Anda di halaman 1dari 7

Nama: Mohammad Fatikunnaja

NIM/Off: 170342615506/ G
Teknik Dasar Biologi Molekuler

Enzim yang digunakan dalam biologi molekuler

Penemuan enzim berperan penting dalam perkembangan biologi molekuler. Khususnya


enzim tipe II restriction endonucleases yang berperan disemua aspek dalam biologi molekuler.
enzim ini mempunyai kemampuan dalam mengenali urutan DNA, yaitu 4-6 pasang basa dan
pembelahan mereka dengan cara yang jelas. Urutan ini yaitu pelindromic atau pengulangan
terbalik secara alami, dimana membaca beberapa peritah kedua untai.

Enzim yang saling berikatan dengan hidrogen antara basis pelengkap masing-masing
dari dua helai yang disebabkan oleh enzim ligase. Kondisi ini banyak dieksplor dalam bidang
biologi sebagai kontruksi DNA rekombinan, yaitu penggabungan DNA dari berbagai fragmen.
Sekitar 500 enzim batasan telah dikenali lebih dari 100 urutan target yang berbeda yang disebut
isoschizomers.

Isolasi dan pemisahan asam nukleat

Isolasi DNA

Untuk menganalisis dan memanipulasi diperlukan isolasi dan purifikasi sampai batas
tertentu. DNA diambil dari sel dengan metode yang paling baik dari pemecahan sel untuk
mencegah DNA fragmen dengan geser mekanis. Ini biasanya di hadapan EDTA kelat ion Mg2+
yang dibutuhkan oleh enzim pendegradasi DNA yang disebut Dnase. Idealnya, dinding sel
dicerna secara enzimatik (mis. Perlakuan lisozim bakteri) dan membran sel harus dilarutkan
menggunakan deterjen. Gangguan fisik perlu dijaga seminimal mungkin dan harus melibatkan
pemotongan atau squasing sel dari pada penggunaan kekuatan geser. Jika terjadi gangguan
harus dilakukan pada 4°C, menggunakan peralatan gelas dan yang telah diautoklaf untuk
menghancurkan aktivitas Dnase. Setelah pelepasan asam nukleat dari sel, RNA dapat
dihilangkan dengan perlakuan ribonuklease (RNase) yang telah dipanaskan untuk
menonaktifkan kontaminan Dnase. RNase relatif stabil terhadap panas hasil dari obligasi
disulfida, yang memastikan renaturasi cepat dari molekul saat pendinginan. Kontaminan utama
lainnya, protein, dihilangkan dengan mengocok larutan secara lembut dengan air fenol jenuh
atau dengan campuran fenol-kloroform, yang keduanya akan mengubah sifat protein tetapi
bukan asam nukleat. Sentrifugasi emulsi yang dibentuk oleh pencampuran ini menghasilkan
fase organik yang lebih rendah, dipisahkan dari atas, fase cairan oleh antarmuka protein
terdenaturasi. Solusi cairan pulih dan dideproteinasi berulang kali, sampai tidak ada lagi bahan
yang terlihat diatas. Akhirnya, preparasi DNA yang dideproteinasi dicampur dengan dua
volume etanol absolut dan DNA dibiarkan mengendap keluar dari larutan dalam freezer.
Setelah sentrifugasi, pellet DNA dilarutkan kembali dalam buffer yang mengandung EDTA
untuk menonaktifkan DNases. Solusi ini dapat disimpan pada suhu 4°C selama minimal 1
bulan. Untuk mengecek intregritas DNA dengan agar gel elektrofosesis dan menentukan
konsentrasi dari DNA dengan menggunakan fakta bahwa 1 satuan absurbansi sama dengan
50𝜇g ml-1 DNA dan jadi

50 × 𝐴260 =concentration of DNA sample (𝜇g ml-1)

Kontaminan mungkin juga dapat diidentifikasi menggunakan UV sektrovotometry


scanning dari 200 sampai 300 nm. Rasio 260: 280 nm dari sekitar 1.8 mengindikasikan bahwa
sampel terbebas dari kontaminasi protein, yang mana absorbansi yang kuat pada 280 nm.

