Residu biji kopi hijau: Sumber antioksidan yang berkelanjutan

Ekstraksi minyak dari biji kopi hijau menghasilkan sisa massa yang dibuang
oleh agribisnis dan belum sebelumnya dipelajari. Bioaktif metabolit
sekunder dalam kopi termasuk senyawa fenolik antioksidan, seperti asam
klorogenik. Biji kopi juga mengandung kafein, methylxanthine yang sangat
penting secara farmasi. Di sini, kami melaporkan profil kimia, aktivitas
antioksidan, dan sitotoksisitas ekstrak hidroetanol dari Coffea arabicaL
hijau. residu biji. Ekstrak biji hijau dan residu memiliki profil kimia yang mirip,
mengandung senyawa fenolik asam klorogenat dan kafein. Lima monoacyl
dan tiga diacyl ester dari asam trans-cinnamic dan quinic acid diidentifikasi
dengan kromatografi cair kinerja ultra / ionisasi elektrospray-waktu
quadruple dari spektrometri massa penerbangan. Ekstrak residu
menunjukkan potensi antioksidan dalam tes DPPH, ABTS, dan pyranine
dan sitotoksisitas rendah. Jadi, co Residu minyak ffee memiliki potensi
besar untuk digunakan sebagai bahan baku
suplemen diet, kosmetik dan produk farmasi, atau sebagai sumber senyawa
bioaktif

1. Pendahuluan
Secara global, kopi adalah komoditas yang menonjol. Bersama pohon
ffee milik keluarga Rubiaceae, dan Coffea arabicaL. (Kopi arabika)
menghasilkan minuman kualitas terbaik (Abrahão, Pereira, Lima,
Ferreira, & Malta, 2008; Monteiro & Trugo, 2005). Banyak penelitian
tentang kopi diterbitkan karena kepentingan ekonomi dan budaya, serta
sifat biologisnya yang bermanfaat. Di antara senyawa bioaktif
hadir dalam biji kopi, senyawa fenolik menonjol karena mereka
tindakan antioksidan. Dari senyawa fenolik ini, asam klorogenat adalah
kelas utama yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan. Ini
Senyawa memiliki sifat pembersih radikal bebas in vitro dan mencegah
propagasi proses oksidatif (Ohnishi et al., 1994; Rivelliet al., 2007).
Asam klorogenik dihasilkan dari esterifikasi quinic asam dengan satu
atau lebih turunan asam trans-sinamat. Ini Senyawa dapat
diklasifikasikan berdasarkan jenis, nomor, dan posisi
residu asil. Asam klorogenik yang paling umum dalam kopi adalah
monoester asam caffeoylquinic, terutama asam 5-caffeoylquinic (5-CQA)
(Parras, Martínez-Tomé, Jiménez, & Murcia, 2007). Sebagai
tambahannya Senyawa fenolik, metabolit sekunder lain yang ada dalam
kopi adalah diterpenes (misalnya, kahweol dan cafestol), triterpen,
methylxanthines (kafein, theobromine, dan theophylline), dan trigonelline
(Monteiro dan Trugo, 2005; Parras et al., 2007). Selain terkenal sifat
stimulan kafein, penelitian juga menunjukkan anti-
potensi oksidan melalui inhibisi in vitro peroksidasi lipid diinduksi oleh
radikal bebas (Parras et al., 2007). Selain metabolit sekunder dalam kopi,
kosmetik industri memiliki minat pada minyak kopi hijau, yang sebagian
besar terdiri dari gliserida dan asam lemak bebas. Minyak ini memiliki
sifat kosmetika, di mencakup retensi kelembaban kulit dan tindakan
potensial dalam mencegah photoaging (Velazquez Pereda Mdel et al.,
2009). Biji kopi hijau kandungan minyak sekitar 15% (v / w) dari C.
arabika, dan minyak diproduksi oleh menekan biji hijau (Speer dan
Kölling-Speer, 2001). Yang diperoleh residu adalah bahan kimia yang
kaya yang biasanya diabaikan oleh industri kopi, dan tidak ada informasi
dalam literatur ilmiah mengenai komposisi kimianya dan sifat
biologisnya. Maka, kami bertujuan untuk menentukan komposisi kualitatif
dan kuantitatif, aktivitas antioksidan , dan sitotoksisitas a ekstrak
hidroetanol dari residu dari ekstraksi minyak hijau C.arabica biji. Untuk
tujuan perbandingan, komposisi kimia dan aktivitas antioksidan dari
ekstrak hydroetanol biji hijau sebelumnya ekstraksi minyak juga dinilai.
Ekstrak ini dapat digunakan lebih lanjut dalam suplemen diet, metics,
atau formulasi farmasi sebagai agen antioksidan atau sebagai sumber
metabolit sekunder kopi yang penting, seperti kafein dan asam
klorogenik. Penelitian ini juga memiliki arti penting dari suatu lingkungan.
sudut pandang mental dan dapat memenuhi prinsip-prinsip kimia hijau
melalui penggunaan kembali produk sampingan yang dihasilkan oleh
industri, meminimalkan pembuangan mereka di lingkungan (Farias dan
Fávaro, 2011; Prado, 2003).

2. Bahan dan metode

2.1. Bahan tanaman Residu biji hijau dan biji hijau C. arabika diperoleh
dari koperasi kopi Cooxupé (Guaxupé, Minas Gerais, Brasil). hijau sisa
biji (300 g) dan biji kopi hijau (250 g) dikeringkan di udara oven sirkulasi
selama 24 jam pada 40 ° C dan bubuk di pabrik pisau.

