Centro de Ciencias Básicas.

Departamento de Química.
Academia de Química.

Lic. Químico Fármaco Biólogo.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

Materia: Análisis de Alimentos

Profesora: M. en C. Adela Aranda Delgado

Alumna
Flores Ibarra Joselyn Georgina.

Marzo 03, 2019

Método de Biuret
El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la
formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un
color violeta característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da
por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se
basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o
por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones
libres de los átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del
reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable;
es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en
configuración tris y amoniaco.
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los
enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4NH. La intensidad de
coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y
la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La
sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de
proteínas en preparados muy concentrados. (Nollet, 1996)

Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas (Rango: 10-1000 ug/ml)

El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos reacciones
químicas. Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se
unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan
el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los
residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El
Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La
reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando
el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el
ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos
da lugar a un complejo de color azul intenso en la solución. Al producirse dicha reacción
hay un cambio en el color de la muestra que puede ser cuantificado determinando la
absorbancia a 660 nm (Olson & Markwell, 2007). La cantidad de proteína en la muestra
puede ser estimada utilizando una curva de calibración con una solución de una proteína
estándar seleccionada, tal como la BSA.
Figura 3. Representación esquemática del ensayo de Lowry.

Las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, y lo más importante, su exactitud. Sin
embargo, requiere de más tiempo que
otros ensayos, y muchos compuestos
comúnmente utilizados en búferes de
preparación de proteínas (tales como
detergentes, carbohidratos, glicerol,
tricina, EDTA, Tris) interfieren con el
ensayo de Lowry y forman precipitados
(Tabla 3) (Olson & Markwell, 2007). No
obstante, el efecto de estas substancias
puede ser reducido diluyendo la muestra,
pero sólo si la concentración de proteínas
es lo suficientemente alta (Waterborg &
Matthews, 1984). Además, se ha
demostrado que el tiempo para realizar
este ensayo puede reducirse al aumentar
la temperatura o utilizando un horno microondas (Waterborg & Matthews, 1984)
Método turbidimétrico
La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes
comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en
ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones se puede utilizar como un índice
de la concentración de proteínas. Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes,
sin embargo las principales desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la
velocidad de precipitación así como no permiten diferenciar entre proteínas y compuestos
insolubles en ácidos tales como ácidos nucleicos. (Layne, 1957)
Unión de colorantes
Controlando el pH y la fuerza iónica del medio los grupos funcionales ácidos y básicos de
las proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos de carga opuesta. Al realizarse la
unión se presenta coloración o bien un cambio de ésta. Comúnmente se usan colorantes
sulfonados los cuales reaccionan a pH ácido con el grupo ε-amino de la lisina y el grupo
guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un número limitado de α-amino
terminales. (Nollet, 1996)
Extracción de proteínas. (Método de Osborne y Mendel).
El método se fundamenta en la relación estructura-solubilidad de las proteínas. Por
ejemplo, se sabe que la zeína que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones
alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgánicas. Las
glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y bastante
soluble en sosa y potasa. Es importante notar que la mayoría de nitrógeno proveniente de
proteínas es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albúminas y
prolinas son solubles en disoluciones alcalinas diluidas. (Osborne, 1914)

REFERENCIAS
 LAYNE E. 1957. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring
Proteins. Methods in Enzimology, 3:447-454
 NOLLET, L. M. L (Ed).; Handbook of Food Analysis; M. Dekker, Nueva York 1996.
 Olson B, Markwell J. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc
Protein Sci. 2007;0:Unit 3.4
 OSBORNE T. B; Mendel L. B. 1914. Nutritive properties of proteins of the maize
kernel. Journal of Biological Chemistry 18, 1 (1914)
 Waterborg J, Matthews H. The lowry method for protein quantitation. Methods Mol
Biol. 1984;1:1-3