Isolasi RNA

Isolasi RNA sangat mirip dengan cara isolasi dari DNA, tetapi molekul RNA relatif
pendek, sehingga kurang mudah rusak oleh pengguntingan. Jadi gangguan sel dapat lebih kuat.
Namun RNA sangat rentan dicerna olehRNase.Yang mana hadir secara endogen pada variasi
konsentrasi pada tipe sel tertentu dan secara eksogen pada jari-jari. Sarung tangan diharuskan,
oleh karena itu dipakai dan detergen yang kuat sebaiknya dimasukkan pada medium isolasi
untuk mendenaturasi segera beberapa Rnase. Selanjutnya deprotonasi harus sangat ketat,
karena RNA sering berkaitan dengan protein. Perlakuan Dnase dapat menghapus DNA dan
RNA dapat diendapkan dengan etanol. Satu reagen dimana umumnya digunakan pada ekstraksi
RNA adalah guanadinium thiocyanate yang mana keduanya inhibitor kuat dari Rnase dan
protein denaturasi. Untuk memeriksa integritas ekstrak RNA dengan menganalisis
menggunakan gel elektroforesis. Paling banyak jenis RNA adalah molekul rRNA, 23S dan 16S
untuk prokariotik dan 18S dan 28S untuk eukariotik. Ini nampak berlainan pita pada gel agar
yang mengindiskasikan bahwa komponen yang lain mungkin menjadi utuh. Biasanya
dilakukan dibawah kondisi denaturasi untuk mencegah formasi struktur kedua pada RNA.
Konsentrasi RNA dapat diperkirakan menggunakan UV spektrofotometry, pada 260 nm. 1
absorbansi sebanding dengan 40 𝜇g ml-1 RNA oleh karena itu

40 × 𝐴260 =concentration of RNA sample ( 𝜇g ml-1)


Kontaminan dapat diidentifikasi dengan cara yang sama seperti DNA.

Pada banyak kasus, diperlukan sekali untuk mengisolasi eukariotik mRNA yang mana
hanya terdsiri 2-5% pada sel RNA dari campuran total molekul RNA. Dilakukan dengan
afinitas kromatografi pada oligo (dT)-cellulose columns. Pada saat konsentrasi garam yang
tinggi RNA mengandung poly A tirai ekor sebagai komplemen molekul oligo (dT) dari afinitas
column dan jadi RNA akan dipertahankan. Seluruh molekul RNA yang lain dapat dicuci
melewati kolom lebih lanjut larutan garam tinggi. Akhirnya dapat dielusi mengunakan
konsentrasi garam yang rendah. Spesies asam nukleat juga dapat subfraksional oleh fisik yang
lebih yang berarti seperti elektroforesis atau kromatografi berdasarkan perbedaan-perbedaan di
ff dalam ukuran asam nukleat fragmen atau karakteristik fisikokimia.

Elektroforesis asam nukleat

Elektroforesis di agarosa atau poliakrilamid gel adalah cara yang paling biasa untuk
memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukuran Teknik ini dapat digunakan analitis atau
preparatif dan dapat kualitatif atau kuantitatif. fragmen besar DNA seperti kromosom juga
dapat dipisahkan dengan modifikasi dari elektroforesis disebut berdenyut. Elektroforesis
lapangan gel (PFGE). Metode termudah dan paling banyak diterapkan adalah elektroforesis gel
agarosa horisontal, diikuti dengan pewarnaan dengan etidium bromida. pewarna ini mengikat
DNA oleh penyisipan antara pasangan ditumpuk dasar (interkalasi) dan itu menunjukkan warna
oranye yang kuat / merah fluorescence ketika diterangi dengan sinar ultraviolet. Sangat sering
elektroforesis digunakan untuk memeriksa kemurnian dan keutuhan persiapan DNA atau untuk
menilai sejauh mana reaksi enzimatik selama, misalnya, langkah-langkah yang terlibat dalam
kloning DNA. Gel agarosa dapat digunakan untuk memisahkan molekul yang lebih besar dari
sekitar 100 bp. Untuk resolusi yang lebih tinggi atau untuk pemisahan ff efektif dari molekul
DNA yang lebih pendek, gel poliakrilamida adalah metode yang disukai ketika elektroforesis
digunakan preparatif, potongan gel yang mengandung fragmen DNA yang diinginkan secara
fisik dihapus dengan pisau bedah. Dalam metode yang terakhir, potongan gel disegel dalam
tabung panjang yang berisi buffer dan kemudian ditempatkan di antara dua elektroda dalam
tangki berisi lebih buffer. Berlalunya arus listrik antara elektroda menyebabkan DNA
bermigrasi dari potongan gel, tetapi tetap terperangkap di dalam tabung dialisis dan karena itu
dapat dipulihkan dengan mudah.. Penggunaan 'kit' seperti standar dalam biologi molekuler
sekarang biasa. Sebuah alternatif untuk analisis konvensional asam nukleat dengan
elektroforesis adalah melalui penggunaan sistem uidicfl mikro. Secara pelan diproduksi unit
berbasis chip di mana volume mikroliter dapat digunakan dan dengan bantuan analisis
komputer memberikan banyak data yang diperlukan untuk analisis.