2.2. Analisis granulometri Analisis granulometri dilakukan dengan

pengayakan (Brasil, 2010). Sebuah aliquot (300,0 g) dari residu biji hijau
kering ditempatkan di saringan pertama dari satu set enam Tyler ®
sieves (600, 250, 180, 125, 75, dan Bukaan 63mm) dan diguncang oleh
alat bergetar (Produtest®) untuk 15 menit. Pada akhir proses, serbuk
disimpan di masing-masing saringan (%, w / w) ditimbang untuk
menentukan jenis bubuk (Brasil, 2010) dan juga untuk menghitung
ukuran partikel rata-rata (APS) menggunakan Persamaan. (1) (Aulton,
2005). APS = Σ (retensi persentase × rata-rata bukaan mesh) / 100 (1)
Aperture rata-rata dari jerat sesuai dengan aritmatika sederhana mean
dari lobang saringan yang melaluinya partikel berlalu dan lobang
saringan di mana mereka dipertahankan.

2.3. Penentuan air dalam bahan tanaman kering dan bubuk Penentuan
air dalam sampel tanaman kering dan bubuk (2,0 g) dicapai dengan
mengukur penurunan berat badan setelah pengeringan oven sirkulasi
udara (110 ° C) hingga berat konstan (Brasil, 2010). Hasilnya dinyatakan
sebagai rasio antara massa awal dan akhir dari bahan tanaman (% w /
w), berdasarkan rata-rata dari tiga penentuan

2.4. Pemilihan campuran pelarut untuk ekstraksi Aliquot dari residu biji
hijau (1,0 g) disonikasi dengan empat campuran hidroalkohol yang
berbeda: 70 dan 80% etanol dan 60 dan 80% metanol, secara terpisah.
Setiap ekstraksi terjadi dalam tiga langkah menggunakan 5 mL pelarut
selama 20 menit per langkah, dan rasio total pelarut / sampel adalah 15
mL / g. Solusi ekstraktif dari masing-masing campuran pelarut adalah
dikumpulkan, disaring, dan dikeringkan dalam SpeedVac (Thermo
Scientific® SPD131DDA). Kandungan fenolik total (Bagian 2.6) dan
antioksidan aktivitas (Bagian 2.10) dari ekstrak ini ditentukan oleh
pemilihan campuran pelarut yang paling cocok untuk ekstraksi skala
besar.

2.5. Persiapan ekstraksi skala besar Residu biji hijau (300 g) dan biji hijau
(250 g) diekstraksi dengan maserasi dengan etanol 70% (40 ° C).
Ekstraksinya diwujudkan dalam tiga langkah 24, 48, dan 48 jam,
menggunakan 1500 mL dari 70% etanol dalam setiap langkah untuk
residu biji hijau dan 1250 mL di setiap langkah untuk biji hijau. Solusi
ekstraktif dikumpulkan, disaring, dipekatkan di bawah tekanan yang
dikurangi untuk eliminasi etanol, dan kemudian lyophilized,
menghasilkan ekstrak kering dari residu biji hijau C. arabika (EESR) dan
biji hijau C. arabika (EESe).
2.6. Penentuan kandungan fenolik total Kandungan fenolik (TP) total
ekstrak kering ditentukan dengan metode yang sebelumnya dijelaskan
oleh Singleton, Orthofer, & Lamuela- Raventós, 1999 menggunakan
reagen Folin-Ciocalteu dan kurva analitis ditentukan dari asam galat
(1,25-20 μg / mL) untuk pemilihan a campuran pelarut yang cocok untuk
ekstraksi (Bagian 2.3) dan 5-CQA (2–30 μg / mL) untuk penentuan dalam
ekstraksi berskala besar (Bagian 2.4). Semua ekstrak dilarutkan dalam
air deionisasi pada konsentrasi 30 μg / mL. Eksperimen dilakukan dalam
rangkap tiga. Hasilnya adalah diekspresikan dalam mikrogram dari total
senyawa fenolik yang setara hingga 5- CQA atau asam galat per 100 μg
ekstrak. 2.7. Contoh pretreatment untuk kromatografi cair kinerja ultra
(UPLC) analisis EESR dan EESe (15 mg) dilarutkan dalam 1,0 mL
metanol: - larutan air (90:10, v / v) dan diserahkan ke ekstraksi fase padat
(SPE, Phenomenex® Strata ™ C18-E; 15 × 10 mm; 55 μm). The C18
cartridge diaktifkan dengan metanol (10 mL) dan dikondisikan dengan
metanol: air (90:10, v / v). Mengikuti penerapan sampel, kartrid dielusi
dengan 4,0 mL metanol: air (90:10, v / v). Lulusan dari EESR dan EESe
dikeringkan, dilarutkan dalam metanol (1,0 mL), dan disaring melalui
membran polyvinylidene difluoride (PVDF) (0,22 μm, Millipore®)
sebelum analisis UPLC.

