LAPORAN PRATIKUM ANALISA FARMASI DASAR

KROMATOGRAFI KOLOM

Responser : Widya Dwi Aryati S.Farm., M.Si., Apt.

Oleh :

Anastasia Sharon Jautan 1606883051

Ananda Hanny Chairunissa 1606924404

Dina Angga Wardani 1606924354

Fatima Rahmanita 1606881336

Maxius Gunawan 1606893872

LABORATORIUM KIMIA FARMASI-MEDISINAL DAN BIOANALISIS

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK, NOVEMBER 2017
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas rahmat-Nya kami dapat
menyelesaikan laporan praktikum ‘Kromatografi Lapis Tipis’ dengan baik. Terdapat
berbagai kendala dalam perjalanan menyelesaikan praktikum dan laporan. Namun
hal ini tidak mengurungkan niat kami untuk menyelesaikan laporan praktikum ini.
Maka kami ingin berterima kasih kepada seluruh pihak yang telah membantu kami
dalam proses pembuatan hingga penyelesaian laporan praktikum ini, yaitu :

1. Tuhan Yang Maha Esa

2. Widya Dwi Aryati S.Farm., M.Si., Apt. sebagai responser pada praktikum
kromatografi kolom
3. Keluarga yang mendukung baik secara materi, maupun non materi

Akhir kata, semoga laporan praktikum ini dapat bermanfaat bagi para
pembaca dan dapat dipergunakan sebaik – baiknya. Penulis menyadari bahwa tidak
ada sesuatu yang sempurna, maka penulis terbuka bagi kritik dan saran yang
membangun demi peningkatan kualitas laporan praktikum berikutnya.

Depok, November 2017

Penulis

ii
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ........................................................................................... ii

DAFTAR ISI ................................................................................................................................. iii
BAB 1 PENDAHULUAN ....................................................................................................... 1
1.1 LATAR BELAKANG ................................................................................................................ 1
1.2 TUJUAN PRAKTIKUM ............................................................................................................. 2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................ 3
BAB 3 METODE PERCOBAAN ......................................................................................... 9
3.1 TEMPAT DAN WAKTU PELAKSAAAN .......................................................................... 9
3.2 ALAT DAN BAHAN .................................................................................................................. 9
3.3 CARA KERJA..............................................................................................................................11
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 13
4.1 HASIL .............................................................................................................................................13
4.2 PEMBAHASAN ..........................................................................................................................14
BAB 5 PENUTUP ................................................................................................................... 17
5.1 KESIMPULAN ............................................................................................................................17
5.2 SARAN ...........................................................................................................................................17
DAFTAR ACUAN ................................................................................................................. 18
LAMPIRAN .............................................................................................................................. 19

iii
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Kromatografi adalah suatu proses pemisahan yang digunakan untuk
pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler (Vogel, 1994).
Kromatografi juga didefinisikan sebagai sebuah metode pemisahan yang
komponen-komponennya dipisahkan dan didistribusikan di antara dua fase
yang salah satu fasenya tetap (diam) dan yang lainnya bergerak dengan arah
yang dapat diketahui. Salah satu fase bergerak secara berkesinambungan
dalam arah tertentu dan didalamnya, zat-zat terlarut menunjukkan perbedaan
mobilitas yang disebabkan oleh perbedaan adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan
uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Berdasarkan hal tersebut,
kromatografi dapat dibagi menjadi beberapa tipe yaitu kromatografi adsorpsi,
partisi cairan dan penukar ion.
Kromatografi partisi cairan, seperti kromatografi kolom, fase cair yang
bergerak mengalir melewati fase cair stationer (fase diam) yang diserapkan
pada suatu pendukung. Prinsip dari kromatografi kolom adalah campuran
akan terpartisi pada kedua fase. Ketika komponen masuk kedalam suatu
sistem kromatografi, maka komponen akan segera terdistribusi diantara fase
diam dan fase gerak. Bila aliran fase gerak dihentikan, maka akan terjadi
kesetimbangan diantara kedua fase. Partisi bergantung pada gerakan relatif
komponen diantara fase diam dan fase gerak. Apabila komponen tertahan
pada fase diam, maka komponen akan lebih lama keluar, begitu pula
sebaliknya, apabila komponen tidak tertahan pada fase diam (artinya ikatan
lemah pada fase diam) maka komponen tersebut akan lebih cepat keluar
bersama dengan fase gerak. Aliran fase gerak (Eluen) dipengaruhi oleh gaya
gravitasi, gara berat dan mekanisme adsorpsi. Komponen sampel akan
bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda kemudian dipisahkan dan
dikumpulkan dalam bentuk fraksi-fraksi yang keluar dari kolom.