Pembatasan Pemetaan Fragmen DNA

Pemetaan pembatasan melibatkan analisis ukuran fragmen pembatas yang dihasilkan


oleh beberapa enzim pembatas secara individu dan dalam kombinasi. Prinsip pemetaan ini
diilustrasikan, di mana lokasi pembatasan dua enzim, A dan B, sedang dipetakan. Pembelahan
A memberikan fragmen 2 dan 7 kilobases (kb) dari molekul 9kb, dimaka kita dapat
memposisikan sebuah lokasi tunggal 2kb dari satu ujung. Demikian pula, B memberikan
fragmen 3 dan 6kb, sehingga memiliki lokasi 3kb tunggal dari satu ujung; tapi tidak mungkin
pada tahap ini untuk mengatakan jika dekat ke lokasi A atau di ujung DNA. Hal ini dapat diatasi
oleh pencernaan ganda. Jika fragmen yang dihasilkan adalah 2, 3 dan 4KB, maka A dan B
dipotong di ujung-ujung molekul; jika mereka 1, 2 dan 6kb, letaknya dekat satu sama lain.
Tidak mengherankan, pemetaan molekul nyata jarang yang sederhana seperti ini dan analisis
komputer dari panjang pembatasan fragmen biasanya diperlukan untuk membangun peta.

Metode Analisis Asam Nukleat

Ada banyak metode untuk menganalisis DNA dan RNA, Namun, banyak cara baru
termasuk penggunaan sistem array berbasis chip. Namun, metode tradisional masih digunakan
di banyak laboratorium.

1. DNA Blotting
Hal ini dapat dicapai dengan mentransfer DNA dari gel utuh pada sepotong
nitroselulosa atau membran nilon ditempatkan dalam kontak. memberikan catatan yang
lebih permanen dari sampel karena DNA mulai digunakan ff di luar dari gel yang tersisa
selama beberapa jam. Pertama gel direndam dalam alkali untuk membuat DNA beruntai
tunggal. Hal ini kemudian ditransfer ke membran sehingga DNA menjadi terikat untuk
itu di persis pola yang sama seperti yang awalnya pada gel. transfer ini, bernama
Southern blot.
1. RNA Blotting
Dengan teknik ini tidak hanya mungkin untuk mendeteksi molekul mRNA tertentu
tetapi juga dapat digunakan untuk mengukur relatif jumlah mRNA spesifik. Biasanya
untuk memisahkan transkrip mRNA dengan elektroforesis gel dalam kondisi denaturasi
karena ini meningkatkan resolusi dan memungkinkan estimasi yang lebih akurat dari
ukuran transkrip.
Metode analisis RNA lebih lanjut yang mengatasi masalah pembekuan RNA
disebut uji perlindungan ribonuklease. Langkah penting dalam bidang analisis RNA
adalah pengembangan RNAi (gangguan RNA), yang menghambat ekspresi gen. Di sini
DNA beruntai ganda mendorong degradasi mRNA. RNA berganda ganda dalam sel
dibelah oleh enzim pemain dadu, menghasilkan pembentukan 21-25 bp kecil yang
mengganggu RNA (siRNA). SiRNA saling melengkapi dengan untaian RNA target.
Protein RNAi kecil dipandu oleh siRNA ke mRNA yang sesuai, di mana target
kemudian dibelah dan tidak dapat diterjemahkan. Banyak bidang sekarang mendapat
manfaat dari penerapan teknik ini di bidang biologi molekuler dan bioteknologi.

