Los macrófagos M2 o el tratamiento con IL-33 atenúan el curso de

infección por Mycobacterium tuberculosis

AR Piñeros , 1, * LW Campos , 1, * DM Fonseca , 1 T. B. Bertolini , 1 A. F. Gembre , 1 R. Q. Prado , 1 J. C.
Alves-Filho ,1 S. G. Ramos , 2 M. Russo , 1, 3, * y VLD Bonato un, 1, *

Abstracto

Los efectos protectores de las infecciones micobacterianas sobre la alergia pulmonar

están bien documentados. Sin embargo, la relación inversa entre la tuberculosis y la
inmunidad tipo 2 sigue siendo difícil de alcanzar. Aunque la inmunidad de tipo 1 es
esencial para la protección contra Mycobacterium tuberculosis, puede ser también
perjudicial para el huésped debido a la inducción de un daño extenso en los tejidos. Aquí,
se determinó si el pulmón de tipo 2 inmunidad inducida por la sensibilización alergeno y
desafío podría afectar el resultado de la infección por M. tuberculosis. Se utilizaron dos
protocolos diferentes en los que se realizó la sensibilización y la exposición al alérgeno
antes o después de la infección por M. tuberculosis. Encontramos un aumento de la
resistencia a M. tuberculosis sólo cuando la exposición al alérgeno se dio después, pero
no antes de la infección. Los ratones infectados expuestos al alérgeno mostraron menor
carga bacteriana e infiltrados celulares en los pulmones. La mayor resistencia a la
infección después del desafío alérgeno se asoció con el aumento de la expresión génica
de macrófagos activados alternativamente (macrófagos M2) y niveles de IL-33. Por
consiguiente, la transferencia adoptiva de macrófagos M2 o el tratamiento sistémico con
IL-33 fue eficaz para atenuar la infección por M. tuberculosis. En particular, la resistencia
mejorada inducida por la exposición al alérgeno dependía del receptor ST2 de IL-33.
Nuestro trabajo indica que la IL-33 podría ser un tratamiento terapéutico alternativo para
la tuberculosis grave.

Introducción

La tuberculosis (TB), una enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis, sigue

siendo un importante problema de salud pública con alta morbilidad y prevalencia. Ha
matado a casi 2 millones de personas en todo el mundo, y se estima que una tercera
parte de la población mundial está infectada1. Actualmente, una de las razones de su
elevada morbilidad es la aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a múltiples
fármacos y resistentes a fármacos2,3. La respuesta inmune celular protectora está
asociada con células T productoras de IFN-γ y macrófagos clásicamente activados
(macrófagos M1). Estas células producen varias moléculas efectoras antibacterianas,
incluyendo citoquinas, quimiocinas y NO, que son responsables del reclutamiento de
células mononucleares inflamatorias, formación de granulomas y actividad
micobactericida4,5. Aunque el IFN-γ es crucial para la protección de la TB y un parámetro
estándar de oro de las vacunas TB potenciales, es evidente que la interacción del
huésped con M. tuberculosis es extremadamente compleja y no puede depender por
completo de la inducción de IFN- γ . Por ejemplo, las células Th1 y los macrófagos M1 se
asocian con hipersensibilidad tipo IV, una respuesta inmunológica patológica asociada
con necrosis, daño pulmonar progresivo, descarga de bacilos de la cavidad y transmisión
bacteriana mejorada9. De hecho, la asociación paradójica entre la transmisión mejorada y
la inflamación polarizada se ilustra mediante observaciones clínicas de que los individuos
VIH-SIDA que tienen inmunidad deteriorada de tipo 1 y están co-infectados con M.
tuberculosis experimentan cargas bacterianas muy altas pero transmiten relativamente
menos bacterias de persona a persona10 , 11. Colectivamente, estos estudios ponen de
relieve el complejo equilibrio entre la inmunidad tipo 1, el daño tisular y el control
bacteriano.

El concepto de que la inmunidad de tipo 1 y tipo 2 son mutuamente inhibitorios se ha