2.9. Kromatografi cair kinerja-ultra / ionisasi elektropray yang terganggu

waktu analisis spektrometri massa penerbangan (UPLC-ESI-QToF-
MSE) EESR Analisis dilakukan pada sistem Acquity UPLC (Waters®)
digabungkan ke sistem quadrupole / waktu penerbangan (Xevo-QTOF,
Waters®). Kondisi kromatografi sama dengan yang digunakan untuk
UPLCUV analisis dengan modifikasi berikut: BEH C18 Waters® kolom
(2.1 × 150 mm; 1.7 μm) digunakan dengan laju aliran 0,4 mL min − 1,
oven kolom ditetapkan menjadi 40 ° C, dan injeksi volume 5 μL. Mode
ESI− diperoleh dalam kisaran 110–1180 Da, temperatur sumber
ditetapkan pada 120 ° C, desolvasi suhu gas adalah 350 ° C, aliran gas
desolvasi adalah 500 L / jam, tegangan kerucut ekstraksi adalah 0,5 V,
dan tegangan kapiler 2,6 kV. Dalam mode scan rendah, tegangan
kerucut adalah 35 V dengan energi tabrakan sebesar 5 eV (trap). Dalam
mode scan tinggi, tegangan kerucut itu 35 V dengan tanjakan energi
tabrakan 20-40 eV (perangkap). Leucine encephalin digunakan sebagai
kunci utama. Modus akuisisi adalah MSE. Itu peralatan dikontrol oleh
Masslynx 4.1 (Waters® Corporation) perangkat lunak. 2.10. DPPH uji
radikal pembilasan Aktivitas pembilasan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH%) ditentukan menggunakan metode yang diusulkan oleh Mensor
et al. (2001) dengan modifikasi berikut. Untuk pemulungan radikal
 evaluasi untuk pemilihan pelarut untuk ekstraksi (Bagian 2.3), 60% dan
80% metanol dan 70% dan 80% ekstrak kering etanol dilarutkan dalam
air (7,0 μg / mL), dan 1,0 mL setiap larutan berair ditambahkan ke 2,5 ml
larutan DPPH metanol (0,004%, b / v). Untuk evaluasi pemulungan
radikal EESR dan EESe (Bagian 2.4), 1.0 mL larutan berair EESR (0-25
μg / mL) dan EESe (0-30 μg / mL untuk EESE) ditambahkan ke 2,5 mL
DPPH metanol solusi (0,004%; b / v). Asam askorbat (0,5-5,0 mg / mL;
larutan encer) digunakan sebagai standar. Tes dilakukan dalam rangkap
tiga, dan persentase penghambatan DPPH% dihitung. Dari nilai-nilai
persentase penghambatan DPPH%, kurva penghambatan dan IC50
nilai-nilai diperoleh.

2.10. DPPH uji radikal pembilasan

Aktivitas pembilasan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH%)
ditentukan menggunakan metode yang diusulkan oleh Mensor etal.
(2001) dengan modifikasi berikut. Untuk pemulungan radikal
evaluasi untuk pemilihan pelarut untuk ekstraksi (Bagian 2.3),
60% dan 80% metanol dan 70% dan 80% ekstrak kering etanol
dilarutkan dalam air (7,0 μg / mL), dan 1,0 mL setiap larutan berair
ditambahkan ke 2,5 ml larutan DPPH metanol (0,004%, b / v).Untuk
evaluasi pemulungan radikal EESR dan EESe (Bagian 2.4),
1.0 mL larutan berair EESR (0-25 μg / mL) dan EESe
(0-30 μg / mL untuk EESE) ditambahkan ke 2,5 mL DPPH metanol
solusi (0,004%; b / v). Asam askorbat (0,5-5,0 mg / mL; larutan
encer)
digunakan sebagai standar. Tes dilakukan dalam rangkap tiga, dan
persentase penghambatan DPPH% dihitung. Dari nilai-nilai
persentase penghambatan DPPH%, kurva penghambatan dan
IC50
nilai-nilai diperoleh.

2.11. ABTS radikal scavenging assay

Kation 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
tes radikal (ABTS% ++) dilakukan seperti yang dijelaskan oleh
Rufino et al.
(2007) dengan modifikasi berikut. Setelah pembentukan ABTS% +
dari larutan metanol garam diammonium dari 2,2′-azino-bis
(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 2 mL larutan ABTS% +
ditambahkan ke 1030 μL dari EESR dan solusi air EESe pada yang
berbeda
konsentrasi (1,55-27,18 μL / mL). Penghambatan persentase
 ABTS + ditentukan seperti yang dijelaskan dalam pembasmian
radikal DPPH
pengujian kadar logam. Asam askorbat (0,48–3,49 μL / mL; larutan
berair) digunakan sebagai
standar. Tes dilakukan dalam rangkap tiga.

2.12. Efek supresif dari uji radikal peroksil (AAPH / pyranine)

Tes ini dilakukan mengikuti metode yang diusulkan oleh Campos,
Sotomayor, Pino, dan Lissi (2004). A 2,2′-azobis (2-
methylpropionamidine)
dihidroklorida (AAPH) solusi (125 μL; 20 mM) ditambahkan ke
100 μL pyranine (0,005 μg / mL) dalam piring 96-well yang gelap.
EESR
solusi (25 μL) ditambahkan ke pelat pada konsentrasi yang
berbeda
(5-20 μg / mL). Trolox digunakan sebagai senyawa referensi
antioksidan
(0,005-0,02 μg / mL), dan kontrol negatif disiapkan tanpa
EESR atau Trolox, seperti yang dijelaskan di atas. Semua solusi
disiapkan
fosfat buffered saline (PBS). Volume akhir dari pelat reaksi
250 μL. Pemutihan pyranine dimonitor menggunakan eksitasi
panjang gelombang 460 nm dan panjang gelombang emisi 510 nm dalam a
Spectramax M2 microplate reader (Molecular Devices®, USA) pada 37 ° C.
Hasilnya dinyatakan sebagai aktivitas antioksidan setara Trolox
(TEAC). Tes dilakukan dalam rangkap tiga.
2.13. Uji sitotoksisitas MTT
Potensi sitotoksik EESR dievaluasi oleh 3- (4,5-dimethylthiazol-
2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay
(Chiari et al., 2012; Mosmann, 1983) terhadap tiga jalur sel (manusia
keratinosit (HaCaT), fibroblas manusia (HDFa), dan hepatoma manusia
sel (HepG2)). Sel-sel ditanam dalam labu kultur yang mengandung
Medium Eagle (DMEM) Dulbecco yang dimodifikasi dilengkapi dengan 10%
serum dan antibiotik betis janin (penisilin, 100 U / mL; streptomisin,
0,1 mg / mL). Kultur diinkubasi pada 37 ± 2 ° C dalam suatu atmosfer
5% CO2. Sel-sel ditransfer ke piring 96-baik dengan sel
kepadatan 1,0 × 106 sel / mL. Piring diinkubasi selama 24 jam untuk selesai
sel adhesi ke piring. Perawatan (selama 24 jam) melibatkan a
100-μL kontrol positif (10% dimethyl sulfoxide (DMSO)), negatif
kontrol (DMEM tanpa serum), dan konsentrasi EESR yang berbeda
(0–11.000 µg / mL dilarutkan dalam DMEM tanpa serum). Kemudian,
perawatan dihapus, piring dicuci dengan PBS dan 100 μL
MTT dalam PBS (1,0 mg / mL) ditambahkan ke masing-masing dengan baik,
diikuti dengan inkubasi
selama 3-5 jam. Setelah itu, supernatan dipindahkan, dan formazan
kristal dilarutkan dalam 100 µL alkohol isopropil. Itu
persentase sel non-viabel dihitung dalam kaitannya dengan absorbansi
dari kontrol negatif (595 nm), seperti yang diusulkan oleh Zhang, Wu,
Tashiro, Onodera, & Ikejima (2004). Dengan demikian, kelangsungan hidup
diperoleh
menggunakan rumus berikut: persentase sel yang tidak dapat hidup = [(Anegatif
kontrol − Atreatment) / Kontrol anegatif] × 100. Untuk penentuan layak
sel, persentase ini dikurangi dari 100%. Untuk sel yang berbeda
garis, IC50 dihitung dengan regresi linier yang diperoleh
kurva. Uji sitotoksisitas dilakukan setidaknya tiga independen
tes, dan setiap perawatan uji diwujudkan dalam rangkap tiga.
2.14. Analisis statistik
Analisis dilakukan menggunakan perangkat lunak InStat3 (GraphPad®,
San Diego, CA, USA). Hasilnya disajikan sebagai mean dan
standar deviasi (SD). Analisis statistik dari data dilakukan
menggunakan analisis satu arah varians (ANOVA) dan Tukey's post-test
dengan asumsi signifikansi untuk p <.001, p <.01, dan p <.05