1
 Pada praktikum ini, kelompok kami melakukan percobaan memisahkan
dua zat warna yang belum diketahui zatnya, yang telah tercampur menjadi
satu sampel. Percobaan ini kami lakukan dengan menggunakan kromatografi
kolom. Prinsip percobaan ini menggunakan tingkat kepolaran zat warna yang
berbeda.

1.2 TUJUAN PRAKTIKUM

Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah
1. Mengetahui dan memahami prinsip kromatografi kolom
2. Mengetahui dan memahami pemilihan fase diam dan fase gerak pada
kromatografi kolom
3. Mengetahui dan memahami persiapan dan pelaksanaan kromatografi
kolom
4. Memisahkan komponen zat warna dalam campuran menggunakan
kromatografi kolom

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Prinsip kromatografi kolom adalah sampel dilewatkan pada adsorben

didalam sebuah kolom kemudian eluen dialirkan dengan gaya gravitasi, gaya
berat dan mekanisme adsorpsi melalui kolom. Komponen pada sampel akan
bergerak melewati kolom dengan laju yang berbeda-beda, sehingga dapat
dipisahkan dengan mengumpulkan fraksi-fraksi yang keluar pada kolom.

Adapun hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kromatografi kolom adalah

adsorben
Adsorben yang digunakan dalam kromatografi kolom harus tidak larut
dalam eluen yang digunakan, Inert, tidak bereaksi dengan sampel, cukup aktif,
sehingga mampu mengadsorpsi sekaligus memungkinkan perambatan sampel,
memungkinkan aliran yang baik dari eluen, reprodusibel, dapat diproduksi dengan
sifat yang konstan. Adsorben yang paling banyak digunakan adalah aluminium
dan silika. Berikut adalah contoh-contoh adsorben pada kromatografi kolom.

3
 Sebelum digunakan adsorben harus diaktifkan terlebih dahulu dengan
pemanasan pada suhu dan waktu tertentu. Derajat keaktifan ini sangat
mempengaruhi sifat adsorben. Berikut adalah penggolongan adsorben berdasarkan
aktivitas adsorpsi relatif terhadap alumina yang disusun pada suatu tingkat
aktivitas Brockmann.

Tingkat kekuatan adsorpsi gugus polar pada senyawa-senyawa polar akan

meningkat dengan urutan sebagai berikut -CO2R, =C=O, -NH2, -OH, -CO2H.
Gugus polar pada adsorben akan menarik molekul komponen sampel dengan
interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen.
Pemilihan eluen didasarkan pada sifat kelarutan dan kekuatan zat elusi
yang merupakan daya adsorpsi komponen sampel pada adsorben sepanjang
kolom. Kekuatan adsorben akan meningkat dengan kenaikan polaritas zat yang
diserap. Semakin memiliki polaritas yang sama maka kekuatan adsorben akan
semakin meningkat, begitu pula sebaliknya.

4
 Pemilihan adsorben dan pelarut digunakan prinsip berikut: untuk
adsorben, digunakan adsorben yang memiliki polaritas yang sama dengan
komponen sampel, sedangkan untuk eluen, digunakan eluen yang memiliki
polaritas yang berlawanan dengan komponen sampel. Pemisahan komponen
dengan eluen yang kurang polar akan terjadi sempurna, namun waktu yang
diperlukan lebih lama sehingga volume eluen yang diperlukan lebih banyak
dibandingkan dengan ketika menggunakan eluen yang lebih polar.
Adapun jenis adsorben dan pelarut yang digunakan pada kromatografi
kolom adalah sebagai berikut.

Alat yang digunakan untuk melakukan pemisahan kromatografi kolom

adalah kolom yang berupa pipa gelas, logam atau plastik, yang dilengkapi dengan
kran pada bagian bawah serta penyaring didalamnya. Ukuran kolom sangat
beragam, tergantung pada banyaknya senyawa yang akan dipisahkan. Berikut
adalah ukuran kolom untuk kromatografi kolom.