aplicado en asma experimental con resultados prometedores, como lo demuestran varios
informes que indican que las infecciones o antígenos micobacterianos inducen efectos
protectores profilácticos y terapéuticos en la enfermedad pulmonar alérgica12,13,14,15 ,
16, 17, 18. Sin embargo, la situación inversa es más compleja a determinar porque uno
debe considerar la multiplicación bacteriana además de prevenir la inmunopatología
tisular. Sin embargo, la inmunidad de tipo 2 se asocia con macrófagos M2 que promueven
la reparación de heridas y la regeneración de tejidos que, a su vez, podrían proteger a los
pulmones de la destrucción de tejidos19. Por el contrario, los macrófagos M2 presentan
baja inmunidad antimicrobiana, lo que podría ser perjudicial para la infección por M.
tuberculosis20,21. Aquí, se determinó el impacto de la inmunidad pulmonar de tipo 2
inducida por la ovoalbúmina como un alérgeno en el resultado de la infección por M.
tuberculosis. Para este propósito, se establecieron dos protocolos básicos en los que la
sensibilización al alérgeno y el desafío se dio antes o después de la infección por M.
tuberculosis. Se encontró que el aumento de la resistencia a la infección por M.
tuberculosis se logró cuando el alérgeno se administró después de la infección. La
resistencia mejorada de los ratones expuestos al alérgeno en comparación con los
ratones infectados se asoció con una población aumentada de células mieloides CD11c +
de pulmón que expresan el receptor de manosa (CD206) y el aumento de la expresión
génica de los macrófagos M2. Además, la transferencia adoptiva de macrófagos M2 o el
tratamiento sistémico con IL-33 fue también eficaz en el control de la infección por M.
tuberculosis. Es importante destacar que la resistencia aumentada inducida por el
alérgeno dependía del receptor ST2 de IL - 33. Nuestros datos indican un nuevo
mecanismo para aumentar la resistencia a la infección por M. tuberculosis mediada por el
eje IL-33 / ST2 y sugiere un tratamiento terapéutico alternativo para la TB grave.

Resultados

La exposición a los alérgenos después de una infección por M. tuberculosis

aumenta la resistencia

Para evaluar el impacto de la inmunidad Th2 sobre el resultado de la infección por

micobacterias, primero infectamos a los ratones con M. tuberculosis y después
sensibilizamos y desafiamos con ovoalbúmina (grupo TB / OVA) como se muestra en la
Fig. 1a. Se esperaba que al inducir la inmunidad Th2 específica de OVA, la resistencia a
la infección micobacteriana se vería afectada. Sorprendentemente, se encontró que
después del desafío alérgeno, los ratones eran más resistentes a la infección por M.
tuberculosis como se reveló por la disminución significativa de los recuentos CFU (Unidad
Formadora de Colonia) en el grupo TB / OVA en comparación con el grupo TB (Figura
1b). Los recuentos diferenciales de células BALF mostraron que el número de eosinófilos
aumentó y que los neutrófilos se redujeron significativamente en el grupo TB / OVA en
comparación con el grupo TB, mientras que no hubo diferencias en los recuentos de
macrófagos y linfocitos entre ambos grupos (Figura 1c). La infección por M. tuberculosis
inhibió las respuestas alérgicas pulmonares inducidas por OVA, tales como la eosinofilia,
la producción de IL-4 e IL-5 (figura 1c-e). Sin embargo, cuando los cultivos de células de
pulmón fueron reestimulados con Ovalbúmina (Ova), el grupo TB / OVA produjo niveles
significativos de IL-4 e IL-5 (figura 1f, g). La producción de moco revelada por la tinción
PAS (índice Mucus) también se redujo en el grupo TB / OVA cuando se comparó con el
grupo OVA. (Figura 1h, i). El análisis histopatológico mostró que los pulmones de ambos
grupos presentaron una respuesta granulomatosa multifocal, pero las áreas de infiltrados
pulmonares disminuyeron significativamente en el grupo TB / OVA en comparación con el
grupo TB (Fig. 1j-k). Sorprendentemente, la producción de IFN-γ por células pulmonares
cultivadas con antígenos de M. tuberculosis no fue significativamente diferente entre los
grupos TB y TB / OVA (Figura 1l). La exposición a los alergenos fue sin efecto sobre los
niveles de IgG1 o IgG2a contra antígenos micobacterianos (Figura 1a, b). Finalmente,
cuando el protocolo TB / OVA se extendió a 80 días después de la infección, como se
muestra en la Figura 2a complementaria, todavía se observó una disminución significativa
de los recuentos de UFC pulmonar en el grupo TB / OVA en comparación con el grupo
TB. Concluimos que la exposición al alérgeno de las vías respiratorias después de la
infección por M. tuberculosis mejora el aclaramiento micobacteriano y la patología
pulmonar. Sin embargo, la situación inversa como se muestra en la Figura 2c
complementaria fue perjudicial para la infección por M. tuberculosis (Figura 2d
complementaria), pero redujo las respuestas alérgicas asociadas con Th2 (Figura 2e-h).

Colectivamente, nuestros resultados muestran que la inmunidad Th2 establecida

después, pero no antes de la infección micobacteriana, aumenta la resistencia a la
infección, mientras que la infección micobacteriana, independientemente del tiempo,
protege contra el desarrollo del asma.