3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Pemilihan campuran pelarut untuk ekstraksi dan
skala besar ekstraksi Efisiensi dan selektivitas ekstraksi senyawa fenolik dari
bahan tanaman bervariasi dengan banyak faktor, seperti mereka struktur kimia,
teknik ekstraksi, kemungkinan senyawa yang mengganggu, dan ukuran partikel
(Naczk & Shahidi, 2004). Jadi, biji hijau residu C. arabika dikarakterisasi dan
diklasifikasikan menurut Brasil Pharmacopeia sebagai bubuk halus (semua
partikel berlalu melalui melalui ayakan dengan aperture mesh nominal 180 mm)
dan ukuran partikel rata-rata yang dihitung adalah 122,1 μm (Aulton, 2005).
Selanjutnya, kelarutan senyawa ini berhubungan dengan tingkat polimerisasi dan
interaksinya dengan komponen tanaman lainnya dan, terutama, jenis pelarut
yang digunakan untuk ekstraksi (Naczk & Shahidi, 2004). Pelarut paling efisien
untuk senyawa fenolik ekstraksi adalah campuran metanol, etanol, air, atau
hidroalkohol (Shouqin, Jun, & Changzheng, 2005). Dalam studi ini, 60% dan
80% metanol dan 70 dan 80% etanol diuji sebagai campuran pelarut untuk
ekstraksi menggunakan sonication. Hasil, isi senyawa fenolik total, dan aktivitas
antioksidan (metode DPPH) dari ekstrak tersebut ditunjukkan pada Tabel 1.
Kandungan fenolik total ekstrak (Tabel 1)

