PRÁCTICA No.

2 Cromatografía en Papel
Análisis Cualitativos de Aminoácidos por cromatografía en papel
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Departamento de Fisicoquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San

Carlos de Guatemala, Carrera de Química Farmacéutica.
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Resumen

Se realizó el análisis cualitativo de aminoácidos por cromatografía en papel. El

objetivo principal de la práctica fue emplear la técnica de cromatografía para separar y
aislar aminoácido al igual que comprender los mecanismos y principios implicados en la
cromatografía de papel , el análisis cualitativo se realizó a partir de la preparación de tres
diferentes fases móviles y la fase estacionaria, se prosiguió con la preparación de la
cámara y el sembrado con 6 tipos de diferentes de aminoácidos con lo cual se logró el
desarrollo cromatográfico. ​Se observó que tanto el pH, como la polaridad de la fase móvil,
se manifiestan en la medición de diferentes Rf para un mismo aminoácido.

Metodología Método

Materiales La cromatografía en papel se

cristalería engloba dentro de las llamadas técnicas de
● cámara cromatográfica de vidrio separación y permite el análisis de mezclas
● capilares complejas de compuestos muy
● Beaker estrechamente relacionados
● probeta químicamente. con una fase móvil
● tubos de ensayo (líquida) y con un soporte ( papel)
● mechero (Meléndez, 2003) . En este caso se utilizó
● Erlenmeyer la cromatografía en papel para el análisis
Reactivos cualitativo de aminoácidos, el cual se llevó
● Agua desmineralizada a cabo con la preparación de la fase móvil
● Aminoácido que estaba formada de ácido acético ,
1. Glutamina agua y n-butanol y una fase estacionaria
2. Serina en la cual se utilizó papel filtro en este se
3. Metionina trazó con un lápiz una recta paralela a una
4. Treonina distancia de 1 cm y sobre ella puntos con
5. Triptófano la misma distancia ,posteriormente se llevó
6. Isoleucina a cabo el sembrado con 6 diferentes tipos
de aminoácidos y se preparó la cámara de
● Ácido acético desarrollo cromatográfico p​ara llevar a
● n-butanol cabo el análisis cualitativo .
Resultados
Cuadro 1 ​Factores de retención de En el cuadro 2 se observa los Rf de
diferentes aminoácidos, con una fase diferentes aminoácidos, en una
móvil de buffer de ácido cítrico. cromatografía en papel, utilizando como
fase móvil un buffer fosfatos a pH 8.
Aminoácido Rf
Cuadro 3 ​Factores de retención de
Glutamina 0.84 diferentes aminoácidos, con una fase
móvil; butanol / ácido acético / agua.
Serina 0.95