La exposición a los alérgenos después de una infección por M. tuberculosis produce una
expresión mixta de los marcadores de macrófagos M1 / M2 en los pulmones

Mycobacterium tuberculosis infecta principalmente a los macrófagos que, a su vez,

cuando se activan adecuadamente, expresan la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) que
se asocia con la resistencia a la tuberculosis experimental22. Debido a que la expresión
iNOS es un marcador de los macrófagos M1 y la inmunidad Th2 induce macrófagos M2,
decidimos investigar la expresión de los marcadores M1 y M2 en el pulmón. Para este
propósito, hemos evaluado iNOS expresión como un marcador M1 y Arg1, Fizz1 y Ym1
expresión génica como marcadores M2. Alergeno exposición no afectó a la expresión de
iNOS como reveló por la expresión de genes iNOS similar en el grupo de TB en
comparación con TB / OVA grupo (Fig. 2a]. Sin embargo, la expresión de los marcadores
M2 fue significativamente mayor en los ratones TB / OVA en comparación con el grupo TB
(Figura 2b). Estos resultados indican que la exposición al alergeno en ratones infectados
aumenta la expresión de genes regulados asociados con los macrófagos M2. Debido a
que la PGE2 media la polarización de M2 y afecta al crecimiento de M. tuberculosis24,25,
determinamos la producción de PGE2 en ratones TB / OVA. Se encontró que la
exposición alergeno no afectó la producción de PGE2 (datos no presentados). Para
caracterizar aún más el fenotipo similar a M2 en los pulmones, se realizó análisis de
FACS en células de pulmón que expresan el receptor de manosa (CD206), otro marcador
M226 y CD11c, que se sabe que es expresado por macrófagos pulmonares y células
dendríticas27,28. Se encontró que el número y la frecuencia de CD11c + CD206 + células
fueron significativamente mayores en los pulmones de TB / OVA ratones que en el grupo
de TB (Figura 2c]. Por último, se midió la expresión de TNF como un marcador de
inflamación pulmonar y encontró una menor expresión de TNF en TB / OVA que en el
grupo de TB (Fig. 2d). Concluimos que la exposición a alergenos aumentó las células
mieloides de tipo M2 y disminuyó la expresión de TNF, pero no afectó la expresión de
iNOS. Por lo tanto, nuestros resultados indican que una mezcla M1 / M2 inmunidad
pulmonar y menor expresión de TNF se asocia con un mejor resultado de la infección
micobacteriana.

La transferencia adoptiva de los macrófagos M2 mejora la resistencia a la infección por M.

tuberculosis

Para evaluar directamente el papel de los macrófagos M2 en la resistencia a la infección

por M. tuberculosis, se generaron macrófagos M2 procedentes de cultivos de médula
ósea y se administraron a ratones infectados con M. tuberculosis por vía intratraqueal.
Sorprendentemente, los animales que recibieron macrófagos M2 a los 30 días después de
la infección exhibieron recuentos de CFU pulmonar significativamente más bajos que los
animales infectados (Figura 3a). Por consiguiente, los pulmones de ratones infectados y
adoptivamente transferidos exhibieron una expresión de genes Fizz1 más alta pero menor
que los ratones infectados (Figura 3b). La Figura 3c confirma que los macrófagos M2
derivados de médula ósea teñidos con éster succinimidílico de carboxifluoresceína
(CFSE) alcanzaron los pulmones. Estos resultados indican que los macrófagos M2 tienen
un efecto beneficioso sobre la infección micobacteriana. Para imitar el microambiente que
se producen in vivo en nuestros experimentos, se evaluó in vitro la actividad fagocítica y
microbicida de macrófagos M2 en presencia de IFN-γ. En ausencia de IFN-γ, los
macrófagos M2 mostraron mayor actividad fagocítica que los macrófagos M1 (Fig. 3d) y
como se esperaba, los macrófagos M1 mostraron mayor actividad microbicida que los
macrófagos M2 (Figura 3e). Sin embargo, tras la estimulación con IFN-γ, los macrófagos
M2 aumentaron su actividad bactericida, que fue incluso mayor que la obtenida con los
macrófagos M1. En conjunto, estos resultados indican que los macrófagos M2 en
presencia de IFN-γ, una situación probable que se produce in vivo, muestran una fuerte
actividad micobactericida.
La resistencia mejorada a la infección por M. tuberculosis después de la estimulación de
alergenos de las vías respiratorias depende en gran medida del receptor ST2 de IL-33