Derivasi Probe Gen

Dalam beberapa kasus dimungkinkan untuk menggunakan protein terkait dari keluarga
gen yang sama untuk mendapatkan informasi tentang urutan DNA. Protein atau urutan DNA
yang serupa tetapi dari spesies yang berbeda mungkin juga memberikan titik awal untuk
menghasilkan apa yang disebut probe gen heterolog. Meskipun dalam beberapa kasus probe
telah diproduksi dan dikloning, dimungkinkan, dilengkapi dengan sekuens DNA dari database
DNA, untuk mensintesis secara kimiawi penyelidikan oligonukleotida untai tunggal. Biasanya
dilakukan oleh para peneliti gen yang dikendalikan oleh komputer dengan menghubungkan
dNTPs bersama-sama berdasarkan urutan yang diinginkan. Sangat penting untuk melakukan
pemeriksaan tertentu sebelum produksi probe untuk menentukan bahwa probe itu unik, tidak
dapat melakukan pelunakan sendiri atau pelengkap sendiri, yang semuanya dapat
membahayakan penggunaannya. DNA tersedia untuk menyiapkan suatu penyelidikan gen.
Dengan demikian dimungkinkan untuk mengisolasi dan memurnikan protein serta
mengurutkan bagian dari ujung N-terminal protein. Dari pengetahuan kita tentang kode
genetik, dimungkinkan untuk memprediksi berbagai sekuens DNA yang dapat mengkode
protein dan kemudian mensintesis urutan oligonukleotida yang sesuai secara kimia. Karena
degenerasi kode genetik, sebagian besar asam amino dikodekan oleh lebih dari satu kodon,
maka akan ada lebih dari satu kemungkinan urutan nukleotida yang dapat mengkode
polipeptida yang diberikan. Semakin lama polipeptida, semakin besar jumlah kemungkinan
oligonukleotida yang harus disintesis.

Pelabelan Molekul DNA Gen Probe

Prob gen dapat divisualisasikan oleh beberapa cara. Ada dua cara utama label probe
gen. Secara tradisional ini telah dilakukan menggunakan radioaktif label, tetapi label bebas
radioaktif. Mungkin label radioaktif paling sering digunakan adalah fosfor-32 (32P), meskipun
untuk beberapa teknik belerang-35 (35S) dan tritium (3H) yang digunakan. Hal ini dideteksi
oleh proses autoradiography, yang mana molekul berlabel probe, terikat sampel DNA,
misalnya terletak di membran nilon, ditempatkan dengan sebuah film X-ray-sensitif. Setelah
dipaparan, film dikembangkan dan tetap hanya sebagai hitam dan putih negatif dan
mengungkapkan lokasi tepat probe berlabel dan karenanya DNA yang telah hibridisasi.
Pelabelan langsung memungkinkan enzim seperti alkali fosfatase digabungkan secara
langsung DNA. Meskipun hal ini dapat mengubah karakteristik DNA probe gen, dapat analisis
cepat karena langkah-langkah perantara tidak diperlukan. Namun, label tidak langsung adalah
sekarang lebih populer. Hal ini bergantung pada penggabungan nukleotida yang memiliki label
yang melekat. Saat ini, tiga label utama yang digunakan adalah biotin, fluorescein dan
digoxygenin. Molekul-molekul yang berikatan kovalen dengan berhubungan dengan
nukleotida menggunakan lengan spacer karbon atom 7, 14 atau 21. Protein tertentu kemudian
dapat digunakan sebagai jembatan antara nukleotida dan protein seperti enzim. Pada sistem
deteksi bergantung pada autoradiography, yang diperlukan untuk radiolabels, serangkaian
reaksi yang mengakibatkan warna atau cahaya atau chemiluminescent reaksi berlangsung. Hal
ini memiliki implikasi penting praktis karena autoradiography dapat mengambil 1-3 hari,
sedangkan warna dan reaksi chemiluminescent mengambil menit.