dihitung menggunakan kurva analitik asam galat. Mempertimbangkan tingkat

kepercayaan minimal (p <.05), Tabel 1 menunjukkan bahwa 70% etanol dan
60% ekstrak residu biji metanol hijau menunjukkan nilai yang lebih tinggi dari
penghambatan DPPH% (22,5%) dibandingkan dengan 80% metanol dan 80%
etanol (18,8% dan 18,7%, masing-masing). Selanjutnya, 70% etanol dan 80%
ekstrak residu ekstrak biji hijau metanol kandungan fenolik total yang lebih tinggi
(14,7% dan 13,8%, masing-masing) dibandingkan ke ekstrak lainnya. Karena
hasil ekstrak mirip dan berdasarkan hasil di atas dan prinsip-prinsip kimia hijau,
seperti toksisitas dan keberlanjutan (Farias dan Fávaro, 2011; Prado, 2003),
70% etanol dipilih untuk ekstraksi yang diusulkan. Hasil ekstraksi skala besar
dengan maserasi dengan 70% etanol hijau C. biji arabika residu (EESR) dan biji
hijau (EESe) masing-masing 21 dan 20,4% (b / b), mempertimbangkan kadar air
dari bahan tanaman kering (8,8% dan 4,4% (b / b), masing-masing). 3.2. Analisis
kimia EESR dan EESe Penentuan kandungan fenolik total EESR dan EESe
(Tabel 2) menggunakan metode Folin-Ciocalteu direalisasikan menggunakan
kurva analitik 5-CQA. Mengenai analisis kimia dari Senyawa fenolik, assay Folin-
Ciocalteu tidak memberikan rincian profil senyawa fenolik yang ada dalam
sampel dan didasarkan pada penentuan kapasitas mengurangi sampel. Di sisi
lain tangan, sebagai tes awal, itu menunjukkan bahwa ekstrak yang diteliti
memiliki kandungan fenolik yang signifikan dan aktivitas antioksidan yang
potensial, seperti yang ditunjukkan di bawah ini oleh tes DPPH, ABTS, dan
pyranine (Bagian 3.3). Kandungan fenolik total ditentukan dalam EESR (27,9%,
b / b) secara statistik (p <.05) sama dengan EEe (27,4%, b / b) (Tabel 2) dan
dapat dianggap tinggi jika dibandingkan dengan kopi lainnya produk sampingan
dan matriks makanan. Mengenai isi fenolik dari produk sampingan kopi lainnya,
Murthy dan Naidu (2012) menemukan bahwa 60% ekstrak isopropanol dari kulit
perak, menghabiskan limbah, dan ceri sekam industri kopi mengandung 25%,
19%, dan 17% (b / b) fenolik senyawa, masing-masing. Namun, Sant'Anna dkk.
(2017) ditemukan isi 0,6% dalam ekstrak berair dari dibakar menghabiskan gelap
kopi bubuk, sedangkan Zuorro & Lavecchia (2012) menemukan nilai dari 1,8%
dan 2,2% (bahan kering) untuk 50% ekstrak etanol kopi yang dihabiskan dasar
dikumpulkan dari bar kopi dan kapsul, masing-masing. Mengenai
matriks makanan lainnya Peschel et al. (2006) menganalisis etanol
ekstrak residu dari apel, pir, stroberi, dan jus bit merah
produksi dan memperoleh nilai mulai dari 4,2% hingga 12,2%. Sousa
et al. (2014) menentukan kandungan total senyawa fenolik sebagai 23%
(b / b) dalam ekstrak etanol 65% kulit batang Stryphnodendron adstringens
(Mart.) Coville. Semua studi ini menggunakan Folin-Ciocalteu
metode dan hasil dinyatakan sebagai setara asam galat.
Schieber, Keller, dan Carle (2001) mengembangkan metode menggunakan
kinerja tinggi
detektor liquid chromatography-photodiode array (HPLCPDA),
yang digunakan untuk pengembangan metode oleh UPLCUV
untuk identifikasi dan kuantifikasi metabolit sekunder
di EESR dan EESe untuk mengurangi waktu untuk kromatografi
analisis dan konsumsi pelarut. Kondisi HPLC dilaporkan
oleh Schieber et al. (2001) dipindahkan ke kondisi UPLC
menggunakan perangkat lunak Acquity® UPLC Column Calculator, dan ponsel
komposisi fase secara eksperimen dioptimalkan.
Gambar. 1 menunjukkan kromatogram untuk EESR menggunakan UPLC-UV
yang dipilih
kondisi. Kedua ekstrak (EESR dan EESe) menyajikan kromatografi serupa
profil. 5-CQA dan kafein diidentifikasi berdasarkan pada
perbandingan waktu retensi (tR) dan co-injeksi standar
ditambahkan ke ekstrak. Di sisi lain, asam caffeic, rutin, dan
quercetin tidak diidentifikasi dalam ekstrak melalui perbandingan tR.
Kurva analitik dari 5-CQA dan kafein diperoleh untuk
tujuan kuantifikasi. Nilai yang lebih tinggi dari senyawa-senyawa ini di EESR
(21,7 ± 0,72 dan 7,2 ± 0,22, masing-masing) daripada di EESe
(13,2 ± 0,35 dan 5,9 ± 0,19, masing-masing), seperti yang ditunjukkan pada
Tabel 2, mungkin
terkait dengan komponen yang diekstrak dari biji hijau, khususnya
minyak tetap, yang tidak ada dalam residu biji hijau. Sebagai tambahan,
isi ini lebih tinggi daripada yang dijelaskan dalam literatur untuk
ekstrak air dari biji hijau C. arabika, yang berkisar antara 9,7%
hingga 12,2% dari 5-CQA dan 3,4% hingga 3,8% kafein (Jeszka-Skowron,
Sentkowska, Pyrzyńska, & De Pena, 2016), ekstrak isopropanol 60% dari
produk sampingan kopi lainnya, yang mengandung 10,8% hingga 15,8% dari 5-
CQA
(Murthy & Naidu, 2012), dan ekstrak mengandung kulit kopi mengandung
silverskin
0,4% hingga 2,6% dari kandungan kafein (Narita & Inouye, 2012).

pektrum mengandung sinyal ion fragmen pada m / z 179 dengan seorang

kerabat
intensitas kurang dari 50%, yang merupakan karakteristik 3-CQA. Demikian,
senyawa 2 diduga diidentifikasi sebagai 3-CQA (asam neoklorogenik).
Spektrum massa senyawa 3 mengandung puncak basa pada m / z 191
dan sinyal ion fragmen pada m / z 179 dengan intensitas relatif 3%,
yang khas untuk 1-CQA atau 5-CQA. Kromatografi komersial
standar 5-CQA digunakan untuk mengkonfirmasi identitasnya melalui UPLCESI-
Analisis QTOF-MSE menggunakan perbandingan tR dan ko-injeksi dengan
EESR. Selanjutnya, C. arabika tidak mensintesis asam 1-asil-kinina
(Clifford et al., 2005). 4-Acyl CQA memiliki puncak dasar pada m / z 173 sebagai
ganti
191. Senyawa 4 menunjukkan sinyal ion fragmen pada m / z 173 dengan a
intensitas relatif 99% dan diduga diidentifikasi sebagai 4-CQA
(asam cryptochlorogenic).
Senyawa 5 menunjukkan sinyal ion molekuler pada m / z 337.0919
[M − H] - yang cocok dengan rumus empiris C16H17O8 p-coumaroylquinic
asam (pCoQA). Sinyal fragmen ion MS2 pada m / z 163
sesuai dengan bagian p-coumaroyl. Menurut Clifford et al.
(2003), adalah mungkin untuk membedakan isomer pCoQA mempertimbangkan
basis
puncak dalam spektrum MS2. Spektrum senyawa 5 mengandung basa
puncak pada m / z 191 dan diduga diidentifikasi sebagai 5-pCoQA.
Spektrum senyawa 6 mengandung sinyal ion molekuler pada m / z
367,1027 [M − H] - yang cocok dengan rumus empiris C17H19O9 dari
asam feruloylquinic (FQA). Sinyal fragmen ion MS2 pada m / z 193
sesuai dengan bagian feruloyl. Puncak basis diamati untuk senyawa
6 dalam spektrum MS2 pada m / z 191 adalah tipikal dari isomer FQA
diganti pada posisi 5 dari gugus asam quinic. Jadi, senyawa 6
secara diduga diidentifikasi sebagai 5-FQA.
Senyawa 10–12 menghasilkan ion induk [diacyl CGA-H] - pada m / z
515.1188, 515.1191, dan 515.1194 [M − H] -, masing-masing, yang
cocok dengan rumus empiris (C25H23O12) asam dicaffeoylquinic
(diCQA). Sinyal fragmen ion MS2 pada m / z 179 relatif terhadap
bagian caffeoyl. Tiga diCQA menghasilkan perbedaan halus dalam