Dado que la mayor resistencia a la infección por M. tuberculosis después de la exposición

al alérgeno se asoció con células similares a M2 y las transferencias de células de
macrófagos M2 resultaron ser beneficiosas en la infección micobacteriana, estábamos
interesados en determinar las citoquinas que podrían estar involucradas en este proceso.
Entre las citocinas de tipo 2, la IL-33 desempeña un papel fundamental en la inmunidad
tipo 2, induce la polarización de los macrófagos M2 y se sabe que induce funciones
pleiotrópicas y protectoras en patologías Th1, 29, 30, 31, 32. Por lo tanto, se realizó por
primera vez in vitro experimentos con la médula ósea diferenciada M0, M1 y M2
macrófagos estimulados o no con Poly I: C33 y encontró que la IL-33 fue secretada sólo
por M2 macrófagos (Poly I: C estimulado 354 ± 37 vs medio 68 ± 9,3) (figura 4a). Para
determinar el papel de la IL-33 en nuestro modelo, primero se utilizó el receptor IL-33 ST2
knockout ratones (ST2KO ratones). Para ello, se evaluaron las cargas bacterianas en los
pulmones de animales con infección micobacteriana en curso que fueron sensibilizados y
desafiados con alérgenos. Los ratones WT infectados y ST2KO (grupos TB) mostraron
cargas bacterianas similares (Fig. 4b). Sin embargo, después de la exposición al alergeno
(grupos TB / OVA), la carga bacteriana disminuyó en WT pero no en ratones ST2KO
(Figura 4b). La expresión de genes iNOS en los pulmones de ST2KO-TB y ST2KO-TB /
OVA ratones fue similar, y esta expresión fue mayor que en sus respectivos homólogos
WT (Fig. 4c]. Por consiguiente, el fenotipo del tipo M2 revelado por la expresión del gen
Arg1 y Fizz1, así como por el número de células CD11c + CD206 + en los pulmones, fue
significativamente menor en los ratones ST2KO-TB / OVA que en los ratones WT-TB /
OVA (Figura 4d ,mi). Estos resultados indican claramente que el receptor ST2 de IL-33 es
crítico para inducir una resistencia mejorada a la infección por M. tuberculosis después de
la exposición al alérgeno y la expresión génica asociada con los macrófagos M2.

El tratamiento con IL-33 mejora la infección por M. tuberculosis

Nuestros resultados indicaron que la producción de IL-33 parece ser crítica en el efecto
protector sobre la infección micobacteriana. Por lo tanto, determinamos los niveles de IL-
33 en el modelo y se encontró que los niveles de IL-33 en los pulmones de ratones TB /
OVA, pero no en OVA / TB (datos no mostrados), fueron más altos en comparación con el
grupo de TB (Figura 5a). Por lo tanto, para comprobar directamente el papel de la IL-33
en la infección micobacteriana, que tratados 30 días de ratones infectados con IL-33
recombinante (Fig. 5b]. Se encontró que el tratamiento con IL-33 (TB + IL-33) dio lugar a
una disminución significativa en los recuentos de CFU pulmonar en comparación con los
ratones infectados no tratados (TB) (Figura 5c]. Puesto que, informes anteriores indicaron
que el tratamiento con IL-33 inducen la producción de citoquinas tipo 2 y el reclutamiento
de eosinófilos y células mononucleares34, 35, determinamos la magnitud de la
inflamación de las vías aéreas después del tratamiento con IL-33. Se encontró que los
animales tratados con IL-33 mostraron menor número de células totales y neutrófilos en
BALF en comparación con grupo de TB no tratado y, sorprendentemente, IL-33 no indujo
la eosinofilia (Fig. 5d). Estos resultados indicaron que el tratamiento con IL-33 en ratones
infectados con M. tuberculosis tiene una actividad anti-inflamatoria. Por consiguiente, la
expresión de IL-1β, otro marcador amplio de inflamación, se redujo en ratones tratados
con IL-33 (figura 5e). Es importante destacar que el número de células positivas a CD11c
que expresan CD206 aumentó después del tratamiento con IL - 33 (figura 5f) indicando
que IL - 33 indujo células de tipo M2. Por consiguiente, los pulmones de ratones tratados
con IL-33 mostraron una disminución de la expresión del marcador M1 (iNOS2) y una
mayor expresión de los marcadores M2 (Arg1 e Ym1) en comparación con el grupo TB
(figura 5g-i).

En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con IL-33 mejora la infección de
M. tuberculosis en curso que está asociada con el aumento de la expresión génica de M2
y con una población de células mieloides que expresan CD206.