5
Perbandingan jumlah adsorben : sampel 30 : 1
Perbandingan panjang : diameter kolom 10 – 15 : 1
Panjang kolom:
a. Sistem multikomponen Kolom panjang
b. Komponen-komponen dengan afinitas yang sama terhadap adsorben Kolom panjang
c. Komponen-komponen dengan afinitas yang berbeda terhadap Kolom pendek
adsorben

Kolom harus diisi dengan adsorben secara homogen dengan cara kering
maupun cara basah. Pada cara kering, adsorben diletakan pada dasar kolom
dengan cara dituang sedikit demi sedikit, dan dipermukaan atas diletakkan kertas
saring sehingga menjaga agar permukaan adsorben rata. Kemudian sepanjang
kolom, eluen dialirkan dengan kran kolom terbuka sehingga eluen meresap hingga
ujung akhir kolom. Apabila eluen sudah dibagian atas kolom, maka aliran eluen
dihentikan dengan cara menutup kran kolom. Pada cara basah, adsorben dengan
pelarut dicampur hingga membentuk bubur, kemudian baru dituang kedalam
kolom yang berisi pelarut. Untuk membantu homogenitas dan menghilangkan
gelembung udara, maka kolom dipukul-pukul atau mengaduk cairan yang ada
didalam kolom.
Kolom dicuci dengan eluen dan kran dibuka terlebih dahulu untuk
mengeluarkan eluen yang ada di atas adsorben. Sampel yang telah dilarutkan
dalam eluen dimasukan kedalam kolom. Setelah sampel masuk kedalam kolom,
kran kolom dibuka dan eluen terus dialirkan ke kolom agar kolom tidak kering.
Proses elusi adalah proses dimana komponen sampel terbawa oleh eluen
dari puncak kolom sampai akhir kolom sehingga terjadi pemisahan komponen.
Pemisahan komponen ini terjadi akrena komponen sampel tertahan oleh adsorben
atau terbawa oleh eluen bergantung pada afinitas terhadap dua fase yang
menyebabkan perbedaan laju alir dari masing-masing komponen. Proses elusi ini
dapat memisahkan komponen-komponen sampel berupa fraksi-fraksi pada
interval waktu penampungan tertentu yang keluar dari kolom.
Ada dua teknik elusi yaitu secara isokratik dan secara gradien. Pada elusi
isokratik, eluen yang digunakan sepanjang elusi berlangsung sama, tidak ada
pergantian eluen. Sedangkan pada elusi secara gradien, penggunaan eluen tidak

6
selalu sama. Ketika komponen yang dikehendaki terpisah dari campuran, untuk
mengeluarkan komponen lain yang ada di kolom dapat digunakan eluen yang
berbeda.
Mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom adalah ketika sampel
mulai dituang pada puncak kolom, dengan segera sampel akan terdistribusi pada
kedua fase. Aliran eluen akan memperbanyak distribusi sampel diantara dua fase.
Komponen sampel bergerak seiring dengan pergerakan eluen dengan kecepatan
yang bergantung pada seberapa besar komponen tertahan oleh adsorben. Jika
komponen mengalami retensi kuat pada adsorben maka retensi komponen pada
eluen akan lebih kecil yang menyebabkan komponen lebih lama keluar dari
kolom, begitupula sebaliknya.
Ketika suatu cairan mengalir sepanjang permukaan aktif suatu padatan,
akan terjadi kesetimbangan adsorpsi dan desorpsi komponen yang terserap pada
permukaan padatan. Bila dibuat grafik hubungan antara konsentrasi sampel dalam
adsorben (Cs) dan konsentrasi sampel dalam eluen (Cm), maka dapat diperoleh
kurva adsorption isotherms seperti berikut:
1. Linier. Konsentrasi sampel yang terserap sebanding dengan
konsentrasi sampel dalam eluen, sehingga kurva linier dan peak yang
dihasilkan simetris. Slope dari kurva merupakan koefisien distribusi
sampel. Slope tidak bergantung pada konsentrasi total sampel.
2. Cembung. Kurva ini terbentuk bila adsorpsi larutan encer lebih kuat
daripada larutan pekat, sehingga harga Kd menjadi lebih kecil dari
harga kesetimbangan. Akibatnya puncak yang dihasilkan tidak simetris
(tailing / pengekoran di belakang).
3. Cekung. Kurva ini terbentuk bila adsorpsi larutan pekat lebih kuat
daripada larutan encer, sehingga harga Kd menjadi lebih besar dari
harga kesetimbangan. Akibatnya puncak yang dihasilkan tidak simetris
(leading / pengekoran di depan).