fragmentasi, tetapi dengan tidak adanya MS3 spectra kunci hirarkis

Clifford dkk. (2005) tidak bisa digunakan. Dalam penelitian kami, yang pertama
dan terakhir
elute menghasilkan puncak basis MS2 pada m / z 173 sedangkan yang kedua
untuk mengelusi
menghasilkan puncak MS2 di m / z 191. Puncak MS2 ini sesuai
ke puncak basis MS3 yang dilaporkan oleh Clifford et al. (2003) dan sesuai
kami menetapkan mereka sebagai 3,4-diCQA, 3,5-diCQA dan 4,5-diCQA dalam
urutan
elusi.
Spektrum senyawa 10 dan 12 mengandung sinyal ion fragmen
di m / z 179 dengan intensitas relatif kurang dari 50%, menghalangi
kemungkinan identifikasi 1,4-diCQA. Menurut Clifford
et al. (2005), 3,4-diCQA menyajikan sinyal ion fragmen pada m / z 335
(∼15%) dalam spektrum MS2 yang tidak terdeteksi untuk 4,5-diCQA. Ini
sinyal ion fragmen diamati untuk senyawa 10 dengan intensitas relatif
17%, dan senyawa 10 diduga diidentifikasi sebagai 3,4-
diCQA. Senyawa 12 tidak menunjukkan sinyal ion fragmen ini dan, berdasarkan
pada kunci hirarkis untuk identifikasi CGA, itu putatif
diidentifikasi sebagai 4,5-diCQA. (Clifford et al., 2005).
Senyawa 11 mengandung puncak basa pada m / z 191 dalam spektrum MS2
nya,
serta sinyal ion fragmen pada m / z 179 dengan intensitas relatif
65%, menyarankan 1,5-diCQA atau 3,5-diCQA. Perbandingan fragmentasi
pola senyawa 11 (MS2), 1,5-diCQA dan 3,5-diCQA
(MS3) (Clifford et al., 2005) menunjukkan pola fragmentasi serupa
antara senyawa 11 dan 3,5-diCQA. Apalagi di C. arabika, esterifikasi
tidak terjadi pada posisi 1. Jadi, senyawa 11 adalah putatif
diidentifikasi sebagai 3,5-diCQA.
UPLC-ESI-QTOF-MSE dan analisis kimia UPLC-UV dari EESR menunjukkan
bahwa biji kopi hijau dan residu biji kopi hijau memiliki kesamaan
komposisi kimia kualitatif. Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa
EESR memiliki kandungan kafein dan 5-CQA yang lebih besar daripada yang
EESe pertimbangkan
signifikansi statistik (p <.05). Perbandingan dari
komposisi kimia EESR dan EESe menunjukkan bahwa biji kopi
residu mungkin menjadi sumber CGA dan kafein yang menarik.
3.3. Penentuan aktivitas antioksidan EESR dan EESe
Penentuan aktivitas antioksidan EESR dan EESe adalah
dilakukan menggunakan beberapa metode, yang memungkinkan pemahaman
yang lebih baik
hasil. Setiap uji mengevaluasi kapasitas antioksidan di bawah yang berbeda
kondisi eksperimental dan kinetika, dan, dengan demikian, hasilnya
komplementer (Jeszka-Skowron, Stanisz, & De Pena, 2016). Müller,
Fröhlich, dan Böhm (2011) menemukan bahwa aktivitas senyawa
sehubungan dengan radikal pemulung sangat bergantung pada pengujian
dipekerjakan. Penggunaan metode berbeda untuk menggambarkan antioksidan
aktivitas turunan tumbuhan telah banyak dijelaskan dalam literatur
(Dudonné, Vitrac, Coutière, Woillez, & Mérillon, 2009; Jeszka-
Skowron, Stanisz, dkk., 2016; Müller et al., 2011).
Metode DPPH didasarkan pada pengukuran kapasitas suatu
senyawa antioksidan untuk mengais radikal DPPH, menguranginya
hidrazin. Nilai-nilai IC50 dihitung dari data grafik
persentase penghambatan DPPH radikal versus asam askorbat, EESR,
atau konsentrasi EESe (μg / mL). Nilai IC50 untuk asam askorbat,
EESR, dan EESe masing-masing adalah 3,3, 17,0, dan 17,5 μg / mL. The IC50
nilai yang diperoleh untuk ekstrak sangat dekat dan secara statistik
sama (p <.05) dan lebih tinggi dari nilai IC50 untuk asam askorbat.
Murthy dan Naidu (2012) menguji produk sampingan kopi yang berbeda
diekstraksi dengan air: campuran isopropanol dan menemukan aktivitas
antioksidan
61% hingga 70% antara 100 dan 500 μg / mL. Dalam pekerjaan kami, kami
menguji 16 kali konsentrasi EESR yang lebih rendah (25,0 μg / mL) dan
menemukan a
Kegiatan pemulung DPPH sekitar 75%. Jeszka-Skowron,
Stanisz, dkk. (2016) mengevaluasi infus benih hijau C. arabika
dari berbagai negara. Infus diencerkan 1: 100 (v / v, metanol)
dan aktivitas pembilasan DPPH maksimum yang diperoleh adalah
59,8% menggunakan benih dari Peru. Benih Brasil dinilai oleh ini
penulis mampu mengais 47,5% dari radikal DPPH. Sebuah perbandingan
dengan hasil kami tidak mudah karena perbedaan dalam cara
ekstraksi, pengenceran, dan konsentrasi; Namun, menggunakan EESR