Discusión

Ahora se reconoce que se necesitan nuevas estrategias terapéuticas para mejorar el

control de todas las formas de infección por M. tuberculosis36. Los macrófagos son
células clave en la infección micobacteriana, y aunque los macrófagos M1 son esenciales
en la muerte de patógenos, también están implicados en el daño tisular4,5. Por lo tanto,
un objetivo potencial para la intervención terapéutica es el control del daño del tejido
pulmonar como consecuencia de las respuestas inflamatorias del huésped. En las
enfermedades autoinmunes, el control de la inflamación tisular es un patrón oro
terapéutico. Sin embargo, en las enfermedades infecciosas, el control de la inflamación
tisular podría conducir a una multiplicación incontrolada de patógenos. Los macrófagos
M2 están implicados en la reparación tisular y están asociados con la inmunidad Th237,
mientras que las infecciones micobacterianas son conocidas por proteger contra la
inflamación alérgica pulmonar12,13,14,17. Aquí se preguntó si el reto alérgeno en
animales sensibilizados a OVA después de la infección micobacteriana establecida podría
afectar el resultado de la infección por M. tuberculosis en curso. Los hallazgos aquí
presentados muestran que el desafío de alergenos en las vías respiratorias en ratones
previamente infectados con M. tuberculosis (TB / OVA) disminuyó la multiplicación de
bacilos en los pulmones. La resistencia mejorada experimentada por el grupo TB / OVA
se asoció con la expresión génica de los macrófagos M2, las células mielóides que
expresan el receptor de manosa (CD206) y la IL-33. Es importante destacar que el
desafío alérgeno de las vías respiratorias no redujo la producción de expresión de los
genes IFN-γ e iNOS2 que están asociados con una respuesta inmune celular protectora
frente a la TB experimental6,38,39. Sin embargo, la producción de TNF-α, que también
está asociada con macrófagos M1, se redujo en nuestro modelo TB / OVA. Esta
disminución en los niveles de TNF-α podría indicar una disminución de la respuesta
inflamatoria pulmonar resultante de una carga bacteriana reducida, mientras que la
expresión de iNOS2 podría estar asociada con la producción de IFN-γ. Recientemente, la
inmunidad humoral ha sido implicada en el control de la infección micobacteriana40,41.
Sin embargo, en nuestro modelo, el desafío alergénico no afectó la producción de IgG1 e
IgG2a frente a los antígenos micobacterianos. Los neutrófilos pueden tener un papel
protector durante la infección por M. tuberculosis42,43,44, sin embargo hemos encontrado
una reducción en el número de neutrófilos en el BALF y una reducción de la carga
micobacteriana en TB / OVA en comparación con el grupo TB. Por lo tanto, estamos a
favor de la idea de que la reducción de la infiltración de neutrófilos en nuestro modelo
podría ser una consecuencia de la inflamación pulmonar reducida.

Aunque el CD206 es un marcador de los macrófagos M226, su expresión por la población