Metionina 0.96 Aminoácido Rf

Treonina 0.98
Glutamina 0.47
Triptófano 0.71
Serina 0.49
Isoleucina 0.96
Metionina 0.80
*RF: Factor de retención
Treonina 0.69
Fuente: ​Datos experimentales obtenidos
en el Laboratorio de Análisis Instrumental, Triptófano 0.73
Edificio T-12, USAC.
Isoleucina 0.91
En el cuadro 1 se observa los Rf *RF: Factor de retención
obtenidos de diferentes aminoácidos, por Fuente: ​Datos experimentales obtenidos
medio de una cromatografía en papel, en el Laboratorio de Análisis Instrumental,
utilizando como fase móvil un buffer de Edificio T-12, USAC.
ácido cítrico a pH 5.
En el cuadro 3 se observa los Rf
Cuadro 2 ​Factores de retención de obtenidos de diferentes aminoácidos, por
diferentes aminoácidos, con una fase medio de una cromatografía en papel,
móvil de buffer de fosfatos. utilizando como fase móvil un mezcla de
butanol, ácido acético y agua a un pH 5.
Aminoácido Rf
Discusión de resultados
Glutamina 0.85
Cromatografía es una técnica
Serina 0.94
analítica que permite separar sustancias
Metionina 0.87 químicamente semejantes utilizando su
distinta capacidad de ser arrastradas por
Treonina 0.92
una fase móvil y de ser retenidas por una
Triptófano 0.52 fase estacionaria ​(Stryer, Berg &
tymoczko, 2007). El movimiento relativo
Isoleucina 0.90 de las moléculas a lo largo del sistema
*RF: Factor de retención cromatográfico es el resultado de un
Fuente: ​Datos experimentales obtenidos equilibrio entre las fuerzas de transmisión
en el Laboratorio de Análisis Instrumental, o arrastre ejercido por la fase móvil en su
Edificio T-12, USAC. desplazamiento sobre la fase estacionaria
y las fuerzas que tienden a frenar dicho
desplazamiento. Las fuerzas de frenado
pueden ser tanto de reparto (basado en
criterios de solubilidad) como de
adsorción.(Macarulla & Goñi, 1993)
La separación de los aminoácidos
en una cromatografía dependen del grado
en que estén disociados y que a su vez
esto depende del pH del medio en donde
se encuentren, en este caso de la fase
móvil. Los aminoácidos al encontrarse en
punto isoeléctrico (pI), poseen una carga
neta de cero, es decir que son moléculas
apolares y cuando se van alejado de su pI
se vuelven moléculas cargadas, es decir
que aumenta su polaridad y tendrán
tendencia a desplazarse con la fase móvil,
mientras que lo aminoácidos que sean
polares, ya sean con carga o sin carga,
serán retenidos por la fase estacionaria.
El papel que se utiliza para la
cromatografía está fabricado con celulosa
pura y fibras de celulosa para intercambio
iónico. Este papel permite separaciones
eficientes y rápidas de sustancias
orgánicas o inorgánicas cargadas. La fase
estacionaria es la celulosa del papel y la
móvil fueron varias en esta práctica. La
celulosa retiene una cierta cantidad de
agua entrelazada entre sus fibras y puede
dar lugar a un mecanismo de reparto de
los componentes de una muestra
aplicados sobre ella cuando se hace fluir
un disolvente de polaridad distinta de la
del agua. Según la solubilidad que tengan
los componentes de la muestra respecto
de las dos fases así será su movilidad. El
reparto de los aminoácidos en el papel se
debe a su naturaleza química. (Rivera,
2005).
Se puede observar la fase móvil
del buffer de ácido cítrico en el cuadro 1,
este buffer está a pH 5, es ácido y polar.
El valor Rf es la relación entre la distancia
recorrido por un aminoácidos y la
distancia que viaja el frente del solvente,
medidas ambas desde el punto de
aplicación de la muestra. El aminoácido
que presentó mayor Rf fue la treonina con
0.98, la cual tiene un su cadena lateral un
alcohol, teniendo mayor afinidad por la
fase móvil polar sin carga, seguido muy
de cerca de metionina, isoleucina y serina,
con Rf de 0.96, 0.96, 0.95, la metionina y
la isoleucina en ese pH tuvieron su grupo
carboxilo disociado, por lo que tuvieron
más afinidad a la fase móvil, la glutamina
tuvo un Rf de 0.85. La glutamina, serina
y treonina son aminoácidos con cadenas
laterales polares sin carga, y la metionina
