTAR PUSTAKA

1. Kresno, SB. Imuno Diagnostik. Dalam: Imunologi: Diagnosis dan Prosedur


Laboratorium. Edisi kelima. Jakarta:Balai Penerbit Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia. 2010: p50-7, 472-82, 513-4.
2. Lakschevitz F. Identification of CD Marker Expression and Neutrophil
Surface Marker Changes in Health and Diseaseusing High through put
screening flow cytometry. 2006. Available from :
https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/75103/3/Lakschevitz_Flavia
_201611_MSc_thesis.pdf.
3. Tipu HN. Cluster of Differentiation 45: An Adjunct to Flowcytometric
Diagnosis of Leukemias. Iranian Journal Of Blood and Cance. Available
from:
https://www.researchgate.net/publication/273080854_Cluster_of_Differentiat
ion_45_An_Adjunct_to_Flowcytometric_Diagnosis_of_Leukemias.
4. Wohlfahrt A, Hannel L, Oliveira L, Soares P, Silva. The importance of
immunophenotyping by flow cytometry in distinction between hematogones
and B lymphoblasts. 2015. Available from :
http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v51n1/1676-2444-jbpml-51-01-0007.pdf.
5. Becton Dickinson company. Introduction to Flow Cytometry: A Learning
Guide. 2002. Available from: https://www.bu.edu/flow-
cytometry/files/2010/10/BD-Flow-Cytom-Learning-Guide.pdf.
6. Leach M, Drummond M, Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology
Diagnosis. First Edition. 2013. p3-19
7. Insert kit BD Multitest™ CD3/CD8/CD45/CD4. Available from :
www.bdbiosciences.com/ds/europe/tds/23-5351.pdf
8. Puspitasari R, Sardjono C, Sandra F. Fluorescence Activated Cell Sorting
(FACS) dalam Kultur Embryonic Stem Cell. CKD. Vol 38. 2011. Available
from :
http://www.kalbemed.com/Portals/6/07_186Fluorescenceactivatedcell.pdf
9. BD FACScalibur. Available from : http://www.bd.com

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 11


10. Fibrianto Yoni, 2016. Becton Dickinson and Company.
11. Ruiz P, Borowitz MJ, Tilahun H, dkk. Productivity and Efficiency of 6-Color
BD Multitest and BD Trucount Technologies for Enumeration of Lymphocyte
Subsets. 2007. Available from :
https://www.bdbiosciences.com/documents/FACSCanto_II_app_note.pdf
12. Lam L, Hubbard. Laboratory Procedure Manual. 2004. Available from :
https://www.cdc.gov/Nchs/data/nhanes/nhanes_03_04/l03_c_met_CD4%2B_
CD8%2B.pdf.

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 12

Anda mungkin juga menyukai