Apabila pada bagian bawah kolom dihubungkan dengan detektor maka

diperoleh signal yang digambarkan sebagai fungsi waktu yang disebut dengan
kromatogram. Fungsi waktu yang ditunjukan pada kromatogram adalah waktu
yang dibutuhkan untuk elusi. Puncak kromatogram muncul pada saat waktu

7
retensi, dimana waktu retensi ini spesifik untuk tiap senyawa dan dapat digunakan
sebagai analisa kualitatif. Analisa kuantitatif dapat dilakuakn dengan
membandingkan AUC (Area Under Curve / luas daerah di bawah kurva)
komponen sampel dengan AUC senyawa baku yang telah diketahui
konsentrasinya.

8
 BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 TEMPAT DAN WAKTU PELAKSAAAN

Tempat : Laboratorium Kimia Farmasi-Medisinal Dan Bioanalisis
Waktu : 15 November 2017, 8.00-11.00 WIB

3.2 ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam Praktikum Analisis Farmasi Dasar
Kromatografi Kolom adalah sebagai berikut:
Alat Gambar

1 set Kolom

(Kolom, kran, statif,

kapas, kertas filter)

Beaker glass

9
Tabung reaksi dan rak
tabung reaksi

Sedangkan bahan yang digunakan dalam Praktikum Analisis Farmasi

Dasar Kromatografi Kolom adalah sebagai berikut:
Bahan Gambar

Silica gel

Sampel Zat

10
 Fase gerak (Air-Etanol-
NaOH (7:2:1)

3.3 CARA KERJA

1. Siapkan perangkat kromatografi kolom (harus lurus terhadap statif), dengan
stopcock (kran) yang telah diberi vaselin terlebih dahulu.
2. Masukkan kapas dan kertas saring ke dalam kolom dan kran kolom ditutup
3. Bersihkan kolom dengan mengalirkan fase gerak.
4. Siapkan adsorben (silica gel) yang telah dihomogenkan ke dalam beaker glass,
tambahkan fase gerak
ke dalam beaker
5. Masukan secara perlahan adsorben (sesuai pembagian kelompok) yang telah
diberi fase gerak dengan
memakai corong ke dalam kolom. Usahakan agar tidak ada rongga (gelembung)
udara pada fase diam.
Panjang fase diam dalam kolom sekitar 2/3 bagian dari panjang kolom. Fase gerak
usahakan lebih dari
2 cm di atas fase diam.
6. Secara perlahan buka kran, pastikan eluen mengalir secara perlahan. Pastikan
tidak ada gelembung
udara pada fase diam dan jaga keberadaan fase gerak pada kolom. Kran ditutup
kembali, dan siap digunakan.
7. Masukkan analit (campuran zat warna dalam sampel) sebanyak kurang lebih 2-
5 ml.

11
8. Perlahan keran dibuka, dan catat waktu pertama penetesan fase gerak.
9. Fraksi yang keluar di tampung, dan waktu penetesan analit pertama dicatat.
Demikian seterusnya.
10. Perhatian: penambahan fase gerak jangan sampai terlambat, sehingga fase
diam kering. Fase gerak ditambahkan dengan hati-hati/perlahan.

12
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL
 Sebelum analit keluar
Menit ke Gambar Keterangan

2 Warna sampel
terpisah menjadi
biru dan kuning

20 Warna kuning
menghilang

 Saat analit keluar

Menit ke Warna yang Volume warna

dihasilkan
35 Biru kehijauan 5,8 mL
cerah
37 Biru muda 2,5 mL
40 Biru kehijauan 0,7 mL

13
 lebih pekat
42 Biru kehijauan 0,5 mL
pekat
47 Biru kehijauan 1,4 mL
pekat
57 Biru pekat 2,2 mL
59 Biru cerah 0,7 mL

4.2 PEMBAHASAN

Kromatografi kolom memanfaatkan perbedaan daya serap dari masing-

masing komponen campuran dengan absorben. Apabila afinitas dengan
absorbennya besar, komponen tersebut akan bergerak lebih lambat sehingga
keluar lebih lama. Sebaliknya, apabila afinitasnya kecil komponen tersebut akan
bergerak lebih cepat sehingga keluar lebih awal. Dibandingkan dengan fase
diamnya, silica gel, eluen bersifat lebih polar. Fase gerak yang digunakan adalah
campuran air-etanol-NaOH (7:2:1) yang bersifat polar. Sampel yang kami
dapatkan adalah campuran dari sunset yellow dan bromotimol blue, karena setelah
sampel dimasukan kedalam kolom warnanya terpisah menjadi biru dan kuning.