tiene una cadena lateral apolar, la
isoleucina tiene una cadena lateral larga.
El triptófano tuvo el menor Rf de 0.71, al
tener una cadena lateral aromática neutra
y apolar en el pH de la fase móvil, por lo
que tuvo mayor afinidad con la fase
estacionaria.
En el cuadro 2 se utilizó un buffer
de fosfatos el cual presentó un pH de 8,
básico y polar. el orden de mayor a menor
respecto al Rf de los aminoácidos fue de
Serina con 0.94, treonina con 0.92,
isoleucina con 0.90, metionina con 0.87,
glutamina con 0.85, triptófano con 0.52. El
orden cambio respecto al buffer anterior,
por el grado de ionización de cada
aminoácido respecto al pH.
La fase móvil de butanol/ácido
acética/ agua tuvo un pH de 5, acido y
polar, parecido al del buffer de citratos, se
puede observar en el cuadro 3 y en el
anexo 1. El orden por Rf fue de
isoleucina con 0.91, metionina con 0.80,
triptófano con 0.73, treonina con 0. 69,
serina con .49 y glutamina con 0.47. A
pesar de tener el mismo pH que la
primera fase móvil, el orden de elución fue
completamente diferente, por lo que la
polaridad de las diferentes fases móviles
tuvo un efecto mayor que su pH en los
resultados de la cromatografía, como
consecuencia se identificaron diferentes
Rf para un mismo aminoácido a pesar de
tener el mismo pH.
Se observó que fases móviles de
diferentes pH afectan la polaridad de los
aminoácidos y se reflejan en Rf distintos
para un mismo aminoácido. Además se
observó que otro factor que influye es la
polaridad de las fases móviles a pesar de
tener un mismo pH, y este factor también
se manifiesta en la medición de un Rf
distinto, para un mismo aminoácido.
Para permitir la visualización de
los aminoácidos separados, dado que son
incoloros en el espectro visible, se hizo
uso de un (revelador) como es la
ninhidrina, la que reacciona con los α-NH2
en los aminoácidos libres o combinados,
formando un compuesto de color azul,
con excepción de la prolina no tiene dicho
grupo libre, sino –NH- ya que forma parte
del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con
ninhidrina se forma un color amarillo, pero
en esta práctica no se utilizó la prolina. La
reacción se puede observar en el anexo
3. ​(Stryer, Berg & tymoczko, 2007)
Conclusiones
La diferencia de pH entre la fase
móvil de buffer fosfatos y las otras dos
fases móviles, se manifiesto en la
medición de distintos Rf.
La polaridad de las fases móvil del
buffer de ácido cítrico y la fase móvil de
butanol / ácido acético / agua, se
manifiesta en la medición de distintos Rf
para un mismo aminoácido al mismo pH.
La Isoleucina presentó mayor Rf
en la fase móvil de butanol / ácido acético
/ agua, mientras que la Treonina fue el
que presentó mayor Rf en la fase móvil de
buffer de ácido cítrico, ambos a pH 5.
Referencias
Stryer, L., Berg, J. & Tymoczko, J. (2007).
Bioquímica​. Reverté.
Macarulla, J. M., & Goñi, F. M. (1993).
Biomoléculas: lecciones de
bioquímica estructural​. Reverté.
Meléndez, F. (2003). ​Cromatografía en
papel de aminoácidos. Córdoba :
Universidad de Rabanales.
Rivera, E. I. V. (2005). ​Prácticas de
bioquímica descriptiva (Vol. 51).
USON.
Anexos
Anexo 1 Cromatografía en papel de
diferentes aminoácidos, utilizando como
fase móvil; butanol / ácido acético / agua.
Gln = Glutamina
Ser = Serina
Met = Metionina
Thr =Treonina
Trp = Triptófano
Iso = Isoleucina
Fuente: Imagen obtenida en el laboratorio
de Analisis Instrumental II, Edificio T-12,
USAC.
Anexo 2 ​Cálculo del Factor de Retención,
de la fase móvil; butanol / ácido acético /
agua.
Factor de retención de la glutamina
Rf = 2.1 cm / 4.5 cm = 0.47

Factor de retención de la Serina

Rf = 2.2 cm / 4.5 cm = 0.49

Factor de retención de la Metionina

Rf = 3.6 cm / 4.5 cm = 0.80

Factor de retención de la Treonina

Rf = 2.7 cm / 4.5 cm = 0.60

Factor de retención de la Triptófano

Rf = 3.3 cm / 4.5 cm = 0.73

Factor de retención de la Serina

Rf = 4.1 cm / 4.5 cm = 0.91

Anexo 3. Reacción de ninhidrina con

aminoácidos.

(Stryer, Berg & tymoczko, 2007)