Akhir label molekul DNA

Bentuk yang paling sederhana label DNA adalah dengan 5’ atau 3’ akhir label; 5’ akhir
label melibatkan reaksi transfer fosfat dimana 5’ DNA yang digunakan sebagai probe dihapus
dan di tempatnya berlabel fosfat, biasanya 32P, yang ditambahkan. Hal ini biasanya dilakukan
dengan menggunakan dua enzim; pertama, alkali fosfatase, digunakan untuk menghapus Grup
fosfat yang ada dari DNA. Kedua enzim, polynucleotide kinase, ditambahkan, catalyses yang
transfer grup fosfat (32P-label) sampai akhir 5’ DNA. Label prob baru kemudian dimurnikan,
oleh kromatografi melalui kolom Sephadex. Menggunakan ujung molekul DNA, akhir 30’
sedikit lebih rumit.

Pelabelan Primer Acak

Dalam pelabelan primer acak, DNA yang akan diberi label didenaturasi terlebih dahulu
dan kemudian ditempatkan dalam kondisi renaturasi dengan adanya campuran berbagai urutan
heksam atau heksanukleotida yang berbeda. Hexamers ini, secara kebetulan, akan mengikat
sampel DNA di manapun menemukan urutan yang saling melengkapi dan dengan demikian
DNA akan dengan cepat mendapatkan taburan acak heksanukleotida yang dianilasikannya.
Masing-masing hexamers dapat bertindak sebagai primer untuk sintesis untai DNA segar yang
dikatalisis oleh DNA polimerase karena memiliki gugus 30-hidroksil. Fragmen Klenow dari
DNA polimerase digunakan untuk pelabelan primer acak karena tidak memiliki aktivitas
exonuclease 50–30. Ini disiapkan dengan pembelahan DNA polimerase dengan subtilisin,
memberikan fragmen enzim besar yang tidak memiliki aktivitas exonuclease 50 hingga 30,
tetapi yang masih bertindak sebagai 50 hingga 30 polimerase. Dengan demikian, ketika enzim
Klenow dicampur dengan sampel DNA yang dianil dengan adanya dNTP, termasuk setidaknya
satu yang diberi label, banyak peregangan pendek dari DNA berlabel akan dihasilkan (Gambar
1.9).

Terjemahan Torehan

Metode tradisional pelabelan DNA adalah dengan proses terjemahan Torehan.


Konsentrasi rendah DNase I digunakan untuk sesekali membuat torehan untai tunggal dalam
DNA untai ganda yang akan digunakan sebagai penyelidikan gen. DNA polimerase kemudian
mengisi torehan, menggunakan deoksiribonukleosida trifosfat (dNTP) yang tepat, pada saat
yang sama membuat torehan baru ke sisi 30 dari yang sebelumnya. Dengan cara ini, torehan
diterjemahkan sepanjang DNA.

Pimerase Chain Reaction

Salah satu alasan digunakannya PCR adalah kesederhanaan reaksi yang bagus dan
relatif mudah langkah-langkah praktis untuk manipulasi. Sering kali ini adalah salah satu
teknik yang digunakan ketika analisis DNA dan RNA. PCR digunakan untuk memperkuat
ketepatan fragmen DNA dari campuran kompleks bahan mulai, biasanya disebut template
DNA, dan biasanya memerlukan sedikit DNA pemurnian. Hal Iiu membutuhkan pengetahuan
tentang beberapa informasi urutan DNA yang membentuk fragmen DNA harus diperkuat. Dari
informasi ini, dua oligonucleotide primersdisintesis secara kimia, masing-masing melengkapi
peregangan DNA ke sisi 3’ dari target DNA, satu oligonucleotide untuk masing-masing dua
untai DNA. Hasilnya adalah amplifikasi fragmen DNA tertentu yang obviates perlunya
prosedur kloning memakan waktu lebih.