an EESe dalam konsentrasi maksimum yang dinilai (25,0 dan 30,0 μg /

mL, masing-masing), kegiatan pemulung DPPH adalah 75% dan 90%,
masing-masing.
Okonogi, Duangrat, Anuchpreeda, Tachakittirungrod, &
Chowwanapoonpohn (2007) membandingkan kapasitas antioksidan dari
kulit buah yang paling umum dikonsumsi di Thailand menggunakan radikal
pemborosan
aktivitas DPPH. Hasil terbaik dari kapasitas antioksidan
adalah untuk ekstrak kulit buah delima (Punica granatum L.) dengan
IC50 3,0 μg / mL, diikuti oleh ekstrak kulit rambutan (Nephelium
lappaceum L.) dan manggis (Garcinia mangostana L.), memiliki
Nilai IC50 masing-masing 6 dan 23 μg / mL.
Untuk mengkonfirmasi potensi antioksidan EESR dan EESe, kami menggunakan
Metode ABTS. Nilai IC50 untuk asam askorbat, EESR, dan EESe adalah
dihitung seperti yang dijelaskan untuk metode DPPH. Hasil untuk penghambatan
radikal kation ABTS juga ditunjukkan secara statistik
sama (p <0,05) nilai IC50 untuk EESR dan EESe (13,6 dan 12,0 μg / mL,
masing-masing) tetapi nilai yang lebih rendah untuk asam askorbat (2,0 μg / mL).
Chiari dkk. (2012) mengevaluasi aktivitas antioksidan menggunakan
Metode ABTS untuk ekstrak etanol 70% daun Psidium guajava L..
The IC50 ditentukan menjadi 114,4 μg / mL, sekitar 8,4 kali
lebih besar dari yang ditemukan untuk EESR dan 9,4 kali lebih tinggi dari yang
diperoleh
di EESe. Dengan demikian, ekstrak EESR dan EESe memiliki antioksidan yang
lebih besar
potensial dibandingkan dengan tanaman antioksidan penting lainnya
sumber.
Efek penekan pada radikal peroxyl (metode AAPH / pyranine)
juga dinilai untuk EESR. Metode ini didasarkan pada pengurangan dalam
penyerapan pyranine fluoresensi ketika teroksidasi oleh radikal peroxyl
(ROO%) (Campos et al., 2004). Gambar. 2 menunjukkan grafik kinetik
profil peluruhan fluoresensi pyranine dengan Trolox (Gambar 2a) dan
EESR (Gbr. 2b). Perbedaan antara area grafik integral dari kontrol dan setiap
konsentrasi Trolox dan EESR dihitung,
dan regresi linier dan koefisien linear dari garis (kemiringan) itu
diperoleh. Koefisien linear EESR kemudian dibagi oleh linear
koefisien Trolox. Hasil tes ini dinyatakan sebagai TEAC
unit, yaitu, aktivitas antioksidan yang setara dengan Trolox. Menurut
metode ini, EESR memiliki TEAC 1,63, menunjukkan lebih tinggi aktivitas
antioksidan untuk radikal peroksil daripada Trolox.
Hasil tes antioksidan ini menunjukkan bahwa ekstrak memiliki
aktivitas antioksidan serupa dengan ekstrak tumbuhan lain, dan, dengan
demikian, hijau
residu biji merupakan sumber yang menarik dari senyawa antioksidan, yang
terutama dikaitkan dengan kehadiran senyawa fenolik. Diantara
senyawa fenolik utama, asam klorogenik ditemukan lebih tinggi
jumlah biji kopi hijau. Dengan demikian, mereka mungkin bertanggung jawab
atas
aktivitas antioksidan dari ekstrak (EESR dan EESe) (Abrahão et al.,
2010).
Ohnishi dkk. (1994) menyimpulkan bahwa 5-CQA, 3,5-dicaffeoylquinic
asam, dan asam caffeic menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi
daripada askorbat
asam menggunakan metode DPPH, dan menyimpulkan bahwa 3,5-
dicaffeoylquinic
asam memiliki aksi penghambatan radikal peroksil yang lebih tinggi daripada
klorogenik dan
asam askorbat. Rivelli dkk. (2007) mengkuantifikasi 5-CQA dan kafein
hadir dalam ekstrak air dan hidroetanol dari Ilex paraguariensis A.
St.-Hill. dan menguji aktivitas antioksidan dari ekstrak (DPPH
metode). Mereka mengevaluasi hubungan yang mungkin antara kafein dan
5-CQA dengan kegiatan ini. Pada konsentrasi yang diuji, kafein tidak
menunjukkan aktivitas antioksidan, dan 5-CQA memiliki IC50 4,6 μg / mL. Kedua
Asam 3,5-dicaffeoylquinic dan 5-CQA diidentifikasi dalam EESR, dan 5-
CQA adalah senyawa utama yang hadir.