de células mieloides que se encuentran en los pulmones no indica necesariamente que,
de hecho, los macrófagos M2 son responsables del efecto beneficioso sobre la infección.
Para abordar directamente la participación de los macrófagos M2 en la resistencia a la
infección por M. tuberculosis, se realizaron experimentos con macrófagos M2 derivados
de cultivos de médula ósea. Se encontró que adoptivamente transferidos M2 macrófagos
mejorado la resistencia de los ratones infectados en comparación con los animales que no
recibieron la transferencia celular. Además, tras la estimulación con IFN-γ, una situación
que imita el microambiente in vivo en los pulmones de ratones infectados, los macrófagos
M2 aumentaron su actividad bactericida. Estos hallazgos inesperados sugieren un nuevo
papel para los macrófagos M2 en las infecciones al mostrar que además de controlar el
daño tisular, los macrófagos M2 también podrían controlar el crecimiento bacteriano en un
microambiente proinflamatorio. Este tipo de respuesta es similar al concepto de tolerancia
a la infección que se define como una estrategia de defensa del huésped que reduce el
impacto negativo de la infección en la aptitud del huésped45, evitando el daño tisular. En
este escenario, el granuloma se asocia inicialmente con la protección del huésped porque
evita el foco infeccioso y evita la propagación. Sin embargo, en la fase crónica, el
granuloma grande puede contribuir a la progresión del crecimiento del bacilo porque
amortigua las interacciones entre los linfocitos T y las células infectadas9,46. Además, el
reclutamiento de macrófagos M1 altamente polarizados puede resultar en necrosis tisular
y en la diseminación de bacilos. En nuestro estudio se observó una reducción en el
tamaño de granuloma-como estructuras en los pulmones de TB / OVA ratones. En
consecuencia, Hammarén et al. Mostró recientemente que las bajas cargas bacterianas
encontradas en el pez cebra infectado con M. marinum se asociaron con la inducción de
una respuesta inmune de tipo 2 30 días después de la infección47. Por el contrario, la
falta de una respuesta inmune Th2 se asoció con la progresión de la TB debido a las
respuestas excesivas Th1 [47]. Se demostró también que la inflamación excesiva ocurre
en ratones deficientes en Tir8 que sucumben rápidamente a la infección por M.
tuberculosis, a pesar de controlar eficazmente la infección en diferentes órganos48.
Debido a que Tir8 es un regulador negativo de TLR / IL-1R señalización, la alta mortalidad
de Tir8-ratones deficientes se atribuyó a una respuesta inflamatoria masiva. El eje IL-33 /
ST2 también ha sido implicado en la modulación descendente de la señalización TLR49.
ST2 es un inhibidor de la interleucina 1 receptor y Toll-like receptor 4 de señalización y
mantiene endotoxina tolerancia49. Se encontró que entre las citocinas de tipo 2
implicadas en respuestas alérgicas o daño pulmonar, IL-33 se incrementó en los
pulmones de ratones infectados expuestos al alérgeno. Por lo tanto, estudiamos los
ratones ST2KO en nuestro modelo. Nuestros resultados mostraron que ST2KO ratones
infectados no mostraron ninguna diferencia en la recuperación de CFU de pulmón en
comparación con ratones WT infectados y están en línea con los informados por Wieland
et al.50. En particular, se encontró que el receptor de IL-33 ST2 deficiencia abolido el
aumento de la resistencia de ratones infectados expuestos al alérgeno desafío y todas las
respuestas de tipo 2 asociado con mayor resistencia. Estos hallazgos indican un papel
fundamental del eje IL-33 / ST2 en la protección contra la infección por M. tuberculosis.
Por lo tanto, tratamos ratones infectados con IL-33 recombinante y encontramos que el
tratamiento reprodujo la resistencia observada a la infección por M. tuberculosis asociada
con la exposición al alérgeno o las transferencias de células de macrófagos M2. Nuestro
trabajo está en línea con trabajos previos que muestran un efecto protector del
tratamiento con IL-33 en la malaria cerebral51, otro ejemplo de inflamación severa.
Debido a que encontramos una disminución de la expresión de iNOS2 durante el
tratamiento con IL-33 y en experimentos con transferencias de células M2, sugerimos que
podría estar operando otra actividad micobactericida alternativa. Un informe reciente
mostró que el ácido itacónico producido por los macrófagos tiene actividad
antimicrobiana52. Además, la producción de ácido itacónico está regulada por el gen
IRG1, que a su vez, es activado por moléculas (IL-10, HO-1 y CO) que pueden asociarse
con macrófagos M253,54. Sin embargo, la IL-33 se describió como un coadyuvante
prometedor que aumenta la inmunogenicidad de una vacuna de ADN que expresa el
antígeno de M. tuberculosis 85B55, lo que sugiere que podría ser una herramienta eficaz
para el desarrollo de vacunas contra la TB. Debe observarse que los efectos beneficiosos
de la inmunidad tipo 2 dependen del tiempo y del contexto. Por ejemplo, la inmunidad de
tipo 2 establecida antes de la infección por micobacterias es perjudicial para el huésped,
como demostró previamente Potian para la infección por helmintos21 y por nosotros en el
modelo OVA / TB (Figura 1c, d). En un enfoque similar empleado con un modelo de
queratitis inducido por la infección corneal de Pseudomonas aeruginosa, Hazlett et al.
Mostró que el tratamiento con IL-33 recombinante era protector56. Es muy deseable que
las nuevas terapias para la TB incluyan dos enfoques: mejorar los mecanismos efectores
celulares y prevenir el daño pulmonar36. De hecho, el tejido El daño como consecuencia
de una inflamación sostenida causa debilidad permanente incluso en los pacientes
curados con TB57. Nuestros resultados muestran los efectos terapéuticos potenciales de
la IL-33 en la infección micobacteriana establecida y destacan que la IL-33 podría
representar un agente terapéutico alternativo para la TB avanzada.

Materiales y métodos

Animales

Se obtuvieron ratones BALB / c y ST2KO hembras (6-8 semanas) en el centro de cría de

la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto, Universidad São Paulo (FMRP-USP). Los
ratones ST2KO58 fueron retrocruzados al fondo BALB / c durante 8 generaciones49.
Todos los animales se alojaron en ABSL3 y proporcionaron alimentos y agua estériles.
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la guía ética
sobre el uso de animales de la FMRP-USP y fueron aprobados por el Comité de Ética
para el Uso Animal de FMRP-USP (protocolo número 133/2012).
Infección por M. tuberculosis

H37Rv Se cultivó M. tuberculosis (American Type Culture Collection 27294, Rockville,

MD) en caldo Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.) a 37ºC durante 7
días y se recogió como se describió previamente59. Los ratones fueron infectados por la
administración de 1 × 105 bacilos por vía intranasal. Los pulmones se evaluaron a los 30
o 80 días de infección.