Bromotomol blue

14
 Sunset Yellow

Bromotimol biru berperan sebagai asam lemah dalam larutan. Bromotimol

blue dapat berada dalam bentuk terdeprotonasi atau terprotonasi, menghasilkan
warna biru atau kuning. Dalam larutan basa, bromotomol blue mendonorkan
H+nya sehingga bromotimol blue terdeprotonasi dan berubah menjadi biru.
Deprotonasi dalam bentuk netral menghasilkan struktur yang sangat terkonjugasi,
berperan pada munculnya perbedaan warna. Bentuk terdeprotonasi dengan puncak
serapan pada 602 nm karenanya memancarkan warna biru terang pada larutan
yang lebih basa. Bentuk terprotonasi bromotimol biru memiliki puncak serapan
pada 692 nm karenanya memancarkan warna kuning terang pada larutan asam.
Trayek pH bromotimol blue adalah 6.0-7.6, berwarna kuning pada pH rendah dan
warnanya akan semakin biru seiring dengan bertambahnya pH latutan. Karena
eluen yang digunakan adalah basa, bromotimol blue tersebut berubah menjadi
biru karena terdeprotonasi.

Pemisahan pada kromatografi kolom sederhana komponen tidak terpisah

dengan baik sehingga hasil yang diberikan berupa gradasi warna. Setelah kurang

15
lebih 5 menit warna kuning menghilang. Hal ini terjadi kemungkinan karena
sampel dari sunset yellow yang diberikan jumlahnya terlalu sedikit. Jumlah
sampel sunsel yellow yang sedikit tersebut tercampur dengan warna biru sehingga
dihasilkan warna biru kehijauan.
Koefisien partisi (log p) menunjukkan kemampuan suatu molekul dalam
menembus membran biologis yang bersifat seperti halnya lapisan lemak. Semakin
besar koefisien partisinya semakin non polar zat tersebut sehingga semakin
mudah melewati membrane biologis. Bromotimol blue memiliki log p 8.99.
sunset yellow memiliki log p -1.18. sehingga dapat disimpulkan bahwa sunset
yellow lebih polar daripada bromotimol blue. Sunset yellow yang lebih polar
tersebut akan keluar lebih awal dibandingkan bromotimol blue sehingga
dihasilkan gradasi warna biru kehijauan diawal.

16
 BAB V

PENUTUP
5.1 KESIMPULAN
Prinsip kromatografi kolom adalah sampel dilewatkan pada adsorben
didalam sebuah kolom kemudian eluen dialirkan dengan gaya gravitasi, gaya
berat dan mekanisme adsorpsi melalui kolom. Komponen pada sampel akan
bergerak melewati kolom dengan laju yang berbeda-beda, sehingga dapat
dipisahkan dengan mengumpulkan fraksi-fraksi yang keluar pada kolom. Pada
percobaan kali ini, sample yang diteliti mengindikasikan bahwa sample
mengandung sunset yellow dan bromotimol blue.
Fase gerak yang digunakan adalah campuran air-etanol-NaOH (7:2:1)
yang bersifat polar. Bromotimol blue memiliki log p 8.99. sunset yellow memiliki
log p -1.18. Sehingga dapat disimpulkan bahwa sunset yellow lebih polar daripada
bromotimol blue. Sunset yellow yang lebih polar tersebut akan keluar lebih awal.
Namun pada percobaan kali ini tidak didapatkan hasil bewarna kuning melainkan
biru-kehijauan. Hal ini mungkin dikarenakan sample yang kurang homogen atau
sunset yellow yang berjumlah sedikit dalam campuran sample, sehingga warna
kuning sunset yellow tercampur dengan bromotimol blue.

5.2 SARAN
Saran penulis adalah untuk memilih sample yang lebih homogen dengan
jumlah takaran yang tepat sehingga hasil kromatografi terpisah dengan baik.
Penulis juga menyarankan untuk membaca lebih lanjut mengenai teori-teori
kromatografi kolom dari sumber yang terpercaya sehingga pratikum dapat
berjalan dengan lancar.

17
 DAFTAR PUSTAKA

Arrahman, A, et al. (2017). Buku Penuntun Praktikum Analisis Farmasi Dasar.

Depok.

Basset, J, dkk. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik Edisi
Keempat. Jakarta: EGC.
Harmita. 2015. Analisis Fisikokimia Kromatografi Vol 2. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC

18
LAMPIRAN

19