3.4. MTT assay

Potensi sitotoksik EESR dievaluasi menggunakan tiga jalur sel,
HepG2 (karsinoma hepatoselular), HaCat (keratinocytes), dan HDFa
(fibroblas). Yang pertama adalah garis sel hepatoma manusia, yang dipilih dalam
hal ini
bekerja karena merupakan model yang banyak digunakan untuk studi sel-sel
yang memetabolisme,
memungkinkan evaluasi toksisitas metabolit terbentuk dari
produk yang diteliti (Chiari et al., 2012). Keratinocytes dan
fibroblas dipilih karena ekstrak memiliki aplikasi potensial
sebagai lotion kulit topikal baik dalam produk kosmetik atau farmasi.
Sitotoksisitas yang dipromosikan oleh EESR untuk sel HepG2 ditunjukkan dalam
Gambar 3a. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa hanya konsentrasi EESR
dari 4560 µg / mL atau lebih tinggi adalah sitotoksik untuk jalur sel ini.
Nilai kelangsungan hidup sel persentase untuk konsentrasi ini secara statistik
berbeda dari kontrol (p <.001).
Untuk sel HDFa (Gambar 3b), sitotoksisitas diamati untuk
konsentrasi 7540 dan 11.000 μg / mL, memiliki tingkat signifikansi
dari p <.01 dan p <.001, masing-masing. Kami memverifikasi peningkatan
dalam viabilitas sel setelah pengobatan dengan EESR pada konsentrasi
2980 μg / mL (p <.05) dan ini mungkin terkait dengan adanya nutrisi
dalam ekstrak sebagai karbohidrat dan asam amino.
Berdasarkan profil dosis-respons untuk konsentrasi HaCat (Gbr. 3c)
4560 μg / mL atau lebih tinggi menyebabkan penurunan persentase
kelangsungan hidup sel dengan tingkat signifikansi p <0,001. Seperti yang
dibahas
untuk HDFa, konsentrasi 1570 dan 2980 μg / mL dihasilkan
dalam peningkatan viabilitas sel (p <.001 dan p <.01, masing-masing).
Nilai IC50 untuk HepG2, HaCat, dan fibroblast adalah
6952,6 ± 673,8, 6007,4 ± 544,8, dan 9883,2 ± 65,3 μg / mL, masing-masing.
Konsentrasi ini, mampu mengurangi kelangsungan hidup ini
sel-sel garis sebesar 50%, dapat dianggap sangat tinggi dalam kaitannya
dengan konsentrasi
diperlukan untuk ekstrak ini untuk menunjukkan aktivitas biologis,
berdemonstrasi
keamanan EESR. Batas keamanan ini (dalam hal ini, the
konsentrasi beracun dibagi dengan konsentrasi efektif) baik
karena konsentrasi ini ribuan kali lebih tinggi daripada
konsentrasi yang diperoleh, misalnya, untuk mengais 50% dari radikal bebas
ditentukan dalam tes penentuan antioksidan. Keamanan ini
berdasarkan uji sitotoksisitas dapat disimpulkan dengan membandingkan
hasilnya
diperoleh dalam studi Martínez et al. (1999), yang menguji sitotoksik
potensi buah dan sayuran. Konsentrasi ekstrak tumbuhan
adalah 5000 μg / mL, menghasilkan sekitar 80% kematian sel. Ini
konsentrasi dianggap tinggi, dan potensi sitotoksik ini
produk, dengan demikian, dianggap tidak signifikan oleh penulis. Keamanan
EESR
juga harus dipertimbangkan dengan mempertimbangkan penggunaan kopi
sebagai
minuman dan produk makanan dan kosmetik.

Kesimpulan
Aktivitas antioksidan ekstrak residu biji kopi hijau dan
Ekstrak biji kopi hijau mirip dan signifikan dibandingkan dengan
produk sampingan kopi lainnya. Menurut analisis kimia kuantitatif
menggunakan UPLC-UV, kami menyimpulkan bahwa 5-CQA adalah senyawa
utama
di EESR, menunjukkan bahwa itu membuat kontribusi besar terhadap
antioksidan
aktivitas ekstraknya, sebagaimana telah ditetapkan dalam literatur. Itu
isi dari 5-CQA dan kafein adalah serupa di EESe dan EESR.
Dalam analisis UPLC-ESI-QTOF-MSE, lima monoacyl dan tiga diacyl
ester dari asam trans-sinamat dan asam quinic diidentifikasi: 3-caffeoylquinic,
Asam 4-caffeoylquinic dan 5-caffeoylquinic, 5-p-coumaroylquinic
asam, 5-feruloylquinic acid, 3,4-dicaffeoylquinic acid, 3,5-
asam dicaffeoylquinic, dan asam 4,5-dicaffeoylquinic. Perbandingan
komposisi kimia EESR dan EESe menunjukkan bahwa kopi hijau
residu biji merupakan sumber yang menarik kafein dan ester dari transcinnamic
asam dan asam quinic sebagai asam klorogenik. Selain itu, EESR
dapat dianggap aman pada konsentrasi yang digunakan sesuai dengan
uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT. Jadi, C. biji hijau arabika
ekstrak residu (EESR) memberikan potensi besar untuk digunakan sebagai
bahan baku
untuk suplemen makanan, kosmetik dan produk farmasi atau
sebagai sumber senyawa antioksidan bioaktif, dan produk sampingan ini
Pemanfaatan konsisten dengan tujuan kimia hijau, memiliki lingkungan
dan manfaat ekonomi.
Ucapan terima kasih
Kami berterima kasih kepada koperasi kopi Cooxupé (Guaxupé, Minas Gerais,
Brasil) untuk menyumbangkan residu biji hijau dan biji hijau C.
arabica L. Selain itu, kami berterima kasih kepada Dukungan dan
Pengembangan Ilmiah
Program dari Sekolah Ilmu Farmasi (UNESP), FAPESP,
CNPq untuk dukungan keuangan.asam dan asam quinic sebagai asam
klorogenik. Selain itu, EESR
dapat dianggap aman pada konsentrasi yang digunakan sesuai dengan
uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT. Jadi, C. biji hijau arabika
ekstrak residu (EESR) memberikan potensi besar untuk digunakan sebagai
bahan baku
untuk suplemen makanan, kosmetik dan produk farmasi atau
sebagai sumber senyawa antioksidan bioaktif, dan produk sampingan ini
Pemanfaatan konsisten dengan tujuan kimia hijau, memiliki lingkungan
dan manfaat ekonomi.

Ucapan terima kasih

Kami berterima kasih kepada koperasi kopi Cooxupé (Guaxupé, Minas Gerais,
Brasil) untuk menyumbangkan residu biji hijau dan biji hijau C.
arabica L. Selain itu, kami berterima kasih kepada Dukungan dan
Pengembangan Ilmiah
Program dari Sekolah Ilmu Farmasi (UNESP), FAPESP,
CNPq untuk dukungan keuangan.