Diseño experimental

Protocolo OVA / TB

Los ratones se sensibilizaron con 100 μg de OVA (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y 1,6
mg de coadyuvante de hidróxido de aluminio por vía subcutánea (s.c.). Catorce días
después de la primera sensibilización, los ratones sufrieron una segunda sensibilización
con 50 μg de OVA en 100 μl de solución salina por inyección intraperitoneal (i.p.). Siete
días después de la segunda sensibilización, los ratones fueron desafiados con 100 μg de
OVA por administración intranasal. Los ratones fueron infectados con 1 × 105 M. bacilos
de tuberculosis por la vía intranasal (i.n.) tres días después del primer desafío.

Protocolo TB / OVA

Los ratones fueron infectados con M. tuberculosis, seguido por sensibilización y desafío
con OVA, como se describe. Para el protocolo extendido (80 días de infección), los
ratones recibieron dos desafíos más en los días 64 y 77.

Lavado broncoalveolar

El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se obtuvo tres días después del desafío, como
se describió anteriormente12,13.

Citometría de flujo

Se incubaron suspensiones celulares (1x106 células) obtenidas después de la digestión

pulmonar60 con sobrenadante de linaje celular 2,4G2 (que contenía anticuerpos anti-
FcγRII / III) durante 40 minutos a 4ºC. Las células se incubaron a continuación durante 30
minutos a 4ºC con anticuerpos monoclonales adquiridos de BD Biosciences: CD11c-
PECyTM 7 (HL3) y CD206-Alexa Fluor® 488 (MR5D3). Las células teñidas se lavaron con
FBS al 2% (suero bovino fetal) y se fijaron con PBS que contenía formaldehído al 1%. Las
muestras (100.000 eventos) se evaluaron utilizando un citómetro FACSCantoTM II (BD,
San José, CA, EE.UU.) y el software CellQuest (BD Biosciences). Las células se
analizaron utilizando el software FlowJo (v 7.6.5, Tree Star, Ashland, OR). Inicialmente,
las células se cerraron en FSC-A y FSC-H para la exclusión de doblete, seguido por una
estrategia de puerta sobre FSC (tamaño) y SSC (granularidad) para seleccionar una
población compatible con macrófagos, dentro de los cuales CD11c + CD206 + población
fue Evaluado.

Producción de moco e inflamación pulmonar

Los lóbulos superiores del pulmón derecho se recogieron de animales individuales, se

fijaron en tampón que contenía 3,7% de formaldehído y luego se embebieron en bloques
de parafina y se seccionaron. Las secciones pulmonares se tiñeron con hematoxilina y
eosina (HE) para caracterizar el infiltrado celular. Se usó tinción con Schiff de ácido
periódico (PAS) para evaluar la producción de moco como se describió previamente12.
Las secciones de pulmón teñido se analizaron utilizando un microscopio Leitz Aristoplan
(Wild Leitz GMBH, Alemania) equipado con una cámara (Leica Microsystems LTDA,
Alemania). Las imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ (NIH Image,
Bethesda, MD, EE.UU.). Se utilizaron células infiltrantes de pulmón para determinar la
relación entre el área pulmonar con células infiltrantes y el área total de tejido pulmonar
fotografiado. Se obtuvo un índice de mucosidad para la relación entre el área teñida
positivamente (PAS positiva) y el área bronquial del pulmón fotografiado.

Citocinas

Se midieron los niveles de citoquinas en BALF, homogeneizados de pulmón y cultivos de

células de pulmón usando kits ELISA obtenidos de BD Biosciences, BD OptEIATM Set
(San Diego, CA, EE.UU.) (IFN-γ, IL-4, IL-5 y TNF) y R & D Systems (Minneapolis, MN,
EE.UU.) (IL - 33). Se prepararon células pulmonares como se describió anteriormente60 y
se cultivaron durante 48 horas con OVA (100 μg / ml) o antígenos micobacterianos (10 μg
/ ml) obtenidos de las micobacterias sonicadas59. Como controles, las células pulmonares
se dejaron sin estimular o se estimularon con Con-A (40 μg / ml).

ELISA para la detección de anticuerpos

El anticuerpo anti-micobacteriano IgG1 e IgG2a se detectaron en suero de ratones TB /

OVA y TB como se describió previamente61. Se utilizó anticuerpos IgG1 anti-ratón
conjugados con biotina (A85-1) e IgG2a (R19-15). La densidad óptica (OD) se midió a 490
nm.

RT-PCR

El lóbulo pulmonar derecho o izquierdo se homogeneizó en 1 ml de reactivo TRIzol

(Invitrogen) y se purificó usando cloroformo. El ARN se precipitó con alcohol isopropílico y
etanol al 70%. La síntesis de cDNA se realizó usando SuperScriptTM II Reverse
Transcriptase (Invitrogen por Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, EE.UU.). La PCR en
tiempo real se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlusTM
(Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) utilizando Maxima SYBR Green /
ROX qPCR Master Mix (2x) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU.) ). Las
muestras se amplificaron usando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95
° C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, una fase de
recocido a 58 ° C durante 30 segundos y una fase de extensión a 72 ° C durante 30
segundos. Las muestras se analizaron utilizando el ciclo umbral (Ct). La expresión génica
se calculó como 2- (ΔΔCt), donde ΔΔCt = ΔCt (muestra) - ΔCt (calibrador) y donde ΔCt
(muestra) = Ct (gen diana) - Ct (normalizador = β-actina). Para la detección se utilizaron
las siguientes secuencias de cebadores: β-Actina (adelante, 5'-CCC TAG GCA CCA GGG
TGT GA-3 ', inversa, 5'-GCC ATG TTC AAT GGG GTA CTT C-3'), iNOS , 5'-TGC TGT
TCT CAG CCC AAC AAT A-3 ', reverso, 5'-GTC CAG GAG TAG TGG AAC ATT CT-3'),
Arg1 (adelante, 5'-CAA AAG GAC AGC CTC GAG GAG-3 5 'CCT GTG GTC TCT CAC
GTC AT-3'), Fizz1 (frente, 5'-CCT GAG ATT CTG CCC CAG GAT-3 '5' TTC ACT GGG
ACC ATC AGC TGG-3 '), Y Ym1 (adelante, 5'-TCA CAG GTC TGG CAA TTC TTC TG-3',
inversa, 5'-ACT CCC TTC TAT TGG CCT GTC C-3 ').

Transferencia adoptiva de macrófagos M2 y tratamiento in vivo IL-33

Treinta días después de la infección, los ratones recibieron 2 x 106 macrófagos M2

derivados de la médula ósea por vía intratraqueal o fueron tratados con IL-33
recombinante (1 μg / ratón) por la vía intranasal ( Cinco dosis totales a intervalos de 2
días) como se informó previamente51,62. Se realizó un ensayo de UFC a los 8 días
después de la adopción de la transferencia celular o 24 horas después del último
tratamiento con IL - 33.

Infección in vitro de macrófagos

Los precursores de médula ósea se incubaron con medio RPMI que contenía 20 ng / ml
de factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) (PeproTech, Rocky Hill, NJ,
EE.UU.) en placas petri (BD OPTILUX). El medio de cultivo se reemplazó el día 3 y se
añadió M-CSF de 5 ng / ml. Después de 7 días, se depositaron 1 x 107 BMDMs en
condiciones que estimulaban la polarización de macrófagos M1 o M2 a través de 200 ng /
ml de IFN-γ (R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) y 1 μg / ml de LPS (Sigma-
Aldrich, St. Louis , MO, EE.UU.) o 30 ng / ml de IL-4 (R & D Systems, Minneapolis, MN,
EE.UU.), 30 ng / mL de IL-13 (R & D Systems, Minneapolis, MN, R & D Systems,
Minneapolis, MN, EE.UU.), respectivamente, durante 48 horas. Después, se sembraron
2,5 x 10 ^ {5} células en placas de 24 pocillos (Corning®, NY, EE.UU.), y después de 4
horas, las células se infectaron con M. tuberculosis (MOI1). El medio de cultivo se
reemplazó con RPMI-1640 que contenía FBS al 10% sin antibióticos después de 4 horas.
Los cultivos de macrófagos M1 y M2 se dejaron sin tratar o se trataron con IFN-γ (200 ng /
ml). El medio fue reemplazado cada 2 días. En los momentos indicados, las células se
lavaron y lisaron con saponina al 0,05%. Los lisados celulares se diluyeron en serie en
PBS, y se colocaron 100 μl en agar MiddleHew 7H11. Los recuentos de UFC se
determinaron después de 30 días de incubación a 37ºC en CO2 al 5%.

Macrófagos estimulados por Poly I: C

BMDMs se diferenciaron en M0, M1 o M2 macrófagos, como se describió anteriormente.

Las células (1x106) se cultivaron en placas de 24 pocillos y se estimularon con 5 μg / ml
de Poly I: C. Después de 24 horas, la producción de IL-33 se evaluó mediante ELISA.

análisis estadístico

Los datos se analizaron con StatSoft, Inc. (2004) STATISTICA software versión 7 (Tulsa,
OK, USA). La significación estadística de las diferencias entre los grupos se estimó
mediante una t de una cola para los datos paramétricos y un Mann-Whitney U-test de
datos no paramétricos. Los datos de experimentos con tres o más grupos se analizaron
mediante ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey para datos paramétricos y la
prueba de Kruskal-Wallis para datos no paramétricos. Los datos se expresaron como la
media ± error estándar de la media (s.e.m.). Se consideró significativo un valor p inferior a
0,05.